Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Streszczenie

Stwierdzono, że narażenie na pewne chemikalia środowiskowe u ludzi i zwierząt powoduje uszkodzenia komórek β trzustki, co prowadzi do rozwoju cukrzycy typu 2 (T2DM). Chociaż mechanizmy indukowanego przez chemikalia β uszkodzenia komórek były niejasne i prawdopodobnie złożone, jednym z powtarzających się odkryć jest to, że te chemikalia wywołują stres oksydacyjny prowadzący do generowania nadmiernej ilości reaktywnych form tlenu (ROS), które indukują uszkodzenie komórki β. Aby zidentyfikować potencjalne cukrzycotwórcze chemikalia środowiskowe, wyizolowaliśmy komórki wysp trzustkowych od myszy C57BL / 6 i hodowaliśmy komórki wysp trzustkowych na 96-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych; następnie komórkom wysp trzustkowych dozowano chemikalia, a wytwarzanie ROS wykryto za pomocą barwnika fluorescencyjnego 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA). Korzystając z tej metody, odkryliśmy, że bisfenol A (BPA), benzo[a]piren (BaP) i polichlorowane bifenyle (PCB) mogą indukować wysoki poziom ROS, co sugeruje, że mogą potencjalnie indukować uszkodzenia w komórkach wysp trzustkowych. Ta metoda powinna być przydatna do badań przesiewowych ksenobiotyków cukrzycowych. Ponadto hodowane komórki wysp trzustkowych mogą być również przystosowane do analizy in vitro toksyczności indukowanej chemicznie w komórkach trzustki.

Wprowadzenie

Wzrost częstości występowania cukrzycy typu 2 stał się globalnym kryzysem zdrowotnym w ostatnich latach, stanowiąc poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego¹. Stwierdzono, że wiele czynników jest przyczynowo związanych z rozwojem T2DM, wśród których powtarzające się wyniki sugerują, że jednym z powszechnych punktów zbieżnych dla tych czynników jest indukcja stresu oksydacyjnego, który prowadzi do generowania nadmiernej ilości ROS^2,3.

Stwierdzono, że szerokie spektrum chemikaliów środowiskowych, w tym PCB, dioksyny i BaP, wywołuje stres oksydacyjny, który może upośledzać funkcję komórek β trzustki i prowadzić do insulinooporności i T2DM⁴. Chociaż fizjologiczny poziom ROS odgrywa ważną rolę w funkcjach komórkowych, narażenie na ROS, które przekracza zdolność systemu antyoksydacyjnego, powoduje uszkodzenie komórek/tkanek i prowadzi do chorób⁵. Komórki β trzustki wyrażają niski poziom enzymu przeciwutleniającego, a zatem są wrażliwym celem dla uszkodzeń wywołanych stresem oksydacyjnym^6,7. Wykazano, że przewlekłe narażenie na wysokie poziomy ROS powoduje wywołaną stresem dysfunkcję komórek trzustki⁵, a także insulinooporność wątroby i tkanki tłuszczowej⁸.

Ogólnym celem tego projektu jest opracowanie testu opartego na komórkach do badania substancji chemicznych pod kątem ich potencjału cukrzycowego na podstawie indukcji ROS w komórkach trzustki. Trzustka nie ma detoksykacji metabolicznej i jest wrażliwym celem dla uszkodzeń wywołanych przez ksenobiotyki^6,7. W związku z tym, poprzez bezpośredni pomiar ROS generowanych w komórkach trzustki, test ten powinien zapewnić bezpośrednie przybliżenie uszkodzenia trzustki wywołanego substancją chemiczną. Aby opracować tę metodę, wyizolowaliśmy mysie wyspy trzustkowe, wyhodowaliśmy izolowaną wyspę trzustkową w warunkach hodowli komórkowej za pomocą chemikaliów i wykorzystaliśmy indukowaną chemicznie generację ROS jako odczyt. Procedura ta jest prosta i skuteczna w identyfikacji substancji chemicznych indukujących ROS w izolowanej wysepce; Można go dalej rozwijać w celu zbadania mechanizmów toksyczności, które są specyficzne dla trzustki in vitro.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Demonstrowany protokół został przeprowadzony pod kierunkiem i za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania (IACUC) Instytutu Medycyny Genomowej Texas A&M.

