Method Article

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

DOI:

10.3791/57361

⸱

July 5th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej składa się z wielu mechanicznych bodźców środowiskowych, które są dobrze znane z tego, że wpływają na zachowanie, funkcję i los komórki w ogóle. Chociaż scharakteryzowano reakcje coraz bardziej przylegających typów komórek na sztywność macierzy, w dużej mierze nieznane jest to, w jaki sposób podatność komórek przylegających na infekcje bakteryjne zależy od sztywności macierzy, podobnie jak wpływ infekcji bakteryjnej na biomechanikę komórek gospodarza. Stawiamy hipotezę, że podatność komórek śródbłonka gospodarza na infekcję bakteryjną zależy od sztywności macierzy, na której znajdują się te komórki, oraz że zakażenie komórek gospodarza bakteriami zmieni ich biomechanikę. Aby przetestować te dwie hipotezy, wykorzystano komórki śródbłonka jako modelowych gospodarzy i Listeria monocytogenes jako modelowego patogenu. Opracowując nowatorski test w formacie wielodołkowym, pokazujemy, że wpływ sztywności matrycy na zakażenie komórek śródbłonka przez L. monocytogenes można ocenić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej i barwienia immunologicznego, a następnie mikroskopii. Ponadto, za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych, można badać wpływ zakażenia L. monocytogenes na biomechanikę komórek śródbłonka gospodarza. Proponowana metoda pozwala na analizę wpływu mechaniki tkankowej na infekcję bakteryjną komórek przylegających, co jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi. Metoda ta ma również zastosowanie w wielu innych typach badań nad biomechaniką komórki i reakcją na sztywność substratu, gdzie ważna jest możliwość przeprowadzenia wielu powtórzeń równolegle w każdym eksperymencie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki w większości tkanek zwierzęcych są zazwyczaj przylegające, przyczepiając się zarówno do sąsiednich komórek, jak i do ich macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zakotwiczenie komórek w ich ECM ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów komórkowych, począwszy od ruchliwości komórek, a skończywszy na proliferacji i przetrwaniu komórek1,2. Zakotwiczenie komórkowe do ECM zależy zarówno od składu ECM, jak i sztywności. Komórki reagują na zmiany w tym ostatnim poprzez dynamiczne przegrupowywanie swojego cytoszkieletu, adhezji komórka-ECM i komórka-komórka, co z kolei krytycznie zmienia biomechanikę i funkcje komórki3,4,5,6. Sztywność ECM może się różnić w zależności od przestrzeni (tj. lokalizacji anatomicznej), czasu (tj. starzenia się) oraz procesów patofizjologicznych (np. miażdżyca, rak, infekcje itp.). Na przykład powszechnie przyjmuje się, że komórki śródbłonka znajdujące się na sztywniejszych w porównaniu z bardziej miękkimi matrycami wywierają zwiększone siły na swoje ECM i na siebie nawzajem oraz wykazują zwiększoną ruchliwość i proliferację7,8. Podobnie, fibroblasty znajdujące się na sztywniejszych matrycach nadają swoim ECM duże siły skurczu i wykazują zwiększoną proliferację, ruchliwość i produkcję ECM9,10,11. Chociaż mechanika komórek i odpowiedź na sztywność ECM były szeroko badane dla różnych typów komórek, związek między przylegającymi komórkami gospodarza, sztywność ich ECM i infekcje bakteryjne są nadal w dużej mierze nieznane.

Aby zbadać rolę sztywności ECM w interakcjach bakteria-komórka gospodarza, L. monocytogenes (Lm) został wybrany jako modelowy patogen. Lm jest wszechobecną bakterią przenoszoną przez żywność, która może powodować infekcje ogólnoustrojowe u wielu różnych gospodarzy ssaków. Ten fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy może przemieszczać się z nabłonka jelitowego do odległych narządów, przechodząc przez różne typy śródbłonka naczyniowego. Jeśli naruszy barierę krew-mózg, Lm może spowodować zapalenie opon mózgowych, a gdy przekroczy łożysko, może spowodować samoistne poronienie12,13. Lm może infekować różne typy komórek gospodarza i może to robić przy użyciu różnych strategii patogennych. Zakażenie Lm było badane głównie w kontekście komórek nabłonkowych, podczas gdy znacznie mniej wiadomo o tym, jak Lm może infekować i omijać komórki śródbłonka wyściełające światło naczyń krwionośnych14,15,16. Co więcej, nadal w dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób sztywność ECM, w którym znajdują się komórki śródbłonka, moduluje zdolność Lm do inwazji na te komórki gospodarza, a następnie do rozprzestrzeniania się. Lm i kilka innych gatunków bakterii (np. Rickettsia parkeri) wykorzystują cytoszkielet aktynowy komórek gospodarza, które infekują, aby zarówno zaatakować ich cytoplazmę, jak i ułatwić rozprzestrzenianie się między komórkami17,18,19. Osiągają to poprzez ekspresję białek, które umożliwiają im zakłócanie szlaków polimeryzacji aktyny gospodarza i wytwarzanie ogonów komet aktynowych, które ułatwiają ich napęd do przodu16,20. W wyniku infekcji cytoszkielet aktynowy komórki gospodarza musi dynamicznie przegrupować się w sposób, który wciąż nie jest w pełni scharakteryzowany, potencjalnie wpływając na biomechanikę komórek gospodarza, w tym siły fizyczne, które wywierają na ich ECM i na siebie nawzajem. Aby zbadać te procesy, ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia (HMEC-1) zostały wybrane jako modelowe komórki gospodarza z trzech powodów: 1. komórki śródbłonka są znane z tego, że są wysoce wrażliwe mechanicznie, ponieważ są stale narażone na różne sygnały fizyczne21; 2. Strategie stosowane przez Lm do infekowania komórek śródbłonka są nadal w dużej mierze nieznane22; oraz 3. HMEC-1 są unieśmiertelnioną linią komórkową i dlatego mogą być łatwo hodowane i poddawane manipulacjom genetycznym.

