Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57346

⸱

12 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Streszczenie

Zrozumienie funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych jest kluczowe dla rozwoju nowych strategii terapeutycznych, które dają nadzieję na poprawę dostarczania leków do mózgu, poprawę ochrony mózgu i leczenie zaburzeń mózgu. Jednak badanie funkcji bariery krew-mózg człowieka jest trudne. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na odpowiednie modele. W związku z tym naczynia włosowate mózgu wyizolowane z ludzkiej tkanki mózgowej stanowią unikalne narzędzie do badania funkcji bariery jak najbardziej zbliżonej do ludzkiej sytuacji in vivo. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych z ludzkiej tkanki mózgowej z wysoką wydajnością oraz przy stałej jakości i czystości. Kapilary są izolowane ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą homogenizacji mechanicznej, wirowania w gradiacji gęstości i filtracji. Po izolacji naczynia włosowate ludzkiego mózgu mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, w tym do testów przecieków, obrazowania żywych komórek i testów immunologicznych w celu zbadania ekspresji i funkcji białek, aktywności enzymów lub sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Izolowane naczynia włosowate ludzkiego mózgu są unikalnym modelem wyjaśniającym regulację funkcji ludzkiej bariery krew-mózg. Model ten może dostarczyć informacji na temat patogenezy ośrodkowego układu nerwowego (OUN), co pomoże w opracowaniu strategii terapeutycznych w leczeniu zaburzeń OUN.

Wprowadzenie

Bariera krew-mózg to ściśle kontrolowany interfejs między krwią a mózgiem, który decyduje o tym, co wchodzi i wychodzi z mózgu. Anatomicznie komórki śródbłonka tworzą barierę krew-mózg i tworzą złożoną, ciągłą sieć naczyń włosowatych. Fizjologicznie ta sieć kapilarna zaopatruje mózg w tlen i składniki odżywcze, jednocześnie usuwając dwutlenek węgla i produkty przemiany materii. Co ważne, dowody potwierdzają, że zmiany bariery przyczyniają się do wielu patologii, w tym choroby Alzheimera, epilepsji i udaru mózgu1,2,3,4,5,6,7. Komórki śródbłonka mózgu służą również jako bariera dla leczenia, blokując wchłanianie leków do mózgu, np. chemioterapia glejaka wielopostaciowego po resekcji guza8,9,10. Pod tym względem izolowane naczynia włosowate ludzkiego mózgu stanowią unikalny model bariery krew-mózg ex vivo, który bardzo przypomina właściwości bariery in vivo, co pozwala na badanie funkcji bariery i dysfunkcji w zdrowiu i chorobie. W tym artykule przedstawiamy protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od ludzkiego mózgu przy niezmiennie wysokiej jakości naczyń włosowatych i wydajności w celu zbadania bariery krew-mózg.

