Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie końcowego znakowania końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą

DOI:

10.3791/57345

⸱

16 maja 2018

 ,  ,  , 
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określamy ilościowo śmierć komórek naskórka u żab z chytridiomykozą, używając dwóch metod. Po pierwsze, używamy końcowego znakowania końca nacięcia dUTP za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) in situ, aby określić różnice między klinicznie zakażonymi i niezakażonymi zwierzętami. Po drugie, przeprowadzamy analizę szeregów czasowych apoptozy nad infekcją za pomocą analizy białka kaspazy 3/7.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

doświadczają na całym świecie ogromnych strat w różnorodności biologicznej, a jedną z głównych przyczyn jest choroba zakaźna – chytridiomykoza. Choroba ta jest wywoływana przez patogen grzybowy Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), który infekuje i niszczy naskórek żaby; Jednak zmiany patologiczne nie zostały jednoznacznie scharakteryzowane. Apoptoza (zaprogramowana śmierć komórki) może być wykorzystywana przez patogeny do uszkadzania tkanki gospodarza, ale może być również mechanizmem odporności gospodarza na choroby w celu usunięcia patogenu. W tym badaniu określamy ilościowo śmierć komórek naskórka zakażonych i niezakażonych zwierząt za pomocą dwóch różnych testów: znakowania końca nacięcia dUTP za pośrednictwem końcowej transferazy (TUNEL) i kaspazy 3/7. Wykorzystując tkankę skóry brzusznej, grzbietowej i udowej w teście TUNEL, obserwujemy śmierć komórek w komórkach naskórka in situ klinicznie zakażonych zwierząt i porównujemy śmierć komórek z niezakażonymi zwierzętami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby określić, jak zmienia się poziom apoptozy w naskórku w trakcie infekcji, usuwamy próbki z czubków palców co dwa tygodnie przez okres 8 tygodni i używamy testu kaspazy 3/7 z wyekstrahowanymi białkami w celu ilościowego określenia aktywności w próbkach. Następnie korelujemy aktywność kaspazy 3/7 z obciążeniem infekcją. Test TUNEL jest przydatny do lokalizacji śmierci komórki in situ, ale jest kosztowny i czasochłonny w przeliczeniu na próbkę. Test kaspazy 3/7 jest skuteczny w przypadku dużych próbek i eksperymentów w czasie. Jednak ze względu na to, że biopsje czubka palca żaby są małe, dostępny jest ograniczony ekstrakt do standaryzacji próbek za pomocą metod kwantyfikacji białek, takich jak test Bradforda. Dlatego sugerujemy oszacowanie powierzchni skóry poprzez analizę fotograficzną biopsji palców u nóg, aby uniknąć spożywania ekstraktów podczas standaryzacji próbki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

doświadczają obecnie jednej z największych strat w globalnej różnorodności biologicznej spośród wszystkich taksonów kręgowców1. Główną przyczyną tych spadków jest śmiertelna choroba skóry chytridiomykoza, wywoływana przez patogen grzybiczy Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Patogen powierzchownie infekuje naskórek, co może prowadzić do zaburzenia funkcji skóry, skutkującego poważną utratą elektrolitów, zatrzymaniem akcji serca i śmiercią3. Obecnie badane są różne potencjalne mechanizmy odpornościowe gospodarza przeciwko Bd, takie jak peptydy przeciwdrobnoustrojowe4,5, flora bakteryjna skóry6, receptory komórek odpornościowych7,8 i aktywność limfocytów9,10. Jednak niewiele badań sprawdza, czy apoptoza naskórka i śmierć komórki są mechanizmem immunologicznym przeciwko temu śmiertelnemu patogenowi.

