Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57309

⸱

16 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia nowatorski test kulkowy in vitro, który bardziej odpowiednio modeluje proces angiogenezy kiełkowania in vivo poprzez włączenie perycytów. Ta modyfikacja umożliwia testowi kulkowemu dokładniejsze odwzorowanie heterotypowych interakcji komórkowych między komórkami śródbłonka a komórkami ściennymi, które mają kluczowe znaczenie dla angiogenezy.

Streszczenie

Angiogeneza to wzrost nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych i jest ważnym składnikiem wielu procesów biologicznych, w tym embriogenezy i rozwoju, gojenia się ran, wzrostu guza i przerzutów oraz chorób oczu i układu krążenia. Potrzebne są skuteczne modele in vitro, które podsumowują biologię angiogenezy, aby odpowiednio zbadać ten proces i zidentyfikować mechanizmy regulacji, które mogą być ostatecznie ukierunkowane na nowe strategie terapeutyczne. Wcześniej wykazano, że test angiogenezy kulek podsumowuje wiele etapów kiełkowania śródbłonka in vitro. Jednak ograniczeniem tego testu jest brak interakcji śródbłonek – komórki ścienne, które są kluczowe dla molekularnej i fenotypowej regulacji funkcji komórek śródbłonka in vivo. Podany tutaj protokół przedstawia metodologię włączania komórek ściennych do testu angiogenezy perełkowej i wykazuje ścisły związek komórek śródbłonka i perycytów podczas kiełkowania in vitro. Protokół szczegółowo opisuje również metodologię skutecznego wyciszania genów docelowych przy użyciu siRNA w komórkach śródbłonka do badań mechanistycznych. Podsumowując, protokół ten zapewnia test in vitro, który w bardziej odpowiedni sposób modeluje różne typy komórek zaangażowanych w kiełkowanie angiogenezy i zapewnia bardziej fizjologicznie istotną platformę do oceny terapeutycznej i odkrycia nowych mechanizmów regulacji angiogenezy.

Wprowadzenie

Angiogeneza jest niezbędna do prawidłowego zarodkowania i gojenia się ran, a także odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach, w tym w progresji raka1 i chorobie wieńcowej. 2,3 Lepsze zrozumienie, w jaki sposób angiogeneza zachodzi podczas normalnego rozwoju i jak jest reaktywowana w kontekstach patologicznych, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju nowych, skutecznych metod terapeutycznych. Potrzebne są wierne modele in vitro, które podsumowują ważne etapy i typy komórek zaangażowanych w angiogenezę in vivo, aby umożliwić naukowcom lepsze scharakteryzowanie mechanizmów molekularnych napędzających angiogenezę i dokonanie nowych odkryć w zakresie regulacji śródbłonka.

Nakatsu i Hughes zoptymalizowali test kiełkowania kulek, który, jak wykazali, przechodzi wiele znanych etapów angiogenezy kiełkowania. 4,5 Celem przedstawionej tutaj metody jest rozwinięcie testu zoptymalizowanego przez Nakatsu i Hughesa poprzez włączenie perycytów do testu, tak aby rola parakrynny i jukstracryny komórek ściennych w kiełkowaniu komórek śródbłonka mogła zostać włączona do nowych badań angiogenezy. Perycyty to komórki ścienne, które są definiowane przez ich rolę jako komórek, które utrzymują bliski kontakt fizyczny z komórkami śródbłonka ze względu na ich osadzenie w błonie podstawnej naczyń. 6 Perycyty i komórki śródbłonka angażują się w skomplikowane wzajemne rozmowy poprzez szlaki sygnałowe, w tym sygnalizację Notch, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ i wiele innych. 7,8 Modele mysie z niedoborem tych szlaków sygnałowych wykazują słabe pokrycie perycytów rozwijającym się naczyniem w embriogenezie, co prowadzi do słabej przebudowy naczyń i dysfunkcji układu krwionośnego. 7 Ponadto, rola perycytów w patologicznej angiogenezie jest ważna, ale często niedoceniana. Na przykład unikalną cechą unaczynienia guza jest to, że naczynia są bardziej niedojrzałe, nieszczelne i dysfunkcyjne z powodu słabego pokrycia perycytów. 9 Zaproponowano, że obecność lub brak perycytów dramatycznie wpływa na fenotyp naczyń krwionośnych guza i jest ważnym mediatorem odpowiedzi na terapie antyangiogenne i przeciwnowotworowe. 9 Tak więc, uwzględnienie roli perycytów w testach in vitro jest kluczem do pełniejszego uchwycenia ważnych mechanizmów regulacji śródbłonka.

