Artykuł metodologiczny

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57301

⸱

6 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2The Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Department of Pathology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Streszczenie

Ortotopowe modelowanie guzów jest cennym narzędziem do przedklinicznych badań nad rakiem prostaty, ponieważ ma wiele zalet zarówno w porównaniu z podskórnymi, jak i transgenicznymi genetycznie modyfikowanymi modelami myszy. W przeciwieństwie do guzów podskórnych, guzy ortotopowe zawierają bardziej dokładne klinicznie unaczynienie, mikrośrodowisko guza i odpowiedzi na wiele terapii. W przeciwieństwie do genetycznie modyfikowanych modeli mysich, modele ortotopowe mogą być wykonywane przy niższych kosztach i w krótszym czasie, wymagają użycia wysoce złożonych i heterogenicznych linii komórek raka myszy lub człowieka, a nie pojedynczych zmian genetycznych, a te linie komórkowe mogą być modyfikowane genetycznie, na przykład w celu ekspresji środków obrazowania. Tutaj przedstawiamy protokół chirurgicznego wstrzykiwania mysiej linii komórkowej raka prostaty z ekspresją lucyferazy i mCherry do przedniego płata prostaty myszy. U tych myszy rozwinęły się guzy ortotopowe, które były nieinwazyjnie monitorowane in vivo i dalej analizowane pod kątem objętości guza, masy, przeżycia myszy i infiltracji immunologicznej. Co więcej, myszy ortotopowe z guzem zostały chirurgicznie wykastrowane, co doprowadziło do natychmiastowej regresji guza, a następnie nawrotu, co stanowi opornego na kastrację raka prostaty. Chociaż do przeprowadzenia tej procedury wymagane są umiejętności techniczne, ten syngeniczny model ortotopowy raka prostaty zarówno zależnego od androgenów, jak i opornego na kastrację jest bardzo przydatny dla wszystkich badaczy w tej dziedzinie.

Wprowadzenie

Szacuje się, że rak prostaty ma najwyższą częstość występowania (161 360 mężczyzn) i powoduje trzecią co do liczby zgonów z powodu raka u mężczyzn (84 590 mężczyzn) w 2017 roku1. Po rozpoznaniu guzy prostaty są zależne od androgenów i są leczone za pomocą chirurgicznej prostatektomii, radioterapii i/lub terapii deprywacji androgenów (ADT), jednak każde leczenie wiąże się z wieloma poważnymi chorobami i powikłaniami2,3,4,5,6,7,8,9,10. Pomimo regresji guza po ADT, prawie wszystkie nowotwory nawracają jako oporny na kastrację rak prostaty (CRPC). Na tym etapie zatwierdzone terapie obejmują docetaksel, immunoterapię Sipuleucel-T oraz małe cząsteczki antyandrogenowe enzalutamid i abirateron, jednak żadna indywidualna terapia nie zapewnia korzyści w zakresie przeżycia większej niż 5,2 miesiąca11,12,13,14,15,16,17. Dlatego mężczyźni we wszystkich stadiach raka prostaty potrzebują zarówno lepszych opcji leczenia, jak i zarządzania chorobami, dla których kluczowe znaczenie ma optymalne przedkliniczne modelowanie choroby.

Przy prawidłowej procedurze, linie komórkowe raka prostaty mogą być chirurgicznie wszczepione do mysiej prostaty, co prowadzi do rozwoju zarówno syngenecznych, jak i ksenogenicznych guzów ortotopowych. Ortotopowe modelowanie guza jest idealne dla wszystkich badań nad biologią nowotworów i opracowywaniem leków, umożliwiając rozwój guza z klinicznie reprezentatywnym mikrośrodowiskiem guza (TME). Wcześniejsze badania wykazały, że guzy podskórne (s.c.) mają zmienione unaczynienie guza, co prowadzi do zróżnicowanych i mniej klinicznie dokładnych odpowiedzi na terapie antyangiogenne18,19. Ponadto w wielu badaniach zaobserwowano zwiększoną lub zmniejszoną skuteczność wielu chemioterapeutyków w leczeniu tej samej linii komórkowej, w zależności od tego, czy podawano ją s.c., czy ortotopowo, przy czym ta ostatnia najlepiej reprezentowała to, co obserwuje się w ludzkim raku20,21,22. Co więcej, tylko w ortotopowym modelu raka jelita grubego, ale nie w modelu s.c., guzy wytwarzały prawidłowe enzymy degradacyjne niezbędne do wywołania przerzutów23. Wreszcie, ponieważ immunoterapie nadal pojawiają się w czołówce terapii przeciwnowotworowej, a zwłaszcza że nie przyniosły jeszcze znaczących korzyści w przypadku raka prostaty24,25, kluczowe znaczenie mają syngeniczne modele przedkliniczne z dokładnym TME i drenażem węzłów chłonnych u immunokompetentnych gospodarzy.

