Artykuł metodologiczny

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57305

⸱

20 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, NorthShore University HealthSystem, 2Midwestern University/Chicago College of Osteopathic Medicine, 3Independent Contractor

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę dla ludzkiego modelu in vitro uszkodzenia rozciągającego w formacie 96-dołkowym w skali czasowej istotnej dla traumy uderzeniowej. Obejmuje to metody wytwarzania rozciągliwych płytek, ilościowego określania mechanicznej zniewagi, hodowli i uszkadzania komórek, obrazowania i analizy wysokiej zawartości w celu ilościowego określenia urazu.

Streszczenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) jest poważnym wyzwaniem klinicznym o wysokiej zachorowalności i śmiertelności. Pomimo dziesięcioleci badań przedklinicznych nie opracowano żadnych sprawdzonych metod leczenia TBI. W artykule przedstawiono nowatorską metodę przedklinicznych badań neurotraumatycznych, która ma na celu uzupełnienie istniejących modeli przedklinicznych. Wprowadza ludzką patofizjologię poprzez wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSCN). Osiąga czas trwania impulsu obciążającego podobny do czasu trwania obciążenia w klinicznym zamkniętym urazie głowy. Wykorzystuje format 96 dołków, który ułatwia eksperymenty o wysokiej przepustowości i efektywnie wykorzystuje drogie komórki i odczynniki do hodowli. Membrany silikonowe są najpierw poddawane obróbce w celu usunięcia neurotoksycznego, nieutwardzonego polimeru, a następnie łączone z komercyjnymi korpusami płytek 96-dołkowych w celu utworzenia rozciągliwych płytek 96-dołkowych. Specjalnie skonstruowane urządzenie służy do wciskania niektórych lub wszystkich dna studni od spodu, wywołując równoosiowe naprężenia mechaniczne, które mechanicznie uszkadzają komórki w hodowli w studzienkach. Zależność między głębokością wgłębienia a odkształceniem mechanicznym jest określana empirycznie za pomocą szybkiego filmowania dna studni podczas wgłębienia. Komórki, w tym hiPSCN, mogą być hodowane na tych błonach silikonowych przy użyciu zmodyfikowanych wersji konwencjonalnych protokołów hodowli komórkowych. Fluorescencyjne obrazy mikroskopowe kultur komórkowych są pozyskiwane i analizowane po urazie w sposób półautomatyczny w celu ilościowego określenia poziomu uszkodzenia w każdym dołku. Prezentowany model jest zoptymalizowany pod kątem hiPSCN, ale teoretycznie może być stosowany do innych typów komórek.

Wprowadzenie

TBI jest główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności w Stanach Zjednoczonych, powodując około 52 000 zgonów i 275 000 hospitalizacji rocznie1. Przeprowadzono ponad 30 badań klinicznych nad potencjalnymi terapiami TBI, ale nie przeprowadzono ani jednego sukcesu2. Ta jednolita awaria sugeruje, że procesy specyficzne dla człowieka oddzielają ludzkie TBI od patofizjologii obserwowanej w powszechnie stosowanych przedklinicznych modelach gryzoni

.

Pojawienie się hiPSCN stworzyło możliwość badania neurotraumy w ludzkim modelu in vitro. Badania przesiewowe leków z wykorzystaniem modeli opartych na hiPSCN mogą dostarczyć wyników, które są bardziej predykcyjne dla sukcesu klinicznego niż modele wykorzystujące komórki gryzoni. Ponadto hiPSCN mogą być genetycznie modyfikowane w celu wyizolowania i zbadania wpływu poszczególnych wariantów genetycznych człowieka na patologię3.

Metoda opisana w tym manuskrypcie ma na celu wykorzystanie unikalnych zalet modelowania chorób opartych na hiPSCN do neurotraumy. Modele urazów neurourazowych metodą rozciągania in vitro są dobrze znane4,5,6 z pierwotnymi komórkami gryzoni i ludzkimi liniami komórkowymi raka nerwowego. Większość z tych modeli generuje rozciągliwość poprzez pneumatyczne obciążenie membrany silikonowej. To podejście jest skuteczne w formacie pojedynczego dołka, ale okazało się trudne do skalowania do formatu wielodołkowego7. W rezultacie, nigdy nie było wysokoprzepustowego badania przesiewowego dla środków do leczenia uszkodzonych neuronów rozciągających.

W tym modelu membrana rozciąga się z powodu wgłębienia od spodu za pomocą sztywnego wgłębnika. Wielokrotnie wykazano, że podejście to generuje klinicznie istotną patologię in vitro w systemach jednostudziennych8,9,10. Nasze ostatnie prace wykazały, że łatwo skaluje się do formatu 96 dołków, zachowując czas trwania impulsu rzędu dziesiątek milisekund11, który jest dziedziną czasu zdarzeń zamkniętego uderzenia głową12,13.

Podsumowując, kluczowymi zaletami tego modelu leczenia in vitro są format 96 dołków, użycie hiPSCN oraz klinicznie istotna dziedzina czasowa zniewagi.

Protokół

1. Detoksykacja silikonu

  1. Za pomocą żyletki i szablonu akrylowego wyciąć z membran silikonowych o grubości 254 µm i wymiarach 30,48 cm x 30,48 cm prostokąty o wymiarach 7,5 cm x 11 cm. Z jednego arkusza można przygotować 10 prostokątnych membran. Zachować papier dołączony do silikonu.
  2. Umieścić membrany w kuwecie z wodą dejonizowaną (DI) i detergentem do szkła laboratoryjnego. Każdą z membran szorować energicznie opuszkami palców w rękawiczkach przez co najmniej 20 s lub do momentu powstania piany.
  3. Płukać membrany pod bieżącą wodą DI, aż do widocznego usunięcia spienionego detergentu. Rozłożyć membrany na papierze (z opakowania) i wysterylizować w autoklawie w cyklu grawitacyjnym.
  4. Każdą membranę silikonową moczyć w 250 mL 70% etanolu na wstrząsarze orbitalnym przy 60 rpm przez 24 h. Użyć pojemnika wykonanego z materiału, który nie reaguje z etanolem, np. z polipropylenu.
    1. Jeśli w jednym pojemniku umieszczono więcej niż jedną membranę lub jeśli membrany przywierają do dna, oddzielić je od siebie za pomocą plastikowych końcówek do pipet i statywów na końcówki.
  5. Przenieść membrany silikonowe (używając rękawiczek) do 250 mL wody DI na membranę i moczyć na wstrząsarze orbitalnym przez 48 h przy 60 rpm.
  6. Ponownie rozłożyć membrany na papierze i umieścić w suszarce do szkła w temperaturze 93 °C na 4 h.
  7. Przechowywać membrany na papierze, w czystym i suchym miejscu, przykryte kolejnym arkuszem papieru w celu ochrony przed kurzem.