W 1969 roku, Siakotos et al. 11 jako pierwsi poinformowali o izolacji naczyń włosowatych mózgu z tkanki mózgowej bydlęcej i ludzkiej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości i separacji kolumn z kulkami szklanymi. Później Goldstein i wsp.12 ulepszył tę metodę, dodając wiele etapów filtracji, aby zmniejszyć ilość tkanki potrzebnej do badania naczyń włosowatych mózgu wyizolowanych od szczurów, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności metabolicznej transportu glukozy. Od tego czasu naukowcy wielokrotnie optymalizowali procedurę izolacji naczyń włosowatych, ulepszając metodę i model naczyń włosowatych mózgu z każdą iteracją13,14,15. Na przykład Pardridge i wsp. 16 izolowało naczynia włosowate bydła za pomocą trawienia enzymatycznego, a nie mechanicznej homogenizacji, a następnie przepuściło zawiesinę kapilarną przez filtr siatkowy 210 μm i kolumnę z kulkami szklanymi. Modyfikacje te poprawiły plamę wykluczającą błękit trypanowy w izolowanych naczyniach włosowatych mózgu, a tym samym zwiększyły żywotność komórek śródbłonka. Na początku lat dziewięćdziesiątych Dallaire i wsp. 17 izolowane naczynia włosowate bydła i szczura, które były wolne od zanieczyszczeń neuronalnych i utrzymywały aktywność metaboliczną transpeptydazy γ-glutamylowej (γ-GTazy) i fosfatazy alkalicznej. W 2000 roku Miller i wsp. 18, użył izolowanych naczyń włosowatych mózgu szczura i świni w połączeniu z mikroskopią konfokalną, aby pokazać nagromadzenie substratów transportowych w świetle naczyń włosowatych. Następnie nasze laboratorium kontynuowało optymalizację procedury izolacji naczyń włosowatych mózgu i opracowaliśmy testy transportowe w celu określenia glikoproteiny P (P-gp)19,20,21, białko oporności na raka piersi (BCRP)22,23, oraz białko oporności wielolekowej 2 (Mrp2)24 działalności transportowej. W 2004 roku opublikowaliśmy dwa raporty, w których wykorzystaliśmy izolowane naczynia włosowate mózgu szczura do zbadania różnych szlaków sygnałowych. W Hartz i wsp. 21, odkryliśmy, że peptyd endothelin-1 szybko i odwracalnie redukuje funkcję transportu P-gp w naczyniach włosowatych mózgu, działając poprzez receptor receptora endoteliny B (ETB), syntazę tlenku azotu (NOS) i kinazę białkową C (PKC). W Bauer i wsp.19, wykazaliśmy ekspresję receptora jądrowego pregnanu X (PXR) i pokazaliśmy modulację PXR ekspresji i funkcji transportu P-gp w naczyniach włosowatych mózgu. W eksperymentach z transgenicznymi humanizowanymi myszami PXR rozszerzyliśmy tę linię badań i pokazaliśmy in vivo zaostrzenie bariery poprzez regulację w górę P-gp poprzez aktywację hPXR25. W 2010 r. Hartz i wsp. 26 użył tego podejścia do przywrócenia ekspresji i aktywności transportowej białka P-gp u transgenicznych myszy z ludzkim białkiem prekursorowym amyloidu (hAPP), u których występuje nadekspresja hAPP. Co więcej, przywrócenie P-gp u myszy hAPP znacznie obniżyło poziomy amyloidu beta (Aβ)40i Aβ42w mózgu.

Oprócz badania szlaków sygnałowych, izolowane naczynia włosowate mózgu mogą być używane do określania zmian w przepuszczalności naczyń włosowatych, które nazywamy przeciekaniem naczyń włosowatych. W szczególności test wycieku Texas Red służy do oceny wycieku barwnika fluorescencyjnego Texas Red ze światła kapilarnego w czasie, a dane te są następnie wykorzystywane do analizy szybkości wycieków. Zwiększone wskaźniki przeciekania naczyń włosowatych w porównaniu do tych z naczyń włosowatych kontrolnych wskazują na zmiany w fizycznej integralności bariery krew-mózg2. Jest to cenne, ponieważ istnieje wiele stanów chorobowych związanych z przerwaniem bariery, np. padaczka, stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera i urazowe uszkodzenie mózgu27,28,29,30. Inne grupy również wykorzystały izolowane naczynia włosowate do rozpoznania szlaków sygnałowych, które regulują ekspresję białek i aktywność transportową białek31,32,33,34,35,36,37. Wreszcie, kontynuowaliśmy optymalizację tej metody pod kątem izolacji naczyń włosowatych ludzkiego mózgu, a ostatnio wykazaliśmy zwiększoną ekspresję P-gp na ludzkiej barierze krew-mózg u pacjentów z padaczką w porównaniu z osobami kontrolnymi bez napadów38. Podsumowując, odkrycia te pokazują, że izolowane naczynia włosowate mózgu mogą służyć jako wszechstronny model do badania funkcji bariery.

W badaniach podstawowych i przemysłowych badaniach przesiewowych leków użyto różnych modeli bariery krew-mózg in vivo, ex vivo i in vitro, głównie w celu testowania dostarczania leków do mózgu39,40,41,42,43,44. Oprócz izolowanych naczyń włosowatych mózgu ex vivo, obecne modele bariery krew-mózg obejmują modele in silico, hodowlę komórkową in vitro izolowanych komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu lub unieśmiertelnione linie komórkowe różnych gatunków, hodowlę in vitro ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), które różnicują się w komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, oraz modele mikroprzepływowe na chipie.

