Artykuł metodologiczny

Protokół MPLEx do analiz multiomicznych próbek gleby

DOI:

10.3791/57343

⸱

30 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów z pojedynczej próbki gleby, co pozwala na skrócenie czasu przygotowania próbki i umożliwia analizy multiomiczną spektrometrią mas próbek o ograniczonych ilościach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zintegrowane badania metaproteomiczne, metabolomiczne i lipidomiczne (multiomiczne) oparte na spektrometrii mas (MS) zmieniają naszą zdolność do zrozumienia i scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych w systemach środowiskowych i biologicznych. Pomiary te umożliwiają nawet dokładniejsze analizy złożonych zbiorowisk mikroorganizmów glebowych, które są najbardziej złożonymi systemami mikrobiologicznymi znanymi do tej pory. Analizy multiomiczne wiążą się jednak z wyzwaniami związanymi z przygotowaniem próbki, ponieważ dla każdego badania omicznego zazwyczaj potrzebne są oddzielne ekstrakcje, co znacznie wydłuża czas przygotowania i wymaganą ilość próbki. Aby rozwiązać ten problem, stworzono metodę 3 w 1 do jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów (MPLEx) z tej samej próbki gleby, dostosowując podejście oparte na rozpuszczalnikach. Ten protokół MPLEx okazał się zarówno prosty, jak i niezawodny dla wielu typów próbek, nawet jeśli jest stosowany do ograniczonych ilości złożonych próbek gleby. Metoda MPLEx w znacznym stopniu umożliwiła również szybkie pomiary multiomiczne niezbędne do lepszego zrozumienia członków każdej społeczności drobnoustrojów, przy jednoczesnej ocenie zmian zachodzących w wyniku perturbacji biologicznych i środowiskowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena zbiorowisk mikroorganizmów glebowych ma ważne implikacje dla zrozumienia obiegu węgla i zmian klimatycznych. Niedawne badania uwypukliły jednak trudności, takie jak brak zsekwencjonowanych genomów mikrobioty w różnych typach gleb oraz nieznana funkcja wielu wykrytych białek. Wyzwania te wynikają z faktu, że gleba jest najbardziej złożonym zbiorowiskiem mikrobiologicznym znanym do tej pory1,2,3. Analizy multiomiczne, które łączą wyniki badań metagenomicznych, metatranskryptomicznych, metaproteomicznych, metabolomicznych i lipidomicznych, zostały ostatnio wdrożone do licznych badań gleby, aby lepiej zrozumieć obecne drobnoustroje, jednocześnie uzyskując kompleksowe informacje na temat zmian molekularnych zachodzących w wyniku perturbacji środowiskowych1,4,5. Jednym z wyzwań związanych z badaniami multiomicznymi jest to, że pomiary metaproteomiczne, metabolomiczne i lipidomiczne oparte na spektrometrii mas (MS) zazwyczaj wymagają określonego procesu ekstrakcji, aby każda omika była zgodna ze stwardnieniem rozsianym6,7,8,9. Te precyzyjne procedury sprawiają, że ich wdrożenie jest niezwykle trudne lub niemożliwe, gdy dostępna jest tylko ograniczona ilość próbki. Wyzwania te skłoniły nas do zbadania metody jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów (MPLEx), która mogłaby wykorzystywać mniejsze objętości lub masy próbek, poprawiając dokładność i zapewniając szybsze przygotowanie próbek do wszystkich trzech analiz10. Do tej pory nie ma alternatywnych procedur ekstrakcji gleby, które mogłyby osiągnąć wszystkie te cele.