Chociaż obecnie istnieje wiele testów in vitro i ex vivo stosowanych do badania angiogenezy, w każdym z nich są niedociągnięcia, które należy wziąć pod uwagę. Niektóre, takie jak proliferacja śródbłonka i testy migracji śródbłonka, są nadmiernie uproszczone i koncentrują się na jednej funkcji śródbłonka w izolowanym otoczeniu na plastiku do hodowli tkankowej. 10 Inne testy występują w bardziej trójwymiarowym (3D) otoczeniu, takie jak test tworzenia rurki Matrigel,10, ale te testy są nadal nadmiernie uproszczone i skupiają się bardziej na zdolności komórek śródbłonka do migracji i tworzenia struktur naczyniowych de novo, w przeciwieństwie do kiełkowania z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych. Co więcej, żaden z tych testów nie obejmuje typów komórek ściennych. Istnieją modele ex vivo, takie jak test aorty pierścieniowej, które obejmują perycyty obecne w narządzie gospodarza, ale manipulacja genetyczna tych modeli jest znacznie trudniejsza ze względu na konieczność generowania modeli myszy z nokautem lub transgenicznych ścieżek będących przedmiotem zainteresowania. Test kiełkowania kulek jest idealny, ponieważ modeluje kiełkowanie śródbłonka, proliferację, migrację, a nawet zespolenie i tworzenie światła w matrycy 3D. 4 Test wiernie pozwala na mechanistyczną ocenę wielu różnych etapów kiełkowania, jednocześnie pozwalając na bezpośrednią modyfikację genetyczną komórek śródbłonka lub perycytów w bardziej kontrolowanym otoczeniu. Skrzepy fibrynowe zawierające kiełkujące kulki można łatwo utrwalić, wybarwić i zobrazować na różnych etapach kiełkowania; Kiełki te można również umieścić w komorze obrazowania na żywo, aby wykonać obrazowanie kiełkowania w czasie rzeczywistym. Przedstawiona tu metodologia jest idealna do badania podstawowych mechanizmów angiogenezy poprzez dogłębne fenotypowanie i dokładną analizę szlaków aktywowanych podczas angiogenezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dzień 1:

1. Przejściowa transfekcja komórek śródbłonka

  1. W razie potrzeby należy wykonać przejściową transfekcję ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) przy użyciu oligonukleotydów regulatorowych genów (np. mikro-RNA lub małego interferującego RNA (siRNA)) i odpowiedniego odczynnika lipofektaminy zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Protokół ten odniósł wielki sukces w wykonywaniu odwrotnych transfekcji z niestandardowymi sekwencjami siRNA i komercyjnym odczynnikiem do transfekcji (patrz tabela materiałów). Autorzy nie testowali innych protokołów transfekcji i odczynników za pomocą tego testu. Kroki odwrotnej transfekcji przy użyciu wymienionych odczynników są następujące:
  2. Rozpuść liofilizowane siRNA lub mikroRNA w stężeniu 20 μM w wodzie wolnej od nukleaz.
  3. Przygotować roztwory do transfekcji w następującym stosunku: 1 ml dowolnej pożywki wolnej od surowicy z 9 μl siRNA lub mikroRNA.
  4. Wymieszać roztwór i pozostawić do inkubacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać 18 μl odczynnika do transfekcji do roztworu i wymieszać.
  6. Pozostawić roztwór do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20-40 minut, mieszając roztwór co 10 do 15 minut przez cały czas inkubacji.
  7. Podczas inkubacji roztworu do transfekcji należy odłączyć HUVEC za pomocą roztworu do odrywania komórek (np. Accutase). W przypadku kolby T175 przemyć kolbę 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodać 5 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  8. Dodać 5 ml kompletnej pożywki do kolby T175, usunąć zawiesinę komórek z kolby i odwirować z prędkością 1200 obr./min przez 3 minuty.
  9. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego i ponownie zawiesić osad komórek o gęstości 1 X 106 komórek na ml w EGM2.
    UWAGA: Protokół ten odniósł wielki sukces przy użyciu pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (EGM2) zawierającej standardowy zestaw pocisków czynnika wzrostu, a także dodatkowe 10% FBS.
  10. Po zakończeniu inkubacji roztworu do transfekcji umieść 1 ml roztworu na 10-centymetrowej płytce i dodaj 1 ml zawiesiny HUVEC na wierzch.
  11. Dodaj dodatkowe 7 ml kompletnej pożywki, aby uzyskać ostateczną objętość na 10-centymetrowej płytce do 9 ml.
  12. Uzupełnić co najmniej dwie płytki o długości 10 cm komórek dla każdego warunku transfekcji, aby upewnić się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do dalszych etapów testu.
    UWAGA: W tych warunkach uzyskuje się końcowe stężenie robocze oligonukleotydu regulatorowego genu wynoszące 20 nM. Autorzy odkryli, że warunki te powodują 60-80% obniżenie ekspresji genów dla ich celów. Inni badacze mogą być zmuszeni do optymalizacji warunków transfekcji zgodnie ze swoimi potrzebami eksperymentalnymi.
  13. Wymienić pożywkę 4-6 godzin po dodaniu kompleksów siRNA na świeżą kompletną pożywkę.
    UWAGA: Ten protokół został opracowany przy użyciu przejścia 1 - 2 HUVEC.

Dzień 2

2. Powlekanie kulek mikronośnika komórkami śródbłonka

  1. Rozpuść mikrokulki nośne (np. Cytodex 3) w stężeniu 60 000 kulek/ml w PBS i autoklawie.
    UWAGA: kulki mikronośne występują w stężeniu około 3 x 106 kulek na gram. Rozpuść kulki w proporcji 20 mg kulek na ml PBS, aby uzyskać gęstość kulek około 60 000 kulek/ml.
  2. Porcję 1 ml kompletnej pożywki do żądanej liczby okrągłodennych probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
  3. Odpipetować 20 μl zawiesiny kulek mikronośnika do każdej probówki (należy upewnić się, że roztwór kulki jest dobrze zawieszony przed pipetowaniem).
    UWAGA: Prawdopodobnie wystąpi dramatyczna zmienność w końcowym stężeniu roboczym kulek obecnych w danej zawiesinie kulek mikronośnika. Koraliki mogą łatwo przylegać do ścianek plastikowych i szklanych pojemników, co może znacznie zmienić stężenie kulek w roztworze. Najbardziej odpowiednia objętość roztworu kulek dodawanego do probówki FACS dla każdej partii zawiesiny kulki mikronośnika będzie musiała zostać określona empirycznie przez badacza. Przedstawione tutaj liczby mają służyć bardziej jako punkt wyjścia. Idealnie byłoby, gdyby warunki były zoptymalizowane tak, aby w żelu fibrynowym na dołek na 24-dołkową płytkę pod koniec testu zanurzonych było 10-20 kulek na studzienkę. Zobacz dalszą dyskusję w sekcji dyskusji poniżej dotyczącą optymalizacji liczby kulek dla testu.
  4. Odłączyć transfekowany HUVEC 24 godziny po transfekcji za pomocą roztworu do oddzielania komórek w następujący sposób:
    1. Przemyć każdą 10-centymetrową płytkę komórek 5 ml PBS, a następnie dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Zawiesić komórki w stężeniu 1 X 106 komórek/ml w kompletnym pożywce.
  5. Dodać 1 ml zawiesiny komórek (tj. 1 X 106 HUVEC) do każdej probówki FACS zawierającej kulki.
  6. Delikatnie mieszać probówki FACS co 20 minut przez 4 godziny w temperaturze 37 °C (w przypadku przejścia do kroku 3.4) lub 2,5 do 3 godzin (w przypadku przejścia do kroku 3.2).
    UWAGA: Ten czas trwania i częstotliwość mieszania zostały empirycznie określone przez poprzednich badaczy, którzy zoptymalizowali podstawowy test kiełkowania koralików. 4 Inne częstotliwości mieszania i czas trwania etapu powlekania ściegu nie zostały przetestowane przez autorów.

