Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy

Aktywność neuronalna u ssaków jest koordynowana przez oscylacje sieciowe, które wspomagają transfer informacji wewnątrz i pomiędzy obszarami mózgu^1,2,3,4. Rytmy mózgu obejmują oscylacje od bardzo wolnych (< 0,8 Hz) do ultraszybkich (> 200 Hz). Liczne dowody potwierdzają udział oscylacji sieci w różnych funkcjach mózgu, w tym w poznaniu5^,6,7,8,9,10, wrodzone zachowania^11,12 oraz zaburzenia neuropsychiatryczne, takie jak choroba Parkinsona Choroba i epilepsja^13,14,15. Selektywne i czasowo precyzyjne metody eksperymentalnej manipulacji oscylacjami sieci są zatem niezbędne do opracowania fizjologicznie wiarygodnych modeli synchronizacji i ustalenia związków przyczynowo-skutkowych z zachowaniem.

Synchronizacja sieci jest zapośredniczona przez różne substraty i procesy biologiczne, począwszy od molekularnej tożsamości kanałów jonowych i ich kinetyki, a skończywszy na neuromodulacji pobudliwości i łączności sieciowej. Biologiczna konstrukcja generatorów rytmu¹⁶ została ujawniona dla wielu rytmów mózgu, których różne aspekty (np. częstotliwość, amplituda) są często spowodowane dynamiką różnych typów komórek i sieci. Na przykład, interneurony hamujące skierowane do somatów głównych komórek są najważniejszymi graczami w pasmach częstotliwości i regionach mózgu^17,18, w tym theta^19,20, gamma^20,21 i tętnienie (140-200 Hz)²² Drgań. Z kolei synchronizacja fazowa odległych komórek jest zapewniona przez solidną sygnalizację sprzężenia zwrotnego komórek piramidowych, która resetuje odpalanie interneuronów. Kluczowy parametr oscylacji, wielkość zsynchronizowanej populacji neuronów, jest ściśle związany z mierzoną amplitudą oscylacji LFP i, przynajmniej w przypadku szybkich oscylacji, zależy od popędu pobudzającego do interneuronów². Natomiast wolniejsze oscylacje, takie jak rytmy delta i theta, są generowane przez pętle reentrantowe dalekiego zasięgu, utworzone przez korowo-wzgórzowo-wzgórzowe ^23,24 i projekcje przegrody hipokampowo-przyśrodkowej^25,26,27, odpowiednio. Oscylacje w takich obwodach są wywoływane przez interakcje opóźnień propagacji sygnału, odpowiedzi pobudliwych i ich preferencji częstotliwości w uczestniczących komórkach^{28,29,30,31,32}. Projekcje hamujące z GABA-ergicznego parwalbuminy (PV) dodatnich komórek przegrody przyśrodkowej (MS) do interneuronów w hipokampie^25,33, regiony przyhipokampowe i kora śródwęchowa²⁶ są niezbędne do generowania oscylacji theta w przyśrodkowym płacie skroniowym. W ten sposób fizjologiczne mechanizmy oscylacji sieci i synchronizacji neuronów mogą być manipulowane za pomocą optogenetyki z precyzją w czasie rzeczywistym.

Manipulacje optogenetyczne specyficzne dla typu komórki zostały zastosowane do badań oscylacji hipokampa i kory mózgowej in vitro^{34,35,36,37,38} oraz in vivo^{30,39,40, 41,42,43,44,45}, w tym funkcjonalne badania gamma^{5,12,36,46,47,48, 49,50,51,52} i oscylacje tętnienia^40,53,54 i wrzeciona uśpione^55,56. Niedawno przeprowadziliśmy ekspresję wirusa ChR2 zależnego od Cre w stwardnieniu rozsianym, kluczowym regionie dla generowania rytmu theta hipokampa myszy PV-Cre. Za pomocą tego preparatu kontrolowano cechy oscylacji theta hipokampa (częstotliwość i stabilność czasowa) poprzez optogenetyczną stymulację projekcji hamujących SM w hipokampie¹¹. Co więcej, optogenetyczna stymulacja hamujących projekcji septo-hipokampa o częstotliwości theta wywoływała rytm theta podczas czuwania. Optogenetycznie porwany rytm theta wykazywał właściwości spontanicznych oscylacji theta u myszy na poziomie LFP i aktywności neuronalnej.

Kluczowe cechy tego protokołu obejmują: (1) wykorzystanie szlaku hamującego, który jest fizjologicznie krytyczny dla spontanicznych oscylacji theta, unikając jednocześnie niespecyficznych skutków dla pobudliwości hipokampa; (2) aksonalna, tj. stymulacja specyficzna dla projekcji w celu zminimalizowania bezpośredniego wpływu na odprowadzanie smrozu niezwiązane z hipokampem; (3) miejscowa stymulacja światłem w rytmie theta, zapewniająca minimalną bezpośrednią interferencję z rytmiczną dynamiką septokampa i hipokampa oraz globalne obustronne porywanie oscylacji theta; (4) parametryczna kontrola częstotliwości i regularności oscylacji theta; oraz (5) kwantyfikacja wierności porywania z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu LFP w celu umożliwienia ilościowej analizy przyczynowości u zachowujących się zwierząt. Ponieważ preparat ten zasadniczo wykorzystuje dobrze znaną rolę odhamowania przegrodowo-hipokampowego w generacji theta^25,30, umożliwia solidną kontrolę nad kilkoma parametrami oscylacji theta u zachowujących się myszy. Badania, w których manipulowano innymi, mniej zbadanymi szlakami i typami komórek obwodu przegrodowo-hipokampowego^{38,39,47,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58} ujawniają dalsze mechanizmy rytmu theta.

