Method Article

Tworzenie biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych: techniki identyfikacji i kwantyfikacji

DOI:

10.3791/57322

⸱

May 6th, 2018

 , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół umożliwia czytelnikowi analizę powstawania biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych przy użyciu wieloaspektowego podejścia do uchwycenia dynamicznej natury biofilmów bakteryjnych poprzez ocenę przylegania, tworzenia matrycy substancji polimerowej zewnątrzkomórkowej i dyspersji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie biofilmu to dynamiczny, wieloetapowy proces, który zachodzi u bakterii w trudnych warunkach środowiskowych lub w okresach stresu. W przypadku patogenów jelitowych znaczna reakcja na stres jest indukowana podczas pasażu żołądkowo-jelitowego i po ekspozycji na żółć, która jest normalnym składnikiem trawienia człowieka. Aby przezwyciężyć bakteriobójcze działanie żółci, wiele patogenów jelitowych tworzy biofilm, który przypuszczalnie umożliwia przetrwanie podczas przechodzenia przez jelito cienkie. W tym miejscu przedstawiamy metodologie definiowania tworzenia biofilmu poprzez testy przylegania do fazy stałej, a także wykrywanie i wizualizację matrycy zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS). Ponadto przedstawiono ocenę dyspersji biofilmu w celu naśladowania analizy zdarzeń wyzwalających uwalnianie bakterii w procesie infekcji. Barwienie fioletem krystalicznym służy do wykrywania przylegających bakterii w wysokoprzepustowym 96-dołkowym teście przylegania płytki. Ocenę produkcji EPS określa się za pomocą dwóch testów, a mianowicie barwienia mikroskopowego matrycy EPS i analizy półilościowej z fluorescencyjnie sprzężoną lektyną wiążącą polisacharydy. Na koniec dyspersję biofilmu mierzy się poprzez zliczanie kolonii i posiew. Pozytywne dane z wielu testów wspierają charakterystykę biofilmów i mogą być wykorzystane do identyfikacji tworzenia biofilmu wywołanego solami żółciowymi w innych szczepach bakterii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie biofilmu jest ważną strategią przetrwania bakterii indukowaną podczas trudnych warunków środowiskowych. Narażenie na związki bakteriobójcze, takie jak antybiotyki, lub zmiany w dostępności składników odżywczych lub tlenu wywołują u bakterii stan stresu, który można złagodzić poprzez tworzenie biofilmu. Biofilm charakteryzuje się przyczepieniem bakterii do powierzchni lub innych bakterii i towarzyszy mu wydzielanie matrycy EPS składającej się głównie z polisacharydów1,2,3. Powstawanie biofilmu to dynamiczny proces, w którym kaskada zdarzeń kończy się utworzeniem dojrzałej przylegającej społeczności bakteryjnej1,2,3. Bakterie wytwarzają adhezyny, które ułatwiają wczesne przyłączanie, jednocześnie zmieniając profile ekspresji genów adhezyny, aby wzmocnić przyczep podczas dojrzewania biofilmu. Jednocześnie zachodzi produkcja EPS w celu pokrycia społeczności bakteryjnej w matrycy w celu ochrony komórek przed początkowym stresorem. Bakterie zawarte w biofilmie rosną powoli; i jako takie sprawia, że większość antybiotyków jest nieskuteczna. Co więcej, powolny wzrost oszczędza energię, dopóki warunki nie zmienią się na korzyść rozwoju bakterii1,2,3. Po ustąpieniu trudnych warunków bakterie rozpraszają biofilm i wznawiają planktonowy tryb życia1,2,3. Tradycyjnie, biofilmy są obserwowane na powierzchniach i stanowią trwałe wyzwanie kliniczne ze względu na rezerwuary infekcji obecne na cewnikach i urządzeniach w pomieszczeniach1,2,3.