Infekcja bakteryjna komórek gospodarza była głównie badana in vitro poprzez umieszczanie komórek na podłożach szklanych lub polistyrenowych, które są znacznie sztywniejsze niż fizjologiczny ECM większości komórek12,14,23. Aby zbadać infekcję komórek wysianych na matrycy, której sztywność jest fizjologicznie istotna i wyjaśnić rolę sztywności ECM w zakażeniu komórek patogenami bakteryjnymi, zastosowaliśmy innowacyjne podejście oparte na wytwarzaniu cienkich hydrożeli poliakrylamidowych zatopionych w mikrokulkach o regulowanej sztywności na płytkach wielodołkowych. Nowatorstwo proponowanego podejścia polega na tym, że umożliwia ono monitorowanie wielu warunków jednocześnie ze względu na format wielodołkowy oraz na tym, że jest kompatybilne z wieloma technikami ze względu na szczególny sposób budowy substratów. Komórki HMEC-1 wysiano na tych pokrytych białkiem hydrożelach, a następnie zainfekowano różnymi szczepami Lm, które albo stają się fluorescencyjne po internalizacji, albo są konstytutywnie fluorescencyjne. Rolę sztywności ECM w podatności komórek HMEC-1 gospodarza na infekcje oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto wykorzystano barwienie immunologiczne i mikroskopię fluorescencyjną w celu rozróżnienia bakterii przylegających od zinternalizowanych. Wreszcie, z powodzeniem przeprowadzono mikroskopię sił trakcyjnych (TFM) w celu scharakteryzowania wpływu infekcji Lm na stresy trakcyjne, które komórki śródbłonka gospodarza wywierają na swoje matryce podczas infekcji. Prezentowany test może być łatwo modyfikowany, aby umożliwić dalsze badania nad wpływem sztywności ECM na podatność na infekcje komórek adherentnych wykorzystujących różne linie komórkowe lub patogeny.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja cienkich dwuwarstwowych hydrożeli z poliakrylamidu (PA) na płytkach wielodołkowych

