Artykuł metodologiczny

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

DOI:

10.3791/57354

⸱

1 lipca 2018

 ,  , 
1College of Life Sciences, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informacje o czasoprzestrzennych lokalizacjach subkomórkowych białka są kluczowe dla zrozumienia jego fizjologicznych funkcji w komórkach. Białka fluorescencyjne i wytwarzanie fluorescencyjnych białek fuzyjnych są szeroko stosowane jako skuteczne narzędzie do bezpośredniej wizualizacji lokalizacji i dynamiki białek w komórkach. Szczególnie przydatne jest porównanie ich z dobrze znanymi markerami organelli po koekspresji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Niemniej jednak klasyczne podejścia do koekspresji białek w roślinach zwykle obejmują wiele niezależnych plazmidów ekspresyjnych, a zatem mają wady, które obejmują niską wydajność koekspresji, zmienność na poziomie ekspresji i wysoki wydatek czasu na krzyżowanie genetyczne i badania przesiewowe. W tym badaniu opisujemy solidną i nowatorską metodę koekspresji wielu chimerycznych białek fluorescencyjnych w roślinach. Pokonuje ograniczenia konwencjonalnych metod dzięki zastosowaniu pojedynczego wektora wyrażenia, który składa się z wielu częściowo niezależnych kaset ekspresyjnych. Każda kaseta ekspresji białek zawiera własne funkcjonalne elementy ekspresji białek, dzięki czemu można ją elastycznie dostosowywać do różnych potrzeb związanych z ekspresją. Ponadto łatwo i wygodnie jest przeprowadzić montaż i manipulację fragmentami DNA w plazmidzie ekspresyjnym przy użyciu zoptymalizowanej jednoetapowej reakcji bez dodatkowych etapów trawienia i ligacji. Co więcej, jest w pełni kompatybilny z obecnymi technologiami i aplikacjami bioobrazowania pochodzącymi z białek fluorescencyjnych, takimi jak FRET i BiFC. W ramach walidacji metody zastosowaliśmy ten nowy system do koekspresji fluorescencyjnie połączonych receptorów sortowania wakuolarnego i wydzielniczych białek błony nośnikowej. Wyniki pokazują, że ich perspektywiczne lokalizacje subkomórkowe są takie same jak w poprzednich badaniach, zarówno pod względem przejściowej ekspresji, jak i transformacji genetycznej w roślinach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chimeryczne fluorescencyjne białka fuzyjne zostały uznane za użyteczne narzędzia do badania dynamiki wewnątrzkomórkowej i lokalizacji subkomórkowej oraz dalszego zrozumienia ich funkcji fizjologicznych i mechanizmów działania1,2,3,4. Szczególnie korzystne jest współekspresja dobrze znanych białek reporterowych organelli z białkiem, o którym mowa, aby lepiej zilustrować jego czasoprzestrzenne uzasadnienie, rozmieszczenie i funkcję (funkcje) w systemie endomembranowym w komórkach4,5,6,7,8.