Ostatnio opisano tworzenie biofilmu dla kilku patogenów jelitowych; bakterie, które infekują jelito cienkie lub okrężnicę4. W przypadku gatunków Shigella zakażenie występuje w okrężnicy człowieka po przejściu przez większość przewodu pokarmowego. Podczas przechodzenia przez jelito cienkie Shigella jest narażona na działanie żółci; Detergent rozkładający lipidy wydzielany do jelita w celu ułatwienia trawienia lipidów, jednocześnie zabijając większość bakterii5. Patogeny jelitowe mają unikalną zdolność opierania się bakteriobójczemu działaniu żółci6. W naszej ostatniej analizie wykorzystaliśmy podobne do in vivo kombinacje glukozy i soli żółciowych, aby wykazać silne tworzenie biofilmu u S. flexneri, a także innych gatunków Shigella, patogennej Escherichia coli i Salmonella4. Wcześniej wykazano, że serowar Salmonella enterica Typhi tworzy biofilm wywołany żółcią w wyniku unikalnej kolonizacji pęcherzyka żółciowego podczas przewlekłej infekcji7,8,9,10. Dodatkowo, wcześniejsze badania z Vibrio11 i Campylobacter12 wykazały tworzenie biofilmu w odpowiedzi na żółć. W związku z tym analizy rozszerzyły obserwacje tworzenia się biofilmu indukowanego żółcią na inne patogeny i pomogły w wykazaniu konserwatywnej odpowiedzi patogenu jelitowego na żółć. W przeciwieństwie do przewlekłych biofilmów, w których transkrypcja genów bakteryjnych jest ograniczona i może wystąpić starzenie się komórek1,2,3, sugerujemy, że biofilm wywołany żółcią jelitową ma charakter bardziej przejściowy. Ten przejściowy, zjadliwy biofilm charakteryzuje się szybkim rozkładem (jak widać w teście dyspersji) i zwiększoną ekspresją genów wirulencji obserwowaną w populacji biofilmu4,6.

Ponieważ tworzenie biofilmu jest wieloaspektowym, dynamicznym procesem, a użycie soli żółciowych jako czynnika inicjującego zostało dopiero niedawno opisane dla większości patogenów jelitowych, stosowane narzędzia i techniki są unikalnymi i kreatywnymi zastosowaniami tradycyjnych metod. W związku z tym przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się strategie ilościowego określenia kilku ważnych cech tworzenia biofilmu indukowanego solą żółciową, w tym przylegania bakterii, produkcji matrycy EPS i dyspersji żywych bakterii z biofilmu. Techniki te zostały wykorzystane przede wszystkim do badań z Shigella; W związku z tym ocena innych patogenów jelitowych może wymagać optymalizacji. Niemniej jednak pozytywne dane ze wszystkich trzech testów wspierają identyfikację biofilmów i ustanawiają powtarzalne protokoły tworzenia biofilmu indukowanego solami żółciowymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. Podłoże z solami żółciowymi: Aby przygotować tryptyczny bulion sojowy (TSB) zawierający 0,4% soli żółciowych (wagowo/objętościowo), należy ponownie zawiesić 200 mg soli żółciowych w 50 ml autoklawizowanego TSB. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Zrób świeżą pożywkę co tydzień.
    Uwagi: Rutynowo stosowane sole żółciowe to mieszanina cholanu sodu i deoksycholanu sodu w stosunku 1:1 wyizolowana z pęcherzyków żółciowych owiec i bydła. Jak wykazano wcześniej4, obecność glukozy była niezbędna do tworzenia biofilmu wywołanego solami żółciowymi. TSB dodał glukozę w stosunku do bulionu Luria-Bertani (LB); a zatem był wystarczający do wywołania tworzenia biofilmu u Shigella i innych analizowanych patogenów jelitowych. W zależności od bakterii, które mają być analizowane, mogą być potrzebne różne stężenia glukozy lub różne wymagania dotyczące cukru.
  2. 0,5% w/v fioletu krystalicznego w wodzie: Rozpuść 2,5 g fioletu krystalicznego w 500 ml wody destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
  3. Konkanawalina A (ConA) sprzężona z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC): Rozpuść zapas w 1x PBS. Rozcieńczyć skoncentrowany bulion 10 mg w 400 μl 1x PBS do końcowego stężenia 25 μg/ml i chronić przed światłem.
  4. PBS + Glukoza: Rozpuść 0,2 g glukozy w 10 ml 1x PBS (2% w/v glukozy końcowej). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
  5. PBS + sole żółciowe: Rozpuść 40 mg w 10 ml 1x PBS (0,4% w/v soli żółciowych końcowych). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
  6. PBS + glukoza i sole żółciowe: Rozpuścić 40 mg soli żółciowych i 0,2 g glukozy w 10 ml 1x PBS (0,4% w/v soli żółciowych i 2% w/v glukozy końcowej). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
  7. Przygotuj płytki agarowe LB.
  8. Wiązanie formaldehydu/aldehydu glutarowego: Dodaj 810 μl formaldehydu (37% roztwór podstawowy, 3% stężenie końcowe) i 125 μl aldehydu glutarowego (25% roztwór podstawowy, 0,25% stężenie końcowe) do 14 ml 1x PBS. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C. Poprawka powinna być zimna, aby można było z niej korzystać.
    Ostrzeżenie: Poprawka jest toksyczna i wymaga utylizacji odpadów niebezpiecznych.
  9. Roztwór do mocowania zapobiegającego blaknięciu: Użyj roztworu do mocowania zapobiegającego blaknięciu zawierającego barwnik 4,6-diamidino-2-fenyloindolowy (DAPI), aby zahamować fotowybielanie próbek mikroskopii immunofluorescencyjnej podczas fluorescencyjnego barwienia DNA bakterii.