  1. Rozpuścić nadsiarczan amonu (APS) w destylowanej ultraczystej wodzie, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 g/ml. Podwielokrotność roztworu należy przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania (3 tygodnie).
    UWAGA: Powyższy roztwór można przygotować przed wytworzeniem hydrożelu.
  2. Aktywacja szkła w naczyniach 24-dołkowych
    1. Inkubować 24-dołkowe szklane płytki denne z dołkami o średnicy 13 mm (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę z 500 μl 2 M NaOH na basenik w temperaturze pokojowej.
    2. Przepłukać studzienki 1x ultraczystą wodą, a następnie dodać 500 μl 2% (3-aminopropylo)trietoksysilanu (patrz Tabela Materiałów) w 95% etanolu do każdej studzienki przez 5 minut.
    3. Przepłukać studzienki 1x ponownie wodą i dodać 500 μl 0,5% aldehydu glutarowego do każdej studzienki przez 30 min. Przepłukać studzienki 1x wodą i wysuszyć je w temperaturze 60 °C bez pokrywy.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Test infekcji bakteryjnej komórek gospodarza znajdujących się na cienkich, dwuwarstwowych hydrożelach poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności. Szkiełka nakrywkowe są modyfikowane chemicznie, aby umożliwić mocowanie hydrożelu. 3,6 μl mieszanin PA osadza się na szklanym dnie. Mieszaninę pokrywa się okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm, aby umożliwić polimeryzację. Szkiełko nakrywkowe usuwa się za pomocą strzykawki z igłą. Na dolną warstwę dodaje się 2,4 μl roztworu PA z mikrogranulkami i przykrywa okrągłym szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Do studzienki dodaje się bufor i usuwa szkiełko nakrywkowe. G. Naświetlanie promieniami UV przez 1 h zapewnia sterylizację. Do żeli dodaje się roztwór zawierający Sulfo-SANPAH, który następnie umieszcza się w promieniowaniu UV na 10 min. Hydrożele przemywa się buforem, a następnie inkubuje przez noc z kolagenem I. J. Hydrożel jest równoważony z pożywką komórkową. K. Komórki gospodarza są wysiewane. Do roztworu dodaje się bakterie L. Lm, a infekcja jest synchronizowana przez wirowanie. M. 1 godzinę po zakażeniu bakterie w roztworze są wypłukiwane i dodaje się pożywkę uzupełnioną antybiotykiem. Po 4 godzinach od zakażenia Lm (JAT985) zaczyna fluoryzować. Komórki HMEC-1 są odłączane od ich matrycy, a roztwory są przenoszone do probówek w celu wykonania pomiarów cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że podane są również dni i przybliżone czasy dla każdego etapu testu. Ten rysunek został zmodyfikowany z Bastounis i Theriot59. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Produkcja hydrożelu poliakrylamidowego
    UWAGA: Zobacz Rysunek 1.
    1. Przygotować roztwory wodne, które zawierają 3 - 10% z 40% podstawowego roztworu akrylamidu (patrz tabela materiałów) i 0,06 - 0,6% 2% podstawowego roztworu bis-akryloamidu (patrz tabela materiałów) do produkcji hydrożeli o regulowanej sztywności w zakresie od 0,6 kPa do 70 kPa. Patrz tabela 1.
      1. W przypadku hydrożeli o natężeniu 0,6 kPa należy zmieszać 3% akrylamidu z 0,045% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 3 kPa zmieszać 5% akrylamidu z 0,074% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 10 kPa należy zmieszać 10% akrylamidu z 0,075% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 20 kPa zmieszać 8% akrylamidu z 0,195% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 70 kPa zmieszać 10% akrylamidu z 0,45% bis-akrylamidem.
        UWAGA: Więcej szczegółów na temat osiągnięcia pożądanej sztywności hydrożelu PA można znaleźć gdzie indziej24,25,26,27.
    2. Przygotuj dwa roztwory wodne dla każdej pożądanej sztywności hydrożelu. Przygotuj roztwór 1 tak, aby był wolny od kulek, a roztwór 2 zawierał 0,03% fluorescencyjnych mikrokulek o średnicy 0,1 μm (patrz tabela materiałów).
    3. Roztwory Degas 1 i 2 przez próżnię przez 15 minut w celu wyeliminowania tlenu, o którym wiadomo, że hamuje polimeryzację roztworów.
    4. Dodać 0,6% podstawowego roztworu APS o stężeniu 10 g/ml i 0,43% tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu 1, aby umożliwić inicjację polimeryzacji. Działaj szybko.
    5. Dodać 3,6 μl roztworu 1 do środka każdego dołka 24-dołkowego naczynia (patrz krok 1.2 w celu jego przygotowania).
    6. Natychmiast przykryj studzienki 12-milimetrowymi, nieobrobionymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi i pozostaw roztwór 1 na 20 minut, aby w pełni się spolimeryzował.
    7. Delikatnie postukać igłą strzykawki w powierzchnię, aby utworzyć mały haczyk na jej końcu, ułatwiający usunięcie szkiełek nakrywkowych. Podnieść szkiełka nakrywkowe za pomocą igły strzykawkowej.
    8. Dodać 0,6% podstawowego roztworu APS o stężeniu 10 g/ml i 0,43% TEMED do roztworu 2. Umieść 2,4 μl mieszaniny na wierzchu pierwszej warstwy w każdym dołku 24-dołkowego naczynia.
    9. Przykryj roztwór 2 okrągłymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm, delikatnie dociskając w dół za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że grubość drugiej warstwy jest minimalna. Pozwól roztworowi 2 polimeryzować przez 20 minut.
    10. Dodać 500 μl 50 mM HEPES pH 7,5 do każdej z studzienek, a następnie usunąć szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą igły strzykawkowej i kleszczyków.
  2. Sterylizacja, powlekanie kolagenem i równoważenie hydrożeli poliakrylamidowych
    1. Hydrożele należy wystawić na działanie promieni UV przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowych, aby umożliwić sterylizację.
    2. Przygotować mieszaninę 0,5% wagowo-objętościowej 6-(4′-azydo-2′-nitrofenyloamino)heksanianu sulfosukcynimidylu (Sulfo-SANPAH, patrz tabela materiałów) w 1% DMSO i 50 mM HEPES pH = 7,5.
    3. Dodać 200 μl tego roztworu na górną powierzchnię hydrożeli. Działając szybko, wystaw je na działanie promieniowania UV (302 nm) przez 10 minut, aby je aktywować.
    4. Umyj hydrożele dwukrotnie 1 ml 50 mM HEPES pH = 7,5. W razie potrzeby powtórz czynność, aby upewnić się, że nadmiar środka sieciującego został usunięty.
    5. Hydrożele pokryć białkowymi 200 μl kolagenu I z ogona szczura 0,25 mg / ml (patrz tabela materiałów) w 50 mM HEPES. Inkubować hydrożele z roztworem kolagenu na wierzchu przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Aby zapobiec odwodnieniu/odparowaniu, umieść płytki wielodołkowe w wtórnym zbiorniku i dodaj laboratoryjne chusteczki czyszczące nasączone wodą na wewnętrznym obrzeżu obudowy.
    6. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego z obiektywem 40X, aby zmierzyć grubość hydrożeli. W tym celu należy zlokalizować pozycje z dolnej (gdzie znajduje się powierzchnia szkła) i górne płaszczyzny hydrożelu (gdzie intensywność kulek fluorescencyjnych jest maksymalna). Następnie odejmij pozycje z, aby określić wysokość.
      UWAGA: Do pomiaru grubości hydrożeli użyliśmy odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego i obiektywu 40X z aperturą numeryczną 0,65. W tym momencie można również wykonać pomiary mikroskopii sił atomowych (AFM), aby potwierdzić dokładną sztywność hydrożeli (patrz Rysunek 2).
    7. Przed wysiewem komórek będących przedmiotem zainteresowania na hydrożelach, dodać 1 ml pożywki do hydrożeli i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut do 1 godziny, aby zapewnić równowagę.
      UWAGA: Dodaliśmy pełną pożywkę MCDB-131, ponieważ jest to pożywka, w której hodowano modelowe komórki gospodarza (HMEC-1) (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 2.1).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Pomiary AFM sztywności hydrożelu PA i rozkładu kulek. A. Dane pokazują oczekiwany moduł Younga (miarę sztywności) hydrożeli PA, biorąc pod uwagę ilość użytego akrylamidu i bis-akrylamidu w porównaniu z modułem Younga mierzonym za pomocą AFM (N = 5 - 6). Poziome paski przedstawiają średnią. Nie można było zmierzyć sztywności hydrożeli o natężeniu 0,6 kPa, ponieważ były one bardzo miękkie i przylegały do końcówki AFM. B. Jest to obraz fazowy zlewających się komórek HMEC-1 i odpowiadający mu obraz kulek osadzonych na najwyższej powierzchni miękkiego hydrożelu o natężeniu 3 kPa-PA. HMEC-1 wysiewano przez 24 godziny w stężeniu 4 x 105 komórek na studzienkę. C. Ten obraz jest taki sam jak Rysunek 2B, ale dla komórek znajdujących się na sztywnym hydrożelu PA o napięciu 70 kPa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Hodowla i wysiewanie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego na hydrożelach