Chimeryczne fluorescencyjne białko fuzyjne może być wyrażane w roślinach poprzez przejściową ekspresję i stabilną transformację genetyczną, które mają swoje zalety i ograniczenia9,10,11. Przejściowa ekspresja białka jest wygodnym podejściem, które obejmuje przejściową ekspresję DNA za pośrednictwem bombardowania biolistycznego, glikolu polietylenowego (PEG) lub elektroporacji w protoplastach oraz infiltrację liści za pośrednictwem Agrobacterium w nienaruszonych komórkach roślinnych, jak pokazano w Rysunek 1A,B12,13,14,15,16. Jednak koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w jednej komórce roślinnej wymaga mieszaniny kilku niezależnych plazmidów ekspresyjnych. Tak więc, wadami stosowania wielu plazmidów do koekspresji białek w roślinach są niższe poziomy koekspresji ze względu na znacznie zmniejszone prawdopodobieństwo jednoczesnego wejścia kilku plazmidów do tych samych komórek w porównaniu z pojedynczym plazmidem oraz różnice w poziomach ekspresji białek spowodowane niekontrolowanie losową ilością każdego typu plazmidu przenoszonego do komórki17, 18. Ponadto technicznie trudne jest wprowadzenie kilku plazmidów o niezależnej ekspresji do jednego Agrobacterium dla koekspresji białka9,10,11. W związku z tym, przejściowa ekspresja białka za pośrednictwem Agrobacterium przez infiltrację liści tytoniu jest zdolna do ekspresji tylko jednego plazmidu na raz, jak pokazano na Rysunek 1B. W przeciwieństwie do tego, wytwarzanie roślin transgenicznych wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych jest zwykle osiągane przez Agrobacterium, które przenosi binarny wektor transformacji. Jednak wektor binarny, który pośredniczy w transferze genów i insercji do genomów roślin, jest zdolny do ekspresji tylko pojedynczego fluorescencyjnego białka fuzyjnego ( Rysunek 1B) 9,< sup class = "xref" >10,< sup class="xref">12. Wygenerowanie transgenicznej rośliny, która jednocześnie eksprymuje kilka chimerycznych białek fluorescencyjnych, wymaga wielu rund krzyżowania genetycznego i badań przesiewowych, które mogą trwać od miesięcy do lat, w zależności od liczby genów, które mają ulec koekspresji.

Zastosowanie pojedynczego wektora ekspresji do koekspresji wielu białek w roślinie zostało zgłoszone w kilku poprzednich badaniach19,20,21. Jednak wiele rund trawienia enzymatycznego i ligacji DNA cząsteczek DNA i wektorów szkieletowych jest zwykle wymaganych do wytworzenia końcowego plazmidu do koekspresji lub nadekspresji białka. W tym miejscu opracowaliśmy nową i solidną metodę koekspresji wielu chimerycznych białek fluorescencyjnych w roślinach. Jest to bardzo wydajna i wygodna metoda, która osiąga wielokrotną koekspresję białek w roślinach zarówno dla przejściowej ekspresji, jak i stabilnej transformacji w uświęcony tradycją sposób. Wykorzystuje pojedynczy wektor, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset ekspresji białek do koekspresji białek, pokonując w ten sposób wady konwencjonalnych metod. Co więcej, jest to bardzo wszechstronny system, w którym manipulacje i składanie DNA odbywa się za pomocą prostej, jednoetapowej, zoptymalizowanej reakcji bez dodatkowych etapów trawienia i ligacji DNA. Zasada działania jest zilustrowana na Rysunek 2. Co więcej, jest w pełni kompatybilny z obecnymi podejściami komórkowymi, molekularnymi i biochemicznymi, które opierają się na chimerycznych fluorescencyjnych białkach fuzyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Strategia projektowania podkładów i amplifikacja DNA

  1. Zaprojektuj startery do klonowania molekularnego fragmentów DNA. Startery składają się z sekwencji wiążących specyficznych dla genu 20 pz i sekwencji zwisu końca 5' od 20 do 25 pz, które są komplementarną nakładającą się sekwencją sąsiednich cząsteczek DNA (patrz na przykład tabela 1).
    UWAGA: Późniejsze składanie każdego fragmentu DNA, połączenie różnych kaset ekspresji białek i integracja z końcowym wektorem ekspresji zależą od rozpoznania sąsiednich nakładających się sekwencji.
  2. Amplifikacja fragmentów DNA, w tym promotora, reportera fluorescencyjnego, genu docelowego i terminatora, które są niezbędne do budowy częściowo niezależnych kaset ekspresji białek za pomocą standardowych reakcji PCR z odpowiednimi starterami i polimerazą o wysokiej wierności.
    UWAGA: Szablony użyte w tym badaniu do amplifikacji DNA pochodzą z poprzednich badań15,22,23. Temperatura wyżarzania i czas wydłużenia reakcji PCR są zależne od startera i genu.