2. Przygotowanie bakterii

  1. Hodować przez noc kultury szczepów bakteryjnych, które mają być testowane, zaszczepiając 3 ml TSB pojedynczą, dobrze izolowaną kolonią w sterylnej probówce hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min do inkubacji przez noc (16 - 24 h).
    UWAGA: Szczepy powinny być ponownie wyjmowane z zamrażarki co 2 do 4 tygodni i utrzymywane na talerzach nie starszych niż 2 tygodnie.

3. Test adherencji w fazie stałej

UWAGA: Ten test określa ilościowo przylegające bakterie przy użyciu metody 96-dołkowej płytki. Bakterie są hodowane statycznie w płaskich płytach dennych. Mycie odbywa się w celu usunięcia nieprzywierających bakterii, a bakterie przylegające są barwione fioletem krystalicznym. Plama fioletu krystalicznego wiąże peptydoglikan w ścianie komórkowej bakterii i może być rozpuszczalna przy użyciu etanolu. Liczba bakterii adherentnych jest określana na podstawie retencji fioletu krystalicznego.

  1. Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml. Etykieta z TSB lub TSB + sole żółciowe (BS).
  2. Dodaj 1 ml TSB lub TSB + BS do odpowiednich probówek.
  3. Zaszczepić probówki 20 μl nocnej hodowli (w rozcieńczeniu 1:50).
  4. Na sterylnej, przezroczystej, płaskodennej, 96-dołkowej płytce poddanej kulturze tkankowej dodać 130 μl / basenik niezaszczepionej pożywki kontrolnej do trzech dołków, aby służyły jako ślepa kontrola. Ustaw trzy studzienki kontrolne dla każdego typu nośnika (TSB i TSB + BS), który ma być testowany.
  5. Dodać 130 μl/studzienkę zaszczepionej kultury do trzech studzienek i powtarzać, aż wszystkie warunki doświadczalne zostaną posiane w trzech egzemplarzach.
  6. Inkubować statycznie przez 4 - 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  7. Za pomocą czytnika płytek zapisz OD600. Ustaw studzienki kontrolne jako "puste". Upewnij się, że pożywka kontrolna jest czysta i nie ma oznak zmętnienia. Jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek zmętnienie, odrzuć eksperyment. Wartości OD600 mogą być wykorzystane do normalizacji danych, jeśli istnieją znaczące różnice w szybkości wzrostu między szczepami bakteryjnymi.
  8. Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą linii próżniowej, delikatnie przechylając płytkę i powoli zasysając pożywkę przy dolnej krawędzi studzienki. Pamiętaj, aby zebrać całą pożywkę hodowlaną bez zakłócania przylegającej populacji bakterii znajdujących się na plastikowej powierzchni. Jeśli matryca EPS została wytworzona w czasie inkubacji, matryca zostanie uwidoczniona jako biały osad. Nie zakłócaj pracy matrycy EPS.
  9. Delikatnie umyj studzienki za pomocą 200 μl sterylnego PBS. Wyjmij mycie PBS za pomocą przewodu próżniowego.
  10. Odwróć płytkę do wyschnięcia. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 20 minut.
    UWAGA: Ponieważ biofilm musi być dokładnie wysuszony przed barwieniem, protokół można wstrzymać na tym etapie na kilka godzin lub nawet na noc. Dodatkowy czas schnięcia nie zmieni procedury barwienia, podczas gdy niepełne suszenie wpłynie na kwantyfikację wyników i odtwarzalność.
  11. Dodaj 150 μl 0,5% fioletu krystalicznego do każdej studzienki doświadczalnej i kontrolnej.
  12. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  13. Umyj studzienki raz 400 μl wody destylowanej. Dodatkowa objętość pomaga usunąć resztkową plamę fioletu krystalicznego z boków studzienek. Usuń pranie za pomocą przewodu próżniowego.
  14. Umyj studzienki pięciokrotnie 200 μl wody destylowanej. Usuń pranie za pomocą przewodu próżniowego.
    UWAGA: Dokładne mycie jest ważne dla oceny ilościowej. Gdy ślepe studzienki są czyste od wody destylowanej i nie zawierają żadnych pozostałości plamy fioletu krystalicznego, przejdź do następnego kroku.
  15. Odwróć płytkę do wyschnięcia, chroniąc przed światłem. Upewnij się, że płyta całkowicie wyschnie, jak wspomniano powyżej.
  16. Odbarwić studzienki 200 μl 95% etanolu. Inkubować płytkę na wytrząsarce przez 30 minut. Aby uniknąć parowania, szczególnie w wyższych temperaturach, wykonaj ten krok w temperaturze 4 °C.
  17. Za pomocą czytnika płytek zapisz OD540.
    UWAGA: Długość fali dla maksymalnej absorbancji fioletu krystalicznego jest bliska 590 nm. W literaturze podaje się zakres od OD540 - OD5954,13,14,15,16 dla absorbancji fioletu krystalicznego; W ten sposób wybierz dostępną długość fali w oparciu o czytnik płytek.

4. EPS Wykrywanie macierzy

UWAGA: Te uzupełniające testy kwantyfikują i wizualizują EPS. W obu przypadkach EPS jest wykrywany za pomocą lektyny do wiązania polisacharydów. Białko sprzężone fluorescencyjnie umożliwia kwantyfikację (krok 4.1) lub wizualizację (krok 4.2).