  1. Hodowla komórek HMEC-1 (ludzkiego, mikronaczyniowego śródbłonka) w pełnych pożywkach MCDB-131 zawierających pożywkę MCDB-131 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 1 μg/ml hydrokortyzonu i 2 mM L-glutaminy (patrz tabela materiałów).
  2. Dzieląc zlewające się kultury 1:6 co 3 - 4 dni i utrzymuj komórki do pasażu 40.
  3. Dzień przed eksperymentem odłącz komórki od naczynia hodowlanego, używając 0,25% trypsyny/EDTA. Najpierw umyć komórki i ich naczynie hodowlane 1x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), a następnie dodać odpowiednią ilość 0,25% trypsyny/EDTA (2 ml na 100-milimetrowe naczynie lub 75-milimetrową kolbę, 1 ml na 60-milimetrową szalkę lub 25-centymetrową kolbę), inkubując kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 - 10 minut, aby umożliwić oderwanie komórek od substratu.
  4. Zneutralizuj trypsynę, dodając żądaną objętość pełnej pożywki MCDB-131, delikatnie pipetować, aby rozbić grudki komórek, a następnie umieść roztwór w stożkowej probówce wirówkowej.
  5. Delikatnie zamieszaj roztwór komórek, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone, a następnie wyjmij 20 μl roztworu i bardzo delikatnie wypełnij dwie komory pod szkiełkiem nakrywkowym szklanego hemocytometru.
  6. Roztwór komórek zawartych w stożkowej probówce wirówkowej osadzać za pomocą wirowania przez 10 minut przy 500 x g.
  7. Podczas 10-minutowego okresu oczekiwania policz komórki za pomocą hemocytometru. Użyj mikroskopu, skup się na liniach siatki hemocytometru za pomocą obiektywu 10X, a następnie użyj ręcznego licznika wyników, aby policzyć liczbę komórek w jednym kwadracie o wymiarach 1 mm x 1 mm.
  8. Przenieś hemocytometr na inny kwadrat o wymiarach 1 mm x 1 mm, policz tam komórki, a następnie powtórz proces jeszcze dwa razy. Oblicz średnią z czterech pomiarów, a następnie pomnóż średnią przez 104. Wartość końcowa to liczba żywotnych komórek/ml w odwirowywanej zawiesinie komórek.
  9. Usuń ciecz ze stożkowej probówki wirówkowej, upewniając się, że osad komórkowy nie jest uszkodzony. Ponownie zawiesić komórki w pełnym pożywce MCDB-131 w stężeniu 4 x 105 komórek/ml.
  10. Wysiewać komórki w zawiesinie na hydrożelach, najpierw usuwając pożywkę, z którą inkubowano hydrożele, a następnie dodając 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego hydrożelu.