2. Wykonanie płytki

  1. Poddać górną część płytki 96-dołkowej działaniu plazmy za pomocą oczyszczacza plazmowego o mocy 200 W (patrz Tabela materiałów) przez 60 s przy wysokiej mocy, umieszczając płytkę w oczyszczaczu plazmowym stroną dolną do góry. Sprawdzić, czy przez okno komory widoczna jest fioletowa poświata, co wskazuje na utworzenie skutecznej plazmy. Ta technika wiązania została zaadaptowana z pracy Sunkara et al.14
  2. W ciągu 60 s umieścić górną część płytki w 200 mL 1,5% (3-aminopropylotrietoksysilanu) (APTES) w wodzie DI na 20 min, stroną dolną do dołu. Roztwór ten jest niestabilny: należy go przygotować nie wcześniej niż 60 s przed wprowadzeniem płytki.
    OSTROŻNIE: Prace z APTES należy prowadzić w dygestorium.
  3. Poddać wyekstrahowaną membranę silikonową działaniu plazmy w oczyszczaczu plazmowym przez 60 s przy wysokiej mocy. Zaplanować czas obróbki plazmowej tak, aby zakończyła się ona nie wcześniej niż 5 min przed końcem 20-minutowego okresu opisanego w kroku 2.2.
  4. Używając pęsety, umieścić poddaną działaniu plazmy membranę na prostokątnym kawałku papieru pergaminowego o wymiarach 7,5 x 11 cm2. Wyrównać aluminiowy blok o wymiarach 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm w dolnej części zacisku do produkcji płytek. Za pomocą pęsety wyrównać membranę silikonową i papier pergaminowy na aluminiowym bloku.
    UWAGA: Pliki projektowe CAD dla tego urządzenia znajdują się w materiałach dodatkowych jako uzupełniający plik kodu „Press Die - Generic 3D.STEP”. Powiązana lista materiałów znajduje się w Uzupełniającej Tabeli 1: Custom Built Devices - BOM.xlsx.
  5. Wyjąć górne części płytek z kąpieli APTES i strząsnąć nadmiar roztworu. Zanurzyć w 200 mL kąpieli z wodą DI na 5 s i strząsnąć nadmiar wody. Zanurzyć w innej 200 mL kąpieli z wodą DI na 5 s i strząsnąć nadmiar wody. Wymienić wodę w tych kąpielach przed zanurzeniem kolejnej górnej części płytki.
  6. Użyć sprężonego powietrza, aby całkowicie wysuszyć górną część płytki.
  7. Umieścić górną część płytki w górnej części zacisku do produkcji płytek. Delikatnie zamknąć zacisk do produkcji płytek, aby docisnąć górną część płytki do silikonu. Pozostawić w zacisku przez co najmniej 1 h.
  8. Pozostawić płytkę do utwardzenia na 24 h w temperaturze pokojowej przed użyciem, chroniąc ją przed zapyleniem.

3. Rozciąganie płytki

  1. Oczyść indentory.
    UWAGA: Patrz Rycina uzupełniająca 1.
    1. Przygotować sonicator kąpielowy o mocy 60 W z wodą dejonizowaną w temperaturze pokojowej.
    2. Umieść blok z wgłębnikami nad kąpielą ultradźwiękową w pozycji odwróconej, tak aby do kąpieli zanurzone były jedynie wierzchołki wgłębników, na głębokość co najmniej 1 mm. Poddaj wgłębniki działaniu ultradźwięków przez 8 min przy częstotliwości 42 kHz.
    3. Osusz wgłębniki za pomocą sprężonego powietrza.
  2. Wyrównaj blok indykatora.
    1. Ustaw kamerę z podglądem na żywo nad urządzeniem do rozciągania w taki sposób, aby była skierowana w dół na matrycę wgniotników. Skup ostrość na wierzchołkach wgniotników.
      UWAGA: Układ opisany w sekcji 4, "Charakterystyka rozciągania błony," jest jedną z możliwych konfiguracji kamery dla tego zadania.
    2. Zamocuj płytkę na stoliku urządzenia do wywoływania urazów za pomocą zacisków stolika (Rysunek 1) i umieścić nad urządzeniem lampę kopułową.
      UWAGA: Patrz na Tabela materiałów do oprogramowania sterującego instrumentem.
    3. Uruchom oprogramowanie sterujące urządzeniem, klikając ikonę oprogramowania na pulpicie komputera sterującego urządzeniem do wywoływania urazu. Uruchom "in_vitro_neurotrauma.lvproj" projekt, klikając go w oknie uruchamiania. Z okna projektu uruchom wirtualne instrumenty (VI) sterowania ruchem i śledzenia pozycji, nazwane odpowiednio „motion_control.vi” i „position_tracker.vi”, poprzez dwukrotne kliknięcie w nie.
    4. Zamknij klatkę otaczającą urządzenie do zadawania urazów. Naciśnij przycisk ze strzałką w lewym górnym rogu VI sterowania ruchem (motion control VI), aby uruchomić VI, a następnie kliknij „Near Bottom”, aby obniżyć stół do odległości 2 mm od wgłębiaczy. Kliknij przycisk „Stop”, aby zatrzymać działanie VI.
      Ostrzeżenie: Należy trzymać ręce z dala od noszy podczas manipulowania kamerą wewnątrz klatki. Klatka powinna być wyposażona w przełącznik drzwiowy, który dostarcza zasilanie do urządzenia rozciągającego wyłącznie wtedy, gdy drzwi klatki są zamknięte.
    5. W oknie projektu kliknij prawym przyciskiem myszy na „Axis 1”. Kliknij „Interactive Test Panel”. W otwierającym się oknie ustaw wielkość kroku na 50 µm wprowadzając wartość „500” w polu „Target Position”.
    6. Wielokrotnie klikaj zielony przycisk „go” znajdujący się na dole okna „Interactive Test Panel”, aż płytka po raz pierwszy zetknie się z dowolnym wgłębieniem. Sprawdź kontakt na obrazie z kamery wyświetlanym w czasie rzeczywistym. Zanotuj pozycję pionową stolika wskazaną w górnym lewym rogu okna „Interactive Test Panel”; jest to pozycja pierwszego kontaktu.
    7. Obniżyć dalej (zgodnie z opisem w kroku 3.2.6), aż każda studnia zetknie się z wgłębnikami. W razie potrzeby przesunąć kamerę, aby widzieć całą płytkę, a następnie przesuwać stół w górę (poprzez określenie ujemnej „Pozycji docelowej” – Target Position) i w dół. Zanotować pionową pozycję stołu wyświetlaną w lewym górnym rogu okna w momencie, gdy wszystkie słupki są w kontakcie (jest to pozycja pełnego kontaktu).
    8. Należy zwrócić uwagę na różnicę między pozycją pierwszego kontaktu a pozycją pełnego kontaktu. Zamknij „Interaktywny panel testowy” (Interactive Test Panel). Uruchom „VI sterowania ruchem” (motion control VI) (patrz krok 3.2.4) i kliknij „Top”, aby podnieść stoлик. Zatrzymaj działanie VI sterowania ruchem za pomocą przycisku „Stop”.
    9. Gdy stoleik osiągnie najwyższą pozycję, należy otworzyć drzwiczki, aby dezaktywować urządzenie. Wyregulować śruby ustalające znajdujące się w narożnikach bloku indentora. Poluzować śrubę ustalającą w narożniku, który nawiązał kontakt jako pierwszy, aby go obniżyć, a następnie dokręcić przeciwległą śrubę, aby podnieść narożnik, który nawiązał kontakt jako ostatni.
    10. Powtórz proces opuszczania stolika do momentu zetknięcia się płytki z wgłębnikami, sprawdzając obrazy kontaktu pod kątem przechyłu, a następnie podnieś stolik i wyreguluj blok wgłębników (krok 3.2.9). Po wyrównaniu stolika i bloku wszystkie wgłębniki zetkną się jednocześnie.
    11. Otwórz drzwiczki, aby dezaktywować urządzenie. Włóż śruby mocujące do odpowiadających im otworów w bloku indentora i dokręć je. Potwierdź, że blok jest wypoziomowany po zamontowaniu śrub mocujących (kroki 3.2.4-3.2.8). Odnotuj pozycję stolika raportowaną przez „Interactive Test Panel” w momencie kontaktu płytki. Będzie ona pozycją zerową dla eksperymentów z indentacji.
  3. Nasmaruj wgłębniki.
    1. Jeśli blok indentora został właśnie przygotowany i nie został jeszcze nasmarowany, należy oczyścić twardą podkładkę gumową (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) oraz miękką podkładkę z pianki gumowej o zamkniętych komórkach (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) za pomocą chusteczki laboratoryjnej nasączonej etanolem. Pozostawić je do wyschnięcia.
    2. Nasącz chusteczkę laboratoryjną olejem kukurydzianym i rozprowadź go na gumowej podkładce, aż uzyska ona matowy połysk.
    3. Umieść gąbkową podkładkę na twardej gumowej podkładce, aby przenieść olej na podkładkę gąbkową. Połóż aluminiową płytkę o wymiarach 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm na gąbkowej podkładce i obciąż ją balastem o masie około 360 g (np., 6 probówek stożkowych wypełnionych każda 45 ml wody), aby zapewnić spójny transfer oleju z twardej gumowej podkładki na podkładkę piankową. Odczekać 10 s, aż olej przeniesie się na piankową podkładkę gumową.
    4. Przenieś piankową podkładkę na matrycę wgłębników. Umieść na niej aluminiową płytę oraz obciążnik balastowy, aby zapewnić jednorodne przeniesienie oleju na końcówki wgłębników. Odczekaj 10 s, aż olej przeniesie się na wgłębniki.
    5. Jeśli od czasu pierwszego ustawienia i nasmarowania bloku indentora nie naciągnięto żadnej płytki, przed rozpoczęciem eksperymentu należy naciągnąć płytkę testową.
      Uwaga: zapobiegnie to wystąpieniu niespójności między pierwszym a kolejnymi rozciąganiami, które mogłyby zakłócić przebieg eksperymentu. W przypadku kolejnych rozciągań należy powtórzyć jedynie kroki 3.3.2–3.3.5 przed każdym rozciąganiem.
  4. Rozciągnij płytkę.
    1. Nasmaruj wgłębiacze zgodnie z opisem w kroku 3.3.
    2. Zabeziecz płytkę na stoliku urządzenia do zadawania urazów za pomocą zacisków stolika. Jeśli wymagana jest sterylność, dostosuj położenie pokrywki tak, aby zabezpieczyć płytkę bez wystawiania powierzchni hodowli na działanie powietrza pokojowego.
    3. Obniżyć stolik do pozycji zerowej za pomocą '„motion control VI” (patrz kroki 3.2.4–3.2.6); pozycja zerowa jest określana podczas kroku 3.2.
    4. Zmień nazwę pliku w "ścieżka pliku" pole w „position tracking VI” unikalną nazwą pliku, a następnie uruchom program za pomocą przycisku ze „strzałką” w lewym górnym rogu tego okna.
    5. Ustaw głębokość i czas trwania wciśnięcia (zazwyczaj odpowiednio 1–4 mm i 30 ms, maksymalna głębokość 5 mm, minimalny czas trwania 15 ms) w polach „Injury (mm)” oraz „Injury Duration (ms)” w panelu sterowania ruchem („movement control panel VI”), klikając w pola i wpisując pożądane wartości.
    6. Uruchom panel sterowania ruchem „movement control panel VI” i kliknij „Injure”, aby wbić płytkę.
    7. Przesuń stolik do górnej granicy zakresu ruchu, klikając przycisk „Top”. Następnie zatrzymaj instrument VI za pomocą przycisku „Stop” i dezaktywuj urządzenie do zadawania urazów, otwierając drzwiczki.
    8. Sprawdź historię przemieszczenia stolika wyświetloną w module „position tracker VI”, aby potwierdzić, że zastosowano określone maksymalne przemieszczenie. Kliknij prawym przyciskiem myszy na wykresie i wybierz opcję „export to Excel”. Kliknij „File| Save as”, aby zapisać dane.

