Protokół MPLEx do analiz multiomicznych próbek gleby

Summary

Przedstawiono protokół jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów z pojedynczej próbki gleby, co pozwala na skrócenie czasu przygotowania próbki i umożliwia analizy multiomiczną spektrometrią mas próbek o ograniczonych ilościach.

Abstract

Zintegrowane badania metaproteomiczne, metabolomiczne i lipidomiczne (multiomiczne) oparte na spektrometrii mas (MS) zmieniają naszą zdolność do zrozumienia i scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych w systemach środowiskowych i biologicznych. Pomiary te umożliwiają nawet dokładniejsze analizy złożonych zbiorowisk mikroorganizmów glebowych, które są najbardziej złożonymi systemami mikrobiologicznymi znanymi do tej pory. Analizy multiomiczne wiążą się jednak z wyzwaniami związanymi z przygotowaniem próbki, ponieważ dla każdego badania omicznego zazwyczaj potrzebne są oddzielne ekstrakcje, co znacznie wydłuża czas przygotowania i wymaganą ilość próbki. Aby rozwiązać ten problem, stworzono metodę 3 w 1 do jednoczesnej ekstrakcji metabolitów, białek i lipidów (MPLEx) z tej samej próbki gleby, dostosowując podejście oparte na rozpuszczalnikach. Ten protokół MPLEx okazał się zarówno prosty, jak i niezawodny dla wielu typów próbek, nawet jeśli jest stosowany do ograniczonych ilości złożonych próbek gleby. Metoda MPLEx w znacznym stopniu umożliwiła również szybkie pomiary multiomiczne niezbędne do lepszego zrozumienia członków każdej społeczności drobnoustrojów, przy jednoczesnej ocenie zmian zachodzących w wyniku perturbacji biologicznych i środowiskowych.

Introduction

Ocena zbiorowisk mikroorganizmów glebowych ma ważne implikacje dla zrozumienia obiegu węgla i zmian klimatycznych. Niedawne badania uwypukliły jednak trudności, takie jak brak zsekwencjonowanych genomów mikrobioty w różnych typach gleb oraz nieznana funkcja wielu wykrytych białek. Wyzwania te wynikają z faktu, że gleba jest najbardziej złożonym zbiorowiskiem mikrobiologicznym znanym do tej pory^1,2,3. Analizy multiomiczne, które łączą wyniki badań metagenomicznych, metatranskryptomicznych, metaproteomicznych, metabolomicznych i lipidomicznych, zostały ostatnio wdrożone do licz....

Protocol

UWAGA: Bardzo wilgotne gleby mogą być liofilizowane przed ekstrakcją bez szkody dla efektywności ekstrakcji. Można również użyć mokrej gleby, ale należy ją wziąć pod uwagę przy dodawaniu odczynników w określonych proporcjach.

UWAGA: Zaleca się użycie 20 g suchej masy gleby na ekstrakcję, która musi być podzielona na dwie probówki po 50 ml (maksymalnie 10 g ziemi na probówkę 50 ml). Ekstrakcje można skalować w górę lub w dół w zależności od dostępnej próbki.

UWAGA: Suche próbki gleby mogą być przesiane przez sito 3 mm w celu homogenizacji i usunięcia małych korzeni i skał. Nie przesiewaj mokrych próbek gleby, poni....

Results

Gdy protokół MPLEx został użyty do ekstrakcji cząsteczek z rodzimej gleby prerii Kansas (gleby Mollisol), potrójne analizy dostarczyły wyników dla 3376 peptydów, 105 lipidów i 102 metabolitów polarnych (wszystkie unikalne identyfikacje). Podczas gdy protokół MPLEx został dobrze opracowany do ogólnej ekstrakcji lipidów i metabolitów^12,13,14,15,