3. Zakażenie ludzkich komórek śródbłonka mikrokrążenia L. monocytogenes

  1. Przygotowanie zaliczkowe
    Uwaga: Wcześniej przygotuj następujące rozwiązania.
    1. Zapasy streptomycyny, chloramfenikolu i gentamycyny
      1. Przygotować 50 mg/ml roztworów podstawowych streptomycyny, ważąc 0,5 g siarczanu streptomycyny i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml ultraczystej wody.
      2. Przygotować 7,5 mg/ml roztworów podstawowych chloramfenikolu, ważąc 75 mg chloramfenikolu i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml 100% etanolu.
      3. Przygotować 20 mg/ml roztworów podstawowych gentamycyny, ważąc 0,2 g siarczanu gentamycyny i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml ultraczystej wody.
      4. Przefiltruj i wysterylizuj wszystkie roztwory podstawowe za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i przechowuj je w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania (1 - 2 miesiące).
    2. Pożywki do infuzji mózgu i serca (BHI) i płytki agarowe
      1. Zlokalizuj dwie kolby o pojemności 1 litra i dodaj mieszadło magnetyczne do każdej kolby.
      2. W przypadku pożywki BHI dodać 37 g proszku BHI do jednej kolby i dodać ultraczystą wodę do 1 l. Energicznie wymieszać roztwór, umieszczając kolbę na magnetycznej płytce mieszającej, aż proszek się rozpuści.
      3. W przypadku płytek agarowych BHI dodać 37 g proszku BHI i 15 g granulowanego agaru (patrz Tabela Materiałów) do drugiej kolby i dodać ultraczystą wodę do objętości 1 l. Energicznie wymieszać roztwór, umieszczając kolbę na magnetycznej płytce mieszającej, aż proszek się rozpuści.
      4. Niezbyt mocno zakręcić pokrywki kolb i autoklawować roztwory przy użyciu ustawienia płynu lub zgodnie ze specyfikacją autoklawu.
      5. Usunąć roztwór z autoklawu, a następnie schłodzić roztwór agaru-BHI do temperatury 55 °C. Jeśli pożywka BHI w kolbie o pojemności 1 l jest utrzymywana w sterylnej formie, może być używana przez okres do miesiąca.
      6. Aby przygotować płytki z agarem i agarem bakterii, należy najpierw dodać antybiotyki, jeśli to właściwe, do kolby zawierającej BHI i agar (w zależności od szczepów bakterii, które mają być hodowane). Na krótko umieścić kolbę na magnetycznej płytce mieszającej, aby umożliwić szybkie mieszanie.
        UWAGA: Stosowane tutaj antybiotyki są specyficzne dla zastosowanych szczepów LM, ale wszelkie niezbędne antybiotyki mogą być stosowane na płytkach BHI-agar. Dodaliśmy streptomycynę do stężenia 200 μg/ml i chloramfenikol do stężenia 7,5 μg/ml, ponieważ szczepy 10403S Lm są odporne na streptomycynę. Szczepy te zostały sprzężone z plazmidem, który zawiera otwartą ramkę odczytu acetylotransferazy chloramfenikolu, stąd odporność na chloramfenikol.
      7. Wlej mieszaninę do 10-centymetrowych płytek do hodowli bakterii polistyrenowych (około 20 ml na płytkę). Aby pozbyć się pęcherzyków, krótko podpal górną powierzchnię płytek. Schłodzić talerze przez noc w temperaturze pokojowej.
      8. Następnego dnia zamknąć suche płytki i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
  2. Zakażenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego L. monocytogenes
    1. Trzy dni przed zakażeniem należy wytrzepać szczep Lm do użycia z glicerolu (przechowywanego w temperaturze -80 °C) na płytkę z agarem BHI, która zawiera 7,5 μg/ml chloramfenikolu i 200 μg/ml streptomycyny, jeśli to konieczne.
      UWAGA: Szczep, który ma zostać wycięty, może być typu dzikiego lub zmutowanego, konstytutywnie wyrażającego fluorescencję (do barwienia immunologicznego, JAT1045 użyto) lub wyrażającego fluorescencję pod promotorem ActA (do cytometrii przepływowej lub mikroskopii sił trakcyjnych zastosowano JAT983 lub JAT985)22.
    2. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C aż do powstania oddzielnych kolonii (1-2 dni).
    3. Dzień przed infekcją wyhoduj pożądaną odmianę przez noc, potrząsając nią z prędkością 150 obr./min w temperaturze 30 °C w pożywce BHI z 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to konieczne).
      1. Umieścić 5 ml pożywki BHI w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, dodać 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to konieczne), a następnie zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki agarowej za pomocą sterylnej końcówki o pojemności 10 μl.
    4. Następnego dnia, tuż przed zakażeniem, zmierzyć gęstość optyczną roztworu bakterii przy długości fali 600 nm (OD600), rozcieńczając próbkę w stosunku 1:5; użyć kuwety zawierającej sam BHI, która posłuży jako ślepa próba.
    5. Rozcieńczyć kulturę przez noc do OD600 0,1 i inkubować ją, wstrząsając przez 2 godziny w temperaturze 30 °C, w pożywce BHI z 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to właściwe), aby umożliwić bakteriom osiągnięcie wzrostu w fazie logarytmicznej.
    6. Zmierz OD600 w roztworze bakteryjnym, który powinien wynosić około 0,2 - 0,3. Jeśli OD600 jest wyższy, rozcieńczyć go do 0,2 - 0,3 samym BHI.
    7. Weź 1 ml roztworu bakteryjnego do probówki mikrowirówkowej. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 2 000 x g, wirując w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml PBS klasy tkankowej do hodowli tkankowej, w kapturze do hodowli tkankowych. Umyj bakterie jeszcze dwukrotnie, wirując je przez 4 minuty w temperaturze 2,000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 1 ml PBS.
    8. Przygotować mieszaninę infekcyjną, mieszając 10 lub 50 μl bakterii zawieszonych w PBS z 1 ml pełnej pożywki MCDB-131 dla wielu infekcji (MOI; tj. liczba bakterii na komórkę gospodarza) około 50 bakterii na komórkę gospodarza lub 10 bakterii na komórkę gospodarza.
    9. Usuń pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek, uważając, aby nie naruszyć hydrożeli lub komórek. Umyj komórki 1x 1 ml pełnego podłoża MCDB-131, a następnie dodaj 1 ml bakterii do każdej studzienki.
    10. Zachowaj trochę mieszanki infekcyjnej (co najmniej 100 μl) do oznaczenia MOI (patrz krok 3.3).
    11. Przykryj talerz pokrywką i owiń talerze folią spożywczą z polietylenu, aby uniknąć wycieku. Umieścić płytki w wirówce i wirować próbki przez 10 minut przy 200 x g, aby zsynchronizować inwazję. Przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować je przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    12. Umyj próbki 4x pełną pożywką MCDB-131 i przenieś je do inkubatora do kultur tkankowych. Po upływie dodatkowych 30 minut należy zastąpić pożywkę pożywką uzupełnioną o 20 μg/ml gentamycyny.
  3. Oznaczanie wielości infekcji (MOI)
    1. Podczas początkowej 30-minutowej inkubacji komórek gospodarza z bakteriami należy przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia mieszanki infekcji w celu określenia MOI. Wykonać 10-krotne rozcieńczenia, mieszając 100 μl mieszanki infekcyjnej z 900 μl 1x PBS (rozcieńczenie 10-1). Następnie zmieszać 100 μl rozcieńczenia 10-1 z 900 μl PBS (rozcieńczenie 10-2).
    2. Kontynuować aż do uzyskania rozcieńczenia 10-5.
      UWAGA: Wszystkie roztwory należy dobrze wymieszać przed ich rozcieńczeniem, a na każdym etapie należy używać świeżych, czystych końcówek do pipet.
    3. Po rozcieńczeniu umieścić 100 μl rozcieńczeń 10-2 - 10-5 na środku płytki BHI/agar/chloramfenikol/streptomycyna (jeśli to właściwe).
    4. Zrób rozsiewacz ze szklanej pipety, używając ognia do zgięcia pipety, aby utworzyć haczyk. Zanurz pipetę w 100% etanolu w celu sterylizacji, a następnie spal etanol płomieniem.
    5. Po ostygnięciu rozsiewacza rozprowadzić jednorodnie rozcieńczenia bakteryjne na płytkach, zaczynając od rozcieńczenia 10-5 i przechodząc do bardziej skoncentrowanych mieszanek. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
    6. W zależności od gęstości kolonii określić liczbę kolonii na płytkach rozcieńczających 10-3 i 10-4 lub 10-4 i 10-5. Oblicz MOI w następujący sposób:
      liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia ÷ objętość początkowo dodana = liczba jtk na μl
      liczba jtk na μl × objętość mieszaniny bakterii na studzienkę = liczba jtk na studzienkę
      liczba CFU na studzienkę × objętość komórek w studzience = liczba bakterii na komórkę
      UWAGA: CFU oznacza jednostki tworzące kolonie.
    7. Uśrednij MOI z dwóch płytek, aby uzyskać końcowe MOI.