3. Sekwencyjne powlekanie perycytów na kulkach mikronośnikowych pokrytych HUVEC

  1. Rozpocznij odłączanie komórek 10T1/2 (perycytów) za pomocą roztworu do odrywania komórek (trypsyna) w następujący sposób:
    1. Przemyć kolbę T175 10 ml PBS, następnie dodać 5 ml trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Zawiesić 10T1/2 w stężeniu 2 X 105 komórek/0,5 ml w kompletnej pożywce.
      UWAGA: Komórki zostały zakupione z American Type Culture Collection (ATCC).
      UWAGA: Hodowla 10komórek T1/2 w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny Streptomycyny.
  2. Po 2,5 do 3 godzinach mieszania roztworu kulki + HUVEC odczekaj 5 minut, aby kulki i swobodnie unoszący się HUVEC osiadły na dnie rurki.
  3. Usuń 0,5 ml kompletnego podłoża z każdej probówki za pomocą pipety P1000 i dodaj 2 x 105 10T1/2 w kompletnych pożywkach w objętości 0,5 ml do każdej probówki FAC. Wymieszać roztwór komórki i kulek, a następnie kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C. Kontynuować mieszanie co 20 minut, aż kulki będą mieszane łącznie przez 4 godziny
    UWAGA: Stosunek 5 HUVEC : 1 perycyt na koralikach jest niezbędny do utrzymania odpowiedniego pokrycia naczyń perycytami.
    UWAGA: W tym momencie protokołu można wykonać następujące alternatywne kroki:
  4. Mieszaj koraliki i HUVEC tylko przez 4 godziny.
  5. Po zakończeniu 4-godzinnego powlekania kulek mikronośnika HUVEC, należy po raz ostatni zamieszać probówki, odczekać 30-60 s, a następnie natychmiast usunąć 1,5-1,75 ml roztworu z probówki FACS.
    UWAGA: Powinno to dać wystarczająco dużo czasu, aby większość koralików osiadła, podczas gdy wiele swobodnie unoszących się HUVEC w podłożu zostanie usuniętych.
    1. Dodaj 2 X 105 10T1/2 do kompletnego podłoża i zwiększ objętość probówki FACS do 2 ml.
    2. Delikatnie mieszaj rurki FACS co 20 minut przez dodatkową godzinę.
  6. Po zakończeniu mieszania delikatnie wymieszaj probówki po raz ostatni i natychmiast usuń cały roztwór (2 ml) i dodaj go do 6-centymetrowej płytki. Dodać dodatkowe 3 ml kompletnej pożywki do każdej płytki i umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.

Dzień 3

4. Przygotowanie roztworów żelu fibrynowego

  1. Przygotować roztwory robocze aprotyniny w stężeniu 1 mg/ml w PBS i trombiny w stężeniu 50 jednostek/ml.
    UWAGA: Duży zapas każdego z tych roztworów może być przygotowany i przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej rok.
  2. Przygotować świeży roztwór fibrynogenu o stężeniu 2 mg/ml. Przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby uzyskać 2,5 ml roztworu na mieszaną probówkę FACS.
    1. Ogrzewać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby cały fibrynogen mógł wejść do roztworu.
    2. Dodać 37,5 μl roztworu aprotyniny na 1 ml roztworu fibrynogenu.
    3. Sterylnie przefiltrować roztwór i odstawić na bok w temperaturze pokojowej.