Discussion

Należy zauważyć, że nie wszystkie laboratoria będą miały taki sam dostępny sprzęt, więc niektóre metody, na przykład etap lizy, można dostosować. Tutaj używamy wirowania i sonikacji, jednak użycie dużego ubijaka do koralików o pojemności 50 ml będzie działać. Jeżeli liofilizator o temperaturze kolektora do -105 °C nie jest dostępny, próbki można suszyć pod strumieniem azotu. Ponadto rodzaje gleby są bardzo zróżnicowane i mogą obejmować piasek,, glinę, torf i glinę (itp.), a także mogą się różnić w zależności od .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498	przechowywany w temperaturze -20° C ! Uwaga chloroform ma ostre potencjalne skutki zdrowotne, podrażnienie skóry i możliwe oparzenia chemiczne, podrażnienie układu oddechowego, może wpływać na nerki, wątrobę, serce. Nosić odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice, pracować w dygestorium.
Metanol	Sigma-Aldrich	34860	przechowywany w temperaturze -20° C ! Uwaga Metanol może powodować podrażnienie dróg oddechowych, skóry i oczu, może uszkadzać nerwy, nerki i wątrobę. Nosić odpowiednie okulary ochronne, odzież i rękawice, pracować w dygestorium.
Oczyszczona woda z	systemu oczyszczania wody	Millipore Milli-Q
Dodecylosiarczan sodu	Sigma-Aldrich	L6026	! Uwaga: SDS powoduje ostrą toksyczność i jest łatwopalny. Działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe. Nosić rękawice i okulary ochronne.
Zestaw do ekstrakcji białek glebowych	MoBio, zestaw do ekstrakcji białek glebowych NoviPure, Qiagen	30000-20
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
1M Trizma HCL	Sigma-Aldrich	T2694
Kwas trichlorooctowy	Sigma-Aldrich	T0699	! Uwaga TCA jest, toksyczny i może powodować oparzenia skóry. Nosić rękawice i okulary ochronne.
Aceton	Sigma-Aldrich	650501	przechowywany w temperaturze -20° C ! Uwaga: Aceton może powodować podrażnienie dróg oddechowych oraz skóry i oczu. Łatwopalna ciecz i para. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
Mocznik	Sigma-Aldrich	208884	! Uwaga Mocznik działa drażniąco na oczy i skórę, należy używać rękawic i okularów ochronnych
Wodorowęglan amonu	Fluka	09830
Trypsyna	Promega	V528A	20µ g fiolki
Zestaw do oznaczania białek kwasu bicunchoninowego	Pierce	23227
Mrówczan amonu	Sigma-Aldrich	09735
Acetonitryl	Sigma-Aldrich	34998	! Uwaga: Acetonitryl działa drażniąco na skórę i oczy. Wysoce łatwopalny. Nosić rękawice i okulary ochronne. Praca pod wyciągiem.
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508	! Uwaga TFA jest niezwykle niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą, kontaktu z oczami, spożycia i wdychania. Może powodować uszkodzenia tkanek, szczególnie błon śluzowych oczu, jamy ustnej i dróg oddechowych. Kontakt ze skórą może spowodować oparzenia. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i pracować pod wyciągiem.
Chlorowodorek metoksyaminy	Sigma-Aldrich	226904	! Uwaga Chlorowodorek metoksyaminy powoduje poważne oparzenia i poważne uszkodzenia oczu, może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
Pirydyna	Sigma-Aldrich	270970	! Uwaga Pirydyna może powodować podrażnienie skóry i oczu, depresję ośrodkowego układu nerwowego. Para może spowodować gwałtowny pożar. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamid z 1% trimetylochlorosilanem	Sigma-Aldrich	69478	! Uwaga MSTFA + 1% TMCS może powodować działanie na skórę, poważne uszkodzenie oczu i działanie toksyczne na narządy docelowe. Łatwopalna ciecz i para. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny, pracować w dygestorium.
chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9541
Milli-Q	model Millipore		MPGP04001
Vortex	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Sonikator sondy	FisherBrand		model FB505
Wirówka z chłodzeniem	model		5810R
50 ml probówka wahliwy wirnik kubełkowy	Eppendorf	A-4-44
50mL rotor o stałym kącie	Eppendorf	FA-45-6-30
Balance	OHAUS		model V22PWE150IT
Serologiczny kontroler pipet	Eppendorf	12-654-100
10mL, szklane pipety serologiczne 25mL	FisherBrand	13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer z Thermotop	Eppendorf	5382000015, 5308000003
kulki ze stali nierdzewnej mieszanej 0,9 i 2,0 mm	NextAdvance	SSB14B
Koraliki granatowe 0,15 mm	MoBio	13122-500
Mieszadło magnetyczne	FisherBrand	11-100-16SH
Mieszadło magnetyczne	Paski
pH, pH zakres 0– 14	FisherBrand	M95903
15 ml, 50 ml stożkowa polipropylenowa probówka wirówkowa	Genesee Scientific	21-103 21-108	kompatybilna z chloroformem
50 ml nasadka wirowa	MoBio	13000-V1-50
Wiadro na lód	FisherBrand	02-591-44
Fiolki szklane 27,25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Breathe Łatwiejsze membrany płytowe	Midwest Scientific	BERM-2000
Chusteczki nasączone alkoholem	Diversified Biotech	BPWP-1000
Inkubator z wytrząsarką grzałkową	Benchmark, Incu-Shaker Mini
Analogowy rotator rurowy z rożna	SoCal BioMed, LLC	82422001
Zestaw do przygotowania próbek wspomaganych filtrem	FASP; Expedeon	44250
Czytnik mikropłytek	Biotek, EPOCH-20
stopni Celsjusza Zamrażarka	Fisher	13986149-80
stopni Celsjusza	Stirling Ultracold	SU78OUE
Q-Exactive spektrometr masowy pułapki jonowej	Thermo Scientific
Agilent 7890A sprzężony z pojedynczym kwadrupolem Spektrometr masowy 5975C	firmy Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo	Thermo Scientific
Waters System NanoEquityTM UPLC	Millford, MA
Butelka na media 250 ml	Fiol
Fiolka HPLC i zatrzaski	MicroSolv	9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-dołkowa płytka	Agilent	5042-6454
Duża szklana fiolka 27,25x70mm	FisherBrand	03-339-22K
Liofilizator	Labconco	7934021
Polerowana szpatułka z płaską główką ze stali nierdzewnej	Spoonula; FisherBrand	14-375-10
Chusteczki Kim	Kimberly-Clark	34721
XBridge C18, 250x4,6 mm, 5 μ M z kolumną ochronną 4,6x20 mm	Wody	186003117, system
serii Agilent 1100	Agilent Technologies	G1380-90000
1,7 ml probówka wirówkowa	Sorenson	11700
Hamilton Szklane strzykawki, 5 ml, 50 i mikro; L oraz 250µ L	Hamilton	81517, 80975, 81175
Pipety Pasteura	FisherBrand	13-678-20A
	Sigma-Aldrich	Z111597
Sonikator do kąpieli	Branson 1800 Myjka
Wirówka próżniowa	Labconco Centrivap Kwasoodporny system
Kolumny MicroSpin, C18 Krzemionka	Grupa Nest	SEM SS18V