PV-Cre knock-in samce myszy⁵⁹, 10-25 tygodni. Myszy trzymano w standardowych warunkach w pomieszczeniu dla zwierząt i utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi i zostały zatwierdzone przez lokalne organy ds. zdrowia (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nadrenia Północna-Westfalia).

1. Wstrzyknięcie wirusa

1. Podczas całej procedury postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego⁶⁰. Załóż fartuch laboratoryjny, maskę chirurgiczną, siatkę na włosy i dwie pary rękawiczek.
2. Przyciąć rurkę sterylnym skalpelem lub nożyczkami do długości około 1 m, włożyć ją do bloku uchwytu strzykawki pompy i zamocować.
   1. Napełnij rurkę całkowicie olejem silikonowym za pomocą strzykawki.
   2. Sprawdź, czy w rurce nie pojawiają się pęcherzyki powietrza. Jeśli zaobserwuje się pęcherzyki powietrza, ponownie napełnij rurkę olejem.
   3. Przymocuj tłok do bloku popychacza.
   4. Powoli przesuwać popychacz w kierunku bloku uchwytu strzykawki, aż końcówka tłoka dotknie rurki.
   5. Włóż końcówkę tłoka do rurki i automatycznie przesuń blok popychacza do przodu z małą prędkością, wybierając "Zaparzaj" w oknie poleceń i niską szybkość infuzji (np. 500 nL/min), aż dotrze do bloku uchwytu strzykawki.
3. Przygotować igłę do wstrzykiwań (34G).
   1. Zdejmij piastę igły z wyraźnym cięciem za pomocą precyzyjnej wiertarki/szlifierki podłączonej do tarczy tnącej. W razie potrzeby użyj igły, aby usunąć metalowe pozostałości ze świeżo ściętej powierzchni.
   2. Przeciągnij rurkę kapilarną (o długości 3-4 cm) przez igłę.
   3. Przyklej igłę do rurki za pomocą super kleju.
   4. Podłączyć igłę do wstrzykiwań do końca rurki, która łączy się z pompką mikrostrzykawki.
4. Przymocuj igłę do uchwytu stereotaktycznego.
5. Pobierać powietrze, aż będzie widoczny pęcherzyk powietrza w przezroczystej rurce nad igłą.
6. Znieczulij mysz 1,5-3% izofluranem w tlenie. Odczekaj około 2-3 minut, a następnie potwierdź, że mysz jest w pełni znieczulona, oceniając jej reakcję na uszczypnięcie palca. Przez cały czas trwania zabiegu należy monitorować oddech zwierzęcia i w razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu.
7. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej za pomocą nieurazowych uchwytów na uszy.
8. Chroń oczy myszy żelem lipidowym.
9. Wstrzyknąć śródskórnie 0,1 ml lidokainy pod skórę głowy za pomocą strzykawki 0,01-1 ml i kaniuli iniekcyjnej 26G.
10. Ogolić i zdezynfekować głowę myszy za pomocą roztworu etanolu. Następnie trzykrotnie naprzemiennie stosować 2% chlorheksydynę z etanolem, aby zdezynfekować miejsce operowane.
11. Wykonaj nacięcie linii środkowej za pomocą cienkich i ostrych nożyczek biegnących od tyłu uszu do poziomu oczu, tak aby widoczna była bregma i lambda.
12. Oczyść czaszkę, nakładając około 50 μl NaCl za pomocą strzykawki i osusz chusteczką papierową i zaciągnięciem się powietrzem.
13. Ustaw głowę myszy, regulując grzbietowo-brzuszny poziom nosa clamp tak, aby bregma i lambda znajdowały się na tym samym poziomie grzbietowo-brzusznym (± 0.3 mm).
14. Wywierć otwór powyżej MS (AP 0.98 i L 0.5 mm w odniesieniu do bregmy).
15. W tym momencie należy rozmrażać porcję wirusa (powinna zawierać co najmniej 2 μl AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) przez około 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
16. Odwirować podwielokrotność przy stężeniu około 4 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 min.
17. Odpipetować pipetą 2 μl wirusa na kawałek Parafilmu; użyć uprzednio zabezpieczonej strony.
18. Zanurzyć końcówkę igły iniekcyjnej w płynie i ostrożnie pobrać z prędkością około 500 nL/min, obserwując poziom płynu. Aby zapobiec zasysaniu powietrza, należy przerwać odstawienie, zanim wirus zostanie całkowicie wchłonięty. Dostosuj szybkość wycofywania zgodnie z lepkością roztworu; Szybsze tempo może ułatwić wycofanie wirusa o większej lepkości.
19. Oczyść igłę chusteczką papierową.
20. Sprawdź, czy wirus znajduje się w probówce, a wirus i olej są oddzielone pęcherzykiem powietrza. Zaznaczyć poziom wirusa w probówce, aby sprawdzić, czy wirus został pomyślnie wprowadzony podczas wstrzyknięcia.
21. Umieścić igłę powyżej kraniotomii i powoli wprowadzić ją do mózgu w pierwszym miejscu wstrzyknięcia (AP 0,98, L 0,5, V -5,2, 5,5° bocznie).
22. Wstrzyknąć 450 nL wirusa z szybkością 100-150 nL/min. Odczekać 10 min. Ostrożnie przesunąć igłę w górę o 0,1 mm i odczekać kolejne 5 minut.
    1. Przesunąć igłę do drugiego punktu wstrzyknięcia (AP 0,98, L 0,5, V -4,6) i wstrzyknąć kolejne 450 nL przy 100-150 nL/min.
    2. Odczekaj ponownie 10 minut przed przesunięciem igły o 0,1 mm w górę. Odczekaj kolejne 5 minut przed wyjęciem igły.
23. Zszyj nacięcie jedwabnym czarnym plecionym szwem za pomocą kwadratowych węzłów. Ogrzej zwierzę czerwoną lampą, aby przyspieszyć powrót do zdrowia. Podawać antybiotyki (0,3 ml erycinum (1:4 w sterylnym NaCl)) i karprofen i.p. codziennie 2-3 dni po zabiegu.
24. Przeciąć rurkę powyżej znaku wskazującego poziom wirusa. Rurka może być używana do dalszych iniekcji. Przed każdym wstrzyknięciem należy przygotować nową igłę do wstrzykiwań.
    UWAGA: Zabieg ten trwa około 1-1,5 godziny. Zwierzę budzi się zazwyczaj w ciągu 5 minut po zabiegu. Należy odczekać co najmniej 6 tygodni do osiągnięcia wystarczającej ekspresji aksonalnej, ale nie dłużej niż 5 miesięcy przed wykonaniem implantacji stereotaktycznej, ponieważ poziomy ekspresji zaczynają spadać po około 6 miesiącach od wstrzyknięcia wirusa.