Aby umożliwić globalne analizy multiomiczne pojedynczej próbki gleby, zastosowano protokół ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym oparty na separacji chloroformu, metanolu i wody10. Ta metoda została pierwotnie opracowana dla całkowitej ekstrakcji lipidów9,11, a ostatnio została zmieniona do jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów z pojedynczej próbki12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30, co pozwala na mniejszą ilość próbek i eksperymentalną zmienność10. W protokole MPLEx chloroform nie miesza się z wodą, co stanowi podstawę do trójfazowego chemicznego rozdzielania składników próbki na odrębne frakcje. Górna faza wodna zawiera zatem metabolity hydrofilowe, po których następuje krążek białkowy, a następnie warstwa lipidowa w dolnej fazie chloroformu (Rysunek 1). Gdy MPLEx jest stosowany do większości gleb, cząstki stałe gromadzą się na samym dnie probówek do pobierania próbek i mogą być wyrzucone po zebraniu wszystkich warstw. Każdy rodzaj gleby może być jednak inny, a w glebach wysoce organicznych, takich jak torf, szczątki gleby pozostają w środkowej warstwie i nie opadają na dno rurki do pobierania próbek. MPLEx zapewnia kilka korzyści podczas izolowania wielu typów cząsteczek z tej samej próbki, takich jak 1) mniejsze ilości próbek mogą być używane do analiz multiomicznych, 2) ekstrakcje multiomiczne z tej samej próbki zmniejszają ogólną zmienność eksperymentalną oraz 3) większa liczba próbek może być przygotowana znacznie szybciej w przypadku badań o wyższej przepustowości10. Łącznie korzyści te mają zasadnicze znaczenie dla zapewnienia lepszych możliwości pomiarowych w celu oceny próbek gleby i ich złożonych zbiorowisk mikroorganizmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Bardzo wilgotne gleby mogą być liofilizowane przed ekstrakcją bez szkody dla efektywności ekstrakcji. Można również użyć mokrej gleby, ale należy ją wziąć pod uwagę przy dodawaniu odczynników w określonych proporcjach.

UWAGA: Zaleca się użycie 20 g suchej masy gleby na ekstrakcję, która musi być podzielona na dwie probówki po 50 ml (maksymalnie 10 g ziemi na probówkę 50 ml). Ekstrakcje można skalować w górę lub w dół w zależności od dostępnej próbki.

UWAGA: Suche próbki gleby mogą być przesiane przez sito 3 mm w celu homogenizacji i usunięcia małych korzeni i skał. Nie przesiewaj mokrych próbek gleby, ponieważ próbka utknie na ekranie.