4. Charakterystyka rozciągania błony

  1. Pomaluj na biało wgłębienie na górnej części każdego indentora, aby zapewnić tło o wysokim kontraście dla wideowizualizacji wysokiej rozdzielczości czasowej.
    Uwaga: Nie maluj krawędzi indentorów w miejscach, w których stykają się one z płytkami.
  2. Wydrukuj w technologii 3D z polikwasu mlekowego (PLA) lub wykonaj w inny sposób cylindryczną stempelkę do robienia kropki w każdej studni. Cylinder powinien mieć średnicę 5,9 mm i wysokość 12,2 mm, z centralnie umieszczonym na górze cylindrycznym wypustkiem o średnicy 1,5 mm i wysokości 1,0 mm.
    UWAGA: Model do druku 3D „stamp.STL” jest dostępny jako plik uzupełniający.
  3. Poddaj płytkę traktowaniu plazmą w pozycji poziomej, aby aktywować silikonową powierzchnię hodowli komórkowej w studniach przez 60 s, zgodnie z opisem w kroku 2.1.
  4. Umieść płytkę na gumowej podkładce lub innej miękkiej powierzchni. Nasącz mały wypustek stempelki (patrz krok 4.2) tuszem z permanentnego markera. Włóż stempelkę do testowanej studni i lekko uciśnij, aby zapewnić dobry transfer tuszu. Nasącz stempelkę przed każdą studnią.
  5. Wyrównaj blok indentorów i nasmaruj indentory urządzenia do zadawania obrażeń (patrz kroki 3.2-3.3). Zamocuj płytkę na stole urządzenia do zadawania obrażeń. Umieść jasne, rozproszone światło osiowe nad urządzeniem.
  6. Ustaw kamerę wysokich prędkości na wysięgniku nad urządzeniem do zadawania obrażeń, skierowaną pionowo w dół, ustawiając obiektyw na najmniejszą wartość przysłony (f-stop), a następnie włącz ją. Uruchom oprogramowanie kamery na komputerze podłączonym do urządzenia. W menu rozwijanym częstotliwości klatek wybierz 2 000 klatek na sekundę, a w menu rozwijanym migawki wybierz najkrótszy czas naświetlania, który zapewnia obrazy o wysokim kontraście. Wycentruj obraz nad zaznaczonymi kropkami w studniach.
    1. Ustaw kamerę tak, aby pole widzenia obejmowało 12 studni w siatce 3 x 4.
      UWAGA: To pole widzenia stanowi optymalny kompromis między przepustowością a rozdzielczością dla obrazu 1 280 × 1 024.
  7. Obniż płytkę do punktu zerowego (patrz kroki 3.2.4-3.2.6). Jednokrotnie kliknij przycisk nagrywania w oprogramowaniu kamery, tak aby pojawił się napis „trigger in”. Uruchom moduą VI trackera pozycji (krok 3.4.4).
  8. Włącz jasne, rozproszone światło osiowe. Wykonaj indentację płytki zgodnie z opisem w kroku 3.4.6.
  9. Wyłącz jasne, rozproszone światło osiowe.
  10. Na komputerze sterującym kamerą znajdź okno nagrania o długości 30-40 ms, w którym nastąpiła indentacja: przesuń strzałki początku i końca na pasku odtwarzania wideo wysokich prędkości w oprogramowaniu kamery. Kliknij Zapisz, wprowadź nazwę w polu „File Name”, wybierz „TIFF” w polu „Format” i kliknij „Save”.
    1. Przejrzyj pliki .TIF w poszukiwaniu obrazów stanu najmniej rozciągniętego (początkowego) oraz najbardziej rozciągniętego (szczytowej indentacji).
    2. Aby zmierzyć wysokość i szerokość kropek na obu obrazach, użyj programu Fiji, aby otworzyć obrazy najmniejszego i szczytowego rozciągnięcia obok siebie. Używając domyślnego prostokątnego narzędzia zaznaczania, kliknij i przeciągnij, aby narysować ramkę wokół kropki na obrazie najmniejszego rozciągnięcia. Zmierz wysokość i szerokość za pomocą funkcji „Analyze| Measure”.
    3. Powtórz czynność dla kropki w tej samej studni na obrazie szczytowego rozciągnięcia. Powtórz dla pozostałych studni.
  11. Oblicz odkształcenie Lagrange'a w kierunkach x i y w następujący sposób:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    UWAGA: W powyższych wzorach Exx to odkształcenie Lagrange'a w kierunku x, Eyy to odkształcenie Lagrange'a w kierunku y, X to szerokość kropki, Y to wysokość kropki, f oznacza obraz końcowy (tj. obraz szczytowej indentacji), a i oznacza obraz początkowy (tj. obraz przed indentacją). Oblicz średnią z dwóch wartości, aby wyznaczyć odkształcenie w danej studni.