4. Cytometria przepływowa do ilościowego określania sztywności matrycy zewnątrzkomórkowej zależnej od podatności komórek gospodarza na infekcje

  1. Odważyć 5 mg kolagenazy i umieścić ją w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj 10 ml 0,25% trypsyny-EDTA i dobrze je wymieszaj.
  2. 8 godzin po zakażeniu usunąć pożywkę z dołków płytki 24-dołkowej i umyć studzienki 1x kulturą tkankową PBS. Wyjmij PBS z dołków i dodaj 200 μl mieszanki trypsyny-EDTA/kolagenazy do każdej studzienki. Umieść go w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut, aby umożliwić całkowite odłączenie komórek.
  3. Użyj świeżej pipety do każdego dołka i odpipetuj mieszaninę w górę iw dół 8 razy. Bądź delikatny, aby nie uszkodzić komórek. Dodaj 200 μl pełnej pożywki do każdego dołka, aby zneutralizować trypsynę.
  4. Przenieś 400-μl roztworu komórkowego z każdej studzienki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml z nasadką sitową o wielkości 35 μm (patrz tabela materiałów).
  5. Analizuj 10 000 - 20 000 komórek na próbkę za pomocą cytometrii przepływowej. Wykonaj akwizycję danych za pomocą cytometrii przepływowej i określ procent zainfekowanych komórek w studzience za pomocą odpowiedniego dostępnego na rynku oprogramowania. Użyj wykresów punktowych do przodu i bocznych wykresów punktowych, aby zabramować większość rozkładu liczby komórek.
    UWAGA: Zapewni to analizę pojedynczych komórek i wyeliminuje zanieczyszczenia lub dublety lub tryplety komórek.
    1. Zmierz sygnał fluorescencji z komórek kontrolnych niezakażonych i przeprowadź bramkę populacji zakażonych komórek z wyłączeniem autofluorescencji.

5. Barwienie immunologiczne bakterii zewnątrzkomórkowych, mikroskopia i przetwarzanie obrazów

Uwaga: To podejście jest stosowane w celu rozróżnienia między zależnym od sztywności ECM adhezją bakteryjną na powierzchni komórki gospodarza a internalizacją (inwazją) bakteryjną w obrębie gospodarzy.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Barwienie immunologiczne zakażonych Lm komórek HMEC-1 znajdujących się na hydrożelach o różnej sztywności w celu odróżnienia adhezji bakteryjnej od inwazji. Obrazy te pokazują reprezentatywny przykład różnicowego barwienia immunologicznego pokazującego A. jądra komórkowe (DAPI), B. wszystkie bakterie (GFP) i C. bakterie zewnętrzne (Alexa-546). Ogniwa HMEC-1 znajdowały się na miękkim hydrożelu o natężeniu 3 kPa. Strzałki wskazują bakterie, które zostały zinternalizowane, więc są wyświetlane tylko na zielonym kanale. Dane w D-F odnoszą się do N = 20 obrazów wykonanych dla zakażonych komórek HMEC-1 znajdujących się na miękkich hydrożelach 3 kPa i sztywnych 70 kPa ipokazują D. całkowita liczba bakterii w jądrze; E. zinternalizowane bakterie na jądra; oraz F. Skuteczność inwazji (stosunek bakterii zinternalizowanych do wszystkich bakterii). Poziome paski przedstawiają średnią danych. Wartość P obliczono za pomocą nieparametrycznego testu sumy rang Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. 30 min po zakażeniu przemyć zakażone komórki HMEC-1 JAT1045 (Lm, który konstytutywnie wyraża białko zielonej fluorescencji (GFP)) 4x z pożywką.
  2. Po czwartym płukaniu wymieszaj 1 μl 1 mg/ml barwnika Hoechst z 1 ml pełnej pożywki MCDB-131 i dodaj ją do każdego dołka, aby zabarwić jądra komórek. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut.
  3. Umyj komórki 1x PBS. Utrwal je za pomocą nieprzepuszczalnego utrwalacza do różnicowego barwienia immunologicznego przez 20 minut w temperaturze pokojowej28.
    UWAGA: Utrwalacz zawiera 0,32 M sacharozy, 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA i 4% formaldehydu (klasa mikroskopii elektronowej).
  4. Umyj komórki 1x PBS. Blokować próbki na 30 minut 5% albuminą surowicy bydlęcej (patrz tabela materiałów) w PBS.
  5. Próbki inkubować przez 1 godzinę zpierwszorzędowym przeciwciałem anty-Lm (patrz tabela materiałów) rozcieńczonym w stosunku 1:100 w PBS zawierającym 2% powierzchni ciała.
  6. Przemyć próbki w PBS 3x, a następnie inkubować je przez 1 godzinę z kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikom AlexaFluor-546 (patrz tabela materiałów) rozcieńczonym w stosunku 1:250 w PBS zawierającym 2% BSA. Umyć próbki 3x w PBS. Próbki należy przechowywać w 1 ml PBS do obrazowania.
  7. Zobrazuj i przeanalizuj ponad 1 000 komórek w każdym stanie.
    1. Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z kamerą CCD (patrz tabela materiałów) i obiektywu powietrznego z fluorytu 40X z aperturą numeryczną 0,6 (NA).
      UWAGA: Moc jest ustawiona na 25%, a czas ekspozycji na 100 ms. Filtry mikroskopowe stosowane dla mCherry to 470/525 nm, dla GFP 530/645 nm, a dla DAPI 395/460 nm, odpowiednio dla wzbudzenia i emisji. Mikroskop, którego używaliśmy, był kontrolowany przez pakiet oprogramowania do mikroskopii o otwartym kodzie źródłowym29.
    2. W celu różnicowego barwienia immunologicznego należy policzyć wszystkie "zielone" bakterie związane z poszczególnymi komórkami jako przylegające. Policz bakterie, które są zarówno "zielone", jak i "czerwone" (z powodu wiązania przeciwciał) jako niezinternalizowane.
      UWAGA: Zidentyfikowaliśmy liczbę jąder, uruchamiając specjalnie przygotowany skrypt i oprogramowanie CellC (patrz Tabela materiałów) do liczenia bakterii30.