2. Składanie fragmentów DNA i budowa kaset ekspresji białek

  1. Zbadać jakość produktów pierwszej rundy PCR za pomocą elektroforezy DNA i określić ilościowo za pomocą spektrofotometru. Sprawdź, czy doszło do degradacji i zanieczyszczenia DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 1%. OD260/OD280 produktów PCR powinien wynosić od 1,6 do 1,8.
  2. Wymieszaj różne fragmenty DNA (0,05 - 0,1 pmol na każdy fragment) w nowej probówce PCR do końcowej objętości 5 μL.
    UWAGA: Wymieszaj cząsteczki DNA przeznaczone dla tej samej kasety ekspresji białka w jednej probówce PCR. Unikaj mieszania ze sobą DNA z różnych kaset ekspresyjnych, ponieważ zmniejszy to wydajność składania DNA ze względu na rosnącą liczbę cząsteczek DNA, które muszą być połączone.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  3. Przygotuj 5 ml bufora zapasowego ISO: 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoksynukleotydu (dNTP); 50 mM ditiotreitolu; 25% glikolu polietylenowego (PEG) 8000; i 5 mM dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD).
  4. Przygotować 1 ml 2x mieszaniny głównej z 400 μl 5x bufor podstawowy ISO, 7,5 jednostki egzonukleazy T5, 62,5 jednostki polimerazy DNA o wysokiej wierności, 5,000 jednostek polimerazy Taq (patrz tabela materiałów) i sterylizowane podwójnie destylowane H2O.
    UWAGA: Jest to adaptacja z poprzednich badań24,25,26; Wolumeny te należy zoptymalizować.
  5. Porcja 100 μl 2x mieszaniny wzorcowej w probówce i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: Częste zamrażanie i rozmrażanie 2x mieszanki głównej może powodować niską wydajność składania DNA.
  6. Dodać 15 μl 2x mieszaniny głównej do 5 μl mieszaniny DNA i inkubować w temperaturze 50 °C przez 60 minut.

3. Budowa wektora do koekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

  1. Amplifikować całą częściowo niezależną kasetę ekspresji białek za pomocą drugiej rundy PCR, używając produktu (0,5 - 1,0 μl) z pierwszej rundy reakcji składania izotermicznego jako matrycy i najbardziej zewnętrznych starterów (np. 1-FP35S i 1-RNOS dla kasety ekspresji 1).
    1. Użyć 1 jednostki polimerazy o wysokiej wierności w objętości reakcyjnej 50 μl, a następnie wykonać 30 cykli (94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 2 min), a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 5 min.
  2. Linearyzować końcowe wektory szkieletowe ekspresji białek pUC18 i pCAMBIA1300, które są przeznaczone odpowiednio do przejściowej ekspresji białek i transformacji genetycznej, dodając 4 jednostki Sma I do końcowej objętości reakcyjnej 10 μl i inkubując przez 1-2 godziny w temperaturze 25 °C. Dezaktywować enzym restrykcyjny przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
  3. Wymieszać równomolowe cząsteczki DNA kaset ekspresji białek i zlinearyzowanego wektora końcowego w końcową objętość reakcji 5 μl. Następnie przeprowadzić drugą rundę rekombinacji DNA, mieszając z 15 μl 2x bufor główny i inkubując w temperaturze 50 °C przez 60 minut.
  4. Użyj produktów końcowych reakcji rekombinacji izotermicznej drugiej rundy do przekształcenia kompetentnych komórek E. coli (np. DH5α) zgodnie ze standardowymi procedurami27. Dwukrotnie sprawdź dodatnie kolonie za pomocą PCR kolonii i sekwencjonowania DNA. Ekstrahować dodatnie plazmidy z E. coli za pomocą mini zestawu do ekstrakcji plazmidu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: W przypadku długotrwałego przechowywania plazmidy rozpuszczone w buforze TE lub podwójnie destylowanymH2Osą bardziej stabilne niż trzymanie ich w szczepach E. coli.