1. Liza komórek glebowych i ekstrakcja metabolitów, białek i lipidów (czas ~1 d)

  1. Na próbkę gleby o wadze 20 g należy odważyć 10 g w dwóch oddzielnych probówkach o pojemności 50 ml, które są kompatybilne z metanolem i chloroformem. Należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze probówek, ponieważ chloroform wypłukuje większość tworzyw sztucznych, zanieczyszczając próbki. Jeśli to możliwe, używaj szkła lub plastikowych rurek wykonanych z polipropylenu lub politetrafluoroetylenu (PTFE).
    UWAGA: Utrzymuj glebę na lodzie i w jak największym chłodzie podczas początkowych etapów ważenia i homogenizacji.
  2. Do każdej probówki dodaj 10 ml stali nierdzewnej przemytej chloroformem i kulek granatu. Do każdej probówki (jedna próbka podzielona na dwie probówki) dodać 4 ml zimnej ultraczystej wody (patrz tabela materiałów dla systemu oczyszczania) i przenieść próbki w pojemniku na lód do dygestoriów.
  3. Używając szklanej pipety serologicznej o pojemności 25 ml, szybko dodaj 20 ml lodowatego chloroformu:metanolu (v/v) w proporcji 2:1.
    Uwaga: Chloroform: metanol ma ostre potencjalne skutki zdrowotne: podrażnienie skóry, możliwe oparzenia chemiczne i podrażnienie układu oddechowego. Może wpływać na nerki, wątrobę i serce. Nosić odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice i zawsze pracować pod wyciągiem.
  4. Dokręć pokrywki i przekręć do roztworu. 2:1 choloroform: metanol pomaga rozbić ścianę komórkową prokariontów, a także dezaktywuje aktywność enzymatyczną.
  5. Przymocuj probówki do nasadek wirowych do probówek o pojemności 50 ml i jeśli to możliwe, wiruj poziomo przez 10 minut w temperaturze 4 °C w lodówce. Następnie umieść próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na ~15 minut, aby całkowicie je schłodzić.
  6. Używając sonikatora sondy umieszczonej w dygestorium, poddaj każdą próbkę sonikacji sondą o średnicy 6 mm (1/4") o amplitudzie 60% przez 30 s każda na lodzie.
    Uwaga: Podczas sonikacji zaleca się stosowanie obudowy dźwiękochłonnej i ochrony słuchu. Wysokie napięcie jest obecne w zasilaczu i wysokiej częstotliwości. Unikać dotykania dna lub boków naczynia na próbkę aktywną sondą; Może pęknąć lub stopić plastik.
  7. Umieść próbki w zamrażarce w temperaturze -80 °C na ~15 minut, ponieważ sonikacja może generować dużo ciepła.
  8. Powtórz kroki 1.5 - 1.7.
    UWAGA: Upewnij się, że próbki pozostają zimne przez cały czas trwania procedury lizy.
  9. Odwirować próbki przy 4 000 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. W tym momencie próbka zostanie rozdzielona na górną warstwę metabolitu, warstwę pośrednią białka i dolną warstwę lipidową (i pozostałą osadkę zanieczyszczeń). Zobacz Rysunek 1.
  10. Umieścić próbki na lodzie w pojemniku na lód i za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 10 ml usunąć górne warstwy metabolitów z dwóch probówek o pojemności 50 ml do jednej dużej szklanej fiolki.
    UWAGA: Unikaj zasysania jakiejkolwiek warstwy białka do pipety; W razie potrzeby pozostawić niewielką warstwę metabolitu.
  11. Lekko przechyl probówkę o pojemności 50 ml, aby uwolnić warstwę pośrednią białka, tak aby swobodnie unosiła się na dolnej warstwie lipidowej. Używając czystej szpatułki laboratoryjnej z płaską główką ze stali nierdzewnej, ostrożnie zgarnij obie warstwy pośrednie białka i umieść je razem w jednej nowej probówce o pojemności 50 ml.
  12. Za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 25 ml usunąć dolne warstwy lipidów z jednej dużej szklanej fiolki.
    UWAGA: Staraj się unikać aspirujących cząstek gleby; Jednak niektóre zanieczyszczenia glebowe i cząstki aspirowane wraz z lipidami zostaną usunięte w późniejszym czasie.
  13. Umieścić oddychające membrany na wierzchu fiolek z metabolitami i szkłem lipidowym i wysuszyć w koncentratorze próżniowym aż do wyschnięcia (lipidy ~ 4 - 5 godzin, metabolity przez noc).
  14. Do probówki z próbką białka i pozostałych probówek z osadkami zanieczyszczeń dodaj 20 ml lodowatego metanolu do każdej z nich i odwiruj. Odbywa się to z granulkami gruzu, aby spłukać chloroform przed próbą rozpuszczenia ewentualnego pozostałego białka z gruzu przed jego wyrzuceniem.
  15. Odwirować granulki zanieczyszczeń i międzywarstwę białkową w temperaturze 4 000 x g przez 5 minut, 4 °C, a następnie zdekantować metanol do pojemnika na odpady niebezpieczne w dygestorium.