Istnieje wiele czynników odpowiedzialnych za te niespójne wyniki oparte na lokalizacji guza. Dzięki innemu TME komórki rakowe są narażone na działanie różnego śródbłonka specyficznego dla tkanki i zmienioną angiogenezę, wpływając w ten sposób na rozwój nowotworu26,27. Guzy ortotopowe z prawidłowym TME pozwalają na klinicznie istotne dostarczanie leków, stany niedotlenienia i ocenę terapii antyangiogennych28. Chociaż modele modyfikowane genetycznie (GEM) zawierają dokładny TME, wymagają długiego czasu na hodowlę, wysokich kosztów i często opierają się na manipulacjach pojedynczym lub kilkoma genami znokautowanymi lub nadmiernie eksprymowanymi powyżej klinicznie istotnych poziomów. W przeciwieństwie do tego, ludzkie lub mysie linie komórkowe raka prostaty używane w guzach ortotopowych, takich jak nowotwory ludzkie, są znacznie bardziej złożone genetycznie zarówno w obrębie pojedynczych komórek, jak i pod względem niejednorodności między komórkami29,30. Ponadto, w przeciwieństwie do GEM, ortotopowe linie komórkowe raka mogą być modyfikowane w celu ekspresji modalności obrazowania lub zwiększonych lub obniżonych poziomów innych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania, a wyniki eksperymentów in vitro i in vivo mogą być bezpośrednio porównywane. Guzy ortotopowe mogą również powstawać z pierwotnych komórek pochodzących od pacjenta. W tym miejscu przedstawiamy metodologię wykonywania iniekcji dogruczołowych komórek raka prostaty, które tworzą ortotopowe guzy zależne od androgenów, a po kastracji nawracają jako ortotopowe CRPC.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym protokole muszą być wykonywane zgodnie z przepisami etycznymi i zgodą odpowiedniego uniwersyteckiego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

1. Przygotowanie materiałów chirurgicznych i komórek rakowych

  1. Przed dniem zabiegu należy przeznaczyć w autoklawie nożyczki do mikropreparacji, kleszcze Graefe, kleszczyki do tkanek Graefe, uchwyt igły z obcinaczami do szwów oraz odpowiednią liczbę obłożeń. Wysterylizuj strzykawkę o pojemności 50 μl i igły o rozmiarze 28 za pomocą gazowego tlenku etylenu (Rysunek 1C).
  2. Przed dniem operacji należy przeprowadzić hodowlę komórek Myc-CaP na 10 cm szalkach w RPMI uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S) w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO2 . W celu bioluminescencyjnego i/lub fluorescencyjnego monitorowania guza, należy przetransfekować komórki 293T odpowiednimi wektorami, a następnie transdukować komórki Myc-CaP za pomocą lentiwirusa z filtrem 0,45 μm31. Sortuj komórki, aby wygenerować stabilną linię komórkową ze 100% dodatnim wynikiem transdukcji.
    UWAGA: Wykonaj całą hodowlę tkankową w sterylnych warunkach i sprawdź, czy wszystkie linie komórkowe są wolne od mykoplazmy. Mysia linia komórkowa raka prostaty wykorzystana w tym badaniu, Myc-CaP32, jest transdukowana w celu stabilnej ekspresji zarówno lucyferazy świetlika, jak i mCherry. Linia komórkowa Myc-CaP została wyizolowana z myszy Hi-myc z nadekspresją c-myc, a komórki te zawierają amplifikowany receptor androgenowy (AR), który jest zależny od androgenu32 i tworzy guzy CRPC po mysiej kastracji33. Wszystkie myszy w tym badaniu to 6-8-tygodniowe samce myszy FVB / NJ. Alternatywne mysie linie komórkowe raka prostaty mogą być stosowane u myszy o odpowiednim tle genetycznym, a także u ludzkich linii komórkowych raka prostaty lub pierwotnych komórek raka prostaty pochodzących od pacjenta z myszami z niedoborem odporności. Optymalna liczba komórek w każdym wstrzyknięciu powinna być określona empirycznie dla alternatywnych linii komórkowych. Ponadto do wizualizacji nowotworów można wykorzystać alternatywne metody obrazowania, w tym obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), pozytonową tomografię emisyjną (PET) lub tomografię komputerową (CT), a także GFP jako alternatywę dla mCherry.
  3. W noc poprzedzającą zabieg umieść matrycę błony podstawnej matrigel i bez czerwieni fenolowej na lodzie w temperaturze 4 °C do rozmrożenia.
  4. W dniu zabiegu należy pobrać komórki, przemywając je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i odłączając 0,25% trypsyną-EDTA. Zneutralizuj trypsynę za pomocą RPMI z 10% FBS i 1% P/S.
  5. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut.
  6. Umyj ogniwa 10 ml RPMI bez FBS lub P/S.
  7. Policz komórki i ponownie zawieś komórki w PBS w stężeniu 6,67x107 komórek/ml (1×106 komórek/15 μl).
  8. Dodać równą objętość matrigelu, aby utworzyć zawiesinę komórek 1:1 PBS/matrigel o końcowym stężeniu 1×106 komórek/30 μl i utrzymywać komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia, aby zapobiec zestaleniu.
    UWAGA: Iniekcje dogruczołowe należy wykonać w ciągu 3 godzin od przygotowania zawiesin komórek matrigelu. W przypadku wykonywania wstrzyknięć dogruczołowych u więcej niż 5 myszy, powtórz powyższe kroki, aby przygotować świeżą zawiesinę komórek matrigelu.