  1. Półilościowe wykrywanie EPS
    1. Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml. Etykieta z TSB lub TSB + BS.
    2. Dodaj 1 ml TSB lub TSB + BS do odpowiednich probówek.
    3. Zaszczepić probówki 20 μl nocnej kultury (rozcieńczenie 1:50).
    4. Na sterylnej, czarnej, płaskodennej, poddanej kulturze tkankowej 96-dołkowej płytce, dodaj 130 μl / basenik niezaszczepionej pożywki kontrolnej do trzech dołków, aby służyły jako ślepa kontrola. Ustawić trzy studzienki kontrolne dla każdego rodzaju badanego medium. Dodać 130 μl/studzienkę zaszczepionej kultury do studzienek i powtarzać, aż wszystkie warunki doświadczalne zostaną posiane w trzech egzemplarzach.
    5. Inkubować statycznie przez 4 - 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    6. Przenieść pożywkę hodowlaną na przezroczystą 96-dołkową płytkę za pomocą pipety, najlepiej pipety wielokanałowej. Należy zachować ostrożność, aby zebrać całą pożywkę hodowlaną bez zakłócania pracy populacji przylegającej i/lub EPS znajdującego się na powierzchni tworzywa sztucznego. Uchylenie.
    7. Utrwalić czarną płytkę na 15 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 200 μl/studzienkę formaldehydu/aldehydu glutarowego w 1x PBS.
    8. Podczas gdy populacja przylegająca się utrwala, oceń frakcję supernatantu z kroku 4.1.6. Za pomocą czytnika płytek zapisz OD600. Ustaw studzienki kontrolne jako "puste". Upewnij się, że pożywka kontrolna jest czysta i nie ma oznak zmętnienia. Jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek zmętnienie, odrzuć eksperyment.
      1. Alternatywnie, cały test można przeprowadzić na czarnej, przezroczystej płycie dolnej. W takich okolicznościach można zarejestrować wartości OD600, a pożywkę hodowlaną można następnie wyrzucić przed przejściem do kroku 4.1.7. Wartości OD600 można wykorzystać do normalizacji danych w przypadku znacznych różnic w tempie wzrostu między szczepami bakteryjnymi.
    9. Usuń poprawkę i wyrzuć do odpadów niebezpiecznych.
    10. Delikatnie umyć studzienki dwukrotnie 200 μl/studzienkę sterylnego PBS. Wyjmij płuczkę PBS za pomocą przewodu próżniowego, delikatnie przechylając płytkę i powoli zasysając płyn do dolnej krawędzi studzienki.
    11. Dodać 150 μl/basenik 25 μg/mL ConA-FITC i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Delikatnie przemyć dwukrotnie 200 μl PBS.
    13. Dodaj 150 μl PBS do każdej studzienki. Zapisać fluorescencję przy długości fali 488 nm.
  2. Mikroskopia konfokalna, wizualizacja produkcji EPS i obliczanie grubości biofilmu
    1. Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml. Etykieta z TSB lub TSB + BS.
    2. Dodaj 1 ml TSB lub TSB + BS do odpowiednich probówek.