  16. Zawiesić białka i szczątki w ciekłym azocie i wysuszyć w liofilizatorze (o temperaturze kolektora -105 °C ze względu na metanol o bardzo niskiej temperaturze zamarzania -98 °C) przez ~ 2 godziny.
    UWAGA: Nie przesuszaj granulek, ponieważ będą one trudniejsze do rozpuszczenia.
  17. Dodać 10 ml buforu do solubilizacji białek (4% SDS, 100 mM DTT (DL-ditiotreitol) w 50 mM buforze tris, pH 8,0; patrz Zestaw odczynników uzupełniających) do probówki międzywarstwowej białka i 20 ml do każdej z granulek zanieczyszczeń.
    Uwaga: SDS powoduje ostrą toksyczność i jest łatwopalny. Działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe. Nosić rękawice i okulary ochronne.
  18. W dygestorium sonda sonikuje próbki o amplitudzie 20% przez 30 sekund, aby wprowadzić je do roztworu. Wirować przez 2 min.
  19. Umieścić próbkę międzywarstwy białka w rotatorze probówki laboratoryjnej na 30 minut przy 300 obr./min, 50 °C, w celu rozpuszczenia białka.
  20. Wiruj poziomo próbki szczątków przez dodatkowe 10 minut, aby zlizować wszelkie pozostałe nienaruszone komórki, a następnie obracaj z próbkami międzywarstw białkowych przez pozostałe 20 minut.
  21. Odwirować wszystkie próbki o masie 4 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) i zebrać supernatant z każdej probówki na próbkę do dwóch probówek o pojemności 50 ml.
  22. Dodaj 10 ml buforu do rozpuszczania białek międzywarstwowych, a następnie poddaj sonicjacji i wiruj z powrotem do roztworu i odwiruj jak poprzednio.
  23. Połączyć supernatanty równomiernie w dwóch probówkach o pojemności 50 ml i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut, 4 °C, w wirniku kubełkowym o stałym kącie.
    UWAGA: Konieczne jest końcowe odwirowanie w celu usunięcia nadmiernej ilości zanieczyszczających substancji humusowych.
  24. Zdekantować supernatanty do dwóch probówek o pojemności 50 ml tak, aby w każdej znajdowało się 30 ml. Następnie, za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, dodaj 7,5 ml TCA (kwasu trichlorooctowego) do każdej probówki. Wirować w roztworze. Daje to 20% TCA w każdej próbce o pojemności 30 ml (odpowiednio dostosuj),
    Uwaga: TCA jest, toksyczny i może powodować oparzenia skóry. Nosić rękawice i okulary ochronne.
  25. Umieścić próbki w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 2 godziny do nocy.
    UWAGA: Białka zazwyczaj wytrącają się w ciągu 1 godziny, ale można je pozostawić na noc (do 18 godzin).
    UWAGA: Nie pozwól, aby ekstrakcja TCA trwała dłużej niż 18 godzin ze względu na możliwą hydrolizę kwasową białka. Jeśli próbka jest zamrożona, rozmrozić ją na lodzie; Nie pozwól, aby próbka rozgrzała się po rozmrożeniu.
  26. W celu osadzenia wytrąconego białka należy odwirować próbkę o masie 4 500 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C i zdekantować supernatant do postaci odpadów.
  27. Dodaj 10 ml 100% lodowatego acetonu do każdej granulki białka, odwiruj i połącz jak granulki w jedną probówkę.
  28. Odwirować probówkę zawierającą połączone osady (za pomocą wagi), a następnie zdekantować supernatant do odpadów.
    Uwaga: Aceton może powodować podrażnienie dróg oddechowych oraz skóry i oczu, a także jest łatwopalną cieczą i parami. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
  29. Umyj granulkę dwukrotnie za pomocą 1,5 ml acetonu i na koniec przenieś do probówki o pojemności 2 ml w celu ostatecznego wirowania przy 10 000 x g przez 5 minut.
  30. Zdekantować supernatant do odpadów i pozostawić granulkę do wyschnięcia odwróconą na papierowej ściereczce w dygestorium przez ~20 minut lub pod strumieniem azotu, aż osadka zacznie lekko pękać.
  31. Dodać 100 - 200 μL buforu do rozpuszczania białek, w zależności od wielkości granulki.
    UWAGA: Objętość buforu solubilizacyjnego dodawanego do próbki powinna być jak najmniejsza. Późniejsze przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP) może wykorzystywać tylko do 50 μl rozpuszczonej próbki na kolumnę; więcej musi być podzielone na wiele kolumn FASP.
  32. Sonikować i wirować osad do roztworu. Należy zauważyć, że próbka może być lepka z powodu substancji humusowych wytrącających się wraz z białkiem, które zostaną usunięte przy kolejnym odwirowaniu.
  33. Wytrząsać próbkę w inkubatorze/wytrząsarce przez 30 minut przy 300 obr./min, w temperaturze 40 °C, w celu rozpuszczenia białka do roztworu i przystąpić do trawienia białka.
  34. Próbkę należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż będzie gotowa do trawienia białka.