2. Przedoperacyjne przygotowanie myszy

UWAGA: Myszy domowe w uniwersyteckim obiekcie dla zwierząt przez co najmniej tydzień przed operacją, aby umożliwić odpowiednią adaptację i zminimalizować stres zwierząt. Kroki 2.1-2.6 są wykonywane przez asystenta chirurga. Wszystkie kolejne czynności chirurgiczne wykonywane są przez chirurga przy użyciu sterylnych rękawiczek i narzędzi chirurgicznych o sterylnej technice.

  1. Znieczulenie myszy izofluranem (2-5% do indukcji przez komorę, 1-3% do utrzymania przez stożek nosowy). Sprawdź pełną indukcję przez utratę odruchu szczypania palców u stóp.
  2. Zważyć myszy i podać co najmniej 0,05 mg/kg przeciwbólowego buprenorfiny s.c.
    UWAGA: Waga myszy ≥20 g jest idealna do udanych iniekcji dogruczołowych prostaty.
  3. Nałóż smar maści okulistycznej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  4. Ogol całe futro z brzucha.
  5. Wysterylizuj brzuch przez trzy rundy okrężnego nakładania peelingu chirurgicznego za pomocą sterylnych, nieprzywierających płatków, a następnie sterylnych chusteczek nasączonych alkoholem. Pozostaw brzuch do wyschnięcia.
    UWAGA: Przez pozostałą część zabiegu chirurgicznego tylko sterylne rękawiczki i narzędzia chirurgiczne mogą stykać się ze wysterylizowanym brzuchem myszy.
  6. Przenieś mysz leżąc na wznak na czystą powierzchnię na poduszce grzewczej bezpośrednio pod obiektywem czystego mikroskopu chirurgicznego.
  7. Przykryj mysz sterylną serwetą z małym otworem wyciętym nad brzuchem.

3. Wstrzyknięcie do gruczołu krokowego

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki chirurgiczne w sterylnych warunkach. Regulacja mikroskopu, umiejscowienia myszy lub innych niesterylnych przedmiotów musi być wykonana przez asystenta chirurga.

  1. Wykonaj około 1 cm nacięcie zewnętrznej skóry wzdłuż linii środkowej brzucha powyżej penisa i gruczołów napletkowych (Rysunek 1D).
  2. Oddziel tkankę łączną między zewnętrzną skórą brzucha a wewnętrzną muskulaturą brzucha, otwierając nożyczki między warstwami.
  3. Wykonaj podobne nacięcie wewnętrznej muskulatury brzucha, używając kleszczy do podniesienia mięśni, aby uniknąć przebicia jelit lub pęcherza moczowego (Rysunek 1D).
  4. Zlokalizuj jeden z obustronnych pęcherzyków nasiennych (Rysunek 1A, biały) / przednie płaty prostaty (Figura 1A,), które często są tylne, boczne i nieco wyższe od pęcherza moczowego (Figura 1A, żółty), ale może się to różnić między myszami. Przednie płaty prostaty są półprzezroczyste i przyczepione do mniejszej krzywizny białych pęcherzyków nasiennych.
  5. Delikatnie podnieś końcówkę pęcherzyka nasiennego za pomocą kleszczyków tkankowych Graefe, aby wytworzyć napięcie na tkance bez nakłuwania pęcherzyka nasiennego (Rysunek 1E).
  6. Wymieszać roztwór matrygelu Myc-CaP przez pipetowanie gentile (wykonywane przez asystenta chirurga), ponieważ komórki mogły się granulować, i powoli odessać 30 μl (1x106 komórek) do igły, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
  7. Ostrożnie wprowadzić skos igły równolegle do długiej osi przedniego płata prostaty. Powoli wstrzyknąć 30 μl do płatka i powoli wycofać igłę, aby zapobiec wyciekowi (Rysunek 1F). Sprawdzić, czy wstrzyknięcie jest odpowiednie przez obrzęk przedniego płata prostaty (Ryc. 1G).
  8. Ostrożnie trzymaj pęcherzyk nasienny i wstrzyknięty płat prostaty na zewnątrz myszy przez około 30 sekund, aby umożliwić częściowe zestalenie się matrigelu w płacie. W tym czasie należy zebrać wszelkie wycieki roztworu komórkowego w jamie brzusznej za pomocą sterylnego aplikatora z końcówką poliestrową, aby zapobiec nieortotopowemu rozwojowi guza, bez naciskania na wstrzyknięty płat prostaty.
  9. Ostrożnie włóż pęcherzyk nasienny i wstrzyknięty płat prostaty do jamy brzusznej, nie wywierając nacisku na płat. Wymień wszystkie uzewnętrznione tkanki.
  10. Wykonaj szwy ciągłe, aby zamknąć wewnętrzną muskulaturę brzucha za pomocą wchłanialnych szwów igłowych 5-0 vicryl
    11. .
  11. Wykonaj szwy przerywane, aby zamknąć zewnętrzną skórę brzucha za pomocą niewchłanialnych nici z odwróconego drutu 4-0 z nylonu.
    UWAGA: Sterylizowane zszywki 9 mm mogą być również używane do zamykania zewnętrznej części skóry brzucha. Jednak w przeciwieństwie do szwów, zakłócają one wszelkie późniejsze sygnały obrazowania guza w bioluminescencji i fluorescencji.
  12. Wyczyść wszystkie narzędzia sterylnymi chusteczkami na etanol (otwieranymi przez asystenta chirurga) i umieść je w sterylizatorze z kulkami szklanymi na 30 sekund. Pozostaw narzędzia do wyschnięcia przed użyciem na następnej myszy.
  13. Przepłukać strzykawkę i igłę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (otwieranym przez asystenta chirurga), aby zapobiec zatkaniu przez resztki matrigel.
    UWAGA: Asystent chirurga powinien być obecny przy wszystkich operacjach, wykonując wszystkie niesterylne przedoperacyjne przygotowanie myszy i pooperacyjną opiekę nad myszami, a także mieszając roztwór matrygla Myc-CaP przed wstrzyknięciami. Aby zminimalizować czas, ponieważ każdy zabieg na myszy wewnątrzkrokowej będzie wymagał 20-30 minut, asystent chirurga może rozpocząć przygotowywanie następnej myszy, podczas gdy chirurg zszywa obecną mysz.