5. Przygotowanie koralików do implantacji żelu

  1. Zbadaj szalki zawierające kulki pokryte mikronośnikiem pod mikroskopem za pomocą obiektywu 20X, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały wystarczająco pokryte komórkami śródbłonka.
  2. Energicznie odpipetować posiany roztwór komórek, aby odłączyć je od płytki o średnicy 6 cm i umieścić roztwór w probówce. Umyj płytkę jeszcze 2 razy pełnym medium i przenieś do tuby, aby zebrać wszystkie resztki kulek, które mogą przykleić się do płytki.
    1. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza i użyj pipety p1000, aby zminimalizować naprężenia ścinające na kulkach pokrytych komórkami śródbłonka.
    2. Jeśli potrzebna jest ocena skuteczności knockdown siRNA w komórkach śródbłonka, w kroku 2 upewnij się, że masz płytkę z kulkami pokrytymi tylko HUVEC. Następnie, podczas tego etapu (5.2), odczepić kulki i zebrać pozostałości HUVEC przyczepione do płytki w celu izolacji RNA i analizy qPCR.
  3. Odczekaj 3 minuty, aby kulki w roztworze osiadły na dnie probówki.
  4. Usuń jak najwięcej supernatantu bez naruszania granulki za pomocą końcówki do pipety p1000 (nie używaj aspiratora próżniowego).
  5. Dodać 1 ml kompletnej pożywki do każdej probówki i ponownie zawiesić kulki.
  6. Odczekaj 30-60 sekund, aby koraliki opadły na dno. Następnie usuń jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety P1000, nie naruszając osadu kulkowego. Nie używaj aspiratora próżniowego, ponieważ prawdopodobieństwo przypadkowego usunięcia granulki kulki jest znacznie zwiększone.
  7. Powtórz kroki 5.5 i 5.6 jeszcze dwa razy. Celem jest usunięcie jak największej ilości swobodnie unoszącego się HUVEC, który mógł zostać odłączony od 6-centymetrowej płytki, przy jednoczesnym nie usuwaniu zbyt wielu kulek pokrytych HUVEC, które powinny osadzać się w rurce FACS szybciej niż swobodnie pływające komórki.
  8. Dodaj 1 ml kompletnego podłoża do kulek.

6. Osadzanie powlekanych koralików w żelu fibrynowym

  1. Usuń jak najwięcej pożywki bez naruszania granulki kulki w każdej probówce FACS za pomocą pipety P1000.
  2. Ponownie zawiesić kulki w 2,5 ml roztworu fibrynogenu.
  3. Odpipetować 13 μl roztworu trombiny do każdego żądanego dołka na 24-dołkowej płytce ze szklanym dnem. Posiewanie w płytce ze szklanym dnem jest niezbędne do optymalnego obrazowania kiełków.
    UWAGA: Nie pozostawiaj trombiny w studzience na dłużej niż 5-10 minut przed następnym krokiem.
  4. Dodaj 0,5 ml roztworu kulek/fibrynogenu do każdej studzienki.
    1. Należy pamiętać o ponownym zaparzeniu roztworu kulkowego przed każdorazowym pipetowaniem roztworu.
    2. Należy zachować ostrożność, aby ostrożnie pipetować bezpośrednio do trombiny już obecnej w studzience. Powoli pipetuj w górę i w dół 2-3 razy, aby dokładnie wymieszać roztwór, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.
    3. Pamiętaj, aby wymieniać końcówkę pipety między studzienkami.
    4. Należy zachować ostrożność, aby nie poruszać się ani nie przeszkadzać w płytce w żadnym momencie podczas początkowego krzepnięcia fibryny, ponieważ każdy ruch może zakłócić tworzenie się żelu.
  5. Pozostaw płytkę w okapie na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na dodatkowe 1,5-2 godziny, aby żel w pełni zastygł

7. Posiewanie fibroblastów na żelu fibrynowym

  1. W ciągu ostatnich 30 minut krzepnięcia żelu należy odłączyć normalne ludzkie fibroblasty płuc (NHLF) w następujący sposób:
    1. Przemyć kolbę komórkową T175 10 ml PBS, następnie dodać 5 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Zawiesić NHLF w stężeniu 20 000 komórek/ml w kompletnych pożywkach.
      UWAGA: Komórki NHLF można hodować za pomocą Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny Streptomycyny.
  2. Umieścić 1 ml zawiesiny komórek NHLF na żelu z każdej studzienki i umieścić z powrotem w inkubatorze.
  3. Zmieniaj całe podłoża co drugi dzień przez cały czas trwania testu.