Śmierć komórki, czy to przez apoptozę (programowana śmierć komórki) lub martwicę (niezaprogramowana śmierć), w naskórku może być patologią infekcji Bd. Wcześniejsze badania sugerują, że zakażenie Bd może indukować apoptozę, ponieważ zakłócenie połączeń wewnątrzkomórkowych obserwuje się, gdy eksplantaty skóry są wystawione na działanie supernatantów zoospor in vitro11. Dodatkowo zwyrodnieniowe zmiany naskórka u żab zakażonych Bd obserwuje się za pomocą mikroskopii elektronowej12,13. Analizy transkryptomiczne wskazują, że szlaki apoptozy są regulowane w górę w zakażonej skórze14, a splenocyty ulegają apoptozie, gdy są wystawione na działanie supernatantów Bd in vitro15. Pomimo rosnącej liczby dowodów sugerujących, że Bd może indukować apoptozę i śmierć komórek gospodarza in vitro, brakuje badań in vivo, które badałyby lub określały ilościowo mechanizmy apoptozy poprzez postęp infekcji. Co więcej, nie wiadomo, czy gospodarz używa apoptozy jako obronnej strategii immunologicznej do zwalczania infekcji Bd, czy też apoptoza jest patologią choroby.

W tym badaniu chcieliśmy wykryć śmierć i apoptozę komórek naskórka u zakażonych zwierząt in vivo za pomocą dwóch metod: testu białka kaspazy 3/7 oraz testu in situ z końcowym transferazą (TUNEL) na końcu nacięcia. Ponieważ każdy test wykrywa różne aspekty śmierci komórki16, razem te metody zapewniają pełne zrozumienie mechanizmów związanych ze śmiercią komórki i zapewniają dokładny pomiar efektu. Test kaspazy 3/7 określa ilościowo aktywność kaspaz efektorowych 3 i 7, co umożliwia ilościowe określenie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych szlaków apoptozy. Natomiast test TUNEL wykrywa fragmentację DNA, która jest spowodowana mechanizmami śmierci komórki, w tym apoptozą, martwicą i piroptozą17. Używamy testu TUNEL do zbadania lokalizacji śmierci komórek w naskórku zarówno klinicznie zakażonych, jak i niezakażonych zwierząt przy użyciu trzech różnych odcinków skóry: grzbietu, brzucha i uda Pseudophryne corroboree. Metoda ta identyfikuje anatomiczne miejsce śmierci komórki, a także rozróżnia jej lokalizację w obrębie określonych warstw naskórka. Następnie używamy testu kaspazy 3/7 do przeprowadzenia ilościowej oceny szeregów czasowych apoptozy podczas 8-tygodniowej infekcji w Litoria verreauxii alpina. Pobieramy próbki czubków palców u nóg co dwa tygodnie od tych samych zwierząt i jesteśmy w stanie skorelować obciążenie infekcją patogenem z aktywnością kaspazy 3/7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uniwersytet Jamesa Cooka zatwierdził etykę zwierząt w aplikacjach A1875 dla P. corroboree oraz A1897 i A2171 dla L. v. alpina.

1. Hodowla i monitorowanie zwierząt

  1. Zwierzęta trzymane w domu indywidualnie, w środowisku odpowiednim dla gatunku, z odpowiednim harmonogramem nawadniania, karmienia i sprzątania. Codziennie sprawdzaj zwierzęta.
    1. Wykorzystać dorosłe osobniki krytycznie zagrożonego gatunku Pseudophryne corroboree (do testu TUNEL, sekcja 4) i zagrożonego Litoria verreauxii alpina (do testu kaspazy 3/7, sekcja 5), pochodzące z obiektów hodowlanych żyjących w niewoli. Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 15 - 18 °C, na podłożu z mchu i żwiru, codziennie spryskuj je wodą z odwróconej osmozy i karm 3 razy w tygodniu świerszczami załadowanymi jelitami.
  2. Zbieraj dane o każdej osobie raz w tygodniu. Pobrać wymaz od osób pod kątem Bd zgodnie z opisem w kroku 2.1. Zważ każde zwierzę z dokładnością do 0,1 g za pomocą wagi i zmierz długość pyska do otworu wentylacyjnego (SVL) z dokładnością do 0,01 mm za pomocą suwmiarki wybierającej.
  3. Po zaszczepieniu (zgodnie z opisem w sekcji 3) należy codziennie badać zwierzęta pod kątem klinicznych objawów infekcji (nieregularne złuszczanie się skóry, brak apetytu, zaczerwienienie nóg, letarg lub opóźniony odruch prostowania) zgodnie z wytycznymi etycznymi dla zwierząt. Poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli występują objawy kliniczne i zachorowalność.
    1. Poddać eutanazji z przedawkowaniem metanosulfonianu trikainy (MS222) (0,1% w/v MS222 do pH 6 - 7 z wodorowęglanem sodu w dojrzałej wodzie z kranu). Trzymaj zwierzęta w MS222 przez 10 minut po ustaniu wszelkiego ruchu i nie wykazują one żadnej reakcji na bodźce.