4. Pooperacyjna pielęgnacja myszy

  1. Podać 1 mg/kg przeciwbólowego meloksykamu s.c. natychmiast, 24 godziny i 48 godzin po zabiegu.
  2. Pozwól myszom dojść do siebie w klatce bez ściółki umieszczonej do połowy na poduszce grzewczej. Monitoruj myszy przez co najmniej 30 minut po operacji, aż odzyskają normalną mobilność i aktywność, po czym umieść je w czystej klatce z jedzeniem na podłodze klatki.
  3. Ponadto codziennie monitoruj myszy pod kątem prawidłowego gojenia się ran, masy ciała, pielęgnacji i poruszania się po operacji. Podziel myszy na osobne klatki po otrzymaniu jakichkolwiek dowodów walki.
  4. Usuń pozostałe szwy w ciągu 14 dni po zabiegu.

5. Bioluminescencyjne obrazowanie guza

  1. Przygotować sterylnie przefiltrowaną Na+ lub K+ D-lucyferynę, zgodnie z opisem producenta i chronić przed światłem.
  2. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 10 μl/g masy ciała lucyferyny.
  3. Co najmniej 10 minut później zobrazuj myszy za pomocą systemu obrazowania widma IVIS, zgodnie z wcześniejszym opisem34,35.
  4. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Living Image Software, zgodnie z wcześniejszym opisem34,35.
    UWAGA: Analiza obrazowania IVIS jest przydatna do określenia udanych wstrzyknięć dosterczowych i początkowego rozwoju guza w celu normalizacji obciążenia guzem w grupach eksperymentalnych. Jednak w zależności od intensywności sygnału bioluminescencyjnego lub fluorescencyjnego, nasycenie może spowodować plateau w kwantyfikacji obrazu pomimo wzrostu rzeczywistego rozmiaru guza. Dlatego w późniejszych stadiach wzrostu guza obrazowanie IVIS może być bardziej przydatne do określenia zmniejszenia wielkości guza po skutecznym leczeniu, a nie wzrostu rozmiaru po nasyceniu obrazu.

6. Pobieranie guzów, analiza guza, punkt końcowy przeżycia

  1. W przypadku pobierania guza do analizy, humanitarnie poddaj myszy eutanazji poprzez ekspozycję na CO2 i wtórne zwichnięcie szyjki macicy lub alternatywne metody zatwierdzone przez IACUC i wypreparuj guzy z jamy brzusznej. Guzy powinny być zlokalizowane ortotopowo na prostacie.
    UWAGA: Guzy przyczepione do przedniej ściany brzucha lub wysiane w całym brzuchu wskazują na słabe lub nieszczelne wstrzyknięcie do gruczołu krokowego i nie powinny być uważane za guzy ortotopowe.
  2. Zważ guzy.
  3. Oblicz objętość guza jako π/6×L×W×H (L = długość najdłuższej osi guza, W = szerokość prostopadła, H = wysokość prostopadła).
  4. Guzy można analizować za pomocą histologii (utrwalenie w 10% obojętnej buforowanej formaliny), cytometrii przepływowej (tworzenie zawiesin pojedynczych komórek), białka (przygotowanie lizatu tkankowego w buforze RIPA) lub RNA (natychmiastowe umieszczenie tkanki w RNAlater).
  5. Do analizy immunologicznej należy również pobrać węzły chłonne okołoaortalne drenujące guz prostaty (Rysunek 1B, pomarańczowy) i śledzionę.
    UWAGA: W przypadku obserwowania myszy w celu przeżycia, punkt końcowy tego modelu definiuje się jako pojawienie się krwotocznego wodobrzusza brzucha36 i/lub zmniejszonego poruszania się, pielęgnacji i/lub piloerekcji37. Myszy do analizy przeżycia otrzymują analgezję przed- i pooperacyjną (kroki protokołu 2.2, 4.1) i muszą być regularnie monitorowane. Myszy powinny zostać rozdzielone do indywidualnych klatek, jeśli dojdzie do walki, i powinny zostać humanitarnie poddane eutanazji po pojawieniu się któregokolwiek z powyższych odczytów końcowych.

7. Kastracja chirurgiczna do modelu CRPC

  1. Aby modelować CRPC, wykonaj powyższy protokół wstrzyknięcia do-gruczołu krokowego (kroki protokołu 1-5).
  2. Co najmniej tydzień później, po rozwinięciu się guza, wykonaj kastrację chirurgiczną poprzez kauteryzację, jak opisano wcześniej38.
  3. Monitoruj regresję i nawroty guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Po kastracji regresja guza nastąpi w ciągu 3 dni, a nawrót guza nastąpi w ciągu około 30 dni, co stanowi CRPC.