1. Przygotowanie roztworu

1. Rozcieńczyć 10x zrównoważony roztwór soli Hanka do 1x podwójnie destylowanym_H2Oi przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować roztwór izolacyjny, dodając HEPES (10 mM), MgCl₂ (1 mM) i glukozę (5 mM). Dostosuj pH do 7,4 i trzymaj na lodzie.
3. Przygotować roztwór kolagenazy z kolagenazy typu 4.
   nuta: W szczególności kolagenaza typu 4 zawiera 160 U na mg suchej masy. 1 g kolagenazy typu 4 rozcieńcza się w 5 ml podwójnie destylowanego_H2Oo stężeniu 200 mg/ml. 2 ml rozcieńczonej kolagenazy dodaje się do 30 ml lodowatego roztworu izolacyjnego, a 6 ml roztworu kolagenazy przenosi się do probówki o pojemności 50 ml dla każdej myszy.
4. Przygotować roztwór do przemywania przez dodanie 1 mM CaCl₂ do roztworu izolacyjnego.
5. Przygotować roztwór oczyszczający z zimnym roztworem polisacharozy/ditrizoesanu sodu (1,1119 g/ml, 5 ml).
6. Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli wysp trzustkowych, dodając L-glutaminę (20 mM), penicylinę (100 U/ml), streptomycynę (100 μg/ml) i płodową surowicę bydlęcą (FBS) (10%) do pożywki RPMI.
7. Przygotować roztwór podstawowy DCFH-DA, rozpuszczając proszek w wodzie destylowanej o stężeniu 200 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   nuta: Roztwór barwiący ROS jest świeżo przygotowany przez rozcieńczenie roztworu podstawowego DCFH-DA do końcowego stężenia 5 μM w RPMI. Ten odczynnik należy chronić przed światłem.

2. Przygotowanie chirurgiczne

1. Dootrzewnowo wstrzyknąć (I.P.) myszy z awertyną (2,5% avertyny, 0,4 ml/20 g). Po tym, jak mysz zostanie całkowicie znieczulona i nie będzie już reagować na szczypanie tylnej stopy, należy ją poddać eutanazji i przenieść do kaptura biologicznego.
2. Umieść uśpioną mysz brzuchem skierowaną do góry i spryskaj skórę 70% etanolem w celu sterylizacji.
3. Otwórz jamę brzuszną za pomocą 1 cm nacięcia w kształcie litery U na górnej części brzucha i cofnij skórę w kierunku rostralnym nad klatką piersiową, aby odsłonić jamę brzuszną.

3. Perfuzja i usuwanie trzustki

1. Jak pokazano w Rysunek 1, znajdź lokalizację bańki. Użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby zacisnąć dwunastnicę blisko pozycji zwieracza Oddi. Użyj innej pary zakrzywionych kleszczy, aby zacisnąć ścianę dwunastnicy, aby zablokować drogę żółciową w dwunastnicy.
   nuta: Na tym etapie nie została wprowadzona bańka. Ten krok ma na celu zablokowanie drogi żółciowej w dwunastnicy.
2. Zmień położenie myszy tak, aby głowa była bliższa, a stopy dystalne w stosunku do badacza.
3. Znajdź wspólny przewód żółciowy i powoli wstrzyknij 3 ml roztworu kolagenazy za pomocą igły 30 G i strzykawki 5 ml. Upewnij się, że wspólny przewód żółciowy i trzustka są napełnione po wstrzyknięciu.
4. Usuń rozdętą trzustkę za pomocą zakrzywionych kleszczy i drobnych nożyczek, aby oddzielić ją od zstępującej okrężnicy, jelit, żołądka i śledziony. Umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce zawierającej 3 ml roztworu kolagenazy i trzymaj ją na lodzie.

4. Trawienie trzustki

1. Umieścić każdą probówkę o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Inkubuj przez 15 - 20 minut (czas różni się w zależności od odmiany i wieku myszy).
2. Zawibruj rurkę za pomocą wiru.
3. Basen 4 - 5 strawionych trzustek w dużym sterylnym sitku do zlewu i użyj miarki, aby trzustka dokładnie się rozpadła. Za pomocą igły 23 G i strzykawki o pojemności 10 ml z roztworem do płukania należy na siłę odpipetować strawione komórki z sita. Zebrać roztwór myjący do probówki o pojemności 50 ml.
4. Odwirować probówki o sile 97 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę i zdekantować supernatant.
5. Dodaj 25 ml roztworu myjącego do probówek i ponownie zawiesić tkankę poprzez delikatne wirowanie. Wirować tkanki w temperaturze 97 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę i zdekantować supernatant. Powtórz 3 razy. Uważaj, aby nie usunąć granulowanej tkanki.