Modele in silico są najczęściej używane w rozwoju leków do wyboru kandydatów na leki na podstawie przewidywanych właściwości wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME). Metody takie jak ilościowe modele zależności struktura-właściwość (QSPR) i ilościowe modele zależności struktura-aktywność (QSAR) są popularnymi metodami stosowanymi w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych bibliotek do przewidywania penetracji mózgu przez kandydatów na leki45,46. Modele te są przydatne do badania molekuł pod kątem właściwości penetracji bariery.

Betz et al.47 ustanowił monowarstwy hodowanych komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu jako system modelowy bariery krew-mózg in vitro. Modele hodowli komórkowych in vitro wykorzystujące świeże tkanki lub unieśmiertelnione linie komórkowe śródbłonka, takie jak ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyń mózgowych (hCMEC), mogą być kolejnym wysokowydajnym narzędziem przesiewowym do penetracji mózgu lub badań mechanistycznych. Jednak modele hodowli komórek śródbłonka naczyń włosowatych w mózgu nie mają fizjologicznego stresu ścinającego związanego z przepływem krwi wewnątrz światła naczyń włosowatych, są ograniczone pod względem ogólnej złożoności biologicznej i ulegają zmianom w ekspresji i lokalizacji ważnych składników bariery, takich jak białka połączeń ścisłych, receptory powierzchniowe, transportery, enzymy i kanały jonowe48,49,50. I odwrotnie, monowarstwy śródbłonka pochodzące z hPSC mają niską przepuszczalność sacharozy w porównaniu z kulturami hCMEC/D3 i zawierają spolaryzowaną ekspresję niektórych transporterów bariery krew-mózg, cząsteczek adhezyjnych i połączeń ścisłych51,52. Jednak komórki te podlegają również zmiennym właściwościom w hodowli, a system musi zostać zweryfikowany pod kątem rekapitulacji właściwości barierowych in vivo52.

Nowsze trendy w badaniach bariery krew-mózg obejmują wykorzystanie systemów hodowli tkanek 3D do tworzenia sztucznych naczyń włosowatych, wykorzystanie technologii organ-on-chip do generowania urządzeń mikroprzepływowych, lub wykorzystanie technologii pustych włókien53,54,55. Sztuczne naczynia włosowate mają jednak znacznie większe średnice (100–200 μm) niż naczynia włosowate mózgu (3–7 μm). W związku z tym siły tnące in vitro nie przypominają w pełni sytuacji in vivo. Jest to rozwiązanie w urządzeniach mikroprzepływowych typu "krew-mózg-bariera-w-chipie", w których sztuczne błony tworzą przedziały "krwi" i "mózg", a płyny są pompowane przez te urządzenia, generując mikroprzepływowe siły ścinające. Podobnie, kohodowle komórek śródbłonka w różnych kombinacjach z astrocytami i komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych zostały również wykorzystane z technologią pustych włókien do odtworzenia parametrów reologicznych obecnych w warunkach in vivo56,57,58. Nie jest jednak jasne, jak dobrze model ten odzwierciedla inne właściwości bariery krew-mózg, takie jak transport, metabolizm, sygnalizacja i inne. Te sztuczne modele kapilarne i chipowe nadają się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, ale komórki używane do generowania tych modeli również podlegają zmianom podczas hodowli.

Zamrożone i utrwalone wycinki mózgu lub hodowle komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu to dodatkowe modele, które mogą być użyte dobadania ludzkiego mikrokrążenia5,59,60,61. Na przykład immunohistochemia utrwalonej tkanki mózgowej służy do określenia lokalizacji i ekspresji białek w tkankach zdrowych w porównaniu z chorymi.

Oprócz wycinków tkanek i modeli in vitro opisanych powyżej, świeżo wyizolowane naczynia włosowate mózgu mogą być wykorzystane do badania funkcji bariery krew-mózg. Ograniczenia tego izolowanego modelu kapilarnego obejmują trudność w uzyskaniu świeżej ludzkiej tkanki mózgowej, brak astrocytów i neuronów oraz stosunkowo czasochłonny proces izolacji. Zaletą izolowanego modelu kapilarnego mózgu jest to, że model ten bardzo przypomina sytuację in vivo, a zatem może być wykorzystany do scharakteryzowania funkcji bariery i dysfunkcji. Co ważne, może być również używany do rozpoznawania mechanizmów sygnalizacyjnych przy użyciu wielu testów i technik molekularnych3,19,62,63.