2. Przygotowanie światłowodów (Rysunek 1A)

1. Stosować światłowód wielomodowy (rdzeń 105 μm, szkło platerowane rdzeniem krzemionkowym, 0,22 NA). Zdejmij powłokę 125 μm z rdzenia włókna za pomocą mikrościągacza, podczas gdy włókno jest nadal przymocowane do szpuli włókna.
2. Przytnij włókno na długość około 2-3 cm za pomocą noża diamentowego.
3. Włóż włókno do ceramicznej skuwki w sztyfcie z tlenku cyrkonu (ID: 126 μm). Około 0,5-1 mm światłowodu powinno wystawać z wypukłej strony tulejki.
4. Za pomocą igły nałóż jedną kroplę kleju epoksydowego na oba końce skuwki, ale nie na boki skuwki. Alternatywnie użyj super kleju.
5. Pozostaw klej do wyschnięcia na co najmniej 30 minut.
6. Wypukłą stronę skuwki wypoleruj za pomocą diamentowej folii polerskiej z włókna docierającego (ziarnistość 3 μm).
7. Przetestuj wierność transferu światła za pomocą miernika mocy optycznej.
   1. Ustaw długość fali na mierniku mocy na tę samą długość fali, co używany laser.
   2. Umieść krosowy tak, aby końcówka była skierowana do środka czujnika. Włącz laser i odczytaj strumień świetlny z miernika mocy. Zapisz wartość.
   3. Podłącz światłowód do krosowego za pomocą pasującej tulei i ustaw go tak, aby końcówka światłowodu była skierowana do środka czujnika. Włącz laser i odczytaj strumień świetlny z miernika mocy. Zapisz wartość.
   4. Oblicz szybkość transmisji: podziel drugą wartość przez pierwszą wartość. Jeśli szybkość transmisji jest mniejsza niż 0,5, wyrzuć światłowód, w przeciwnym razie użyj go do implantacji.
   5. Przetestuj szybkość transmisji dla każdego włókna przed implantacją.
   6. W przypadku późniejszych eksperymentów dostosuj natężenie światła wyjściowego lasera do szybkości transmisji światłowodu: ustaw strumień świetlny z końcówki krosowego na 5-15 podzielony przez szybkość transmisji, aby uzyskać ostateczny strumień świetlny z końcówki światłowodu 5-15 mW.
      UWAGA: Zobacz także ref. ⁶¹ dla przygotowania światłowodów.