2. Testy na infekcję Bd

  1. Wymaz na Bd
    1. Wymaz z każdego zwierzęcia za pomocą nowego sterylnego wacika ze sztucznego jedwabiu (jeden wacik na zwierzę). Użyj następującej metody pobierania wymazówki: pięć razy na wietrze, pięć razy na każdym udzie, boku i kończynie. Daje to w sumie 45 uderzeń.
    2. Delikatnie obracaj wacik podczas i między pociągnięciami, aby zapewnić skuteczne wychwytywanie DNA. Rozbij końcówkę wacika do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu ekstrakcji.
  2. Ekstrakcja DNA i test qPCR
    1. Ekstrahować genomowe DNA z wacików, dodając 50 μl dostępnego w handlu odczynnika do ekstrakcji DNA z 30 - 40 mg kulek krzemionkowych o średnicy 0,5 mm. Kulki ubijały próbki w bijaku do bijaków z maksymalną prędkością przez 2 minuty. Po etapie ubipania kulek odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 1 minutę.
    2. Próbki inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia. Odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 3 minuty, a następnie przenieść supernatant do pojedynczych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu qPCR.
    3. Stosuj ilościowy PCR (qPCR) zgodnie z Boyle i wsp. 200418 do analizy obciążenia infekcją. Użyj następujących modyfikacji:
      1. Rozcieńczyć próbki do ekstrakcji DNA w stosunku 6:100 podwójnie dejonizowaną wodą. Dodaj 0,7 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdego dołka, aby zapobiec zahamowaniu PCR. Uruchom każdą próbkę pojedynczo. Na każdej płytce należy zastosować kontrolę ujemną (bez szablonu) i kontrolę pozytywną z szeregiem wzorców rozcieńczeń w celu oszacowania obciążenia zoosporami (infekcją).

3. Szczepienie

  1. Kultura Bd
    1. Przygotuj bulion hodowlany, dodając 16 g tryptonu, 2 g hydrolizatu żelatyny i 4 g laktozy (TGHL) do 1 l wody dejonizowanej. Autoklaw (121 °C przez 40 min) i pozostawić bulion do ostygnięcia.
    2. Zaszczepić izolat Bd (w tym przypadku wyizolowany z izolatu Nowej Południowej Walii, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage number 11) w bulionie TGHL i rosnąć przez 7 dni w temperaturze 23 °C, a następnie przenieść kulturę bulionową na płytki agarowe TGHL.
    3. Aby przygotować płytki, dodaj 16 g tryptonu, 2 g hydrolizatu żelatyny, 4 g laktozy (TGHL) i 10 g agaru bakteriologicznego do 1 l wody dejonizowanej i autoklawu (121 °C przez 40 min). Gdy mieszanina ostygnie na tyle, aby można ją było dotknąć, ale zanim stwardnieje, wlej agar TGHL do płytek hodowlanych o średnicy 92 mm, tak aby były wypełnione w 1/4 do 1/3, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
    4. Gdy agar zastygnie i całkowicie ostygnie, zaszczepij każdą płytkę 0,5 ml Bd z płynnego bulionu i równomiernie rozprowadz. Pozostaw mieszaninę bulionu Bd do wyschnięcia na talerzu przez około 1 godzinę, a następnie uszczelnij płytki plastikową folią parafinową. Inkubować płytki stroną agarową do dołu w temperaturze 23 °C przez 5 - 7 dni.
  2. Płytki zalewowe do roztworu do inokulacji zoospor
    1. Sprawdzaj ruchliwość zoospor pod mikroskopem odwróconego światła, aby zapewnić żywotność codziennie przed inokulacją. Gdy uwalnianie zoospor jest wysokie, a wiele zoospor pływa poza zarodniami, kultura jest gotowa do zaszczepienia.
    2. Zalej każdą płytkę 3 ml dojrzałej wody z kranu lub sztucznej wody ze stawu, wlewając wodę do płytki i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić uwolnienie zoospor do wody. Po okresie inkubacji zdekantować zawiesinę zoospor do nowego sterylnego pojemnika.
    3. Oszacować stężenie zoospor zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą hemocytometru. Gdy znane jest stężenie zawiesiny zoospor, rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 1 x 106 zoospor na 3 ml starą wodą z kranu.
  3. Szczepienie zwierząt
    1. Zaszczepić każde zwierzę, wylewając 3 ml mieszaniny inokulum na jego venter19 w oddzielnych pojemnikach o pojemności 50 ml. Pozwolić, aby nadmiar inokulum zebrał się na dnie pojemnika do zaszczepiania. Pozostawić każde zwierzę w indywidualnym pojemniku do zaszczepiania na 24 godziny, aby zapewnić zakażenie, a po 24 godzinach inokulacji zwrócić każdą osobę do zdezynfekowanego terrarium.
      1. Zdezynfekuj terraria za pomocą dostępnego w handlu roztworu wybielacza o stężeniu 13% objętości/objętości (v/v)20, spłucz co najmniej dwa razy wodą, a następnie pozostaw do wyschnięcia na nie mniej niż 24 godziny.
    2. W przypadku kontroli ujemnych Bd, zaszczepić zwierzęta metodą symulacyjną przy użyciu tych samych metod, co w ppkt 3,2 - 3,3, ale zalać płytki agarowe wolne od Bd 5 ml dojrzałej wody z kranu zamiast płytek agarowych zaszczepionych Bd.