    3. Zaszczepić probówki 20 μl nocnej hodowli (w rozcieńczeniu 1:50).
    4. Ustawić sterylną 24-dołkową płytkę ze sterylnymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm. Dodać 400 μl/studzienkę niezaszczepionej pożywki kontrolnej do trzech studzienek, aby służyły jako ślepa próba. Ustawić trzy studzienki kontrolne dla każdego rodzaju badanego medium.
    5. Dodać 400 μl zaszczepionej kultury do studzienek w dwóch dołach i powtarzać, aż wszystkie warunki eksperymentalne zostaną platerowane.
    6. Inkubować statycznie przez 4 - 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    7. Wizualnie potwierdzić wzrost w stanie TSB, wzrost i osad EPS (biały) w stanie TSB + BS oraz brak wzrostu i/lub białego osadu w sterylnych studzienkach kontrolnych. Usunąć supernatanty.
    8. Utrwalać przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy użyciu 200 μl/studzienkę roztworu formaldehydu/aldehydu glutarowego w 1x PBS.
    9. Usuń poprawkę i wyrzuć do odpadów niebezpiecznych.
    10. Delikatnie umyć studzienki dwukrotnie 200 μl/studzienkę sterylnego PBS. Wyjmij mycie PBS za pomocą przewodu próżniowego.
    11. Dodać 150 μl/basenik po 25 μg/ml ConA-FITC i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Delikatnie przemyć dwukrotnie 200 μl/studzienkę PBS.
    13. Montaż z roztworem mocującym zapobiegającym blaknięciu z DAPI.
      UWAGA: Roztwór jest gotowym roztworem montażowym na bazie glicerolu zawierającym DAPI do zachowania etykiety fluorescencyjnej przy jednoczesnym barwieniu DNA w komórkach bakteryjnych w celu wizualizacji jako barwienia przeciwstawnego. Postępuj zgodnie ze wskazówkami i zaleceniami zestawu dotyczącymi czasu inkubacji przed obrazowaniem próbek. Procedurę barwienia DAPI można przeprowadzić przed nałożeniem roztworu do mocowania zapobiegającego blaknięciu, który nie zawiera DAPI.
    14. Ocena za pomocą mikroskopii konfokalnej. W mikroskopie konfokalnym ustaw laser na wzbudzenie/emisję 495 nm/519 nm w celu wizualizacji FITC. Ustaw drugi laser na wzbudzenie/emisję 360 nm/460 nm, aby zobrazować DAPI. Zlokalizuj biofilm, skupiając się na kanale DAPI. Użyj zarówno kanałów DAPI, jak i FITC, aby określić pełną grubość i ustawić górną i dolną granicę obrazowania. Rejestruj obrazy stosu Z o pełnej grubości, przechwytując obrazy co 0,25 μm po ustawieniu obwodów na górze i na dole stosu Z. Więcej informacji na temat mikroskopii konfokalnej można znaleźć w publikacjach Paddocka i wsp.17,18,19,20
    15. Zrekonstruuj obrazy 3D w ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/), aby zobrazować pełne tworzenie się biofilmu i obliczyć grubość biofilmu. Średnia grubość uzyskana dla biofilmów indukowanych solą żółciową S. flexneri wynosiła 14 μm4.