5. Wysiewanie hodowlanych komórek

  1. Autoklawować pojemniki i obciążniki, które będą wykorzystywane do sterylizacji.
  2. Poddać płytki z silikonowym dnem obróbce plazmowej w pozycji odwróconej do góry (stroną dnem do dołu) przez 60 s (patrz krok 2.1). Natychmiast zanurzyć płytki w sterylnych pojemnikach z 70% etanolem na 15 min.
  3. Zanurzyć płytki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w oddzielnych sterylnych pojemnikach na 30 min.
  4. Odssać PBS z dołków. Suszyć tylko jedną płytkę na raz, aby zapobiec utraceniu efektu obróbki plazmowej w dołkach.
    Uwaga: Płytki z silikonowym dnem zapewniają mniejszą odpowiedź dotykową niż płytki sztywne podczas pipetowania i częściej powodują blokowanie końcówki pipety.
  5. Do wysterylizowanych płytek dodać 100 µL 0,1 mg/mL poli-L-ornityny (PLO) na dołek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  6. Przepłukać dołki dwukrotnie 100 µL sterylnego PBS, pozostawiając drugą porcję płuczki w dołkach do momentu przygotowania zawiesiny komórkowej.
  7. Wyjąć fiolkę z hiPSCN z przechowywania w ciekłym azocie, używając rękawic ochronnych, i umieścić na suchym lodzie. Szybko przenieść fiolkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i rozmrażać przez dokładnie 3 min. Nie obracać fiolki ruchem wirowym.
  8. W komorze sterylnej delikatnie przenieść zawartość fiolki do probówki stożkowej o pojemności 50 mL, używając pipety serologicznej 1 mL.
  9. Przepłukać pustą fiolkę kriogeniczną 1 mL pełnej pożywki podtrzymującej w temperaturze pokojowej (baza pożywki + suplement).
  10. Przenieść 1 mL pożywki do probówki 50 mL kroplami, z prędkością około jednej kropli na sekundę. Podczas dodawania delikatnie obracać probówkę ruchem wirowym. Dodać 8 mL pełnej pożywki podtrzymującej w temperaturze pokojowej do probówki 50 mL z prędkością około 2 kropli/s.
  11. Zakręcić probówkę i odwrócić 2-3 razy. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Obliczyć objętość dodatkowej pożywki wymaganej do rozcieńczenia zawiesiny komórkowej do stężenia 225 000 komórek/mL.
  12. Delikatnie pipetować obliczoną wcześniej ilość pożywki do probówki z zawiesiną komórkową, używając pipety serologicznej 25 mL.
  13. Dodać 10 µL roztworu stokowego lamininy (1 mg/mL) na 1 mL zawiesiny komórkowej za pomocą mikropipety 1 000 µL, aby uzyskać stężenie 10 µg/mL lamininy w zawiesinie komórkowej. Raz zassać i wypuścić ciecz końcówką używaną do lamininy, następnie zakręcić probówkę i raz ją odwrócić.
  14. Odssać PBS z płytek, zajmując się każdą płytką po kolei. Użyć pipety wielokanałowej, aby dodać 100 µL zawiesiny komórkowej hiPSCN do każdego dołka. Dołki mają powierzchnię hodowlaną 0,33 cm2, zatem gęstość komórek na powierzchnię wynosi 67 500 komórek/cm2.
  15. Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej na 15 min po wysianiu, aby wspomóc adhezję. Aby uniknąć wibracji wentylatora w sterylnej komorze hodowlanej, umieścić przykryte płytki na blacie laboratoryjnym. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
  16. Przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki po 24 h, napełniając dołki 200 µL pełnej pożywki podtrzymującej. Przeprowadzać częściową wymianę pożywki (100 µL/dołek) co 2-3 dni.

6. Zadawanie obrażeń hodowlom

  1. W wyrównać blok wciskarzy i wyznaczyć pozycję zero zgodnie z opisem w kroku 3.2. Nasmarować wciskarze zgodnie z opisem w kroku 3.3.
  2. Ustawić nazwę pliku dla historii przemieszczenia w „position tracker VI” (krok 3.4.4). Ustawić parametry urazu w „motion control VI” (krok 3.4.5).
  3. Wyjąć płytkę przeznaczoną do urazu z inkubatora i zamocować ją w uchwycie stołu. Dostosować położenie pokrywy, aby zabezpieczyć płytkę, nie wystawiając kultur na działanie powietrza pokojowego.
  4. Obniżyć płytkę do punktu zero (kroki 3.2.4-3.2.6) za pomocą „motion control VI”. Uruchomić „position tracker VI” (krok 3.4.4).
  5. Użyć „motion control VI” do wykonania wciśnięcia płytki (zgodnie z opisem w kroku 3.4.6). W przypadku rozciągnięć pozornych pominąć tylko ten krok.
  6. Cofnąć stół do górnego zakresu ruchu (patrz krok 3.4.7). Przenieść płytkę z powrotem do inkubatora.
  7. Przejrzeć i zapisać przebieg przemieszczenia (zgodnie z krokiem 3.4.8).

7. Mikroskopia

  1. Przygotować 10-krotny roztwór barwiący zawierający 2 µg/mL Hoechst 33342 oraz 5 µg/mL Calcein AM w pożywce podtrzymującej.
  2. Zabarwić każdą studnię, dodając 20 µL 10-krotnego roztworu barwiącego.
  3. Inkubować z barwnikiem przez 15 min w temperaturze 37 °C.
  4. Wykonać obrazy fluorescencyjne w szerokim polu. Do obrazowania sygnałów Calcein AM i Hoechst 33342 użyć odpowiednio konwencjonalnych zestawów filtrów FITC i DAPI. Jeśli sekwencja obrazowania wielu studni zajmie więcej niż 10 min, płytkę należy umieścić w inkubatorze stołowym, aby zachować żywotność kultur.
    UWAGA: Obiektyw 10X o aperturze numerycznej 0,30 NA zapewnia wystarczającą szczegółowość do oceny żywotności i morfologii komórek. Dostosować wzmocnienie sygnału, aby zapewnić dobrą wizualizację neurytów, nawet jeśli spowoduje to częściowe nasycenie znacznie jaśniejszego ciała komórki.
  5. Przeprowadzić segmentację obrazów żywych komórek w zielonym kanale Calcein AM, aby zidentyfikować ciała komórkowe i neuryty. W celu pomocniczej identyfikacji ciał komórkowych wykorzystać obrazy jąder w niebieskim kanale Hoechst 33342.