Wyniki

W niniejszym manuskrypcie wykonaliśmy chirurgiczne wstrzyknięcie linii komórkowej raka prostaty mysiej, Myc-CaP, do przedniego płata prostaty (Rysunek 1A), co doprowadziło do rozwoju ortotopowych guzów prostaty z klinicznie istotnym TME i odpowiednimi węzłami chłonnymi drenażującymi prostatę (Rysunek 1B). Procedurę tę przeprowadzono przy użyciu nożyczek do mikrodysekcji, kleszczyków Graefe, kleszczyków tkankowych Graefe, uchwytu igłowego z przecinką oraz strzykawki 50 µL z igłą 28G (Rysunek 1C). Po wykonaniu nacięcia w linii środkowej brzucha o długości około 1 cm powyżej gruczołów nap prepucjalnych (Rysunek 1D), zlokalizowano i wypreparowano jeden pęcherzyk nasienny wraz z przylegającym przednim płatem prostaty (Rysunek 1E), a następnie do prostaty wstrzyknięto 30 µL (1x106 komórek) zawiesiny komórkowej w PBS/matrigelu w stosunku 1:1 (Rysunek 1F), co początkowo zweryfikowano poprzez obrzmienie płata i brak wycieku (Rysunek 1G).

Aby monitorować wzrost guza ortotopowego, stabilnie przetransfekowaliśmy komórki Myc-CaP w celu ekspresji zarówno lucyferazy świetlika, jak i mCherry, co pozwoliło na śledzenie guzów za pomocą nieinwazyjnej bioluminescencji in vivo (Rycyna 2A) oraz fluorescencji (Rycyna 2B) odpowiednio. Jednym z ograniczeń tej metody obrazowania jest fakt, że w zależności od siły sygnału, kwantyfikacja obrazu może ulec nasyceniu, podczas gdy guz nadal zwiększa swoją objętość. Dlatego przy wysokich intensywnościach sygnału obrazowanie in vivo jest bardziej przydatne do wstępnej normalizacji masy guza w grupach eksperymentalnych oraz do późniejszego określania zmniejszenia wielkości guza po zastosowaniu zabiegów eksperymentalnych. Można również wykorzystać dodatkowe metody obrazowania, takie jak MRI, PET lub CT dla małych zwierząt.

Guzy ortotopowe wypreparowano z jamy brzusznej w 30. dniu po wstrzyknięciu do prostaty (Rycina 3A). Guzy ortotopowe powinny znajdować się w miejscu przedniego płata prostaty. Obecność mas guzowatych w całej jamie brzusznej lub przytwierdzonych do przedniej ściany brzucha wskazuje na nieprawidłowe wstrzyknięcie do prostaty i wyciek preparatu. Przy zastosowaniu właściwej techniki objętość guza (Rycina 3B) i jego masa (Rycina 3C) mogą zostać zarejestrowane z relatywnie małym błędem standardowym. Jednak, jak zaobserwowano, wystąpi pewna zmienność w przypadku małych i dużych mas guzowych. Dlatego w przypadku wszystkich eksperymentów kluczowe jest wstępne wykorzystanie ilościowej oceny obrazowej przed leczeniem w celu wyrównania obciążenia guzami pomiędzy ramionami badawczymi. Ponadto, ponieważ te mysie komórki nowotworowe zostały wstrzyknięte do immunokompetentnych myszy FVB/NJ, mikrośrodowisko guza (TME) można analizować za pomocą immunohistochemii (IHC) (lub cytometrii przepływowej lub innych technik) w kierunku limfocytów T CD3 (Rycina 3D) (lub innych typów komórek odpornościowych). Wreszcie, model ten zapewnia obiektywny punkt końcowy przeżycia, ponieważ duża masa guza pierwotnego powoduje krwotoczną wodniczkę brzuszną36 (Rycina 3E) i/lub zmniejszenie aktywności ruchowej, zaburzenia pielęgnacji ciała i/lub piloerekcję37. Sporadycznie przyczyną śmierci może być również wzrost guza blokujący odpływ moczu.

Wreszcie, model ten może być wykorzystany do badania zarówno raka prostaty zależnego od androgenów, jak i CRPC, który charakteryzuje się złym rokowaniem i wymaga opracowania nowych opcji terapeutycznych. Po rozwoju guza ortotopowego myszy zostały poddane chirurgicznej kastracji, zgodnie z wcześniejszym opisem38. Ponieważ jest to drugi główny zabieg chirurgiczny wpływający na przeżywalność, należy zachować szczególną ostrożność podczas monitorowania rekonwalescencji oraz wszelkich działań niepożądanych lub powikłań. W ciągu 3 dni po kastracji zaobserwowano silną regresję guza, po której nastąpił ponowny wzrost guza po około 30 dniach, co reprezentuje CRPC (Rycina 4A). Guzy CRPC mogą być wycinane i analizowane histologicznie; nie wykazują one różnicowania neuroendokrynnego, ponieważ utrzymują wysokie poziomy AR i są negatywne w kierunku markera neuroendokrynnego, synaptofizyny (Rycina 4B).