5. Test dyspersji

UWAGA: W tym teście wykrywa się demontaż biofilmu poprzez dyspersję bakteryjną. Tutaj tworzą się dojrzałe biofilmy, a następnie (zwykle następnego dnia) pożywki są zastępowane PBS lub uzupełnionym PBS. Składnik sklarowany nad osadem jest następnie oceniany w celu ilościowego określenia liczby bakterii, które oddzieliły się od biofilmu.

  1. Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml. Etykieta z TSB lub TSB + BS.
  2. Dodaj 1 ml TSB lub TSB + BS do odpowiednich probówek.
  3. Zaszczepić probówki 20 μl nocnej hodowli (w rozcieńczeniu 1:50).
  4. Na sterylnej, przezroczystej, płaskodennej, 96-dołkowej płytce poddanej kulturze tkankowej dodać 130 μl / basenik niezaszczepionej pożywki kontrolnej do trzech dołków, aby służyły jako ślepa kontrola. Skonfiguruj trzy studzienki kontrolne dla każdego typu nośnika, który ma być testowany.
  5. Dodać 130 μl/basenik zaszczepionej kultury do trzech dołków i powtarzać, aż wszystkie warunki doświadczalne zostaną posiane w trzech egzemplarzach.
  6. Inkubować płytkę statycznie przez 4-24 godziny w temperaturze 37 °C.
  7. Przed kontynuacją ogrzej PBS, PBS + glukoza, PBS + sole żółciowe i PBS + sole żółciowe + glukoza do 37 °C. Odczynniki te należy codziennie przygotowywać na świeżo.
  8. Za pomocą czytnika płytek zapisz OD600. Ustaw studzienki kontrolne jako "puste". Upewnij się, że podłoże jest klarowne bez oznak zmętnienia. Jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek zmętnienie, odrzuć eksperyment. Wartości OD600 mogą być wykorzystane do normalizacji danych, jeśli istnieją znaczące różnice w szybkości wzrostu między szczepami bakteryjnymi.
  9. Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą przewodu próżniowego. Pamiętaj, aby zebrać całą pożywkę hodowlaną bez zakłócania populacji przylegającej znajdującej się na plastikowej powierzchni.
  10. Delikatnie umyć studzienki dwukrotnie 200 μl/studzienkę sterylnego PBS. Wyjmij mycie PBS za pomocą przewodu próżniowego.
  11. Zastąp płukanie 130 μl/studzienką następujących składników w trzech studzienkach każdy: PBS, PBS + glukoza, PBS + sole żółciowe i PBS + sole żółciowe + glukoza. Odczynniki te muszą być wstępnie podgrzane do temperatury 37 °C.
  12. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  13. Ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C. Przenieść supernatanty na świeżą, sterylną płytkę 96-dołkową.
  14. Używając 96-dołkowej płytki lub bloku rozcieńczającego, przygotować 10-krotne (1:10) seryjne rozcieńczenia supernatantu do sterylnego PBS.
    UWAGA: Seria rozcieńczeń powinna wahać się od nierozcieńczonego do 10-6 w zależności od badanego szczepu bakteryjnego. Można przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu określenia optymalnego zakresu rozcieńczania.
  15. Umieścić na agarze LB 5 μl każdego rozcieńczenia za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Policz kolonie następnego dnia i uwzględnij współczynnik rozcieńczenia przy określaniu jednostek tworzących kolonie regeneracyjne (CFU). Aby obliczyć procentową dyspersję w stosunku do kontroli 1x PBS (ustawionej na 100%), podziel CFU odzysku z każdego warunku leczenia przez CFU odzysku z próbki kontrolnej 1x PBS.