Wyniki

Urządzenie rozciągające umożliwia powtarzalne przemieszczanie stolika z czasem trwania impulsu tak krótkim jak 10-15 ms, w zależności od amplitudy impulsu (Rysunek 2A). Amplitudy impulsów są wysoce powtarzalne, jednak czas trwania impulsu różni się o około 1 ms między powtórzeniami. Rzeczywista amplituda impulsu odbiega od amplitudy zadanej, gdy załadowana jest duża liczba studzienek, a zadana amplituda jest wysoka (patrz Rysunek 2B). Wraz ze zwiększaniem amplitudy przemieszczenia stolika powyżej 3 mm, rzeczywista amplituda przemieszczenia w coraz większym stopniu odbiega od amplitudy zadanej (patrz Rysunek 2B). Staranne wyrównanie bloku wsporników eliminuje jakąkolwiek tendencję zmian odkształcenia błony w rzędach lub kolumnach (Rysunek 2C). Przy zadanej amplitudzie przemieszczenia stolika 3,5 mm (rzeczywista amplituda przemieszczenia 3,3 mm) przy zagłębieniu 52 studzienek, średnie odkształcenie Lagrange'a we wszystkich lokalizacjach studzienek wynosiło 0,451 (odchylenie standardowe średnich dla wszystkich lokalizacji = 0,051, średnia odchyleń standardowych dla wszystkich lokalizacji = 0,065, n = 5 pomiarów na studzienkę). Wyniki te przedstawiono tutaj dla kompletności, mimo że niektóre z nich zostały już opisane11.

Optymalna, nieuszkodzona hodowla będzie zawierać niewiele lub żadnych skupisk liczących więcej niż 5 komórek. Neuryty będą pojedyncze, długie, cienkie i zakrzywione, bez widocznych oznak napięcia lub tworzenia się grudek (Rysunek 3A). W idealnych warunkach żywotność hodowli powinna być zbliżona do wartości określonej w arkuszu danych producenta (zazwyczaj 60-70%), a hodowle na silikonie powinny przypominać te utrzymywane na konwencjonalnych sztywnych podłożach hodowlanych (Rysunek 3B). Neuryty mogą być widoczne lub niepodatne na obserwację w mikroskopie świetlnym przy małym powiększeniu. Zarówno stężenie lamininy, jak i gęstość komórek wpływają na hodowle w stanie wyjściowym oraz po uszkodzeniu. Zwiększenie gęstości komórek zwiększyło liczbę i rozmiar skupisk tworzących się w hodowli. Zwiększenie stężenia lamininy często przeciwdziałało temu efektowi (Rysunek 3A). Jednakże zbyt duże zwiększenie stężenia lamininy osłabiło wrażliwość hodowli na uszkodzenia (Rysunek 4). Optymalne stężenie lamininy dla hodowli nieuszkodzonych wynosiło 50 µg/mL lamininy (Rysunek 3), ale optymalna różnica między populacją kontrolną (sham) a populacją z uszkodzeniem rozciąganiem została uzyskana przy stężeniu 10 µg/mL lamininy (Rysunek 4). Wyższe stężenia lamininy zmniejszały wrażliwość hodowli na uszkodzenia w krótkich odstępach czasu (Rysunek 4), ale poprawiały również bazową żywotność komórek w dłuższych odstępach czasu (np. 7 dni). Podsumowując, warto zoptymalizować stężenie lamininy dla każdego scenariusza eksperymentalnego.

Odkształcenie błony, czas obrazowania po urazie, stężenie lamininy oraz gęstość komórek wywarły wysoce istotny statystycznie główny efekt na długość neurytów na komórkę (ANOVA, p <0,001). Efekt odkształcenia błony na długość neurytów na komórkę wykazał wysoce istotne statystycznie interakcje z czasem obrazowania po urazie oraz stężeniem lamininy (ANOVA, p <0,001) oraz istotną statystycznie interakcję z gęstością komórek (ANOVA, p <0,05). Podobnie odkształcenie błony, czas obrazowania po urazie, gęstość komórek oraz stężenie lamininy wywarły wysoce istotny statystycznie główny efekt na żywotność komórek (ANOVA, p <0,001). Efekt odkształcenia błony na żywotność komórek wykazał wysoce istotną statystycznie interakcję z czasem obrazowania po urazie (ANOVA, p <0,001) oraz istotną statystycznie interakcję z gęstością komórek (ANOVA, p <0,05). Wyniki te dowodzą, że czas, gęstość komórek i stężenie lamininy wywierają istotny wpływ na zależność między zastosowanym bodźcem urazowym a wynikami eksperymentu, w związku z czym każdy z tych parametrów powinien zostać starannie zoptymalizowany.

Niska żywotność komórek i obecność perłowatych neurytów, wraz z zahamowanym wzrostem neurytów, wskazują na toksyczne warunki hodowli, które mogą wynikać z niewłaściwego przygotowania silikonu. Pominięcie lub skrócenie czasu moczenia w wodzie bądź suszenia w piecu może spowodować pozostanie w membranie odpowiednio wchłoniętego etanolu lub wody, które mogą dyfundować do pożywki i wywoływać stres komórkowy. W kulturach z silnym uszkodzeniem zaobserwuje się obniżoną żywotność komórek, skrócenie lub brak neurytów, neuryty perłowate oraz neuryty wyglądające na napięte lub rozciągnięte. Uszkodzenie może indukować agregację w kulturach komórkowych, które przed uszkodzeniem były dobrze rozproszone. Duże skupiska komórek mogą utrudniać analizę morfologiczną. W przypadku analizy morfologicznej poziom uszkodzenia powinien być tak dobrany, aby wystąpiły zauważalne zmiany, ale komórki nadal były obecne wraz z częścią neurytów.