Schemat procedury chirurgicznej u gryzoni; narzędzia, nacięcie, manipulacja tkankami; proces dysekcji.
Rycina 1: Przedni płat prostaty, drenujące węzły chłonne oraz reprezentacyjna technika wewnątrzprostatycznych iniekcji komórek. Obrazy (A) prawy przedni płat prostaty (czarny, *), przyległa prawa pęcherzyk nasienny (biały), prawy jądrze i poduszka tłuszczowa (zielony) oraz pęcherz moczowy (żółty), (B) obustronne paraaortalne węzły chłonne drenujące prostatę (pomarańczowe), (C) nożyczki do mikrodissekcji, pęseta Graefe, pęseta tkankowa Graefe, uchwyt igłowy z przecinaczem do szwów oraz 50 µL strzykawka z igłą o rozmiarze 28G (od lewej do prawej), (D) cięcia w linii pośrodkowej, (E) zewnętrzna ekspozycja pęcherzyków nasiennych i przedniego płata prostaty, (F), wstrzyknięcie doprostatyczne, i (G) przepełnienie płata przedniego prostaty. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza; seria danych mysich; ilościowa analiza wykresu strumienia.
Rysunek 2: In vivo bioluminescencyjne i fluorescencyjne obrazowanie guzów. (A) lucyferazy i (B) Obrazowanie ortotopowych guzów Myc-CaP wykazujących ekspresję mCherry przeprowadzono przy użyciu systemu obrazowania IVIS Spectrum. Bioluminescencję określono jako całkowity strumień (fotony/s). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces analizy guza; obejmuje preparat guza, wykresy objętości/masa, preparat histologiczny, obiekt badań.
Rysunek 3: Analizy guza ortotopowego pod kątem objętości guza, masy, histologii w celu oceny nacieku immunologicznego oraz przeżywalności. Guzy ortotopijne wypreparowano w 30. dniu po wtryśnięciu do prostaty i przeanalizowano za pomocą (A) obrazowanie makroskopowe, (B) objętość guza (π/6×L×W×H; L=długość najdłuższej osi guza, W=szerokość prostopadła, H=wysokość prostopadła), (C) masa guza, (D) IHC CD3 (pasek skali=100 µm), oraz (E) przeżywalność, z punktem końcowym w postaci wystąpienia krwotocznej wodobrzusza. (A-B) Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie fluorescencyjne myszy przed i po Cx; wykres progresji nowotworu; wstawki histologiczne.
Rycina 4: Iniekcje wewnątrzprostatyczne z następującą kastracją chirurgiczną w celu modelowania zarówno raka prostaty zależnego od androgenów, jak i CRPC. (A) Myszy z ortotopowymi guzami wykazującymi ekspresję lucyferazy poddano obrazowaniu bioluminescencyjnemu przed i po kastracji (Cx), a (B) wycięto nawrotowe guzy CRPC (czarny = ortotopowy guz prostaty; żółty = pęcherz moczowy), a następnie poddano je analizie H&E&E, IHC AR i IHC synaptofizyny (z dodatnią kontrolą mysią) (pasek skali=50 µm). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

W tym manuskrypcie przedstawiamy protokół wykonywania chirurgicznych iniekcji komórek raka gruczołu krokowego do wnętrza gruczołu krokowego. Wykorzystaliśmy zależną od androgenów i nadekspresję MYC (nadekspresję MYC obserwuje się do 80-90% ludzkiego raka prostaty39) mysią linię komórkową raka prostaty, Myc-CaP, pierwotnie wyizolowaną z myszy Hi-Myc32,33. Ta linia komórkowa została stabilnie transdukowana w celu ekspresji zarówno lucyferazy, jak i mCherry, odpowiednio do nieinwazyjnego bioluminescencyjnego i fluorescencyjnego obrazowania guza in vivo. Co więcej, kastrację chirurgiczną wykonywano również po rozwoju guza zależnym od androgenów, co prowadziło do regresji guza, a następnie nawrotu. Dlatego podajemy szczegóły do modelowania zarówno ortotopowego androgenozależnego raka prostaty, jak i CRPC u immunokompetentnego gospodarza.

Komórki Myc-CaP wstrzyknięto do przedniego płata prostaty myszy. Prostata myszy składa się z przednich, brzusznych i grzbietowo-bocznych płatów prostaty, a ludzka prostata składa się ze strefy obwodowej, strefy przejściowej i strefy środkowej w jednym płacie40. Podczas gdy wcześniejsze badania porównywały anatomicznie i histologicznie grzbietowo-boczny płat myszy z ludzką strefą obwodową, miejscem większości nowotworów prostaty41, a przedni płat myszy z ludzką strefą centralną 42,43, nowsza i bardziej kompleksowa analiza wykazała, że płat przedni i płat grzbietowo-boczny wykazują ściśle powiązane wzorce ekspresji genów, w porównaniu z płatem brzusznym. 44 Ponadto rozwój raka gruczołu krokowego zaobserwowano w płacie przednim GEMs40, a w przypadku zabiegu wewnątrzgruczołowego płat przedni pozwala na wstrzyknięcie niezbędnej objętości roztworu komórek rakowych przy minimalnym wycieku i zmienności.