3. Przygotowanie matryc z drutu wolframowego do nagrań LFP (Rysunek 1B)

1. Przyklej kilka (na przykład 6) prowadnic rurki krzemionkowej o grubości 100 μm równolegle do lepkiej strony kawałka taśmy. Wytnij jeden kawałek, około 4-6 mm, na jeden zespół przewodów.
2. Przez rurki prowadzące przewleczone są izolowane formvarem druty wolframowe 45 μm za pomocą kleszczy.
3. Zdejmij sześć izolowanych emalią cienkich miedzianych drutów łączących (o długości około 5 mm) i przewód uziemiający (o długości około 2-3 cm) za pomocą skalpela, aby zeskrobać izolację na obu końcach. je do pinów nanozłącza.
4. Podłącz każdy drut łączący do jednego drutu wolframowego za pomocą odpowiednio jednej kropli farby przewodzącej srebro. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 30 minut.
5. Nałożyć minimalną ilość cementu, aby przykryć druty. Nie należy nakładać cementu na druty wolframowe, które zostaną wprowadzone w tkankę mózgową lub w górnej części nanołącznika. Pozostaw cement do wyschnięcia na co najmniej 30 minut.
6. Wykonać cięcie pod kątem (5-20°) drutów wolframowych za pomocą nożyczek ze stali nierdzewnej, aby umożliwić niezawodne zagnieżdżenie drutów poniżej lub powyżej strefy brzusznie przylegającej do warstwy piramidalnej, gdzie amplituda theta jest zbyt niska dla oszacowania wierności porwania.
7. Odizoluj końcówkę (około 2 mm) przewodu uziemiającego za pomocą skalpela, aby zeskrobać izolację. Potraktuj go topnikiem i wstępnym.
8. Sprawdź potencjalne przesłuchy między elektrodami za pomocą multimetru cyfrowego. W tym celu podłącz styki złącza do multimetru, który musi być ustawiony w trybie pomiaru rezystancji. Sprawdź parami kombinacje kanałów; odczyt na multimetrze poniżej 5 MΩ wskazuje na znaczny przesłuch.
9. Sprawdź impedancję każdego drutu elektrodowego w soli fizjologicznej za pomocą miernika impedancji. Typowe wartości impedancji wynoszą poniżej 100 kΩ.
10. Aby ułatwić implantację, przyklej jedno włókno światłowodowe do układu drutów tak, aby końcówka włókna znajdowała się na poziomie najkrótszego drutu, a końcówka światłowodu znajdowała się w bliskiej odległości, ale nie dotykała drutów wolframowych. Utrzymuj jak najmniejszy kąt włókna, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki podczas implantacji.
    UWAGA: Zobacz także ref. ⁶² dla produkcji tablic z drutu wolframowego.

4. Implantacje stereotaktyczne

1. Przygotować się zgodnie z opisem w krokach 1.6-1.13.
2. Usuń tkankę łączną z górnej części czaszki i dokładnie dociśnij mięśnie szyi na około 2 mm, aby zapobiec artefaktom mięśniowym podczas nagrywania.
3. Oczyść czaszkę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i soli fizjologicznej, a następnie wywierć 4 otwory (2 z przodu i 2 nad móżdżkiem, średnica 0,8 mm), aby umieścić ze stali nierdzewnej (00-96x1/16) do szlifowania i stabilizacji implantu (Rysunek 1D). Umieść uziemiającą podłączoną do jednego drutu miedzianego (o długości około 2-3 cm) nad móżdżkiem.
4. Całkowicie przykryj uziemiającą cementem, aby zapobiec artefaktom mięśniowym podczas zapisów elektrofizjologicznych. Zbuduj cementowy pierścień łączący wszystkie (Rysunek 1E).
5. Wykonaj kraniotomię powyżej strony implantacji (Hipokamp, AP -1,94, L 1,4, V 1,4 w odniesieniu do bregmy). Nałóż około 5 μl sterylnego NaCl na powierzchnię tkanki mózgowej.
6. Powoli opuść układ drutów za pomocą stereotaksji w kraniotomii. W przypadku nagrań jednostkowych należy wszczepić sondę silikonową zamiast tablicy przewodów⁶³; w celu zapobieżenia artefaktom światła optoelektrycznego, wszczepij światłowód oddzielnie w hipokampie, tak aby końcówka światłowodu nie była skierowana bezpośrednio w stronę sondy (Rysunek 1C - I). W celu zbadania koordynacji porywania między półkulami należy wszczepić dodatkowy światłowód w przeciwległym obszarze hipokampa CA1.
7. Nałożyć około 5 μl ciepłego płynnego wosku/oleju parafinowego, podgrzanego w temperaturze 70 °C, za pomocą strzykawki powyżej miejsca implantacji, aby chronić tkankę mózgową.
8. Nałóż cement wokół siatki drucianej i przykryj czaszkę cementem.
9. Nałóż jedną kroplę topnika na wstępnie przylutowany przewód uziemiający/odniesienia i wstępnie przylutowany przewód podłączony do uziemiającej, na przykład za pomocą igły, i połącz przewody za pomocą lutownicy.
10. Przykryj cały przewód uziemiający cementem.
11. Podawać 0,3 ml eryciny (1:4 w sterylnym NaCl) i karprofenie (5 mg/ml) docelowo po zabiegu chirurgicznym i przez co najmniej dwa dni po zabiegu. Mysz zazwyczaj budzi się w ciągu 15 minut po operacji. Ogrzej zwierzę czerwoną lampą, aby przyspieszyć powrót do zdrowia.
12. Monitoruj masę ciała myszy codziennie przez pierwszy tydzień po operacji lub do momentu, gdy waga się ustabilizuje. Utrata masy ciała nie powinna przekraczać 10% masy ciała myszy zarejestrowanej przed operacją. Aby przyspieszyć stabilizację masy ciała, w pierwszych dniach po operacji podawaj myszy mokrą karmę i mleko skondensowane.
13. Aby zarejestrować aktywność komórkową hipokampa podczas porywania, wszczepij silikonową sondę do hipokampa (AP -1,94, L 1,4, V 1, z późniejszym obniżeniem), jak opisano w ref. ⁶² (Rysunek 1C - I). Wszczepić światłowód w hipokampie w AP -3, L 1,4, V 1,6, 39° ogonowo-rostralnym. Wszczepić dodatkowy światłowód w SM (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° boczny), jeśli pożądana jest stymulacja somatów komórkowych.