4. Test TUNEL

  1. Poddać eutanazji zwierzęta, które wykazują kliniczne objawy chytridiomykozy, jak opisano w kroku 1.3.1, oraz równą liczbę zwierząt z grupy kontrolnej ujemnej Bd.
  2. Przeanalizuj próbki skóry (grzbietowej, brzusznej i udowej) od każdego zwierzęcia. Utrwal próbki skóry przez 2 godziny w formaldehydzie buforowanym fosforanem o stężeniu 4% v/v. Krótki i stały czas utrwalania pozwala na pełne utrwalenie tkanek, ale także pozwala na skuteczne i dokładne barwienie immunohistochemiczne. Następnie przenieś do 80% etanolu aż do zatopienia w celu podziału.
  3. Zanurz skórę w wosku parafinowym w celu przygotowania histologicznego zgodnie ze standardowymi metodami21. W skrócie protokół jest następujący:
    1. Odwodnić tkanki w stopniowanej serii etanolu i usunąć etanol za pomocą ksylenu. Zanurz tkankę w wosku parafinowym i umieść wszystkie trzy próbki skóry dla każdej osoby w jednym bloku parafiny.
  4. Wyciąć skórę za pomocą mikrotomu zgodnie ze standardowym preparatem histologicznym21. Tkankę należy podzielić szeregowo na 5 μm, a następnie przymocować do szkiełek hydrofilowych. Umieść cztery seryjne histosekcje dla każdego typu skóry na szkiełku. Wykonaj trzy preparaty na osobę z seryjnymi sekcjami skóry, pamiętaj, że każdy szkiełko ma przymocowane cztery sekcje każdej tkanki.
  5. Zabejcuj szkiełka w następującej kolejności:
    1. Wybarwić pierwsze szkiełko hematoksyliną, a następnie przeciwbarwieniem eozyny (H&E). Ten slajd ma na celu wizualizację lokalizacji zarodni Bd w skórze.
    2. Wybarwić drugi szkiełko po dostępnym w handlu teście TUNEL do przygotowania histologicznego i postępować zgodnie z instrukcjami producenta, które opisano poniżej.
      1. Najpierw należy odparafinować skrawki tkanek w słoiku z kopeliną, myjąc szkiełka trzema zmianami ksylenu przez 5 minut na pranie, a następnie dwiema zmianami 100% etanolu przez 5 minut każde mycie. Następnie wykonaj jedno płukanie 95% etanolem przez 3 minuty, a następnie 70% etanolem przez 3 minuty. Na koniec nakładaj jedno pranie PBS przez 5 minut.
      2. Wstępnie potraktować tkankę świeżo rozcieńczonym enzymem trawiącym białka (proteinaza K o stężeniu 20 μg/ml rozcieńczonym w PBS) i dodać bezpośrednio do szkiełka. Pozostawić do inkubacji na 15 minut. Umyć z dwiema zmianami PBS w słoiku z kopeliną przez 2 minuty każda.
      3. Strzepnąć nadmiar płynu i schować w 3,0% nadtlenku wodoru w PBS w słoiku z kopeliną przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Spłukać dwukrotnie PBS, przez pięć minut przy każdym myciu.
      4. Stuknąć nadmiar płynu, a następnie nanieść 75 μl/5cm2 buforu równowagi bezpośrednio na tkankę na szkiełku. Inkubować przez 10 s. Strzepnąć nadmiar płynu wokół sekcji i nałożyć 55 μl/5cm2 działającego końcowego enzymu transferazy deoksynukleotydylo-tranferazy (TdT). Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      5. Po inkubacji TdT umieścić szkiełko w słoiku z kopinem o sile roboczej buforu zatrzymującym/myjącym, mieszać przez 15 s i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełko trzema zmianami PBS przez 1 minutę na pranie. Strzepnij nadmiar płynu.