8. Obserwuj kiełkowanie w ciągu 2-7 dni po implantacji kulek w żelu fibryny. Czas potrzebny do wykiełkowania będzie zależał od przejścia i numeru partii HUVEC.

9. Utrwalenie testu kiełkowania

  1. Po wystąpieniu wystarczającej ilości kiełkowania, aby móc określić różnicę fenotypową między grupami leczonymi, należy przemyć wszystkie studzienki jeden raz 2 ml PBS.
  2. Do każdej studzienki dodać 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
  3. Wyjąć płytkę z inkubatora i postukać w boki płytki.
    UWAGA: Celem tego etapu jest usunięcie jak największej liczby komórek NHLF rosnących na wierzchu żelu fibrynowego, aby ułatwić przenikanie przeciwciał do żelu, a także obrazowanie żelu. Całkowity czas inkubacji z roztworem do odrywania komórek może wymagać dostosowania w celu optymalizacji usuwania NHLF. Naukowcy są ostrzegani, aby nie inkubować żelu przez zbyt długi czas, ponieważ roztwór do odrywania komórek może wniknąć w żel i zacząć zakłócać struktury śródbłonka w środku.
  4. Po usunięciu wystarczającej ilości komórek NHLF należy zgasić roztwór do oddzielania komórek 1 ml kompletnej pożywki.
  5. Odessać odłączony NHLF i pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego i raz umyć studzienki 1 ml PBS.
  6. Dodać 300 μl 2% roztworu paraformaldehydu w PBS do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  7. Usuń 2% roztwór paraformaldehydu i umyj każdą studzienkę 3 razy 1 ml PBS przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Należy odpowiednio zutylizować 2% roztwór paraformaldehydu zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego (EHS).
    1. Dodać 1 ml PBS do każdej studzienki i przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do barwienia lub obrazowania kiełków.

10. Barwienie testu kiełkowania

  1. Dodać 300 μl 0,5% Triton-X 100 w PBS do każdego dołka i inkubować przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Za pomocą aspiratora próżniowego wyjmij Triton-X100 i umyj 3 razy w PBS przez 5 minut każdy.
  3. Dodać 500 μl roztworu blokującego do każdego żelu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Roztwór blokujący składa się z następujących składników: 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 i 1% surowicy (użyj tego samego gatunku, z którego pochodzą przeciwciała drugorzędowe) w PBS.
  4. Usunąć roztwór blokujący z każdej studzienki i dodać 300 μl roztworu barwiącego zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe do każdej studzienki.
    UWAGA: Roztwór barwiący jest taki sam jak roztwór blokujący, ale bez obecnej surowicy odpornościowej. Autorzy odnieśli sukces w inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi w rozcieńczeniach od 1:200 do 1:400.
  5. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze barwiącym przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  6. Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 3 razy w TBS z 0,5% tween przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Po trzecim praniu ponownie zastąp świeży bufor do mycia i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc.
  7. Inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w roztworze barwiącym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Usuń wtórny roztwór barwiący przeciwciała i przemyj 5 razy przez 20 minut za pomocą TBS zawierającego 0,5% teen w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
  9. Rozcieńczyć barwienie jądrowe w PBS i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ten protokół odniósł wielki sukces z Hoechst rozcieńczonym 1:10000 w PBS.
    UWAGA: Nie ma potrzeby usuwania roztworu do barwienia jądrowego przed obrazowaniem.
  10. Obraz w ciągu kilku dni od zakończenia barwienia w celu uchwycenia optymalnego sygnału fluorescencyjnego.