figure-results-1
Rysunek 1: Opisany schemat urządzenia do wywoływania urazów. (A) widok z góry, (B) widok izometryczny, (C) widok z przodu, (D) widok z prawej strony. Pasek skali odnosi się do widoków ortograficznych (A, B i D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Kinematyka bodźca mechanicznego. (A) Historia przemieszczeń platformy podczas 5 impulsów dla zakresu określonych amplitud (amplitudy określone są w legendzie) w przypadku niezaładowanych studni. (B) Historia przemieszczeń platformy podczas 10 impulsów dla zakresu określonych amplitud (amplitudy określone są w legendzie) przy załadowaniu 52 studni. (C) Średnie odkształcenie w każdej studni przy amplitudzie przemieszczenia platformy 3,3 mm (n = 5 pomiarów na studnię, średni błąd standardowy na studnię = 0,029). Należy zauważyć, że C4-F4 i C9-F9 to kontrolne studnie nierozciągane. Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy Sherman et al.11 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Optymalizacja warunków hodowli na silikonie. (A) Wpływ zmiennej gęstości komórek i stężenia lamininy na hodowle hiPSCN na silikonie. Agregacja komórek zwiększa się wraz ze wzrostem gęstości komórek i spadkiem stężenia lamininy. Gęstość komórek i stężenie lamininy muszą zostać zoptymalizowane, aby uzyskać kultury monodyspersyjne. Kultury monodyspersyjne są mniej podatne na artefakty podczas kwantyfikacji. Należy zauważyć, że zakres dynamiczny został dostosowany w celu optymalizacji wizualizacji neurytów. W konsekwencji znacznie jaśniejsze somaty są nasycone. Takiej prezentacji preferuje się nad alternatywę w postaci optymalizacji zakresu dynamicznego względem somatów, co czyni znacznie ciemniejsze neuryty niemal niewidocznymi. Warunki zaznaczone czerwonym kwadratem uznano za optymalne dla eksperymentów dotyczących urazów rozciągających in vitro. (B) W warunkach optymalnych hodowle na membranach silikonowych wyglądają podobnie do hodowli na konwencjonalnych sztywnych podłożach. Panel po lewej przedstawia hiPSCN hodowane w gęstości 33 750 cells/cm2 z zastosowaniem 3,3 µg/mL lamininy na konwencjonalnej, sztywnej płytce 96-dołkowej (podłożem hodowli komórkowych jest kopolimer cykliczny olefiny poddany obróbce do hodowli tkanek). Panel po prawej powiela panel obramowany na czerwono z części (A). Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Fenotyp uszkodzenia i jego zależność od stężenia lamininy. (A) Zdrowa hodowla z zastosowaniem 10 µg/mL lamininy i gęstości 67 500 komórek/cm2. Neuryty są długie i nie wykazują obecności pęcherzyków. Stwierdzono niewielką liczbę martwych jąder oraz nieliczne skupiska. (B) Hodowla w tych samych warunkach, poddana uszkodzeniu przy maksymalnym odkształceniu 57% i obrazowana po 4 h. Neuryty są skrócone lub nieobecne, a niektóre wykazują pęcherzyki (wskazane strzałkami). Stwierdzono mniejszą liczbę komórek Calcein AM-dodatnich oraz więcej jąder Calcein AM-ujemnych (i.e., martwych). Uszkodzenie spowodowało zwiększenie skupiania się komórek przeżywających. (C) 4 h po uszkodzeniu długość neurytów na komórkę spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (D) 4 h po uszkodzeniu żywotność komórek spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (E) 24 h po uszkodzeniu długość neurytów na komórkę spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (F) 24 h po uszkodzeniu żywotność komórek spada wraz ze wzrostem odkształcenia w sposób zależny od stężenia lamininy. (n = 4 na słupek, słupki błędów oznaczają ± 1 odchylenie standardowe, paski skali = 100 µm). Wartości odkształcenia wyznaczono na podstawie przemieszczenia platformy, korzystając z danych z wcześniejszej publikacji autorstwa Sherman et al.11 Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Rysunek techniczny indentora. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę figurę.

Tabela uzupełniająca 1: Urządzenia budowane na zamówienie. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Schemat połączeń pinów ładowarki płytek 96-dołkowych. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający z kodem 1: Rysunki wspomaganego komputerowo projektowania urządzenia do zadawania urazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik z kodem 2: Rysunki wspomaganego komputerowo projektowania zacisku do wykonania płytki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 3: Reprezentacja 3D geometrii stempla, odpowiednia do wykorzystania w drukarce 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodu 4: SubVI dla MuStLiMo_si_initialize.vi, który jest SubVI dla motion_control.vi. Konwertuje wpisy w polach dialogowych na parametry ruchu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający z kodem 5: SubVI for Multiple Straight Line Moves_simplified.vi, który jest SubVI dla motion_control.vi. Przetwarza wpisy w oknach dialogowych na parametry ruchu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 6: SubVI dla position_tracker.vi. Licznik śledzi wejście przemieszczenia z enkodera liniowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający z kodem 7: Podstawowy projekt LabVIEW. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 8: Główny program VI sterujący ruchem urządzenia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 9: SubVI dla motion_control.vi. Wykonuje szybkie przemieszczenie, które rozciąga płytkę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 10: SubVI dla motion_control.vi. Wykonuje powolne przemieszczenie, które porusza stolikiem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 11: SubVI dla motion_control.vi. Wykreśla (zazwyczaj niedopróbkowaną) historię przesunięć w panelu sterowania motion_control.vi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 12: Instrument VI najwyższego poziomu rejestrujący historię przemieszczeń.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik z dodatkowym kodem 13: Zawiera Variable2, służący do komunikacji między motion_control.vi a position_tracker.vi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający z kodem 14: Schemat płytki drukowanej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający z kodem 15: Układ płytki drukowanej. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Kluczem do uzyskania spójnego, biofidelicznego fenotypu w tym modelu jest zastosowanie konsekwentnej mechanicznej zniewagi biofidelicznej. Model ten może generować czas trwania impulsu tak krótki, jak 10-15 ms, który jest podobny do czasu trwania impulsu w przypadku uderzeń głową człowieka zgodnie z eksperymentami ze zwłokami12,13. Konsystencja tej zniewagi zależy od wyrównania płytki z blokiem wgłębnika i konsekwentnego smarowania wgłębników. Gdy blok wgłębnika jest dobrze wyrównany, nie ma trendu w przyłożonym odkształceniu w rzędach lub kolumnach (Rysunek 2C). Cienka warstwa smaru zazwyczaj wytwarza mniejsze tarcie niż gruba warstwa, a lepkie smary nie są zalecane, ponieważ zanieczyszczają silikon i utrudniają przepływ światła podczas mikroskopii. Rzeczywista amplituda przemieszczenia stopnia może być znacznie niższa od zalecanej amplitudy przemieszczenia, gdy stosuje się wiele wgłębników, a zalecana amplituda przemieszczenia stopnia jest duża (> 3 mm). Jednakże, chociaż rzeczywiste przemieszczenie jest mniejsze niż zalecane przemieszczenie przy dużych amplitudach, pozostaje powtarzalne (rysunek 2B). W związku z tym duże, rzeczywiste amplitudy przemieszczeń można niezawodnie uzyskać, wprowadzając określoną wartość przekraczającą wartość pożądaną. Amplituda przemieszczenia ma znaczenie tylko dlatego, że jest to łatwy do zarejestrowania wskaźnik zastępczy dla szczytowego odkształcenia błony, który bezpośrednio mierzy mechaniczne uszkodzenie, które wywołuje patologię. W związku z tym opisana procedura określania odkształcenia membrany na podstawie przemieszczenia stopnia ma kluczowe znaczenie. Proces ten należy powtórzyć, jeśli w systemie zostaną wprowadzone jakiekolwiek poważne zmiany, które wpływają na interakcję między płytką a wgłębnikami, na przykład, jeśli stosowane są wgłębniki o różnych średnicach, różne materiały lub powłoki wgłębnika lub różne rodzaje płytek z silikonowym dnem. Proces ustawiania bloku wgłębnika i wyznaczania pozycji zerowej należy powtórzyć na początku każdego eksperymentu. Schemat urządzenia rozciągającego pokazano na rysunku 1. Modele CAD wymagane do odtworzenia urządzenia są dostarczane jako materiały dodatkowe: "Urządzenie do urazów - PEŁNY MONTAŻ - Ogólne 3D. KROK"; powiązany zestawienie materiałów dostarczone jako "Tabela uzupełniająca 1: Urządzenia zbudowane na zamówienie - BOM.xlsx. Patrz również Tabela uzupełniająca 2 96 Płytka studzienkowa _loader - Okablowanie z wyprowadzeniami Diagram.xlsx, która opisuje połączenia okablowania łączące różne elementy systemów. "Interconnector_circuit_board.dip" opisuje płytkę drukowaną, która łączy kable.