5. Oczyszczanie wysepek

1. Dodać 10 ml roztworu oczyszczającego do umytego osadu tkankowego i delikatnie zawiesić zawartość.
2. Delikatnie nałóż 5 ml roztworu izolacyjnego na roztwór oczyszczający. Uważaj, aby między tymi dwoma roztworami znajdowała się ostra ciecz.
3. Odwirować probówkę o sile 560 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut z powolnym przyspieszaniem i bez hamowania. Włóż pipetę do interfejsu i zbierz warstwę wysp trzustkowych do nowych probówek o pojemności 50 ml.
4. Umyj wysepki zgodnie z opisem w kroku 3.5.

6. Posiewanie i obróbka komórek wysp trzustkowych

1. Zawiesić wyspy trzustkowe w 10 ml roztworu do hodowli wysp trzustkowych, delikatnie wymieszać i umieścić 100 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej na płytce 96-dołkowej. Umieść około 5 wysepek na 96 dołków.
2. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 12 godzin.
3. Odwirować (112 x g) 96-dołkową płytkę i usunąć pożywkę.
4. Rozcieńczyć chemikalia środowiskowe w pożywce hodowlanej wysepek. Dodać 100 μl każdego z rozcieńczalników chemicznych do oddzielnych studzienek płytki. Zawiesić wysepki w każdej studzience i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C (stężenie różni się w zależności od różnych substancji chemicznych w środowisku).

7. Barwienie i pomiar ROS

1. Po leczeniu wysp trzustkowych przemyć 1x PBS (200 μL na każde 96 dołków).
   nuta: Stężenie chemikaliów jest następujące: AFB1: 3 μM, Atrazyna: 100 μM, BaP: 10 μM, BPA: 100 μM, β-estrogen, PCB126: 10 μM, Nonylofenol i BPA: 100 μM.
2. Użyj N-acetylocysteiny (NAC) jako przeciwutleniacza do tłumienia ROS. Dodać 5 mM NAC do rozcieńczalników chemicznych indukowanych ROS i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C.
3. Odwirować 96-dołkową płytkę przy 112 x g i inkubować z 5 μM roztworem sondy fluorescencyjnej (H2-DCFH-DA rozpuszczony w pożywce RPMI) w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
4. Przemyć leczone komórki wysp trzustkowych 3 razy PBS i zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek przy 488 nm.
   nuta: Akumulację DCF w komórkach można zmierzyć poprzez wzrost fluorescencji przy długości fali 530 nm, gdy próbka jest wzbudzana przy długości fali 488 nm.
5. Wykonaj test wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS)⁹ na wyspach trzustkowych i nieleczonych ksenobiotykami indukujących ROS w celu zmierzenia wpływu ksenobiotyków na fizjologiczną funkcję wysp trzustkowych.

Wyniki

Mikrograf zdrowego wyizolowanego wysepki widoczny jest na Rysunku 2, gdzie wysepki mają kształt okrągły lub owalny i stosunkowo jednolity rozmiar (choć jednorodność rozmiaru może różnić się w zależności od szczepu). Następnie zbadaliśmy funkcje wysepek trzustkowych w teście in vitro, izolując wysepki i stymulując wydzielanie insuliny w hodowlach tych wysepek. Rysunek 3 przedstawia naszą typową analizę testu GSIS z wyizol...

Dyskusja

Coraz więcej dowodów sugeruje, że narażenie na chemikalia środowiskowe odgrywa ważną rolę w rozwoju cukrzycy typu 2. ROS indukowany ksenobiotykami został uznany za potencjalny czynnik etiologiczny przyczyniający się do rozwoju cukrzycy typu 2. Ludzie są narażeni na działanie szerokiej gamy ksenobiotycznych substancji chemicznych i istnieje ogromne zapotrzebowanie na nowatorskie techniki badawcze, aby skutecznie zidentyfikować substancje toksyczne dla trzustki i zbadać mechanizm toksyczności specyficzny dla komórek trzust...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 i razy; Hank' s Zrównoważony roztwór soli	GIBCO	14185-052
Kolagenaza typu 4	Worthington Biochemical Corporation	CLS-4
roztwór polisarozy/diatrizoinianu sodu	Sigma	10771
2',7'-dichlorofluoresceina (DCFH-DA)	Sigma	D6883-50MG
czytnik mikropłytek fluorescencyjnych	Biotek
L-glutamina	Sigma	G8540-25G
streptomycyna	GIBCO	15140148
FBS	GIBCO	26140079
RPMI 1640	GIBCO	11875-085
avertin	Sigma	T48402-25G
Zestaw ELISA insuliny dla szczurów/myszy	Millipore	EZRMI-13K
Wirówka	Sorval	Sorval RT7	do wirówki płytkowej 96-dołkowej
Czytnik mikropłytek	Biotek	Epoch 2	do odczytu fluorescencji