11. Kwantyfikacja testu kiełkowania

  1. Po zobrazowaniu kiełków zaimportuj pliki obrazów do ImageJ i użyj narzędzia Policz, aby policzyć liczbę kiełków, lub narzędzia Linia, aby zmierzyć długość kiełków.
    UWAGA: Kiełki definiuje się jako wypukłości śródbłonka o długości większej lub równej średnicy koralika, z którego wyrastają. 11 Długość kiełka może być mierzona jako odległość od punktu, w którym kiełek zaczyna wystawać z koralika, do czubka kiełka. Średnia długość kiełków na koralik i średnia liczba kiełków na koralik są przydatnymi wskaźnikami do oceny fenotypowych efektów wyciszania genów w angiogenezie kiełkowania. Średnia liczba kulek zawierających co najmniej jeden kiełek na grupę poddawaną działaniu substancji może być również wykorzystana jako wskaźnik do oceny odporności kiełkowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia ścisłe powiązanie dwóch typów komórek in vitro, a obecność perycytów uzupełnia zjawisko kiełkowania (Rycina 1A, B). Protokół ten pozwala również na efektywne wyciszenie (np. poprzez interferencję RNA) wybranego genu w konkretnym typie komórek (na przykład VEGFA specyficznie w komórkach śródbłonka lub PDGFRβ w perycytach)7,12 w trakcie bad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia metodę charakteryzowania złożonych etapów i heterotypowych interakcji komórkowych angiogenezy kiełkowania, umożliwiając badaczowi zastosowanie podejść genetycznych i obrazowych w celu przeprowadzenia dokładnych badań mechanistycznych. Podczas wykonywania testu ważne jest, aby skuteczne pokrycie śródbłonka kulek miało miejsce podczas etapów mieszania kulek. Słaba powłoka śródbłonka stanie się widoczna, jeśli koraliki nie wydają się mieć szorstkiej powierzchni przypominającej piłkę golfową następne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy doktorom Victorii Bautch i Joshua Boucher za pomocne dyskusje i porady dotyczące optymalizacji standardowych warunków testowania kiełkowania koralików i protokołu barwienia testu kiełkowania. S.H.A. było częściowo wspierane przez grant z National Institute of General Medical Sciences w ramach nagrody 5T32 GM007092.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylne końcówki do pipetPipety VWR
Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet KitLonzaCC-3162HUVEC Media
MEMGibco1109511410T1/2 Media
DMEMGibco11965118NHLF Media
PBS do hodowli tkankowych klasy PBSGibco14190-144Nie zawiera magnezu i wapnia
AccutaseLife TechnologiesA1110501Do liftingu HUVEC
TrypsinLife Technologies15050065Do podnoszenia 10T 1/2 i NHLF
Customs siRNASigma
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150
HUVECLonzaC2517A
10T 1/2ATCC
NHLFATCC Cytodex
3 kulki mikronośnikoweSigmaC3275
Płytki 6 i 10 cm powlekane kulturami tkankowymiCorning
Fibrinogen z osocza bydlęcegoSigmaF8630
TrombinSigmat9549
AprotyninaSigmaa3428
Falcon Probówki z okrągłym dnemCorning
Inkubator do hodowli tkankowych z kapturem
24-dołkowe szklane płytki denneMatTekP24G1.513FPłytki ze szklanym dnem są potrzebne tylko wtedy, gdy kiełki mają być obrazowane. Jeśli nie, dopuszczalne jest również stosowanie plastiku z kultur tkankowych.
Sterylne urządzenie
filtracyjne

Bibliografia

  1. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  2. Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
  3. Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
  4. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
  5. Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
  6. Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
  7. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  8. Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
  9. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  10. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  11. Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
  12. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
  13. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wypustkowanie kom rek r db onkainterakcja perycyty r db onkowatest angiogenezy na kuleczkachpowlekanie kuleczek mikrono nikowychimplantacja elu fibrynowegowyciszanie gen w siRNAzawiesina kuleczek z kom rkamiangiogeneza in vitroinkorporacja kom rek muralnychtest biologii naczyniowej
Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.