Nasze laboratorium ma dostęp zarówno do świeżej, jak i mrożonej ludzkiej tkanki mózgowej za pośrednictwem Sanders-Brown Center on Aging (IRB #B15-2602-M)64. W tym kontekście autopsje przebiegają zgodnie ze standardowym protokołem, mózgi są uzyskiwane w ciągu <4 godzin, a wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi NIH Biospecimen Best Practice Guidelines65. Biorąc pod uwagę ten wyjątkowy dostęp do ludzkiej tkanki mózgowej, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od ludzkiej tkanki mózgowej, co skutkuje wysoką wydajnością nienaruszonych, żywotnych naczyń włosowatych ludzkiego mózgu. Dwa powszechne punkty końcowe będące przedmiotem zainteresowania to określenie ekspresji i aktywności białka. W związku z tym wraz z innymi ustaliliśmy różne testy, które można stosować z izolowanymi naczyniami włosowatymi mózgu do badania ekspresji i poziomów aktywności białek. Testy te obejmują Western blot, prosty test zachodni, test immunoenzymatyczny (ELISA), reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR), zymografię, testy aktywności transportowej i testy nieszczelności kapilarnej. Testy te pozwalają naukowcom badać zmiany w funkcji bariery w stanach patologicznych człowieka, określać szlaki rządzące ekspresją i aktywnością białek oraz identyfikować cele farmakologiczne w leczeniu chorób związanych z barierą krew-mózg.

Razem wzięte, świeżo wyizolowane naczynia włosowate mózgu mogą służyć jako solidny i powtarzalny model bariery krew-mózg. W szczególności model ten można łączyć z wieloma różnymi testami w celu określenia szerokiego wachlarza punktów końcowych do badania funkcji bariery.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższe informacje są oparte na aktualnych standardach bezpieczeństwa i regulacji na Uniwersytecie Kentucky, Lexington, KY, USA. Jako środek ostrożności przed rozpoczęciem pracy z tkanką ludzką należy zapoznać się z programem bezpieczeństwa biologicznego instytucji oraz z najbardziej aktualnymi przepisami i zaleceniami.

UWAGA: Tkanka ludzka może być źródłem patogenów przenoszonych przez krew, w tym ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) i innych. Praca z tkanką ludzką stwarza ryzyko zakażenia patogenami przenoszonymi przez krew. Dlatego podczas pracy z tkankami ludzkimi konieczne są pewne względy regulacyjne i bezpieczeństwa w celu ochrony personelu laboratoryjnego. Praca z tkankami ludzkimi w USA wymaga laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, a także środków ostrożności i szkolenia zgodnie z sekcją NIH IV-B-7, ustawą OSHA z 1970 r., klauzulę 5(a)(1) oraz instytucjonalnym programem bezpieczeństwa biologicznego użytkownika. Ogólnie rzecz biorąc, zgoda Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego i/lub Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej musi zostać uzyskana przed przeprowadzeniem jakichkolwiek badań z udziałem materiałów ludzkich (tkanki, płyny ustrojowe). Szkolenie jest wymagane od całego personelu pracującego z ludźmi i obejmuje podstawowe szkolenie w zakresie bezpieczeństwa laboratoryjnego, np. w zakresie higieny chemicznej i bezpieczeństwa laboratoryjnego, a także szkolenie specjalistyczne w zakresie bezpieczeństwa biologicznego, odpadów niebezpiecznych i patogenów przenoszonych przez krew u ludzi. Wszystkim pracownikom pracującym z ludźmi zaleca się szczepienie przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B przed rozpoczęciem pracy z ludźmi. Personel jest zobowiązany do noszenia specjalnych środków ochrony osobistej podczas pracy z materiałami ludzkimi, np. fartuch laboratoryjny z mankietami i osłoną twarzy, a także do noszenia rękawic przez cały czas. Wszystkie prace wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego (klasa 2). Ze wszystkimi urządzeniami, które mają kontakt z materiałami ludzkimi i wszelkimi odpadami z materiałów ludzkich, należy obchodzić się w odpowiedni sposób, aby zapobiec skażeniu i/lub zakażeniu personelu. Wszystkie urządzenia i powierzchnie są czyszczone 10% wybielaczem i 75% etanolem po każdej procedurze z udziałem ludzi. Rozlany płyn z materiałami ludzkimi należy natychmiast uprzątnąć. Naczynia szklane są sterylizowane w autoklawie po każdym użyciu. Odpady, w tym nieutrwalone tkanki ludzkie, są zbierane w oznakowanym worku na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i sterylizowane w autoklawie. Ostre narzędzia są zbierane w pojemniku odpornym na przebicie i przeciekanie oznaczonym jako niebezpieczne biologicznie. Wszystkie odpady z materiałów ludzkich są utylizowane zgodnie z przepisami instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