      6. Nałóż koniugat anty-digoksygeniny (rodamina), który został podgrzany do temperatury pokojowej do tkanki, 65 μl/5 cm2. Inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej i unikać ekspozycji na światło. Prać z czterema zmianami PBS przez 2 minuty na pranie. Strzepnij nadmiar płynu.
      7. Na koniec dodaj 15 μl 0,5 - 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindole) w podłożu do mocowania szkiełka do szkiełka, które działa jak przeciwbarwnik. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci lub cementem gumowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemności, ponieważ test jest wrażliwy na światło.
    3. Barwienie trzeciego szkiełka jest barwione przy użyciu testu TUNEL i barwienia przeciwstawnego DAPI, ale stosuje się je jako kontrolę dodatnią i ujemną dla każdej próbki.
      UWAGA: Spośród 4 histosekcji na szkiełkach kontrolnych, pierwsze 2 to kontrpróby kontroli dodatniej, a ostatnie 2 to kontrpróby kontroli ujemnej.
      1. W przypadku kontroli dodatnich, zamiast kroku 4.5.2.2, należy wstępnie potraktować tkankę buforem DN (zasada trizma 30 mM, pH 7,2, 4 mM MgCl2, 0,1 mM DDT) i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie rozpuść Dnazę I w buforze DN do końcowego stężenia 0,1 ug/ml i nałóż ją bezpośrednio na szkiełko. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyć szkiełko 5 płukaniami dH2O przez 3 minuty przy każdym myciu. Zetrzyj nadmiar płynu. Następnie wznowić test TUNEL zgodnie z zaleceniami w sekcji 4.5.2.3.
      2. W przypadku kontroli ujemnych nie należy dodawać do tych próbek końcowego enzymu transferazy deoksynukleotydylu (TdT) (jak opisano w sekcji 4.5.2.4).
  6. Obserwować szkiełka TUNEL natychmiast po zakończeniu testu.
    1. Rób zdjęcia w losowych odstępach czasu wzdłuż każdego odcinka skóry z 200-krotnym powiększeniem za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając filtrów zarówno dla barwienia rodaminy, które ujawnia komórki apoptotyczne i wydaje się czerwone, jak i DAPI, które ujawnia wszystkie jądra i wydaje się niebieskie, aby można było wygenerować nakładkę komórek. Upewnij się, że co najmniej 100 komórek zostało sfotografowanych na każdy fragment skóry na próbkę. Preparaty należy przechowywać w ciemnym pojemniku mikroskopowym w temperaturze -20 °C.
    2. Policz komórki (zabarwione na niebiesko DAPI) na obrazie. Upewnij się, że na każdy odcinek skóry liczy się co najmniej 100 komórek. Aby osiągnąć 100 komórek, policz wszystkie komórki na obrazie. Jeśli na jednym obrazie znajduje się mniej niż 100 komórek, policz kolejny obraz, aż osiągniesz co najmniej 100 komórek na odcinek skóry na zwierzę.
    3. Następnie policz liczbę komórek dodatnich TUNEL na tych samych obrazach (barwione na czerwono rodamina). Komórki dodatnie TUNEL, które wskazują na apoptozę, a nie martwicę lub tło, to pojedyncze komórki z wyraźnymi krawędziami komórek (błony są nienaruszone bez lizy). Czasami komórki kurczą się, tworząc ciała apoptotyczne.
    4. Zlokalizuj obszary zliczone w teście TUNEL i przeanalizuj odpowiadające im regiony na histosekcjach barwionych H&E. Upewnij się, że wybarwione skrawki H&E odpowiadają miejscom zakażenia Bd, co zapewnia, że miejsca zakażone Bd są używane podczas liczenia komórek apoptotycznych w teście TUNEL.