2. Przygotowanie lipidów (czas ~20 min)

  1. Po wyschnięciu próbek lipidów dodać 200 μl chloroformu:metanolu w proporcji 2:1 do fiolki, przemieszać do roztworu i przenieść do probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml, dodać dodatkowe 200 μl do szklanej fiolki, odwirować i odpipetować pozostałe lipidy i przenieść do probówki.
  2. Odwirować pozostałości z próbki o sile 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść supernatant do szklanej fiolki z lipidami i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy LC-MS/MS (dodatkowe informacje dotyczące LC-MS/MS w metodach uzupełniających).
  4. Jeżeli próbki nie mogą być analizowane bezpośrednio po przygotowaniu, lipidy należy przechowywać w rozpuszczalniku w temperaturze -20 °C, aby zapobiec utlenianiu i degradacji.

3. Przygotowanie metabolitu i derywatyzacja (Czas ~5 h)

  1. Następnego dnia po ekstrakcji usunąć próbki metabolitów z odkurzacza Speed Vac i przechowywać w suchym miejscu w temperaturze -20 °C do czasu, aż będą gotowe do derywatyzacji i analizy w GC. Jeśli metabolity nie są uruchamiane na GC, należy je przygotować przy użyciu odpowiedniego protokołu dla tego urządzenia.
  2. Bezpośrednio przed derywatyzacją metabolitów do analizy na GC, przenieść je z dużych szklanych fiolek, dodając 200 μl metanolu, wirując i dodając do probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml. Powtórz raz.
  3. Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut, 4 °C. Przenieść supernatant do mniejszych szklanych fiolek, dodać oddychającą membranę do góry i całkowicie wysuszyć w Speed Vac.
  4. Metabolity należy oprowadzić, dodając 20 μl roztworu metoksyaminy do fiolki z próbką i wirować przez 30 s na wirowniku ze średnią prędkością.
    Uwaga: Chlorowodorek metoksyaminy powoduje poważne oparzenia i poważne uszkodzenia oczu, może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny oraz pracować pod wyciągiem.
  5. Użyj soniku do kąpieli, aby upewnić się, że próbka jest całkowicie rozpuszczona.
  6. Inkubować próbkę w inkubatorze z pokrywą zapobiegającą kondensacji pary wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i 30 minut, wytrząsając z prędkością 1 000 obr./min.
  7. Odwrócić fiolkę jeden raz, aby wymieszać próbki ze skondensowanymi kroplami na powierzchni kapsla. Obracać próbkę w temperaturze 1 000 x g przez 1 minutę, RT.
  8. Przeprowadzić sililację, dodając 80 μl (za pomocą strzykawki) N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamidu z 1% trimetylochlorosilanem. Wir przez 10s.
    Uwaga: MSTFA + 1% TMCS może powodować działanie na skórę, poważne uszkodzenie oczu i działanie toksyczne na narządy docelowe i jest łatwopalną cieczą i parą. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny oraz pracować pod wyciągiem.
  9. Inkubować próbkę w inkubatorze z pokrywą zapobiegającą kondensacji pary wodnej utrzymywaną w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wytrząsając z prędkością 1 000 obr./min.
  10. Odwrócić fiolkę jeden raz, aby wymieszać próbki ze skondensowanymi kroplami na powierzchni kapsla.
  11. Obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g, RT.
  12. Przenieść przereagowany roztwór do fiolek odpowiednich do analizy GC-MS.