4. Przejściowa koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach za pośrednictwem bombardowania biolistycznego

  1. Przygotuj komórki zawiesinowe tytoniu BY-2 i młode rośliny Arabidopsis do bombardowania.
    1. Hodowla komórek BY-2 w pożywce Murashige i Skoog (MS) poprzez subhodowlę dwa razy w tygodniu w temperaturze 25 °C w wytrząsarce ustawionej na 130 obr./min. Filtr zbiera 30 ml 3-d hodowanych komórek BY-2 na kawałku 70-milimetrowej autoklawowanej bibuły filtracyjnej za pomocą pompy próżniowej, ustawiając podciśnienie na 40 mbar.
    2. Aby zapobiec wysychaniu komórek podczas kolejnych etapów, dodaj kilka kropli płynnej pożywki hodowlanej komórek BY-2 na szalce Petriego przed umieszczeniem bibuły filtracyjnej (następny krok).
    3. Przenieść bibułę filtracyjną z komórkami BY-2 na nową szalkę Petriego (85 mm x 15 mm).
    4. Nasiona Arabidopsis thaliana (Col-0) należy sterylizować powierzchniowo, wirując mieszaninę z 70% (v/v) etanolem zawierającym 0,05% Tween 20 przez 10 minut.
    5. Odwiruj nasiona za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez 2 sekundy, usuń supernatant i umyj nasiona 100% etanolem raz przez 30 sekund. Odpipetuj nasiona na nową sterylną bibułę filtracyjną w sterylnym kapturze. Następnie wysusz nasiona na powietrzu i rozprowadź je na płytkach agarowych o pojemności 1/2 MS.
    6. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez 48 godzin przed przeniesieniem ich do komory wzrostu roślin z następującymi ustawieniami: 16 h światła / 8 h ciemności o intensywności 120 - 150 μm m-2 s-1, 22 °C.
    7. Przenieś 7-dniowe próbki roślin do okręgu o średnicy 30 mm w środku nowej płytki średniej 1/2 MS, aby zwiększyć skuteczność bombardowania.
      Uwaga: Unikaj nakładania się roślin podczas przenoszenia i umieszczania ich na nowej płytce 1/2 MS.
    8. Dodaj kilka kropli 1/2 MS płynnego podłoża na powierzchnię roślin lub tkanek, aby zachować wilgoć i zapobiec wysuszeniu roślin podczas kolejnych kroków.
  2. Pokryj cząsteczki złota plazmidowym DNA.
    1. Dokładnie przetaczaj roztwór mikronośnika ze złotem przez 3 minuty. Przygotuj nową probówkę o pojemności 1,5 ml.
    2. Kolejno dodawać następujące roztwory do probówki i wirować: 25 μL (1,5 mg) cząsteczek złota, wir 10 s; 10 μL 25,46 mg/L spermidyny, wir 10 s; 5 μL 1 μg/μL plazmidowego DNA, wir 3 min; 25 μL roztworu 277,5 mg/L CaCl2, wir 1 min.
      Uwaga: Na tym etapie kontynuuj wirowanie.
    3. Odwiruj mikronośniki złota za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez 5 s i ostrożnie odpipetuj supernatant bez naruszania osadu. Przemyć 200 μl absolutnego etanolu i ponownie zawiesić granulat wirowo na 5 - 10 s. Kręć z maksymalną prędkością przez 5 s i usuń etanol.
    4. Ponownie zawiesić cząstki złota w 18 μl absolutnego etanolu i podwielokrotnej zawiesinie 6 μl cząstek na środku trzech makronośników. Pozwól im wyschnąć na powietrzu.
  3. Przenieś DNA do roślin poprzez bombardowanie cząstkami.
    1. Ustaw system dostarczania cząstek w następujący sposób: 1100 psi, podciśnienie 28 mm Hg, odległość 1 cm przerwy i odległość lotu cząstek 9 cm.
    2. Bombarduj komórki/rośliny na płytce z podłożem agarowym trzy razy w trzech różnych pozycjach, a następnie utrzymuj komórki/rośliny w ciemności natychmiast po bombardowaniu.
      Ostrzeżenie: Podczas obsługi systemu dostarczania cząstek należy nosić okulary ochronne ze względu na powiązanie z systemem gazu pod wysokim ciśnieniem i cząstek o dużej prędkości.
  4. Trzymaj bombardowane komórki/rośliny w ciemności w komorze wzrostu roślin przez 6 do 72 godzin przed obserwacją sygnałów fluorescencyjnych. Ustawić komorę wzrostu roślin na 24 godziny ciemności i 22 °C.
    Ostrzeżenie: Skuteczność ekspresji i intensywność sygnału fluorescencyjnego są zależne od promotora, genu i rośliny/tkanki.