Jeśli urządzenie zostanie dezaktywowane ze stopniem znajdującym się w pobliżu środka jego ruchu, stage przesunie się po odcięciu zasilania, ponieważ jest obciążony sprężyną. Po przywróceniu zasilania pętla sprzężenia zwrotnego wykryje dużą różnicę między ostatnią znaną zalecaną pozycją a rzeczywistą pozycją. Spowoduje to, że stage nagle przesunie się do pozycji, w której znajdował się, gdy urządzenie zostało dezaktywowane. Ten nagły ruch może powodować błędy w wyjściu enkodera, dlatego należy zachować ostrożność, aby dezaktywować urządzenie tylko wtedy, gdy znajduje się ono w pozycji spoczynkowej bez zasilania na szczycie swojego skoku.

Zacisk produkcyjny został zaprojektowany tak, aby połączyć korpus płytki i silikonowe dno w sposób umożliwiający optymalne połączenie. W tym celu w projekcie przedstawiono trzy kluczowe cechy przedstawione w pliku uzupełniającym "Press Die - Generic 3D. KROK". Po pierwsze, uchwyt korpusu płyty zaciskowej jest równoległy do silikonowego dna. Jeśli jest on prawidłowo zbudowany, nie będzie wymagał żadnej regulacji po początkowej konfiguracji. Po drugie, warstwa gumy piankowej w zacisku zapewnia niewielką podatność pod płytą, ponieważ całkowicie sztywny system teoretycznie doświadczyłby nagłego wzrostu od zerowej siły zacisku do nieskończonej siły zacisku, gdy zacisk był zamknięty. Położenie poprzeczki i dociskowej zacisku można regulować, dzięki czemu można precyzyjnie dostroić odległość między dwiema stronami zacisku.

Należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić jasne, białe tło za kropką na dnie studni podczas eksperymentów z charakteryzacją szczepów. Im lepszy kontrast na tych obrazach, tym łatwiej będzie zautomatyzować proces pomiaru wysokości i szerokości kropki, który może stać się żmudny dla operatora analizującego duży eksperyment. Szybkie filmowanie dna studni w 96-dołkowej płycie stanowi wyzwanie, ponieważ ściany studni mają tendencję do rzucania cieni. Zastosowanie światła kopułkowego lub rozproszonego światła osiowego, które może oświetlać wzdłuż linii wzroku kamery bez zasłaniania obrazu, eliminuje cienie lub odbicia lustrzane, które powstałyby przy konwencjonalnym źródle światła. Należy używać najjaśniejszego dostępnego źródła światła, ponieważ jasne oświetlenie pozwala na uzyskanie obrazów przy krótkim czasie naświetlania. Krótkie czasy naświetlania minimalizują rozmycie ruchu. Ulepszenie diod elektroluminescencyjnych (LED) w rozproszonym świetle osiowym pozwala na skrócenie czasu naświetlania podczas szybkiej akwizycji wideo. Diody LED można zmodernizować, otwierając rozproszone światło osiowe, wyjmując standardowe diody LED, montując 4 matryce LED dużej mocy na tylnej szybie za pomocą uchwytów diod LED, podłączając je do zasilacza prądu stałego i ponownie montując rozproszone światło osiowe (numery katalogowe znajdują się w Tabeli materiałów ). Wadą modernizacji diod LED jest to, że pasywnie chłodzone diody LED nie mogą być włączone dłużej niż kilka sekund ze względu na ryzyko przegrzania. Dlatego do wyrównania bloku pocztowego i regulacji kamery potrzebne jest inne światło.

Przedstawiona metoda ilościowego określania odkształcenia membrany poprzez pomiar dylatacji kropki wybitej na membranie jest stosunkowo prymitywna, ale można ją skalować do wielu dołków w solidny sposób. Pole odkształceń na dnie odwiertu można scharakteryzować bardziej szczegółowo za pomocą cyfrowej korelacji obrazu. Technika ta polega na natryskiwaniu nakrapianego wzoru na podstawę studni, a następnie obrazowaniu go z dużą prędkością podczas deformacji. Komercyjne oprogramowanie może być następnie wykorzystane do ilościowego określenia odkształcenia w każdym punkcie obrazu poprzez śledzenie ewolucji nakrapianego wzoru.

Protokół ten tworzy wieloaspektowy, klinicznie istotny fenotyp urazu rozciągającego w hiPSCN. Śmierć komórki, zwyrodnienie neurytów i perełkowanie neurytów są dobrze udokumentowanymi następstwami TBI u ludzi i modeli zwierzęcych15. Kluczem do sukcesu w tym modelu jest ustanowienie i utrzymanie zdrowych kultur. Ogólnie rzecz biorąc, protokół hodowli komórkowej opracowany przy użyciu konwencjonalnych sztywnych płytek jest wartościowym punktem wyjścia dla rozciągliwej hodowli płytkowej. Należy jednak zawsze brać pod uwagę możliwość, że dane ogniwa mogą inaczej reagować na silikon. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku hiPSCN, które są bardzo wrażliwe na warunki hodowli. Niektóre przykłady optymalizacji gęstości komórek i stężenia lamininy znajdują się w sekcji Reprezentatywne wyniki (Rysunek 3, Rysunek 4). Aktywacja silikonu za pomocą obróbki plazmowej jest niezbędna. Silikon jest hydrofobowy i niereaktywny; W stanie naturalnym nie wiąże się z lamininą ani innymi cząsteczkami używanymi do promowania przyczepiania komórek. Obróbka plazmowa sprawia, że powierzchnia staje się hydrofilowa i odsłania grupy reaktywne. Zmiany te umożliwiają cząsteczkom adhezyjnym wiązanie się z silikonem i promowanie przyczepiania komórek. Należy zauważyć, że efekt obróbki plazmowej rozprasza się w ciągu kilku minut, chyba że powierzchnia jest zanurzona w cieczy, dlatego zabiegi polegające na osuszaniu aktywowanej powierzchni powinny być wykonywane tak szybko, jak to możliwe. Prostym sposobem sprawdzenia, czy efekt obróbki plazmowej już minął, jest umieszczenie kropli wody na powierzchni. Na nieleczonym silikonie kropla będzie się skraplać, podczas gdy na silikonie poddanym obróbce plazmowej rozprzestrzeni się. W przypadku zastosowanych przez nas hiPSCN (patrz Tabela materiałów), producent zaleca dodawanie lamininy do zawiesiny komórek, a nie wstępne powlekanie. Ten protokół z powodzeniem włączył to podejście. Chociaż segmentację można teoretycznie przeprowadzić za pomocą oprogramowania open source lub języków programowania ogólnego przeznaczenia, do uzyskania dobrych wyników wymagany jest wysoki stopień biegłości w posługiwaniu się tymi narzędziami. Neuryty są często trudne do odróżnienia od sygnału tła, ponieważ są tak smukłe. Dlatego zalecamy korzystanie z komercyjnych narzędzi programowych dystrybuowanych przez firmy zajmujące się mikroskopią o wysokiej zawartości z dedykowanymi modułami do segmentacji i kwantyfikacji neuronów, jeśli są one dostępne. Nawet w przypadku oprogramowania komercyjnego rozsądnie jest eksportować obrazy segmentacji, aby wizualnie zweryfikować dokładność.

