Mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy wybór i przygotowanie odpowiednich komórek do mikromanipulacji oraz użycie mikromanipulatora piezoelektrycznego do repozycji chromosomów w tych komórkach.

Streszczenie

Mikromanipulacja chromosomami była podstawową metodą wyjaśnienia mechanizmu kongresacji chromosomów, punktu kontrolnego wrzeciona i ruchów chromosomów anafazowych, a także była kluczem do zrozumienia, co kontroluje ruchy chromosomów podczas podziału komórki. Wykwalifikowany biolog może użyć mikromanipulatora do odłączenia chromosomów od wrzeciona, do przemieszczenia chromosomów w komórce i do przyłożenia sił do chromosomów za pomocą małej szklanej igły z bardzo cienką końcówką. Podczas gdy perturbacje chromosomów można wywołać przy użyciu innych metod, takich jak pułapkowanie optyczne i inne zastosowania lasera, do tej pory żadna inna metoda nie pozwala na repozycjonowanie składników komórkowych w skali od dziesiątek do setek mikronów przy niewielkim lub zerowym uszkodzeniu komórki.

Wybór i przygotowanie odpowiednich komórek do mikromanipulacji chromosomami, szczegółowo opisując przygotowanie pierwotnych kultur spermatocytów konika polnego i świerszcza do użycia w obrazowaniu żywych komórek i mikromanipulacji, są opisane tutaj. Ponadto pokazujemy konstrukcję igły, która ma być używana do przesuwania chromosomów w komórce, oraz zastosowanie sterowanego joystickiem mikromanipulatora piezoelektrycznego z przymocowaną do niego szklaną igłą do repozycji chromosomów w dzielących się komórkach. Przykładowy wynik pokazuje użycie mikromanipulatora do odłączenia chromosomu od wrzeciona w pierwotnym spermatocycie i przemieszczenia tego chromosomu w komórce.

Wprowadzenie

Mikromanipulacja ujawniła część mechanizmu kongresacji chromosomów, punkt kontrolny wrzeciona i ruchy chromosomów anafazy. Najwcześniejsza publikacja opisująca wyniki eksperymentów mikromanipulacyjnych została napisana przez Roberta Chambersa¹. Chambers używał mechanicznego mikromanipulatora z dołączoną szklaną igłą do badania cytoplazmy wielu różnych typów komórek. Niestety, metody kontrastowe, które pozwalały na wizualizację chromosomów i wielu innych składników komórkowych w żywych komórkach, nie były wówczas dostępne, więc eksperymenty Chambersa nie mogły pokazać efektów repozycjonowania takich składników komórkowych. Wczesne mikromanipulac....

Protokół

1. Przygotowanie pierwotnej hodowli komórek spermatocytów owadów do mikromanipulacji

1. Przygotowanie preparatów
   1. Zaopatrz się w szkiełko o wymiarach 75 mm x 25 mm z okrągłym otworem o średnicy 20 mm wyciętym w środku szkiełka.
      UWAGA: Zostały one wycięte z pojedynczej tafli szkła okiennego tak, aby miały rozmiar szklanego szkiełka z otworem pośrodku.
   2. Przepuść szkiełko nakrywkowe 25 mm x 25 mm #1.5 przez płomień palnika Bunsena przez 2 sekundy.
   3. Nałóż smar próżniowy wokół krawędzi otworu w szkiełku
   4. Umieść szkiełko nakrywkowe na otworze, jak w Rysunek 1. Naciśnij go i upewnij się, ż....

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia przykładową mikromanipulację dwiema sąsiadującymi pierwotnymi spermatocytami pasikonika w kilku przykładach możliwych zastosowań mikromanipulacji. Eksperyment ten został przeprowadzony przy użyciu odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego. Obraz z 0:00 (czasy podano w min:s) pokazuje obie komórki przed manipulacją. Jeden chromosom w dolnej komórce jest pokazany pod wpływem naprężenia wywołanego przez igłę do mikromanipulacji (0:05; cza.......

Dyskusja

Wraz z praktyką przesuwanie chromosomów w komórce może stać się drugą naturą. Igły, które są zarówno wystarczająco sztywne, jak i wystarczająco cienkie, są trudne do "opanowania" w wytwarzaniu, ale ta umiejętność przychodzi również z praktyką. Igły, które są tak cienkie, że odkształcają się podczas ruchu w oleju halowęglowym, nie będą przydatne do wpychania chromosomów w komórce. Igły, które są tak, że ich końcówki są widoczne i tak duże, jak 1/3 szerokości chromosomu (lub większej), z dużym prawdopodobieństwem zabiją ko.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikro szkło osłonowe VWR	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, nie 1,5
Dow Corning Smar wysokopróżniowy	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Nożyczki do mikropreparacji, stal nierdzewna	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
Średnica zewnętrzna 0,85 mm, średnica wewnętrzna 0,65 mm rurka ze szkła Pyrex	Drummond Scientific	Zamówienie niestandardowe - zadzwoń w celu złożenia wniosku
Odwrócony, fazowy mikroskop kontrastowy z 10-krotnym lub 16-krotnym obiektywem o małym powiększeniu i 60-krotnym lub 100-krotnym obiektywem o dużym powiększeniu	Dowolna marka
mikrokuźnia	zbudowana na zamówienie lub mikromanipulator Narashige	MF-900
	zbudowany na zamówienie lub Burleigh PCS-6000 z niestandardowym joystickiem sterującym piezo-pieczo	PCS-6300