5. Generowanie stabilnego transgenicznego Arabidopsis z koekspresją wielu chimerycznych białek fluorescencyjnych przez transformację za pośrednictwem Agrobacterium.

  1. Rozmrozić kompetentne komórki Agrobacterium (PMP90) na lodzie i odczekać 30 minut, a następnie dodać 2 μl wektora binarnego (100 - 200 ng) (przygotowanego powyżej) do właściwych komórek. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 10 minut.
  2. Przenieść mieszaninę do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji o średnicy 0,1 cm. Włóż kuwetę do systemu elektroporacji i wykonaj elektroporację z następującymi ustawieniami: 1,6 kV, 600 omów, 25 μF.
  3. Dodać 1 ml płynnego podłoża SOC do kuwety natychmiast po elektroporacji, odpipetować komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 28 °C w poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min przez 120 min.
  4. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej 2,348 x g przez 5 minut, odrzucić większość supernatantu, delikatnie zawiesić ponownie granulowane komórki za pomocą końcówki pipety, rozprowadzić je na płytce LB zawierającej 50 mg/l higromycyny B i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2-3 dni.
  5. Przekształć rośliny Arabidopsis thaliana Col-0 za pomocą Agrobacterium, który zawiera wektor binarny pCAMBIA1300 zintegrowany z wieloma kasetami ekspresji białek, metodą floral dip28, jak opisano wcześniej, w celu wygenerowania stabilnych roślin transgenicznych.
  6. Wysterylizuj powierzchnię transgenicznych nasion Arabidopsis, mieszając je z 70% (v/v) etanolem zawierającym 0,05% Tween 20. Wirować przez 10 minut. Odwiruj nasiona za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez 2 s, usuń supernatant i umyj nasiona 100% etanolem raz przez 30 sekund.
  7. Odpipetuj nasiona na sterylną bibułę filtracyjną w sterylnym kapturze. Następnie wysuszyć je na powietrzu i rozprowadzić na płytkach agarowych o pojemności 1/2 MS zawierających higromycynę B w celu badania przesiewowego dodatniego potomstwa.
  8. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Następnie przenieś je do komory wzrostu roślin i kultury na 7 dni.
  9. Wybierz 7-dniowe młode rośliny, które przeżyły, sprawdzając sygnały fluorescencyjne pod mikroskopem fluorescencyjnym, a następnie przenieś rośliny do gleby w celu dalszego badania przesiewowego roślin homozygotycznych.

6. Zabiegi farmaceutyczne

  1. W przypadku leczenia farmakologicznego każdy lek należy rozcieńczyć w płynnym podłożu MS do odpowiednich stężeń roboczych przed inkubacją z komórkami lub roślinami.
    1. Leczenie Wortmanninem: przygotować 1 mM roztwory podstawowe wortmanniny, rozpuszczając proszek wortmanniny w DMSO i przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C. Przenieść komórki roślinne lub młode rośliny do płynnej pożywki MS zawierającej 16,5 μM wortmamminy i inkubować przez 30 - 45 minut przed obrazowaniem.
    2. Leczenie preparatem Brefeldin A (BFA): przygotować 1 mM roztwory podstawowe BFA, rozpuszczając proszek BFA w DMSO i przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C. Przenieść komórki roślinne lub młode rośliny do płynnej pożywki MS zawierającej 10 μg/ml BFA przez 30 - 45 minut przed obrazowaniem.