Istnieją pewne ograniczenia związane z pracą w płytach rozciągliwych w porównaniu z pracą z konwencjonalnymi, sztywnymi płytami. Rozciągliwe płyty można obrazować w normalny sposób za pomocą obiektywów pneumatycznych. Jednak obrazowanie z obiektywami immersyjnymi jest bardzo trudne. Olej do soczewek może uszkodzić silikon. Dodatkowo obiektyw wywiera nacisk na membranę silikonową, gdy porusza się ona w górę. Ciśnienie to przesuwa membranę w pionie, co utrudnia ustawienie ostrości próbki. Membrany silikonowe stosowane obecnie do produkcji płyt mają grubość około 250 μm. Grubość ta przekracza odległość ogniskową wielu obiektywów zanurzeniowych o dużej mocy. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby przed zaciśnięciem membrany były idealnie płaskie, aby uzyskać płaskość wymaganą do mikroskopii. Systemy autofokusa mogą w pewnym stopniu kompensować odchylenia w płaskości gotowej płyty. Przyszłe wersje protokołu mogą wstępnie naprężać membranę przed jej połączeniem z górną częścią płyty, aby zapewnić płaskość. Bezklejowa procedura klejenia membrany silikonowej z blatem płyty14 jest uważana za ważną zaletę obecnego protokołu. Eliminuje to ryzyko neurotoksyczności kleju, a także wszelkie odchylenia płaskości spowodowane niejednolitą grubością warstwy kleju.

Matryce wieloelektrodowe są powszechnie stosowane w eksperymentach z hiPSCN w celu oceny ich dojrzałości i funkcjonalności. Niestety, systemy te są niekompatybilne z tym modelem, ponieważ podłoże hodowli komórkowej jest sztywne. Możliwe jest stworzenie rozciągliwego układu wieloelektrodowego, chociaż do tej pory wykazano to tylko w formaciepojedynczej studzienki 16,17. Należy pamiętać, że wgłębniki można usuwać pojedynczo z bloku wgłębnika, tak aby niektóre studzienki nie były wgłębione i mogły służyć jako pozory. Usunięcie wgłębnika zapobiega wgnieceniom, ale nie eliminuje całkowicie obciążenia mechanicznego, ponieważ podczas ruchu stolika w studzienkach nadal występuje ruch bezwładnościowy. Warto porównać te studnie do studni w płytach, które nigdy nie były poddawane ruchowi scenicznemu, aby zmierzyć jakikolwiek patologiczny wpływ ruchu płynów. Ponadto układ wgłębników w bloku powinien być dwusymetryczny (symetryczny od przodu do tyłu i z boku na bok). Ten środek ostrożności zapewnia, że płyta jest równomiernie obciążona podczas wgłębienia, dzięki czemu stolik nie przechyla się na boki i nie powoduje zakleszczenia prętów w łożyskach.

Jednym z głównych wyzwań związanych z innowacjami terapeutycznymi w neurotraumie jest złożoność i niejednorodność tego schorzenia. Trauma stosuje stres multimodalny do każdego typu komórek w ośrodkowym układzie nerwowym jednocześnie. Neurony zostały niezawodnie wygenerowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i są obecnie szeroko dostępne u dostawców komercyjnych. Innowacje w tej dziedzinie postępują szybko, a inne typy komórek nerwowych, takie jak astrocyty18 i mikroglej19 , również pochodzą z hiPSC. Wkrótce być może uda się wyizolować autonomiczne reakcje komórkowe każdego z tych typów komórek na traumę in vitro , a następnie wspólnie hodować różne typy komórek, aby zrozumieć, w jaki sposób komunikują się po traumie. W ten sposób może się ostatecznie zdarzyć, że uda się odtworzyć wyzwanie kliniczne od podstaw, aby dokładnie je zrozumieć w ludzkim systemie. Podejście to różni się od podejścia konwencjonalnego opartego na modelach gryzoni i ma potencjał do generowania nowych informacji, które doprowadzą do pierwszych terapii tego powszechnego, wyniszczającego i trudnego do opanowania schorzenia.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest częściowo wspierana przez grant z National Institutes of Health (R21NS098129). Chcielibyśmy podziękować za doskonałą pomoc techniczną ze strony SueSan Chen, Jonathana Tana, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng i Feng Yuan Bu, którzy zaprojektowali i zbudowali konstrukcję podtrzymującą światła używane podczas eksperymentów z obrazowaniem z dużą prędkością opisanych w tym manuskrypcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
.010" Arkusz silikonowySpecialty Manufacturing, Inc#70P001200010Arkusz polidimetylosiloksanu (PDMS)
SparkleenFisher Scientific #043204
Nunc 256665Fisher Naukowy #12-565-600Bezdenna 96-dołkowa płytka
Kim WipesULINES-8115
Środek do czyszczenia plazmyHarrick Plasma#PDC-001-HC
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigma-Aldrich#440140
APTES Papier pergaminowyReynoldsN/A
Dome LightCCS incLFX2-100SW
Zasilacz światła kopułkowegoCCS incPSB-1024VB
Osiowa jednostka oświetlenia dyfuzyjnego               SiemensNerlite DOAL-75-LEDRozproszone światło osiowe Matryca
LED dużej mocy                     CREEXLamp CXA2540Matryca LED dużej mocy                     
Oprawka LEDMolex1807200001Oprawka LED   
Zasilacz LEDMean WellHLG-320H-36BZasilacz prądu stałego   
Oprogramowanie FastCam Viewer Softeware do aparatuPhotron
Fastcam Mini UX50Szybki aparat fotograficzny PhotronN/A
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8Nikon#1455Obiektyw do aparatu szybkotnącego
0,1 mg/mL Poli-L-OrnitynaSigma-Aldrich#P4597
iCellsCellular Dynamics International#NRC-100-010-001
NośnikiiCellMiędzynarodowa Dynamika Komórkowa#NRM-100-121-001 
Suplement iCellCellular Dynamics International#NRM-100-031-001
LamininSigma-Aldrich#L2020
Hoechst 33342Fisher Scientific 
Calcein AMFisher Scientific 
siłownik cewki drgającej BEI KimcoLA43-67-000A 
Optyczny enkoder liniowy RenishawT1031-30A 
serwonapędCopley ControlsXenus XTL 
KontrolerNational InstrumentscRIO 9024 Kontroler PowerPC w czasie rzeczywistym 
Obudowa cRIONational InstrumentscRIO 9113
cyfrowy moduł wejściowyNational InstrumentsNI 9411
obudowa do gromadzenia danychNational InstrumentsNI 9113
LabVIEWOprogramowanie do sterowania instrumentamiNational Instruments
hiPSCNsCellular Dynamics International
#H3570#C3099

Bibliografia

  1. Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).
  2. Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).
  3. Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).
  4. Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).
  5. Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).
  6. Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).
  7. Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).
  8. Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).
  9. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).
  10. Kang, W. H., Morrison, B. 3rd Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).
  11. Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097(2016).
  12. Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
  13. Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
  14. Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).
  15. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
  16. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).
  17. Yu, Z., Morrison, B. 3rd Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).
  18. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  19. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obr bka membrany silikonowejindukcja odkszta cenia mechanicznegoszybka wideofilmografiaanaliza mikroskopowa z wykorzystaniem fluorescencjiniestandardowe urz dzenie do wywo ywania uraz wekwibiaksjalne odkszta cenie mechanicznekwantyfikacja d ugo ci neuryt w

Powiązane artykuły