Ten protokół umożliwia czytelnikowi analizę powstawania biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych przy użyciu wieloaspektowego podejścia do uchwycenia dynamicznej natury biofilmów bakteryjnych poprzez ocenę przylegania, tworzenia matrycy substancji polimerowej zewnątrzkomórkowej i dyspersji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych: techniki identyfikacji i kwantyfikacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tworzenie biofilmu to dynamiczny, wieloetapowy proces, który zachodzi u bakterii w trudnych warunkach środowiskowych lub w okresach stresu. W przypadku patogenów jelitowych znaczna reakcja na stres jest indukowana podczas pasażu żołądkowo-jelitowego i po ekspozycji na żółć, która jest normalnym składnikiem trawienia człowieka. Aby przezwyciężyć bakteriobójcze działanie żółci, wiele patogenów jelitowych tworzy biofilm, który przypuszczalnie umożliwia przetrwanie podczas przechodzenia przez jelito cienkie. W tym miejscu przedstawiamy metodologie definiowania tworzenia biofilmu poprzez testy przylegania do fazy stałej, a także wykrywanie i wizualizację matrycy zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS). Ponadto przedstawiono ocenę dyspersji biofilmu w celu naśladowania analizy zdarzeń wyzwalających uwalnianie bakterii w procesie infekcji. Barwienie fioletem krystalicznym służy do wykrywania przylegających bakterii w wysokoprzepustowym 96-dołkowym teście przylegania płytki. Ocenę produkcji EPS określa się za pomocą dwóch testów, a mianowicie barwienia mikroskopowego matrycy EPS i analizy półilościowej z fluorescencyjnie sprzężoną lektyną wiążącą polisacharydy. Na koniec dyspersję biofilmu mierzy się poprzez zliczanie kolonii i posiew. Pozytywne dane z wielu testów wspierają charakterystykę biofilmów i mogą być wykorzystane do identyfikacji tworzenia biofilmu wywołanego solami żółciowymi w innych szczepach bakterii.
Wprowadzenie
Tworzenie biofilmu jest ważną strategią przetrwania bakterii indukowaną podczas trudnych warunków środowiskowych. Narażenie na związki bakteriobójcze, takie jak antybiotyki, lub zmiany w dostępności składników odżywczych lub tlenu wywołują u bakterii stan stresu, który można złagodzić poprzez tworzenie biofilmu. Biofilm charakteryzuje się przyczepieniem bakterii do powierzchni lub innych bakterii i towarzyszy mu wydzielanie matrycy EPS składającej się głównie z polisacharydów1,2,3. Powstawanie biofilmu to dynamiczny proces, w którym kaskada zdarzeń kończy się utworzeniem dojr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Podłoże z solami żółciowymi: Aby przygotować tryptyczny bulion sojowy (TSB) zawierający 0,4% soli żółciowych (wagowo/objętościowo), należy ponownie zawiesić 200 mg soli żółciowych w 50 ml autoklawizowanego TSB. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Zrób świeżą pożywkę co tydzień.
Uwagi: Rutynowo stosowane sole żółciowe to mieszanina cholanu sodu i deoksycholanu sodu w stosunku 1:1 wyizolowana z pęcherzyków żółciowych owiec i bydła. Jak wykazano wcześniej4, obecność glukozy była niezbędna do tworzenia biofilmu wywołanego solami żółciowymi. TSB dodał glukozę w stosunku do bulionu Luria-Bertan....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W Rycina 1tworzenie biofilmu jest indukowane u większości z sześciu badanych patogenów jelitowych po hodowli w pożywkach zawierających sole żółciowe. Znaczący wzrost liczby bakterii przylegających po ekspozycji na sole żółciowe obserwuje się w prawie wszystkich badanych szczepach. Wyjątkiem jest szczep enteroagregacyjny E. coli (EAEC); należy jednak zwrócić uwagę na wywołaną obserwację Δaaf mutant4Wyniki wska.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza powstawania biofilmu jest trudna ze względu na dynamiczny charakter biofilmów i zmienność między szczepami, materiałami, laboratoriami i testami. W tym miejscu przedstawiono kilka strategii określania tworzenia biofilmu w patogenach jelitowych po ekspozycji na sole żółciowe, z dostarczonymi informacjami eksperymentalnymi w celu zwiększenia odtwarzalności. Istnieją dodatkowe względy w celu zapewnienia odtwarzalności. Przede wszystkim zalecamy przeprowadzenie co najmniej trzech niezależnych eksperymentów, z których.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.
Podziękowania
Dziękujemy Rachael B. Chanin i Alejandro Llanos-Chea za pomoc techniczną. Dziękujemy Anthony'emu T. Maurelliemu, Bryanowi P. Hurleyowi, Alessio Fasano, Brettowi E. Świerczewskiemu i Bobby'emu Cherayilowi za szczepy użyte w tym badaniu. Prace te były wspierane przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases Grant K22AI104755 (CSF). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tryptyczny bulion sojowy | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glukoza | Sigma | G7021-1KG | |
| Sole żółciowe | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| Probówki hodowlane 14 mL, 17 x 100 mm, plastikowe, sterylne | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield twardy środek zapobiegający blaknięciu z DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyd | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Aldehyd gluterowy | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Płaskodenne płytki 96-dołkowe (przezroczyste) | TPP | 92696 | |
| Płaskodenne płytki 96-dołkowe (czarne) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Płytki 24-dołkowe płaskodenne (przezroczyste) | TPP | 92424 | |
| Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm, okrągłe | Fisher | 08-774-383 | |
| Czytnik płytek 96-dołkowych | Spectramax | ||
| Czytnik płytek fluorescencyjnych | Biotek Synergy 2 | ||
| Konfokalny lub fluorescencyjny Mikroskop | Nikon A1 mikroskop konfokalny | ||
| 37° C Inkubator wstrząsający | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37° C Inkubator płytkowy | Thermolyne serii 5000 |
Bibliografia
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