Korzystanie z modeli raka s.c. i transgenicznego GEM ma wiele wad i ograniczeń. Guzy S.c. wyhodowane w sztucznym TME mają zróżnicowaną odpowiedź na chemioterapię, w przeciwieństwie do obu guzów ortotopowych z tych samych linii komórkowych i choroby ludzkiej 20,21,22. Może to być spowodowane zmienionym unaczynieniem guzów SC, czego przykładem jest ich zróżnicowana odpowiedź na terapię antyangiogenną18,19. Wręcz przeciwnie, guzy ortotopowe rozwijają się z prawidłowym TME, drenującym węzły chłonne i naczyniowe, i mogą być wykonywane za pomocą mysich linii komórkowych, co pozwala również na analizę immunologii guza i odpowiedzi na immunoterapię.

Transgeniczne GEM rozwijają guzy z odpowiednim TME w immunokompetentnym gospodarzu, jednak modele te zazwyczaj nadmiernie upraszczają ludzkiego raka, rozwijając guzy z pojedynczymi lub kilkoma zmianami genetycznymi29. Analiza Myc-CaP i innych linii komórkowych raka prostaty wykazała, że zawierały one znacznie większe zmiany liczby kopii somatycznych i zmiany chromosomalne niż guzy myszy Hi-Myc i innych GEM, z którychpochodziły. Co więcej, GEM-y są ograniczone zwiększonymi kosztami i czasem potrzebnym do hodowli myszy do przeprowadzenia eksperymentów o wystarczającej mocy. Ortotopowe modelowanie guza może przezwyciężyć te ograniczenia. Ludzkie i mysie linie komórkowe raka prostaty zawierają wiele zmian genetycznych istotnych dla choroby u ludzi29 i, podobnie jak rak u ludzi, wykazują również dużą niejednorodność między poszczególnymi komórkami30. Ortotopowe mysie guzy syngeniczne pozwalają na analizy immunologiczne, podczas gdy ortotopowe ludzkie guzy ksenogeniczne pozwalają na analizę terapii na komórkach ludzkich. Wreszcie, w przeciwieństwie do GEM, linie komórkowe mogą być modyfikowane przed wstrzyknięciem, co pozwala na ekspresję cząsteczek obrazowania bioluminescencyjnego lub fluorescencyjnego w celu monitorowania wzrostu guza, normalizacji obciążenia guzem w grupach eksperymentalnych, monitorowania odpowiedzi na leczenie oraz śledzenia regresji guza i nawrotu CRPC po kastracji chirurgicznej.

Krytyczne kroki w tym protokole obejmują zlokalizowanie i eksternalizację pęcherzyka nasiennego i przyczepionego przedniego płata prostaty bez uszkadzania innych tkanek lub nakłuwania pęcherzyka nasiennego, wykonanie udanego wstrzyknięcia dokrokowego 30 μl zawiesiny komórkowej bez wycieku oraz prawidłowe zbieranie wszelkich wycieków, aby zapobiec rozwojowi guza nieortotopowego w całym jamie brzusznej. Głównym ograniczeniem wstrzyknięć dogruczołowych jest zdobycie umiejętności technicznych wymaganych do zminimalizowania zmienności guza między myszami. Jest to szczególnie ważne w przypadku modelowania CRPC, które ma dodatkową zmienną w postaci kastracji chirurgicznej. Myszy, którym wstrzyknięto doprostatycznie i wykastrowano je, muszą być również ściśle monitorowane pod kątem powrotu do zdrowia i zdarzeń niepożądanych, ponieważ przeszły one dwie poważne operacje przeżycia. Kolejnym ograniczeniem jest czas każdego wstrzyknięcia dogruczołu krokowego. Czas ten można skrócić nawet do 20 minut, a asystent chirurga może przygotować następną mysz w trakcie szycia bieżącej myszy. Wreszcie, ortotopowe guzy Myc-CaP są agresywnymi, szybko rosnącymi nowotworami, które osiągają punkt końcowy przeżycia w ciągu około 46 dni (i już po 35 dniach) ze względu na pierwotną masę guza. Badania wymagające wolniejszego rozwoju guza lub długotrwałego leczenia powinny być zoptymalizowane empirycznie pod kątem początkowej liczby komórek iniekcyjnych i schematu leczenia. W przeciwieństwie do ograniczeń guzów s.c. i GEM, wszystkie powyższe ograniczenia ortotopowego modelu guza można przezwyciężyć, a dodatkowe modyfikacje protokołu można wprowadzić w oparciu o indywidualne potrzeby eksperymentalne.