4. Trawienie białka (czas ~1 d)

  1. Odwirować próbkę o masie 15 000 x g przez 5 minut, RT, w celu osadzenia wszelkich zanieczyszczeń.
  2. Przeprowadzić przygotowanie próbki wspomaganej filtrem (FASP) do mineralizacji przy użyciu zestawów FASP (patrz Tabela materiałów) zgodnie ze zmodyfikowanymi instrukcjami producenta31,32:
    1. Dodać 400 μl 8 M buforu mocznikowego do kolumny FASP (500 μL 30K MWCO filtr wirowy).
    2. Po zakończeniu wirowania próbki odpipetować supernatant (wyrzucić osad) i dodać do 50 μl próbki do 400 μl 8 M mocznika w kolumnie.
      UWAGA: Dodaj tylko do 50 μl próbki na kolumnę. Jeśli próbka zawiera więcej niż 50 μl, należy użyć wielu kolumn i połączyć peptydy po strawieniu. Najlepiej pozostawić tę objętość tak niską, jak to możliwe (idealnie 30 μl), aby upewnić się, że kolumna FASP usunie wszystkie SDS, które mogą radykalnie zakłócać analizę specyfikacji masy.
    3. Umieść kolumnę w dołączonej probówce o pojemności 1,5 ml i odwiruj próbkę o sile 14 000 x g przez 30 minut, RT.
    4. Usunąć przepływ do odpadów i dodać 400 μl 8 M mocznika do kolumny i ponownie odwirować.
    5. Powtórz poprzedni krok jeszcze raz, w sumie 3 płukania mocznikiem.
      UWAGA: Upewnij się, że próbka jest bliska suchości na kolumnie, jeśli po każdym wirowaniu na filtrze pozostało więcej niż ~ 30 μL, kontynuuj wirowanie.
    6. Dodać 400 μl 50 mM NH4HCO3 i odwirować przy 14 000 x g przez 20 minut, wyrzucić odpady i powtórzyć raz.
    7. Przenieść kolumny do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    8. Dodać 75 μl buforu do wytrawiania trypsyny do kolumn i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w inkubatorze z pokrywą zapobiegającą kondensacji pary wodnej przy 750 obr./min.
    9. Dodać 40 μl 50 mM NH4HCO3 do kolumn.
    10. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 15 minut, aby zebrać peptydy do probówki, utrzymując zanieczyszczenia o dużej masie cząsteczkowej na górze kolumny.
    11. Dodać 40 μl 50mM NH4HCO3 do kolumny i ponownie odwirować.
  3. Wyrzuć kolumnę, wysusz peptydy w probówce w Speed Vac do ~30 μL, a następnie test BCA (zestaw do oznaczania białek kwasu bicynchoninowego; patrz Tabela materiałów) peptydy.
  4. Opcjonalnie wykonaj krok czyszczenia, jeśli podejrzewa się zanieczyszczenie SDS (widoczne bąbelki)33. W przypadku wybrania tej opcji należy następnie przeprowadzić ekstrakcję do fazy stałej. Szczegółowe informacje na temat tej metody oczyszczania są dostępne w Metodach uzupełniających.
  5. Rozcieńczyć próbkę do analizy MS lub opcjonalnie przejść do frakcjonowania metodą HPLC (dwa następne kroki).
  6. W celu frakcjonowania należy rozcieńczyć próbki do objętości 400 μl 10 mM buforem mrówczanu amonu (pH 10,0).
  7. Rozpuścić na kolumnie C18 (patrz tabela materiałów) rozdzielając w tempie 0,5 ml/min przy użyciu systemu HPLC z fazami ruchomymi (A) 10 mM mrówczanu amonu, pH 10,0 i (B) 10 mM mrówczanu amonu, pH 10,0/acetonitrylu (10:90).
    1. Dostosuj nachylenie od 100% A do 95% A przez pierwsze 10 minut, 95% A do 65% A przez min 10 do 70, od 65% A do 30% A przez min 70 do 85, utrzymuj na poziomie 30% A przez min 85 do 95.
    2. Ponownie zrównoważyć 100% A przez min 95 do 105 i utrzymać na poziomie 100% A do min 120.
    3. Zbieraj frakcje co 1,25 minuty (96 frakcji na całym gradiencie), a na koniec połącz każdy rząd, aby uzyskać łącznie 12 próbek lub co drugi rząd w celu uzyskania 24 próbek (każda z n = 8 lub n = 4 frakcje połączone).
  8. Wysuszyć wszystkie frakcje w próżni i dodać do każdej z nich 15 μl ultraczystej wody w celu przechowywania w temperaturze -20 °C do czasu analizy LC-MS/MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy protokół MPLEx został użyty do ekstrakcji cząsteczek z rodzimej gleby prerii Kansas (gleby Mollisol), potrójne analizy dostarczyły wyników dla 3376 peptydów, 105 lipidów i 102 metabolitów polarnych (wszystkie unikalne identyfikacje). Podczas gdy protokół MPLEx został dobrze opracowany do ogólnej ekstrakcji lipidów i metabolitów12,13,14,15,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Należy zauważyć, że nie wszystkie laboratoria będą miały taki sam dostępny sprzęt, więc niektóre metody, na przykład etap lizy, można dostosować. Tutaj używamy wirowania i sonikacji, jednak użycie dużego ubijaka do koralików o pojemności 50 ml będzie działać. Jeżeli liofilizator o temperaturze kolektora do -105 °C nie jest dostępny, próbki można suszyć pod strumieniem azotu. Ponadto rodzaje gleby są bardzo zróżnicowane i mogą obejmować piasek,, glinę, torf i glinę (itp.), a także mogą się różnić w zależności od ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Nathanowi Johnsonowi za pomoc w przygotowaniu rysunków. Badania te były wspierane przez Program Pan-omiczny finansowany przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (Genomic Science Program), Microbiomes in Transition (MinT) Laboratory Directed Research Development Initiative w Pacific Northwest National Laboratory, a także National Institutes of Health National Institute of Environmental Health Sciences (R01 ES022190) i NIH (P42 ES027704). KEBJ pragnie podziękować R21 HD084788 za wsparcie finansowe w celu opracowania i walidacji nowatorskich technik ekstrakcji multiomicznej. Praca ta została wykonana w Laboratorium Nauk Molekularnych Środowiska im. W. R. Wileya (EMSL), krajowym ośrodku naukowym DOE w Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL jest wieloprogramowym krajowym laboratorium prowadzonym przez Battelle dla DOE w ramach kontraktu DE-AC06-76RL01830.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ChloroformSigma-Aldrich650498przechowywany w temperaturze -20° C ! Uwaga chloroform ma ostre potencjalne skutki zdrowotne, podrażnienie skóry i możliwe oparzenia chemiczne, podrażnienie układu oddechowego, może wpływać na nerki, wątrobę, serce. Nosić odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice, pracować w dygestorium.
MetanolSigma-Aldrich34860przechowywany w temperaturze -20° C ! Uwaga Metanol może powodować podrażnienie dróg oddechowych, skóry i oczu, może uszkadzać nerwy, nerki i wątrobę. Nosić odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice, pracować w dygestorium.
Oczyszczona woda zsystemu oczyszczania wodyMillipore Milli-Q
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL6026! Uwaga: SDS powoduje ostrą toksyczność i jest łatwopalny. Działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe. Nosić rękawice i okulary ochronne.
Zestaw do ekstrakcji białek glebowychMoBio, zestaw do ekstrakcji białek glebowych NoviPure, Qiagen30000-20
DL-dithiothreitolSigma-Aldrich43815
1M Trizma HCLSigma-AldrichT2694
Kwas trichlorooctowySigma-AldrichT0699! Uwaga TCA jest, toksyczny i może powodować oparzenia skóry. Nosić rękawice i okulary ochronne.
AcetonSigma-Aldrich650501przechowywany w temperaturze -20° C ! Uwaga: Aceton może powodować podrażnienie dróg oddechowych oraz skóry i oczu. Łatwopalna ciecz i para. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
MocznikSigma-Aldrich208884! Uwaga Mocznik działa drażniąco na oczy i skórę, należy używać rękawic i okularów ochronnych
Wodorowęglan amonuFluka09830
TrypsynaPromegaV528A20µ g fiolki
Zestaw do oznaczania białek kwasu bicunchoninowegoPierce23227
Mrówczan amonuSigma-Aldrich09735
AcetonitrylSigma-Aldrich34998! Uwaga: Acetonitryl działa drażniąco na skórę i oczy. Wysoce łatwopalny. Nosić rękawice i okulary ochronne. Praca pod wyciągiem.
Kwas trifluorooctowySigma-AldrichT6508! Uwaga TFA jest niezwykle niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą, kontaktu z oczami, spożycia i wdychania. Może powodować uszkodzenia tkanek, szczególnie błon śluzowych oczu, jamy ustnej i dróg oddechowych. Kontakt ze skórą może spowodować oparzenia. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i pracować pod wyciągiem.
Chlorowodorek metoksyaminySigma-Aldrich226904! Uwaga Chlorowodorek metoksyaminy powoduje poważne oparzenia i poważne uszkodzenia oczu, może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
PirydynaSigma-Aldrich270970! Uwaga Pirydyna może powodować podrażnienie skóry i oczu, depresję ośrodkowego układu nerwowego. Para może spowodować gwałtowny pożar. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamid z 1% trimetylochlorosilanemSigma-Aldrich69478! Uwaga MSTFA + 1% TMCS może powodować działanie na skórę, poważne uszkodzenie oczu i działanie toksyczne na narządy docelowe. Łatwopalna ciecz i para. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
chlorek potasuSigma-AldrichP9541
Milli-Qmodel MilliporeMPGP04001
VortexScientific IndustriesSI-0236Vortex Genie 2
Sonikator sondyFisherBrandmodel FB505
Wirówka z chłodzeniemmodel5810R
50 ml probówka wahliwy wirnik kubełkowyEppendorfA-4-44
50mL rotor o stałym kącieEppendorfFA-45-6-30
BalanceOHAUSmodel V22PWE150IT
Serologiczny kontroler pipetEppendorf12-654-100
10mL, szklane pipety serologiczne 25mLFisherBrand13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer z ThermotopEppendorf5382000015, 5308000003
kulki ze stali nierdzewnej mieszanej 0,9 i 2,0 mmNextAdvanceSSB14B
Koraliki granatowe 0,15 mmMoBio13122-500
Mieszadło magnetyczneFisherBrand11-100-16SH
Mieszadło magnetycznePaski