UWAGA: Nasze laboratorium otrzymuje świeże próbki kory czołowej od zmarłych osób za pośrednictwem Sanders-Brown Center on Aging (IRB #B15-2602-M). Kryteria włączenia to: włączenie do badania kohortowego UK-ADC longitudinal autopsja oraz interwał pośmiertny (PMI) ≤4 h64. Autopsje przebiegają zgodnie ze standardowym protokołem, a wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi NIH Biospecimen Best Practice Guidelines65. Krótki PMI wynoszący mniej niż 4 godziny ma ogromne znaczenie dla zapewnienia żywotności kapilarnej po izolacji. Można używać zarówno świeżej, jak i mrożonej tkanki. Jeśli konieczne jest zamrożenie, świeżo uzyskana ludzka tkanka mózgowa powinna zostać zamrożona szokowo w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80 °C. Świeża lub rozmrożona tkanka powinna być przechowywana w buforze izolacyjnym (patrz poniżej) i szybko przetworzona. Okazuje się, że 10 g świeżej tkanki ludzkiej daje około 100 mg naczyń włosowatych mózgu (mokra masa).

1. Konfiguracja

  1. Przygotowanie buforu
    UWAGA: Potrzebna objętość buforu zależy od ilości tkanki. Wszystkie objętości w poniższym protokole są oparte na 10 g tkanki kory mózgowej człowieka.
    1. L Bufor izolacyjny: Użyj 1,5 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) i uzupełnij 5 mM D-glukozy (1,35 g) i 1 mM pirogronianu sodu (0,165 g). Po dodaniu glukozy i pirogronianu dostosuj do pH 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu. Przed użyciem schłodzić i przechowywać bufor w temperaturze 4 °C.
    2. Albumina surowicy bydlęcej (BSA): Dodać 10 g proszku BSA do 1 l buforu izolacyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie BSA wynoszące 1%. Mieszaj powoli, aby uniknąć pęcherzyków, dostosuj do pH 7,4 i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie wymieszaj; Unikaj tworzenia się pęcherzyków, aby uniknąć denaturacji albuminy.
    3. Pożywka o gradiencie gęstości: Odważyć 18 g pożywki o gradientu gęstości do szklanej butelki i dodać mieszadło magnetyczne. Dodać 60 ml buforu izolacyjnego i energicznie wstrząsać przez 5 minut, aż cały proszek zostanie zawieszony. Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić rozpuszczenie podłoża o gradiencie gęstości. Mieszaj przez 10 minut bezpośrednio przed użyciem.
    4. Przechowywać wszystkie w temperaturze 4 °C; wszystkie narzędzia i przechowywać na lodzie podczas całej procedury izolacji. Wymieszaj wszystkie przed użyciem.
  2. Konfiguracja eksperymentalna
    1. Zamontuj tłuczek młynka do tkanek Potter-Elvehjem na elektronicznym mieszadle górnym. Umieść pod maską młynek do tkanek Potter-Elvehjem i homogenizator Dounce z tłuczkiem na lodzie pod maską. Przygotuj siatkę filtracyjną o grubości 300 μm (5 x 5 cm2), złóż ją w stożek, a następnie włóż i przymocuj do probówki Falcon o pojemności 50 ml za pomocą taśmy (Rysunek 1A).
    2. Umieść pierścienie łączące i filtry odkształcające ogniwa (wielkość porów: 30 μm) na probówkach Falcon o pojemności 50 ml. Przygotuj worki na odpady niebezpieczne biologicznie. Umieść cały wymagany sprzęt w komorze bezpieczeństwa biologicznego (patrz tabela materiałów).