5. Test kaspazy 3/7

  1. Zbieraj czubki palców u nóg od każdego zwierzęcia (zarówno narażonego na Bd, jak i Bd-ujemnego) raz w tygodniu przez 3 tydzień po szczepieniu i co dwa tygodnie do końca eksperymentu, do 8 palców u nogi na osobę.
    1. Odciąć czubek palca u nogi w drugim paliczku za pomocą wysterylizowanych płomieniowo nożyczek, umieścić w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C.
  2. Ekstrahować białka z zamrożonej próbki palca u nogi.
    1. Umieścić próbki w 100 μl buforu do próbek (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) z dwoma kulkami ze stali nierdzewnej (3,2 mm) w mikroprobówce z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Próbki należy poddać lizie w 4 cyklach po 1 minutę ubijania kulek z maksymalną prędkością (w tym samym ubijaku do kulek, co w kroku 1.2.1), a następnie 3 minuty na lodzie. Po lizie odwirować próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zebrać supernatant do użycia w teście.
  3. Określić ilościowo stężenie białka w próbce za pomocą testu Bradforda.
    1. Na płytce 384-dołkowej wymieszaj 10 μl ekstraktu białkowego z 10 μl odczynnika Bradford i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Każdą próbkę należy wykonać w dwóch egzemplarzach, wraz z serią 5-krotnych wzorców rozcieńczenia BSA. Odczytać absorbancję przy 595 nm na płytce czytnika absorbancji.
  4. Alternatywnie, jeśli próbki czubków palców u nóg są zbyt małe (stężenie białka jest bliskie najniższej normie określonej w teście Bradforda w kroku 4.3.1 lub jeśli żaby, z których pobiera się próbki, mają masę całkowitą poniżej 3 g), należy standaryzować próbki, szacując powierzchnię skóry za pomocą zdjęć, zamiast testu Bradforda.
    1. Przed ekstrakcją białek z próbki do testu kaspazy należy sfotografować każdy palec u nogi w 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu światła odwróconego.
    2. Przeanalizuj próbkę palca u nogi za pomocą komputerowego oprogramowania do obrazowania, szacując obszar palca. W tym celu narysuj linię wokół krawędzi zacisku na palce i poproś oprogramowanie do obrazowania o oszacowanie obszaru w kształcie. Następnie pomnóż ten obszar przez liczbę pi (3.14), co w przybliżeniu przybliży pole powierzchni trójwymiarowej próbki skóry (ponieważ długość x pole przekroju poprzecznego (pi x średnica) daje zewnętrzną powierzchnię probówki).
  5. Wykonaj test kaspazy 3/7.
    1. Do 384-dołkowej płytki luminescencyjnej dodać 10 μl dostępnego w handlu odczynnika kaspazy 3/7 i 10 μl ekstraktu białkowego. Zbadaj każdą próbkę w trzech egzemplarzach.
    2. Wymieszać odczynniki, potrząsając powoli płytką przez 15 s. Inkubować płytkę z dala od światła przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zmierz luminescencję za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test TUNEL