    UWAGA: Można również użyć rutynowych płytek z pożywkami dla interesującego szczepu bakteryjnego. Na przykład Shigella może być platerowana na czerwonych talerzach Kongo. Upewnij się, że płytki są suche, aby można było zastosować odpowiednie techniki powlekania punktowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 1, tworzenie się biofilmu jest indukowane w większości z sześciu badanych patogenów jelitowych po wzroście w pożywce zawierającej sole żółciowe. Znaczny wzrost bakterii adherentnych po ekspozycji na sole żółciowe obserwuje się w prawie wszystkich badanych szczepach. Wyjątkiem jest enteroagregacyjny E. coli (EAEC); należy jednak zwrócić uwagę na indukowaną obserwację Δaaf mutant4. Wyniki wskazują, że dodatk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza powstawania biofilmu jest trudna ze względu na dynamiczny charakter biofilmów i zmienność między szczepami, materiałami, laboratoriami i testami. W tym miejscu przedstawiono kilka strategii określania tworzenia biofilmu w patogenach jelitowych po ekspozycji na sole żółciowe, z dostarczonymi informacjami eksperymentalnymi w celu zwiększenia odtwarzalności. Istnieją dodatkowe względy w celu zapewnienia odtwarzalności. Przede wszystkim zalecamy przeprowadzenie co najmniej trzech niezależnych eksperymentów, z których...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Rachael B. Chanin i Alejandro Llanos-Chea za pomoc techniczną. Dziękujemy Anthony'emu T. Maurelliemu, Bryanowi P. Hurleyowi, Alessio Fasano, Brettowi E. Świerczewskiemu i Bobby'emu Cherayilowi za szczepy użyte w tym badaniu. Prace te były wspierane przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases Grant K22AI104755 (CSF). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tryptyczny bulion sojowySigma-Aldrich22092-500G
Crystal VioletSigmaC6158-50
Concanavalin-A FITCSigmaC7642-10mg
GlukozaSigmaG7021-1KG
Sole żółcioweSigmaB8756-100G
LB AgarSigmaL7533-1KG
Probówki hodowlane 14 mL, 17 x 100 mm, plastikowe, sterylneFisher14-959-11B
Vectashield twardy środek zapobiegający blaknięciu z DAPIVector LaboratoriesH-1500
FormaldehydSigma-AldrichF1635-500
Aldehyd gluterowySigma-AldrichG6257
Płaskodenne płytki 96-dołkowe (przezroczyste)TPP92696
Płaskodenne płytki 96-dołkowe (czarne)Greiner Bio-One655076
Płytki 24-dołkowe płaskodenne (przezroczyste)TPP92424
Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm, okrągłeFisher08-774-383
Czytnik płytek 96-dołkowychSpectramax
Czytnik płytek fluorescencyjnychBiotek Synergy 2
Konfokalny lub fluorescencyjny MikroskopNikon A1 mikroskop konfokalny
37° C Inkubator wstrząsającyNew Brunswick Scientific Excella E25
37° C Inkubator płytkowyThermolyne serii 5000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063(2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202(2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132(2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), 992-6, 998-1002, 1004 (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745(2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151(2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178(2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bile Salt BiofilmEnteric PathogensCrystal Violet StainingEPS DetectionBiofilm DispersionColony CountingFluorescent Lectin Assay96 Well Plate AssayStatic IncubationPBS Washing

Related Articles