7. Obrazowanie mikroskopem konfokalnym i analiza kolokalizacji subkomórkowej białek

  1. Przenieś młode rośliny lub komórki zawiesinowe na konwencjonalne szkiełko podstawowe i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze w celu obrazowania za pomocą standardowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Użyj następujących ustawień: obiektyw wodny 63X (brak 1.4), tło 0, wzmocnienie 700, rozmiar piksela 0.168 mm i detektor fotopowielacza. Wzbudzaj białka znakowane GFP przy 485 nm i wykrywaj fluorescencję przy 525 nm. W przypadku białek oznaczonych RFP wzbudzić przy 514 nm i wykryć przy 575 nm.
  2. Oblicz współczynnik kolokalizacji sygnałów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) z wtyczką kolokalizacyjną korelacji Pearsona-Spearmana (PSC), jak opisano wcześniej8. Współczynniki korelacji Pearsona lub współczynniki korelacji rang Spearmana są pokazane w wynikach (Rysunek 4). Wygenerowane wartości r będą wynosić od -1 do 1. 0 pokazuje brak wykrywalnej korelacji dwóch sygnałów, podczas gdy +1 i -1 pokazują pełną dodatnią i ujemną korelację, odpowiednio, dwóch sygnałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy solidną i wysoce efektywną metodę koekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach. Przełamuje bariery konwencjonalnych podejść wykorzystujących wiele oddzielnych plazmidów do koekspresji białek, jak pokazano w Rysunek 1A, B, poprzez przejściową ekspresję lub stabilną transformację genetyczną. W tej nowej metodzie generujemy pojedynczy wektor ekspresji, który składa się z wielu kaset ekspresji białe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu zademonstrowaliśmy nowatorską metodę silnej koekspresji chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach. Może być stosowany zarówno do przejściowej ekspresji, jak i transformacji genetycznej i jest kompatybilny z obecnymi aplikacjami i technologiami bioobrazowania, molekularnymi i biochemicznymi opartymi na białkach fluorescencyjnych 9,10,13. Ponadto pokonuje trudności związane z konwencjonalnymi metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Wang za pomocne dyskusje i komentarze. Prace te są wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, grant nr 31570001) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong i miasta Guangzhou (grant nr 2016A030313401 i 201707010024) dla H.W.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polimeraza KOD-FXTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
C4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
Epicentrum egzonukleazy T5T5E4111K
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530S
Polimeraza DNA TaqNEBB9022S
Murashige i Skoog Mieszanina soli bazalnej (MS)SigmaM5524
EtanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidynaBBIA614270-0001
Złote cząstki mikronośnikaBio-Rad165-22631,0 i mikro; m
CaCl2BBICD0050-500
MakronośnikiBio-Rad165-2335
Płytka bezpieczeństwaBio-Rad165-2329
Ekran zatrzymującyBio-Rad165-2336
TryptonOXOIDLP0042
Ekstrakt drożdżowyOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlukozaBBIA600219-0001
Hygromycyna BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimetylosulfotlenek (DMSO)BBIA600163-0500
T100 TermocyklerBio-Rad1861096
Komora wzrostowaPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/HeBio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
KuwetaBio-Rad1652083
Wirówka stołowaEppendorf5427000097
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 7 DUO (780& 7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometryThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 ZasilaczTanonEPS 300
Mikroskop fluorescencyjnyMshotMF30
AgrozaBBIA600234
AmpicylinaBBIA100339
Kwas etylenodiaminotetraoctowyBBIB300599
System dostarczania cząstek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
  3. Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
  4. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  5. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
  6. Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
  7. Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
  8. Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
  9. Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
  10. Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
  11. Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246(2017).
  12. Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
  13. Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
  14. Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
  15. Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
  18. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  19. Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218(2014).
  20. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
  21. Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28(2007).
  22. Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
  23. Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
  24. Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
  25. Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
  26. Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
  27. Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
  28. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
  29. Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
  30. Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
  31. Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
  32. Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
  33. Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
  34. Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
  35. Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
  36. Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071(2017).
  37. Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
  38. Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
  39. Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wsp ekspresja bia ekpojedynczy wektor ekspresyjnybombardowanie cz steczkamimikroskopia konfokalnaanaliza FRETtest BiFClokalizacja VSR 2lokalizacja SCAMP4biologia kom rki ro linnej

Powiązane artykuły