Ponieważ ortotopowy model guza zakłada wykorzystanie komórek przetwarzanych in vitro, komórki te mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb badania. Tutaj zmodyfikowaliśmy te komórki, aby stabilnie wyrażały lucyferazy i mCherry do monitorowania guza in vivo . Przeprowadziliśmy również nokaut CRISPR-Cas9 supresora guza PTEN, aby wygenerować bardziej agresywną, klinicznie istotną linię komórkową, która rośnie szybciej jako guzy ortotopowe (manuskrypt w recenzji). Dzięki zaletom ortotopowego modelu guza, możliwości badania zarówno androgenozależnego raka prostaty, jak i CRPC, a także możliwości ekspresji metod obrazowania lub knockdownu lub nadekspresji wybranych genów, protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla wszystkich badań nad rakiem prostaty.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health dla Praveena Thumbikata (NIDDK R01 DK094898), Sarki Abdulkadir (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) i Jonathana Ankera (NCI F30 CA203472).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa Myc-CaPATCCCRL-3255Przed użyciem sprawdź, czy jest wolna od mykoplazmy
Nożyczki do mikropreparacjiRobozRS-5910
Kleszcze GraegeRobozRS-5135
Kleszczyki do tkanek GraefeRobozRS-5150
Uchwyt na igły Olsen-Hegar z obcinakami do szwówFST12002-12
50 &mikro; L Strzykawka 705 RN SYRHamilton7637-01Sterylizacja gazowym tlenkiem etylenu
Igły o rozmiarze 28 Mały piasta RNHamilton7803-02Styl punktowy 4, kąt 45°, długość 0,75 cala. Sterylizowane gazowym tlenkiem etylenu
RPMIGibco18875-093
FBSGibco10437-028
Pencillin/StreptomycynaGibco15140-122
PBSGibco14190-144
0,25% trypsyna-EDTAGibco25200-056
Matrigel matryca membrany podstawnej, bez czerwieni fenolowej, bez LDEVCorning356237Rozmrozić na lodzie w 4° C na noc przed użyciem
IzofluranHenry Schein11695-0500-2Nabyty z Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)
26 Strzykawka BD o rozmiarze 5/8309597Do wstrzykiwań meloksykamu i buprenorfiny
Hirochlorek buprenorfiny 0,3 mg/ml12496-0757-5Substancja kontrolowana, nabyta od Northwestern University CCM
Ophthalmic smarowanie maściąAkron17478-162-35
Peeling chirurgiczny Betadine (powidon-jod, 7,5%)Produkty Purdue67618-151-16
Sterylne nieprzywierające podkładkiMoore Medical10775
Sterylne chusteczki nasączone alkoholemFisher Scientific22-363-750
Mikroskop chirurgiczny Stemi DV4Zeiss
Sterylne aplikatory z końcówką poliestrowąPuritan25-806 1PD
5-0 vicryl wchłanialne nici igłowe do odwrotnego cięciaeSzwyJ493G
4-0 nylon monfilament niewchłanialne szwy igłowe do odwrotnego cięciaeSutures699H
Sterylizator z kulkami szklanymiFine Science Tools18000-45
Sterylna sól fizjologiczna 0,9% chlorek soduHospira0409-4888-02
Meloksykam (Eloxiject) 5 mg/mlHenry Schein11695-6925-1Nabyty od Northwestern University CCM
D-lucyferyna Firefly, monohydrat soli sodowejGoldbioLUCNA
IVIS System obrazowania widmaPerkinElmer
Cauery, długopis chirurgicznyBovie Medical CorporationAA01
CD3 i epsilon; przeciwciało (klon 2GV6)Ventana790-4341
CaliperFisher Scientific14-648-17
Przeciwciało przeciwko receptorowi androgenowemuThermo ScientificRB-9030-P11:500 rozcieńczenie barwienia
Przeciwciało synaptofizyny (klon Z66)Life Technologies18-01301:200 rozcieńczenie barwienia

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306 (11), 1205-1214 (2011).
  3. Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97 (20), 1525-1532 (2005).
  4. Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27 (24), 3916-3922 (2009).
  5. Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. , (2015).
  6. Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110 (2), 213-228 (2014).
  7. Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368 (5), 436-445 (2013).
  8. Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352 (2), 154-164 (2005).
  9. Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97 (5), 963-968 (2006).
  10. Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9 (9), e107516(2014).
  11. Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26 (2), 242-245 (2008).
  12. Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376 (9747), 1147-1154 (2010).
  13. Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13 (10), 983-992 (2012).
  14. Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363 (5), 411-422 (2010).
  15. Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369 (3), 213-223 (2013).
  16. Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66 (5), 815-825 (2014).
  17. Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367 (13), 1187-1197 (2012).
  18. Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63 (5), 723-726 (1991).
  19. Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34 (3), 357-360 (1995).
  20. Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13 (3), 627-630 (1993).
  21. Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13 (2), 209-222 (1994).
  22. Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3 (3), 413-422 (1993).
  23. Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10 (3), 229-243 (1991).
  24. Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15 (7), 700-712 (2014).
  25. Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366 (26), 2443-2454 (2012).
  26. Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
  27. Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5 (2), 207(2004).
  28. Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55 (4-5), 547-555 (2011).
  29. Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13 (2), 339-347 (2015).
  30. Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87 (3-4), 225-232 (1999).
  31. Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29 (17), 2477-2487 (2010).
  32. Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65 (24), 11565-11571 (2005).
  33. Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72 (6), 587-591 (2012).
  34. Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
  35. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
  36. Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1 (10), 609-613 (2014).
  37. Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41 (2), 87-93 (2000).
  38. Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
  39. Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1 (6), 617-628 (2010).
  40. Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
  41. McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12 (12), 897-906 (1988).
  42. Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
  43. Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11 (2), 225-254 (2004).
  44. Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. J Biol Chem. 280 (43), 36442-36451 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ortotopowy rak prostatyrak zale ny od androgen wobrazowanie bioluminescencyjne i fluorescencyjnewstrzykni cie do prostatyanaliza obj to ci guzaocena nacieku immunologicznegoprocedura chirurgicznej kastracjiregresja i nawr t guza
Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.