5. Stymulacja optogenetyczna i akwizycja danych elektrofizjologicznych

1. Przyzwyczaj mysz do ustawień nagrywania (np. 15 minut sesji, 1-2 sesje dziennie przez 3 dni). Zbadaj zachowanie zwierzęcia przed rozpoczęciem pierwszych eksperymentów. Jeśli mysz porusza się w komorze, eksploruje otoczenie, węszy, przeprowadza hodowlę itp., rozpocznij pierwszą sesję eksperymentalną.
2. Umieść mysz w znajomej komnacie pod nieobecność innych zwierząt w tym samym pomieszczeniu.
3. Przymocuj diodę LED do sceny czołowej za pomocą taśmy klejącej, aby śledzić pozycję zwierzęcia. Upewnij się, że światło LED jest przechwytywane przez kamerę przez cały okres, w którym zwierzę eksploruje komorę nagrywania, przed rozpoczęciem eksperymentów. Nagrywaj w ciemności, aby śledzić światło LED. Umieść kamerę nad komorą nagrywania.
4. Sprawdź moc światła z krosowego. Oszacuj strumień świetlny z końcówki światłowodu po podłączeniu w zależności od szybkości transmisji wszczepionego włókna. Upewnij się, że strumień świetlny z końcówki światłowodu wynosi od 5 do 15 mW, aby umożliwić niezawodne porywanie.
5. Podłącz przedwzmacniacz czołowy do przewlekle wszczepionego złącza. Podłącz patchcord światłowodowy do przewlekle wszczepionego włókna hipokampa w celu przeprowadzenia eksperymentów ze stymulacją optogenetyczną. W eksperymentach ze stymulacją światłem kontrolnym podłącz światłowód do atrapy skuwki podłączonej do zestawu słuchawkowego.
6. Umieść mysz w komorze nagrywania.
7. Otwórz oprogramowanie, aby sterować generatorem bodźców w celu wygenerowania protokołu stymulacji.
8. Wybierz kanał, który steruje laserem DPSS 473 nm. W pierwszym wierszu wprowadź 3,000 mV (1. kolumna), czas 30 ms (2. kolumna), wartość 0 mV (3. kolumna), czas 112 ms (4. kolumna), powtórzenie wiersza 840 i powtórzenie grupy 1, aby wygenerować protokół dla 2 minut stymulacji 7 Hz z impulsami o długości 30 ms. Dostosuj czas trwania w 4. kolumnie i liczbę powtórzeń rzędu, jeśli wymagana jest stymulacja z inną częstotliwością lub o innym czasie trwania. W drugim rzędzie wybierz 0 mW (1. kolumna), czas 500 h (2. kolumna), powtórzenie wiersza 1 i powtórzenie grupowe 1, aby upewnić się, że laser jest wyłączany po zakończeniu protokołu stymulacji.
9. Kliknij "Plik > Zapisz jako" i zapisz plik o żądanej nazwie.
10. Upewnij się, że wyjście TTL stymulatora wyzwalające laser jest podłączone do analogowej płytki wejściowej Digital Lynx w celu synchronizacji pozyskiwania danych elektrofizjologicznych i optogenetycznych.
11. Alternatywnie, aby parametrycznie regulować zmienność częstotliwości oscylacji theta, należy zastosować ciągi impulsów świetlnych w różnych odstępach między impulsami, z okresami następującymi po rozkładzie Gaussa. Zmodyfikuj dyspersję interwałów międzyimpulsowych dla różnych protokołów, np. od kroku 3.2 do 15.1 ms². Zastosuj te protokoły do generowania epok theta o różnej zmienności częstotliwości theta (Rysunek 6).
12. Otwórz oprogramowanie systemu nagrywania. Kliknij "ACQ", aby uzyskać i "REC", aby nagrać. Poczekaj przed rozpoczęciem stymulacji świetlnej, aby zarejestrować zachowanie linii bazowej (np. 2 minuty, aby uzyskać prędkość linii bazowej lub 30 minut, aby wyodrębnić pola miejsca linii bazowej).
13. Otwórz oprogramowanie, aby sterować generatorem bodźców. Kliknij "File > Open" i wybierz plik protokołu. Kliknij "Pobierz i Start", aby rozpocząć stymulację światłem.
    UWAGA: Eksperyment można badać, a stymulację rozpocząć za pomocą pilota; Wyklucza to wpływ obecności eksperymentatora na zachowanie zwierzęcia. W zależności od celu badania, stymulacja może być inicjowana i przerywana podczas określonych zachowań.

6. Połączone podejście do optogenetycznego porywania i specyficznego dla projekcji hamowania wyjścia hipokampa

1. Ekspresja ChR2 w komórkach GABA-ergicznych MS myszy PV-Cre, jak opisano w sekcji 1.
2. Ponadto wstrzyknąć łącznie 2,4 μl halorodopsyny zależnej od CamKIIα (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) w obie grzbietowe półkule hipokampa (AP -1,7; L ± 1,05; V -2,05 i -1,4 mm; AP -1,7; L ± 1,7; V -2,05 i -1,55 mm; AP -2,3; L ± 1,5; V -2,2 i -1,3 mm; AP -2,3; L ± 2,2; V -1,65 i -2,45 mm).
3. Odczekaj 6 tygodni na odciągnięcie.
4. Wszczepić układ drutu wolframowego ze światłowodem w obszarze CA1 hipokampa, jak opisano w sekcji 4. Dodatkowo wszczepia się obustronnie światłowody w przegrodzie bocznej (LS, AP 0,1, L 0,25, V -2,25 mm oraz AP 0,5, L -0,3, V -2,7 mm).
5. Wykonaj eksperymenty z optogenetycznym porywaniem theta zgodnie z opisem w krokach 5.4-5.5.
   1. W celu jednoczesnego zahamowania wyjścia hipokampa do LS, należy wygenerować protokół generowania bodźca: np. wyzwolić początek kanału wyjściowego podłączonego do lasera DPSS 593 nm 15 s ciągłym impulsem trwającym łącznie 45 s, przed wyzwoleniem impulsów wyjściowych do lasera DPSS 473 nm.
   2. Podłącz oba włókna w LS za pomocą krosowych za pomocą wielomodowego łącznika światłowodowego do lasera DPSS 593 nm.
   3. Rozpocznij nagrywanie, pobierz i uruchom protokół, aby kontrolować generowanie bodźców.