U zakażonych zwierząt było więcej komórek TUNEL dodatnich niż u niezakażonych zwierząt kontrolnych. Lokalizacja in situ komórek TUNEL dodatnich różniła się u zwierząt zakażonych i kontrolnych. U zwierząt kontrolnych stwierdzono równomierne rozmieszczenie komórek TUNEL-dodatnich w warstwach skóry skórnej i naskórka na niskich poziomach (patrz Rysunek 1A), ale u zakażonych zwierząt ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badaliśmy apoptozę naskórka i śmierć komórek jako potencjalny mechanizm patologii śmiertelnej choroby chytridiomykozy lub mechanizm oporności na choroby u gatunków wrażliwych na Bd . Zastosowaliśmy dwie metody oceny śmierci komórek w naskórku, test TUNEL do analizy śmierci komórek naskórka in situ oraz test kaspazy 3/7 do monitorowania śmierci komórek naskórka przez cały postęp infekcji. Odkryliśmy, że śmierć komórki i apoptoza są skorelowane z obciążeniem infekcją, a śmierć komórki jest znacznie wyższa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy następującym osobom, które pomagały w hodowli i zbieraniu danych: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney i T. Knavel; oraz M. Merces za pomoc przy sekcjach. Chcielibyśmy również podziękować M. McFaddenowi, P. Harlowowi i Taronga Zoo za wyhodowanie L. v. alpina oraz G. Marantelli za wychowanie P. corroboree. Dziękujemy F. Pasmansowi, A. Martelowi za porady dotyczące testów apoptozy, C. Constantine'owi, A. Kladnikowi i R. Webbowi za pomoc w teście TUNEL oraz T. Emeto i W. Weßels za pomoc w protokole i zestawie do testu kaspazy 3/7. Ten manuskrypt i protokół są adaptacją Brannelly et al 2017 Peer J22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
POLARstar OmegaBMG LabtechCzytnik płytek luminescencyjnych
384-dołkowa płaska przezroczysta płyta dolnaCorning3707
384 well z niskim kołnierzem biała płaska płyta dolnaCorning3570
Agar bakteriologiczny (oxoid)FisherOXLP0011B
Formal-Fixx 10% neutralna buforowana formalinaFisher6764254
Rosół laktozowy (Oxoid)FisherOXCM0137B
Wodorowęglan soduFisherBP328-500
Tricane-S (MS-222)FisherNC0872873
TryptoneFisherBP1421-500
Surowica bydlęca AlbuminaInvitrogen15561020
Sterylny wacik ze sztucznego jedwabiuDrut medyczny i SprzętMW-113
ApopTag Czerwony zestaw do wykrywania apoptozy in situ OdczynnikMerck MilliporeS7165
Coomassie BradfordPierce23200
Caspase Glo  3/7PromegaG8090
Bufor HEPESSigma AldrichH0887-20ML
Chlorek magnezuSigma Aldrich1374248-1G
Hydrolizat żelatyny EnzymatycznySigma-AldrichG0262
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pH 7,2 (1X)Thermo/Life20-012-043
PrepmanThermo/Life4318930
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher4444556
ParafilmBemisPM996
Wybielacz CloroxClorox
Etanol, 200 proof, klasa molekularnaFisherBP2818500
Mikroskop fluorescencyjny Carl Zeiss MikroskopfluorescencyjnyCarl Zeiss
Koraliki ze stali nierdzewnej 3,2 mmBioSpec11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		TaqmanIndywidualny projekt dla podkładów i sondy
Podkład 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		TaqmanIndywidualny projekt dla podkładów i sondy
Sonda do spoiwa z mniejszym rowkiem Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′)TaqmanIndywidualny projekt starterów i sondy
Rotor-Gene qPCR InstrumentsQiagenqPCR Maszyna
mikrowirówek 1,5mlFisher02-681-372
Płytki Petriego do hodowli komórkowychNunc263991
Mini-beadBeater Koraliki cyrkorowo-krzemianowe, 0,5 mmBioSpec11079105Z
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127(2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069(2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test TUNELtest kaspazy 3 7mikroskopia fluorescencyjnaekstrakcja bia ekbiopsja ko c wki palcawykrywanie apoptozypatogen grzybiczytkanka sk ry

Powiązane artykuły