Mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów

Nicolas K.H. Lin; Ryder Nance; Jane Szybist; Alan Cheville; Leocadia V. Paliulis

doi:10.3791/57359

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikromanipulacja chromosomami w spermatocytach owadów

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57359

⸱

22 października 2018

Nicolas K.H. Lin¹ , Ryder Nance² , Jane Szybist² , Alan Cheville² , Leocadia V. Paliulis³

¹Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University, ²Department of Electrical and Computer Engineering, Bucknell University, ³Biology Department, Bucknell University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy wybór i przygotowanie odpowiednich komórek do mikromanipulacji oraz użycie mikromanipulatora piezoelektrycznego do repozycji chromosomów w tych komórkach.

Streszczenie

Mikromanipulacja chromosomami była podstawową metodą wyjaśnienia mechanizmu kongresacji chromosomów, punktu kontrolnego wrzeciona i ruchów chromosomów anafazowych, a także była kluczem do zrozumienia, co kontroluje ruchy chromosomów podczas podziału komórki. Wykwalifikowany biolog może użyć mikromanipulatora do odłączenia chromosomów od wrzeciona, do przemieszczenia chromosomów w komórce i do przyłożenia sił do chromosomów za pomocą małej szklanej igły z bardzo cienką końcówką. Podczas gdy perturbacje chromosomów można wywołać przy użyciu innych metod, takich jak pułapkowanie optyczne i inne zastosowania lasera, do tej pory żadna inna metoda nie pozwala na repozycjonowanie składników komórkowych w skali od dziesiątek do setek mikronów przy niewielkim lub zerowym uszkodzeniu komórki.

Wybór i przygotowanie odpowiednich komórek do mikromanipulacji chromosomami, szczegółowo opisując przygotowanie pierwotnych kultur spermatocytów konika polnego i świerszcza do użycia w obrazowaniu żywych komórek i mikromanipulacji, są opisane tutaj. Ponadto pokazujemy konstrukcję igły, która ma być używana do przesuwania chromosomów w komórce, oraz zastosowanie sterowanego joystickiem mikromanipulatora piezoelektrycznego z przymocowaną do niego szklaną igłą do repozycji chromosomów w dzielących się komórkach. Przykładowy wynik pokazuje użycie mikromanipulatora do odłączenia chromosomu od wrzeciona w pierwotnym spermatocycie i przemieszczenia tego chromosomu w komórce.

Wprowadzenie

Mikromanipulacja ujawniła część mechanizmu kongresacji chromosomów, punkt kontrolny wrzeciona i ruchy chromosomów anafazy. Najwcześniejsza publikacja opisująca wyniki eksperymentów mikromanipulacyjnych została napisana przez Roberta Chambersa¹. Chambers używał mechanicznego mikromanipulatora z dołączoną szklaną igłą do badania cytoplazmy wielu różnych typów komórek. Niestety, metody kontrastowe, które pozwalały na wizualizację chromosomów i wielu innych składników komórkowych w żywych komórkach, nie były wówczas dostępne, więc eksperymenty Chambersa nie mogły pokazać efektów repozycjonowania takich składników komórkowych. Wczesne mikromanipulacje, które zmieniały pozycję chromosomów, wykorzystywały aparat Chambersa do zamiatania strefy środkowej wrzeciona w komórkach anafazowych, pokazując, że takie manipulacje mogą zmienić pozycję ramion chromosomów w neuroblastach anafazowych koników polnych². Nicklas i jego współpracownicy byli pierwszymi, którzy przeprowadzili precyzyjne mikromanipulacje chromosomami, rozciągając chromosomy³, odłączając je od wrzeciona i wywołując reorientację³^,⁴, stabilizując nieprawidłową orientację poprzez przyłożenie napięcia do chromosomów5^,⁶^,⁷, oraz mierząc siły wytwarzane przez wrzeciona w anaphase⁸^,⁹. Inne prace przeprowadzone przez laboratorium Nicklas wykazały, że ziarnistościami cytoplazmatycznymi można również manipulować¹⁰ i że centrosomy mogą być repozycjonowane za pomocą mikromanipulacji¹¹. Mikromanipulacja jest przydatna nie tylko do przenoszenia chromosomów i innych składników komórkowych. Igła do mikromanipulacji może czysto przeciąć wrzeciono mitotyczne w zdemembranowanych komórkach¹² lub może być użyta do rozpuszczenia otoczki jądrowej¹³. Ponadto sąsiednie komórki mogą być łączone za pomocą mikromanipulacji¹⁴^,¹⁵.