2. Przygotowanie próbki mózgu

UWAGA: Rysunek 1A pokazuje schemat przebiegu całej procedury izolacji opisanej poniżej. Ludzka tkanka mózgowa może pochodzić z dowolnej części kory mózgowej i może być używana świeża lub mrożona. Zamrożoną tkankę mózgową można rozmrozić w temperaturze pokojowej (bez buforu; ~30 min na 10 g). Aby osiągnąć porównywalne wyniki, tkanka mózgowa powinna być pobrana z tego samego obszaru mózgu dla każdego eksperymentu. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem świeżej (PMI <4 h) ludzkiej kory mózgowej, która nie została zamrożona.

  1. Przygotowanie ludzkiej tkanki mózgowej: Udokumentuj wagę tkanki mózgowej. Wszystkie liczby w poniższym protokole są odpowiednie dla 10 g świeżej tkanki mózgowej człowieka. Umieść tkankę mózgową na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Ostrożnie usuń wszystkie opony za pomocą kleszczy. Użyj skalpela, aby odciąć białą istotę.
  2. Mielenie ludzkiej tkanki mózgowej: Ostrożnie pokrój tkankę mózgową i zmiel ją skalpelem. Mielemy przez około 5 minut (kawałki 2–3 mm). Przenieś tkankę mózgową do młynka do tkanek Potter-Elvehjem. Dodać 30 ml buforu izolacyjnego.
    UWAGA: Kawałki tkanki mielonej są trudne do zobaczenia, ponieważ tkanka mózgowa zamienia się w papkę w procesie mielenia.

3. Homogenizacja

  1. Młynek do tkanek Potter-Elvehjem (prześwit: 150–230 μm): Homogenizuj każdą próbkę za pomocą 100 pociągnięć przy prędkości homogenizatora 50 obr./min. Udokumentuj czas co 25 uderzeń i całkowity czas potrzebny na 100 ruchów. Patrz Tabela 1 dla proponowanego protokołu homogenizacji; Całkowity czas homogenizacji 10 g ludzkiej kory czołowej wynosi około 22 minut. Nie mieszaj powietrza, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
  2. Homogenizator Dounce (luz: 80–130 μm): Przenieść homogenat do homogenizatora Dounce na lodzie. Homogenizuj zawieszenie za pomocą 20 uderzeń (~6 s/suw, łącznie ~2 min). Unikaj bąbelków.

4. Wirowanie

  1. Rozprowadź równomiernie homogenat mózgu w czterech probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i udokumentuj całkowitą objętość homogenatu. Rozprowadzić 50 ml buforu gradientu gęstości do probówek wirówkowych (12,5 ml na probówkę). Użyj 10 ml buforu izolacyjnego do przepłukania tłuczka i homogenizatora, a następnie rozprowadź w czterech probówkach wirówkowych (~2,5 ml na probówkę).
  2. Szczelnie zamknij probówki wirówkowe nakrętkami. Wymieszaj homogenat, pożywkę o gradiencie gęstości i buforuj, energicznie potrząsając probówkami. Wirować przy 5 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C (wirnik o stałym kącie nachylenia); Wybierz średnią prędkość zwalniania, aby pelety były przymocowane do rurki. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 2 ml 1% BSA.

5. Filtracja

UWAGA: Aby oddzielić naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych resztek komórek, konieczne jest kilka etapów filtracji.

  1. Oczko 300 μm: Po ponownym zawieszeniu granulatu przefiltruj zawiesinę przez siatkę 300 μm. Kapilary są filtrowane przez siatkę, podczas gdy większe naczynia i większe szczątki mózgu pozostają na siatce. Ostrożnie umyj siatkę z objętością do 50 ml 1% BSA. Odrzuć siatkę.
    UWAGA: Ten etap filtracji oczyszcza zawiesinę kapilarną z większych naczyń lub kawałków resztek mózgu.
  2. Filtr odkształceń komórkowych 30 μM
    UWAGA: Ten etap filtracji oddziela naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych zanieczyszczeń mózgowych.
    1. Rozprowadzić filtrat kapilarny z kroku 6.1 na pięciu filtrach odkształceń komórkowych 30 μm (około 10 ml filtratu kapilarnego na filtr odkształcenia komórkowego). Naczynia włosowate są zatrzymywane przez ten filtr, podczas gdy czerwone krwinki, inne pojedyncze komórki i małe szczątki mózgu przechodzą przez filtr i są zbierane w filtracie.
    2. Umyj każdy filtr 25 ml 1% BSA. Następnie wlej wszystkie filtraty na szósty filtr, aby zwiększyć wydajność. Umyj każdy filtr 50 ml 1% BSA; Utrzymuj filtry szczepu komórkowego z kapilarami i wyrzuć filtrat.