7. Przetwarzanie danych

1. Przekonwertuj sygnały elektrofizjologiczne i umieść dane śledzenia za pomocą Neurophysiological Data (ND) Manager odpowiednio do formatów .dat i .pos⁶⁴.
2. Uzyskaj LFP poprzez filtrowanie dolnoprzepustowe i próbkowanie w dół sygnału szerokopasmowego do 1,250 Hz za pomocą ND Manager⁶⁶.
3. W każdym nagraniu wybierz kanał o maksymalnej amplitudzie oscylacji theta (za pomocą Neuroscope)¹⁹.
4. Wykryj znaczniki czasowe impulsów laserowych i epok stymulacji za pomocą algorytmu wykrywania progów (za pomocą funkcji MATLAB findpeaks.m lub podobnej)¹¹.
5. Aby zaimportować plik .dat w oprogramowaniu do wielokanałowej analizy danych, kliknij "Plik > Importu", wybierz "pliki binarne" jako typ danych i wybierz plik .dat. W oknie konfiguracji wprowadź poprawną liczbę kanałów i częstotliwość próbkowania 1 250 Hz, kliknij "ok" i zapisz jako plik .smr. Wykreśl widma mocy, wybierając opcję "Analiza > widok nowych wyników > PowerSpectrum". W ustawieniach wybierz kanał o największej amplitudzie theta i rozmiarze 16 384 FFT, kliknij "Nowy", zdefiniuj jako "Czas rozpoczęcia" początek epoki stymulacji, a jako "Czas zakończenia" koniec epoki stymulacji, a następnie kliknij "Proces".
6. Obliczyć wierność porywania jako stosunek skumulowanej gęstości widmowej mocy (PSD) w zakresie częstotliwości stymulacji optogenetycznej (częstotliwość stymulacji ± 0,5 Hz) do skumulowanego PSD w paśmie theta (5-12 Hz) metodą wielostożkową (NW = 3, rozmiar okna 8,192) dla epok 10 s (np. zestaw narzędzi ).
7. Wyklucz z analizy rejestrowanie epok, w których dominujący pik PSD wynosi ≤ 5 Hz (epoki inne niż theta, za pomocą funkcji MATLAB find.m).
8. Wykreśl raster widm mocy LFP dla wszystkich zarejestrowanych epok zgodnie z obliczoną wiernością porywania (przy użyciu funkcji MATLAB sortrows.m i pcolor.m). Załaduj widma mocy i wierność porywania, klikając "File > Open", zapisaną zmienną In. Typ Power = sortrows(In,1); pcolor(Potęga(:,2:koniec)).

Kierowanie ChR2 do komórek GABAergicznych w MS, jak opisano w sekcji 1, jest zilustrowane w Rysunek 2A. Optogenetyczna stymulacja aksonów komórek GABA-ergicznych MS w grzbietowym hipokampie za pośrednictwem światłowodu, który jest wszczepiony powyżej obszaru CA1, powoduje oscylacje theta przy częstotliwości bodźca w półkuli ipsilateralnej (Rysunek 2B), a także przeciwległej (Rysunek 2C). Oscylacje theta mogą być mniej lub bardziej efektywnie porywane przez stymulację optogenetyczną (Rysunek 3A), której skuteczność została obliczona dla każdej epoki zapisu jako względna moc theta LFP wokół częstotliwości stymulacji, tj. wierność porywania (Rysunek 3B). Wierność porywania powyżej 0,3, czyli wyższą niż w spontanicznych nagraniach light-off, zaobserwowano w około 80% epok zapisu. Optostymulacja przy częstotliwościach innych niż theta była mniej skuteczna (Ryc. 3C).

Wyraźnie, tj. parametrycznej manipulacji częstotliwością oscylacji theta towarzyszą pojawiające się zmiany regularności theta: czasowa regularność amplitudy i częstotliwość oscylacji theta była zwiększana w epokach o wysokiej wierności porywania. Stabilność oscylacji może być również regulowana parametrycznie poprzez zastosowanie ciągów impulsów świetlnych, których okresy są zgodne z rozkładami Gaussa o różnych dyspersjach (Rysunek 4).

Optogenetyczna kontrola częstotliwości oscylacji wyeliminowała korelację między częstotliwością theta a prędkością biegu, zgodnie z kontrolą częstotliwości przez MS poprzez rosnące aferenty podczas ruchu (Rysunek 5A). Optostymulacja indukowała również oscylacje theta podczas bezruchu (Ryc. 5B). Preferencyjne fazy wypalania zarejestrowane w obszarze CA1 w przypuszczalnych komórkach piramidowych i interneuronach były niezmienione w stosunku do optogenetycznie porwanej oscylacji theta w porównaniu do spontanicznej theta (Ryc. 6).