Przy tak szerokiej gamie interesujących eksperymentów, które można przeprowadzić za pomocą mikromanipulacji, na pierwszy rzut oka zaskakujące jest, że eksperymenty mikromanipulacji zostały przeprowadzone przez bardzo niewielu biologów chromosomowych. Jednym z powodów tego niedoboru jest to, że mitotycznie dzielące się hodowane komórki, które pochodzą z tkanek kręgowców i są powszechnie używane do badania ruchów chromosomów, są niezwykle trudne do mikromanipulacji. Te komórki hodowli tkankowej na ogół mają cytoszkielet korowy, który "przeszkadza" igle do mikromanipulacji, a chromosomy albo nie mogą być osiągnięte przez igłę, albo igła przebija się przez komórkę, prowadząc do pęknięcia i śmierci komórki. My i inni eksperymentatorzy, którzy stosują mikromanipulację, odkryliśmy, że komórki stawonogów są podatne na mikromanipulację. Spermatocyty stawonogów łatwo rozprzestrzeniają się pod warstwą oleju halowęglowego i wydają się mieć znacznie mniej wytrzymały cytoszkielet korowy pod błoną komórkową podczas podziału komórki. W ten sposób jądra stawonogów stanowią dobre źródło komórek dzielących się meiotycznie (spermatocyty) i komórek dzielących się mitotycznie (spermatogonia) z łatwo dostępnymi chromosomami do mikromanipulacji. Seryjne cięcie spermatocytu konika polnego utrwalonego podczas manipulacji ujawniło, że igła nigdy nie penetruje błony komórkowej; błona komórkowa deformuje się wokół igły (Nicklas R.B., komunikacja osobista). Spermatocyty wielu taksonów owadów i pająków zostały z powodzeniem poddane mikromanipulacji, w tym konikom polnym, modliszkom, muszkom owocowym, muchom żurawiowym, świerszczom, plucikom,, pająkom czarnej wdowy, pająkom piwnicznym i pająkom tkającym kule³^,⁷^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²². Hodowane, mitotycznie dzielące się komórki owadów mogą być mikromanipulowane. Na przykład chromosomy w neuroblastach koników polnych w kulturze pierwotnej mają chromosomy, którymi można łatwo manipulować za pomocą mikromanipulacji²^,²³. Podejrzewamy, że dostępne linie hodowlane pochodzące od Drosophila i innych owadów będą również mikromanipulowalne, chociaż nie testowaliśmy tej techniki na tych komórkach. Pokażemy, jak można przygotować dzielące się komórki koników polnych i świerszczy do mikromanipulacji. Świerszcze można łatwo dostać w większości sklepów zoologicznych o każdej porze roku. Koniki polne są łatwo dostępne tylko latem, chyba że badacz ma dostęp do kolonii laboratoryjnej, ale używany gatunek (Melanoplus sanguinipes) ma łatwo spłaszczone komórki i długie, łatwe do manipulowania chromosomy.

Innym powodem, dla którego eksperymenty z mikromanipulacją zostały przeprowadzone przez niewielką garstkę biologów, jest to, że mikromanipulatory, które dobrze poruszają chromosomami, są rzadko dostępne na rynku. Odkryliśmy, że mikromanipulator piezoelektryczny sterowany joystickiem kontroluje ruch igły bez wibracji, dryfu lub opóźnienia między ruchem joysticka a ruchem igły, ale inne typy manipulatorów mogą również z powodzeniem przesuwać chromosomy w komórce. Mikromanipulatory zaprojektowane przez Ellisa i Begga²⁵^,²⁶ są idealne do mikromanipulacji chromosomami, chociaż wykorzystują starszą technologię. Mikromanipulatory piezoelektryczne są obecnie dostępne i powszechnie stosowane w elektrofizjologii; Jednak te mikromanipulatory nie są zazwyczaj sterowane joystickiem. Sterowanie joystickiem jest kluczem do płynnych ruchów wymaganych do udanej mikromanipulacji, dlatego należy skonstruować niestandardowy joystick, aby obecnie dostępne mikromanipulatory piezoelektryczne działały w mikromanipulacji chromosomowej. Mikromanipulatory piezoelektryczne sterowane joystickiem, które działają najlepiej, mają bezpośrednią kontrolę położenia, w której ruch joysticka przekłada się bezpośrednio na ruch igły.

Nowo zaprojektowany mikromanipulator piezoelektryczny może być zbudowany z dostępnych na rynku części, które można łatwo wymienić, oraz z małych elementów drukowanych w 3D, i dobrze sprawdza się w mikromanipulacji chromosomami²⁴. Mikromanipulator ma regulowaną czułość, ręczne pozycjonowanie zgrubne i brak wibracji, dryfu lub opóźnień w ruchu igły oraz bezpośrednią kontrolę położenia igły. Naukowcy mogą skonstruować mikromanipulator, korzystając z instrukcji dostępnych online²⁴. Poniżej przedstawiono metody przygotowania pierwotnej hodowli komórek spermatocytów i mikromanipulowania chromosomami w komórkach w tej hodowli.