6. Kolekcja kapilarna

  1. Odwróć filtry do góry nogami i umyj naczynia włosowate 50 ml 1% BSA dla każdego filtra do probówek o pojemności 50 ml. Delikatnie uciskaj końcówką pipety o pojemności 5 ml i przesuwaj ją po filtrze, aby zmyć naczynia włosowate mózgu.
  2. Upewnij się, że zmyłeś wszystkie naczynia włosowate mózgu, zwłaszcza z krawędzi filtra. Unikaj pęcherzyków, ponieważ utrudnia to proces filtracji i zwiększa ryzyko utraty naczyń włosowatych.

7. Mycie

  1. Po zebraniu kapilar odwirować wszystkie próbki o masie 1 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C (wahliwy wirnik kubełkowy). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w około 3 ml buforu izolacyjnego. Połącz wszystkie zawieszone granulki z jednej próbki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i napełnij ją buforem izolacyjnym. Ponownie odwirować przy 1.500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i umyć jeszcze dwa razy.
  2. Udokumentuj czystość naczyń włosowatych za pomocą mikroskopu (100-krotne powiększenie) i kamery (Rysunek 1B).
    UWAGA: Wydajność naczyń włosowatych mózgu z 10 g ludzkiej tkanki mózgowej wynosi zwykle około 100 mg. Izolowane naczynia włosowate mózgu mogą być teraz wykorzystywane do eksperymentów, przetwarzane (np. lizat, izolacja błony) lub zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze -80 °C w krioprobówkach przez co najmniej 6-12 miesięcy (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja z tkanki mózgu człowieka pozwala uzyskać zawiesinę wzbogaconą w naczynia włosowate mózgu człowieka (Rycyna 1B) z niewielkimi ilościami większych naczyń, erytrocytów, innych pojedynczych komórek oraz pewną ilością debris komórkowego. Niektóre naczynia włosowate są rozgałęzione, a w niektórych w świetle naczyń uwięzione są erytrocyty. Typowe naczynie włosowate ma średnicę 3–7 µm i długość około 100-200 µm z otwartym światłem; większość końców naczyń wł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje izolację nienaruszonych i żywotnych naczyń włosowatych ludzkiego mózgu ze świeżej tkanki. W tej sekcji szczegółowo omawiamy następujące kwestie: 1) modyfikacje protokołu, 2) rozwiązywanie typowych błędów, 3) ograniczenia techniki, 4) znaczenie modelu w odniesieniu do istniejących i alternatywnych modeli bariery krew-mózg oraz 5) potencjalne zastosowania izolowanych naczyń włosowatych ludzkiego mózgu.

Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany dla 10 g świeżej tkanki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy i wyrażamy uznanie dla dr Petera Nelsona i Sonyi Anderson z Banku Tkanek Mózgowych UK-ADC za dostarczenie wszystkich próbek ludzkiej tkanki mózgowej (numer grantu NIH: P30 AG028383 z National Institute on Aging). Dziękujemy Mattowi Hazzardowi i Tomowi Dolanowi, Information Technology Services, Academic Technology and Faculty Engagement, University of Kentucky za pomoc graficzną. Projekt ten był wspierany przez grant nr 1R01NS079507 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke (dla B.B.) oraz przez grant nr 1R01AG039621 z National Institute on Aging (dla A.M.S.H.). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu lub Narodowego Instytutu Starzenia się. Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Środki ochrony osobistej (PPE)
Rękawice lateksowe Diamond Grip Plus, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636
Jednorazowe ochronne fartuchy laboratoryjnePPE VWR, Radnor, PA, USA470146-214PPE; ze względu na charakter materiału pozyskiwanego przez człowieka zaleca się stosowanie jednorazowego fartucha laboratoryjnego
Osłona twarzy, jednorazowaThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA19460102środki ochrony indywidualnej; Ze względu na charakter materiału pozyskiwanego przez człowieka zaleca się stosowanie jednorazowej osłony twarzy
Materiały
Worki do autoklawu wysokotemperaturowego Clavies 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA01-815-6
Suchy papier ławkowy Versi 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA14-206-32do pokrycia obszarów roboczych
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75800-272dla używanych skalpeli
Wybielacz 8,2% Clorox Bakteriobójczy 64 uncje.Centrum Zaopatrzenia w Wielkiej Brytanii, Lexington, KY, USA323775
Equipment
4 ° C LodówkaThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA13-986-148
Miernik pH Accume BASIC AB15Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, USA501-21024-01-3
Wirówka Sorvall LEGEND XTRThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75004521
Mikroskop preparacyjny Leica L2Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, Stany Zjednoczoneużywany do usuwania opon
mózgowych Homogenizator POLYTRON PT2500Kinematica AG, Lucerna, Szwajcaria9158168
Scale P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, USA0191392
Standard mini StirThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA1151050
Termosy Ciekły azot DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, USA11-670-4Cużywane do zamrażania tkanki?
Waga analityczna Voyager ProOHAUS, Parsippany, NJ, StanyZjednoczone VP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USAdo sprawdzania izolowanych naczynek
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipeta 1-5 mlThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377823T1zmywać naczynka filtr
Finnpipette II Pipeta 100-1 000 &mikro; LThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377821T1granulat do resuspend w BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, USA739658
50 ml probówek Falcon 25/stojak - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
Ostrza skalpela EISCOThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAS95938Cdo mielenia tkanki mózgowej
PARAFILMVWR, Radnor, PA, USA52858-000do przykrycia zlewki i kolby miarowej
Thermo Scientific Finntip Pipet Końcówki 5 mlThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21-377-304do zmywania kapilar z filtra
Strzykawka 60 ml z Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USABD309653używana z pierścieniem łączącym do filtrowania kapilar
Rękojeść skalpela #4Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10060-13używany do mielenia
Dumont Kleszczy #5Fine Science Tools, Foster City, CA, USA11251-10używany do usuwania opon
mózgowych Potter-Elvehjem Tissue GrinderThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3431E2550 mL objętość, prześwit: 150-230 μ
m Homogenizator DounceVWR, Radnor PA USA62400-642Objętość 15 mL, prześwit: 80-130 μ m
Filtry tkane Spectra/Mesh (300 &mikro; m)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA146424Służy do filtrowania zawiesiny kapilarnej w celu usunięcia wszelkich opon mózgowych, które mogą pozostać
pluriSitka (wielkość porów: 30 i mikro; m)pluriSelect Life Science, Lipsk, Niemcy43-50030-03
Pierścień łączącypluriSelect Life Science, Lipsk, Niemcy41-50000-03wielokrotne użycie
1 L Kolbado przygotowania buforu izolacyjnego
1 L Zlewkado przygotowania 1% BSA
Stir Bardo przygotowania 1% BSA i Ficoll®
Schott Butelka (60 ml)do przygotowania Ficoll®
Wiadroaby wszystko było zimne
100 mm Szalkado mielenia tkanki mózgowej
Skrobak do komórek do hodowli tkankowychVWR, Radnor, PA, USA89260-222do usuwania supernatantu po odwirowaniu
Chemicals
BSA Frakcja V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAA9647-500gprzygotować w DPBS z Ca2+ & Mg2+ dzień wcześniej. Unikaj bąbelków podczas przygotowywania. Przechowywać w lodówce. Powoli mieszaj przez 10 minut przed użyciem.
DPBS z Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - część buforu izolacyjnego
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375Ważny jest tutaj dokładny pomiar. Odważyć w butelce z mieszadłem. Wstrząśnij wigojnie po dodaniu DPBS. Przechowywać w lodówce O/N. Rano będzie pogodnie. Mieszaj delikatnie przez 10-15 minut przed użyciem. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
Glukoza (D-(+) dekstroza)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG7528Stężenie glukozy (D-(+) dekstrozy): 5 mM
Roztwór wzorcowy wodorotlenku soduSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA71474w celu dostosowania pH DPBS
Pirogronian soduSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP2256Stężenie: 1 mM
bezpieczeństwa służy miarowa na lód, Petriego

Bibliografia

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805(2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40(2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149(2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18(2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709(2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja tkanki mózgowejwirowanie w gradiencie gęstościhomogenizacja mechanicznatesty filtracyjnebariera krew-mózgludzkie naczynia włosowate mózguanaliza czystości naczyń włosowatychtesty nieszczelnościobrazowanie żywych komórek
Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.