Aby zbadać udział hipokampa w szlaku przegrody bocznej w regulacji lokomocji za pośrednictwem theta, optogenetycznie zahamowaliśmy ten szlak. Halorodopsyna (eNpHR3.0) ulegała obustronnej ekspresji w komórkach piramidowych hipokampa (Figura 7A), podczas gdy ChR2 ulegała ekspresji w komórkach GABA-ergicznych MS jak powyżej, a oscylacje theta były optogenetycznie porwane (Figura 7B). Porywanie theta zmniejszało zmienność prędkości biegu, ale nie wtedy, gdy hipokamp do szlaku LS był zahamowany (Rysunek 7C).

Rysunek 1: Ilustracja przedstawiająca światłowody, elektrody i chirurgię. (A) Ilustracja światłowodu. (B) Ilustracja układu drutowego przyklejonego do światłowodu w celu rejestracji LFP w hipokampie podczas porywania oscylacji theta w hipokampie. (C) W celu rejestrowania aktywności komórkowej hipokampa silikonowa sonda jest zamontowana na mikronapędzie. (D) Miniaturowe śrubki umieszczone są na czaszce. Druty miedziane są wstępnie przylutowane do masy i referencyjnej przed umieszczeniem ich nad móżdżkiem. (E) Cement nakłada się na pokrycie i połączenie. Górne niebieskie kółko wskazuje miejsce, w którym wykonano kraniotomię w celu wszczepienia sondy silikonowej. Dolne niebieskie kółko wskazuje miejsce, w którym wykonano kraniotomię w celu implantacji światłowodu w hipokampie. (F) Jeden światłowód jest wszczepiany pod kątem ogonowo-rostralnym, aby celować w region CA1 hipokampa. Drugie włókno można wszczepić do przegrody przyśrodkowej, jeśli pożądana jest stymulacja somatów komórkowych (opcjonalnie). (G) Sonda silikonowa jest obniżona tuż nad obszarem CA1 hipokampa. (H) Granice mikrodysku i złącza są przyklejone do implantu i uziemienia, a przewody odniesienia są przylutowane. (I) Siatka miedziana jest skonstruowana tak, aby otaczać implant i służyć jako klatka Faradaya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Przygotowanie do optogenetycznego porywania theta hipokampa. (A) ChR2 ulegał ekspresji w komórkach przegrody przyśrodkowej PV+ u myszy PV-Cre (górny schemat). Jasna fluorescencja w SM (1, 2) potwierdza udaną ekspresję konstruktu w somatach. Włókna stwardnienia rozsianego wystają przez otwór (f) i fimbrię (fi) do hipokampa (3-6); ACA: spoidło przednie; część przednia. HDB: jądro poziomej kończyny pasma ukośnego; Lub: stratum oriens. Światłowód do stymulacji optogenetycznej światłem niebieskim jest wszczepiony powyżej warstwy piramidalnej obszaru hipokampa CA1 (dolny schemat). Podziałka skali: 500 μm (ilustracje 1, 3, 4) i 50 μm (ilustracje 2, 5, 6). (B) LFP w hipokampie podczas spontanicznych oscylacji theta (po lewej) i porywania optogenetycznego 7 Hz (w środku) lub 10 Hz (po prawej). Niebieskie paski wskazują okna czasowe aplikacji światła. Zwróć uwagę na resetowanie fazy przez impuls świetlny wskazany strzałką. Zwróć uwagę na obwiedni gamma podczas spontanicznego i porwanego theta, wskaźnika fizjologicznego rytmu theta. Odwrócenie fazy między warstwą oriens (str. or.) a warstwą promienistą (str. rad.) jest również utrzymywane podczas porywania. (C) Porywanie jest niezawodne podczas stymulacji optogenetycznej ipsilateralnej (górne poletka), a także przeciwległej (dolne powierzchnie). Schematy ilustrują położenie włókien w stosunku do położenia elektrod. Przykładowe ślady LFP podczas theta i zastosowania impulsów świetlnych są pokazane w środku. Po prawej stronie widma mocy LFP hipokampa podczas stymulacji ipsi i kontralateralnej oznaczone kolorami zgodnie z częstotliwością stymulacji. Ten rysunek został zmodyfikowany z ref. 11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wierność optogenetycznego porywania theta hipokampa. (A) Przykładowe ślady LFP w hipokampie podczas niskiej i wysokiej wierności porywania. (B) Gęstości widmowe mocy wynoszące 10 epok s podczas spontanicznej theta, z rzędami uporządkowanymi według wiodącej częstotliwości theta (po lewej) oraz podczas stymulacji optogenetycznej 7 Hz (środek) i 10 Hz (po prawej), z rzędami uporządkowanymi według wierności porywania. Odpowiednie przykładowe widma mocy (oznaczone strzałką) są wykreślone powyżej. Zwróć uwagę na niezawodną wierność porywania w różnych epokach. Po prawej stronie pokazane jest skumulowane prawdopodobieństwo wierności porywania dla częstotliwości theta. (C) Porywanie wymaga stymulacji rytmicznej theta. Aktywność sieci hipokampa można z powodzeniem porwać za pomocą częstotliwości w zakresie 6-12 Hz. Przy niższych częstotliwościach (np. 2 lub 4 Hz) lub wyższych (np. 20 Hz) porywanie nie jest niezawodne. Ten rysunek został zmodyfikowany z ref. 11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Parametryczna manipulacja regularnością oscylacji theta. (A) Stymulację stosowano z różnymi częstotliwościami w zakresie theta ze średnią częstotliwością 7,8 Hz zgodnie z rozkładem