pH, pH zakres 0– 14FisherBrandM95903
15 ml, 50 ml stożkowa polipropylenowa probówka wirówkowaGenesee Scientific21-103 21-108kompatybilna z chloroformem
50 ml nasadka wirowaMoBio13000-V1-50
Wiadro na lódFisherBrand02-591-44
Fiolki szklane 27,25x70mmFisherBrand03-339-22K
Breathe Łatwiejsze membrany płytoweMidwest ScientificBERM-2000
Chusteczki nasączone alkoholemDiversified BiotechBPWP-1000
Inkubator z wytrząsarką grzałkowąBenchmark, Incu-Shaker Mini
Analogowy rotator rurowy z rożnaSoCal BioMed, LLC82422001
Zestaw do przygotowania próbek wspomaganych filtremFASP; Expedeon44250
Czytnik mikropłytekBiotek, EPOCH-20
stopni Celsjusza ZamrażarkaFisher13986149-80
stopni CelsjuszaStirling UltracoldSU78OUE
Q-Exactive spektrometr masowy pułapki jonowejThermo Scientific
Agilent 7890A sprzężony z pojedynczym kwadrupolem Spektrometr masowy 5975Cfirmy Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap VeloThermo Scientific
Waters System NanoEquityTM UPLCMillford, MA
Butelka na media 250 mlFiol
Fiolka HPLC i zatrzaskiMicroSolv9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-dołkowa płytkaAgilent5042-6454
Duża szklana fiolka 27,25x70mmFisherBrand03-339-22K
LiofilizatorLabconco7934021
Polerowana szpatułka z płaską główką ze stali nierdzewnejSpoonula; FisherBrand14-375-10
Chusteczki KimKimberly-Clark34721
XBridge C18, 250x4,6 mm, 5 μ M z kolumną ochronną 4,6x20 mmWody186003117, system
serii Agilent 1100Agilent TechnologiesG1380-90000
1,7 ml probówka wirówkowaSorenson11700
Hamilton Szklane strzykawki, 5 ml, 50 i mikro; L oraz 250µ LHamilton81517, 80975, 81175
Pipety PasteuraFisherBrand13-678-20A
Sigma-AldrichZ111597
Sonikator do kąpieliBranson 1800 Myjka
Wirówka próżniowaLabconco Centrivap Kwasoodporny system
Kolumny MicroSpin, C18 KrzemionkaGrupa NestSEM SS18V
.System oczyszczania wody papierowe FisherBrand 14512130 186002805 ka na wodę FisherBrand 1395-250 Wody Szklana fiolka na próbkę MS i wkładki MicroSolv 9502S-WCV, 9502S-02ND Szkło HPLC 186003064 Żarówki do pipet Pasteura ultradźwiękowakoncentratorów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
  2. White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
  3. White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
  4. Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
  5. Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
  7. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
  8. Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
  9. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
  10. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
  11. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  12. Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138(2016).
  13. Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
  14. Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
  15. Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
  16. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209(2015).
  17. Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188(2015).
  18. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
  19. Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155(2013).
  20. Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
  21. Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
  22. Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558(2012).
  23. Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
  24. Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584(2012).
  25. Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
  26. Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
  27. Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719(2010).
  28. Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
  29. Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
  30. Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
  31. Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
  32. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
  33. Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
  34. Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
  35. Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
  36. Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
  37. Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277(2014).
  38. Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
  39. Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza multiomicznaekstrakcja z pr bek glebyekstrakcja metabolit wbia ek i lipid wekstrakcja chloroformowo metanolowaizolacja warstwy po redniej bia ekrozdzia przez wirowaniesonikacja sondobr bka w dygestoriumzamra anie w ciek ym azocie

Powiązane artykuły