Gaussa. Odchylenie standardowe interwałów między impulsami wzrosło we wszystkich protokołach od σ = 3,19 do σ = 15,09. W sumie wygenerowano i zastosowano 11 protokołów, z których każdy trwał 1 minutę stymulacji. Spośród nich rozkład prawdopodobieństwa 5 protokołów pokazano po lewej stronie rysunku. Widmowe gęstości mocy w zakresie 1-14 Hz LFP hipokampa podczas stosowania odpowiednich protokołów są wykreślone w środku rysunku. Prawdopodobieństwa okresów theta podczas stosowania odpowiednich protokołów są zilustrowane po prawej stronie. (B) Wariancja zastosowanych interwałów międzyimpulsowych określała wariancję współbieżnego okresu theta (r Pearsona = 0,94, p = 0,0002). (C) Zależność między zmiennością amplitudy theta a interwałem międzyimpulsowym (r Pearsona = 0,61, p = 0,08). Ten rysunek został zmodyfikowany z ref. 70. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Rytmiczne porywanie optogenetycznej theta determinuje LFP hipokampa podczas zachowania. (A) Częstotliwość stymulacji optogenetycznej określała częstotliwość theta podczas lokomocji. W związku z tym aferenty związane z prędkością nie wpływają na częstotliwość theta w hipokampie, a w konsekwencji prędkość nie jest skorelowana z częstotliwością theta (kolor niebieski), jak ma to miejsce podczas spontanicznego theta (kolor). Dane są przedstawione jako średnia ± s.e.m. (B) Podczas spokojnego czuwania theta hipokampa może być wywołana przy braku ruchu. Ślady LFP w hipokampie przed i podczas udanego porywania są pokazane powyżej, a przykładowe ślady prędkości zarejestrowane podczas porywania są pokazane poniżej (czerwony ślad odpowiada śladowi LFP w hipokampie przedstawionym powyżej). Niebieskie paski oznaczają okna czasowe impulsów stymulacji świetlnej. Ten rysunek został zmodyfikowany z ref. 11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Aktywność komórkowa hipokampa podczas porywania theta. (A) Aktywność komórkową rejestrowano za pomocą sond silikonowych (schemat). Pojedyncze interneurony i komórki piramidowe zostały wyizolowane i zidentyfikowane zgodnie z ich odpowiednim kształtem fali. Pokazany tutaj jest średni kształt fali (środek) i autokorelogram przykładowej izolowanej komórki piramidalnej. (B) Preferowana faza rozładowania komórek piramidowych (Pyr) nie różniła się podczas spontanicznej (w kolorze czarnym, n = 29 neuronów) i optogenetycznie porwanej (na niebiesko, n = 30) theta (p = 0,79). (C) Pokazany tutaj jest autokorelogram (po lewej) i preferencyjna faza odpalania szybko odpalającego się interneuronu podczas spontanicznego i optogenetycznie porwanego theta. Poniżej odpowiedniego rytmu LFP w hipokampie podczas spontanicznej (po lewej) i porwanej (po prawej) theta. (D) Preferowana faza rozładowania szybko strzelających interneuronów nie różniła się podczas spontanicznego (w kolorze czarnym) i optogenetycznie porwanego (w kolorze niebieskim, n = 28 neuronów) theta (p = 0,97). Średni autokorelogram jest pokazany po lewej stronie. (E) Przeciętne komórki str. oriens autokorelogramu. (F) Preferowana faza rozładowania interneuronów str. oriens nie różniła się w przypadku spontanicznej (czarnej) i optogenetycznie porwanej (niebieskiej, n = 10 neuronów) theta (p = 0,56). Histogramy preferowanych faz rozładowania są pokazane po prawej stronie. (G) Na średnie szybkości wypalania nie miało wpływu porywanie theta w komórkach piramidowych (p = 0,98), szybko strzelających interneuronach (p = 0,96) lub interneuronach Str. oriens (p = 0,85). Ten rysunek został zmodyfikowany z ref. 11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7: Połączenie porywania theta w hipokampie i optogenetycznego hamowania wyjścia podkorowego hipokampa przez LS. (A) eNpHR3.0 (halorodopsyna) ulegała ekspresji w komórkach piramidowych hipokampa (górny schemat). Pomyślna ekspresja konstruktu została potwierdzona przez jasną fluorescencję w somatach w hipokampie (górne obrazy) i aksonach w LS (dolne obrazy). Włókna światłowodowe zostały wszczepione obustronnie powyżej LS (schemat dolny). Podziałka skali: 500 μm (obrazy po lewej), 50 μm (obrazy po prawej). (B) Theta hipokampa jest skutecznie porywana podczas hamowania szlaku hipokampa do LS. Pokazano tutaj gęstości widmowe mocy dla stymulacji światłem niebieskim 9 Hz podczas hamowania wyjścia. (C) Hamowanie głównego podkorowego szlaku wyjściowego hipokampa zapobiega wpływowi porywania theta hipokampa na prędkość. Pokazano tutaj spadek zmienności prędkości po porywaniu optogenetycznym (biały pasek z niebieskimi obwódkami), przy jednoczesnym hamowaniu szlaku hipokampa do LS (żółty pasek z niebieskimi obwódkami). Odpowiednia średnia prędkość bazowa jest pokazana po lewej stronie. Ten rysunek został zmodyfikowany z ref. 11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.