6. Wielodołkowa mikroskopia sił trakcyjnych i jednowarstwowa mikroskopia naprężeń

figure-protocol-4
Rysunek 5: Komórki HMEC-1 zakażone Lm zmniejszają wielkość sił trakcyjnych, które wywierają na ECM podczas infekcji. Panel A pokazuje obraz fazowy, B pokazuje pole deformacji, C pokazuje pole naprężeń trakcyjnych, a D pokazuje wewnątrzkomórkowe pole napięcia niezakażonych komórek HMEC-1 znajdujących się na hydrożelu o natężeniu 20 kPa. Kolorowe paski map odkształceń (μm), map naprężeń trakcyjnych (Pa) i map napięć wewnątrzkomórkowych (nNμm-1) są pokazane w górnej części map cieplnych. Kolumny pokazują trzy reprezentatywne punkty czasowe: 3, 8 i 18 godzin po zakażeniu. E-H. Taki sam jak panele A-D, ale dla komórek zakażonych Lm przy MOI 300. Obrazy bakterii (kanał czerwony) są nakładane na obrazy fazowe komórek. Zapisy TFM przeprowadzono poprzez obrazowanie wielu dołków jednocześnie. Rozmiar okna dla PIV wynosił 32 piksele z nakładaniem się 16. Podziałka wynosi 32 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Bastounis i Theriot59. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotuj hydrożele PA na 24-dołkowej płytce (patrz krok 1). Wysiewaj komórki HMEC-1 (patrz krok 2) i zainfekuj je JAT983, jak opisano powyżej (patrz krok 3).
  2. Przygotuj żywą pożywkę mikroskopową, uzupełniając L-15 Leibovitz 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu i 1 μg/ml hydrokortyzonu.
    UWAGA: L-15 zawiera już 2 mM L-glutaminy, więc nie jest konieczne dodawanie dodatkowego, jak w przypadku pożywki MCDB-131.
  3. 4 godziny po zakażeniu (gdy zinternalizowany JAT983 zaczyna fluoryzować), wymieszaj 1 μl 1 mg / ml barwnika Hoechst z 1 ml pełnej pożywki L-15 i dodaj ją do każdej studzienki, aby zabarwić jądra komórek. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut, a następnie zastąpić w każdym dołku pełne podłoże L-15 1 ml pełnego podłoża L-15 uzupełnionego 20 μg/ml gentamycyny.
  4. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w komorze środowiskowej mikroskopu (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z kamerą CCD (patrz tabela materiałów) i obiektywu powietrznego z fluorytu 40X o natężeniu 0.6 NA.
  5. Uzyskuj wielokanałowe obrazy poklatkowe kulek fluorescencyjnych i bakterii fluorescencyjnych oraz obrazy kontrastu fazowego komórek gospodarza co 10 minut przez 4 do 12 godzin
    UWAGA: W przypadku obrazowania moc została ustawiona na 25%, a czas ekspozycji na 100 ms. Filtry mikroskopowe (wzbudzenie/emisja) stosowane dla mCherry i GFP to odpowiednio 470/525 nm i 530/645 nm.
  6. Na końcu nagrania dodaj 500 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) do wody w każdej ze studzienek.
    UWAGA: Komórki zostaną odłączone od hydrożelu, a hydrożel powróci do swojego początkowego stanu niezdeformowanego, ponieważ jest elastyczny.
  7. Zrób zdjęcie hydrożelu i użyj go jako referencyjnego obrazu niezdeformowanego.
  8. Określ dwuwymiarowe odkształcenie hydrożelu w każdej chwili czasu za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV)31, porównując każdy obraz serii poklatkowej z obrazem referencyjnym niezdeformowanego hydrożelu. Użyj odpowiednich rozmiarów okien i nakładania się w zależności od eksperymentu.
    UWAGA: Użyliśmy okien o rozmiarze 32 pikseli z nakładaniem się 16 pikseli.
  9. Oblicz naprężenia trakcyjne 2D, które komórki wywierają na hydrożel, jak opisano w innym miejscu32,33.
  10. Oblicz naprężenie monowarstwy na podstawie naprężeń trakcyjnych, jak opisano wcześniej34, rozwiązując równania równowagi mechanicznej dla cienkiej elastycznej płytki poddanej siłom reakcji wytwarzanym przez hydrożel PA na monowarstwie, które mają znak przeciwny do zmierzonych naprężeń trakcyjnych.
    UWAGA: Patrz Materiał uzupełniający 1.

7. Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od L. monocytogenes rozprzestrzenianie się przez komórki śródbłonka

figure-protocol-5
Rysunek 6: Dane z poklatkowej mikroskopii ilościowej dotyczące rozprzestrzeniania się Lm za pomocą monowarstw HMEC-1 wysiewanych na podłożach o sztywności 3 kPa i 70 kPa. Ten panel pokazuje nieruchome obrazy z dwóch reprezentatywnych ognisk infekcji po 0, 200, 400 i 600 minutach. Kanał fazowy przedstawia monowarstwy komórek HMEC-1, a kanał czerwony przedstawia wewnątrzkomórkowy Lm (patrz krok 7 protokołu). B. Ten panel pokazuje obszar wypukłej powłoki obejmujący ognisko infekcji wykreślone w funkcji czasu. Obszar skupienia w warunku 3 kPa (czerwony) rośnie szybciej niż w przypadku 70 kPa (zielony). C. Panel ten przedstawia odległość promieniową od środka do krawędzi ogniska infekcji wykreśloną w funkcji czasu dla reprezentatywnych ognisk infekcji rosnących w monowarstwach HMEC-1 wysiewanych na podłożach PA o sztywności 3 kPa (czerwony) i 70 kPa (zielony). Prędkość promieniowa (dr/dt) jest stała dla stanu 3 kPa, ale dwufazowa dla warunku 70 kPa. D. Dane te pokazują prędkość radialną przez pierwsze 200 minut z dziesięciu niezależnych ognisk infekcji. Czerwone (3 kPa) i zielone (70 kPa) punkty danych przedstawiają nachylenia dwóch ognisk opisanych w poprzednich panelach. Poziome paski przedstawiają średnią danych. Wartość P obliczono za pomocą nieparametrycznego testu sumy rang Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotuj hydrożele PA na 24-dołkowej płytce (patrz krok 1), wysiew komórki HMEC-1 (patrz krok 2) i hoduj przez noc kultury JAT983, jak opisano powyżej (patrz krok 3).
  2. W dniu zakażenia należy przygotować mieszankę infekcyjną, mieszając 10 μl osadu bakteryjnego na ml pełnej pożywki MCDB-131. Ostrożnie wyjmij pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek i dodaj 1,9 ml pełnej pożywki MCDB-131 i 0,1 ml mieszanki bakteryjnej do każdej studzienki.
    UWAGA: Dolny MOI używany w tym teście jest niezbędny do analizy zdarzeń rozprzestrzeniania się, które rozpoczynają się od pojedynczej bakterii atakującej komórkę gospodarza.
  3. Przykryj płytkę pokrywką i zamknij ją folią, aby uniknąć wycieku. Umieścić płytki w wirówce i wirować próbki przez 10 minut przy 200 x g, aby zsynchronizować inwazję.
  4. Przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować je przez 5 minut.
  5. Umyj próbki 4x pożywką i przenieś je do inkubatora do hodowli tkankowych. Po dodatkowych 5 - 7 minutach zastąp pożywkę pożywką uzupełnioną 20 μg/ml gentamycyny.
  6. Inkubuj płytkę w inkubatorze przez dodatkowe 5 godzin, aby umożliwić promotorowi actA włączenie i sterowanie wyrażeniem mTagRFP open reading frame35.
  7. Przygotuj żywą pożywkę mikroskopową, uzupełniając L-15 Leibovitz 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu i 1 μg/ml hydrokortyzonu.
    UWAGA: L-15 zawiera już 2 mM L-glutaminy, więc nie jest konieczne dodawanie dodatkowego, jak w przypadku pożywki MCDB-131.
  8. Zmieszaj 1 μl 1 mg/ml barwnika Hoechst z 1 ml pełnej pożywki L-15 i dodaj do każdego dołka, aby zabarwić jądra komórek. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut, a następnie zastąpić w każdym dołku pełne podłoże L-15 1 ml pełnego podłoża L-15 uzupełnionego 20 μg/ml gentamycyny. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w komorze środowiskowej mikroskopu (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Do obrazowania użyto odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z kamerą CCD (patrz tabela materiałów) i obiektywu fluorytowego 20X z 0,75 NA. Moc została ustawiona na 50%, a czas naświetlania na 50 ms. Filtry mikroskopowe stosowane w mCherry to 470/525 nm odpowiednio dla wzbudzenia i emisji.
  9. Obraz w wielu pozycjach co 5 minut za pomocą funkcji autofokusa do monitorowania, jak Lm rozprzestrzenia się przez monowarstwy HMEC-1 osadzone na hydrożelach o różnej sztywności.
    UWAGA: L-15 jest buforowany HEPES, więc nie jest konieczne stosowanie CO2 podczas obrazowania.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podatność komórek HMEC-1 na zakażenie Lm zależna od sztywności ECM:
Hydrożele PA o różnej sztywności, wszystkie pokryte powierzchniowo kolagenem I, zostały zbudowane na wielodołkowych szklanych płytkach dennych, jak opisano w kroku 1 protokołu (patrz Rysunek 1). Pomiary AFM zostały przeprowadzone w celu potwierdzenia dokładnej sztywności hydrożeli, jak opisano wcześniej26,27 (patrz Rysunek 2). Wcześniejsze badania wykazały, że miejscowa zgodność błony podstawnej komórek śródbłonka może wynosić od 1 kPa (np. tkanka mózgowa) do 70 kPa (np. aorta)36,37,38,39,40. Dlatego zdecydowaliśmy się przetestować infekcję komórek HMEC-1 znajdujących się na matrycach o następującej sztywności: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa i 70 kPa. Dla każdej sztywności hydrożelu wyprodukowano sześć hydrożeli, aby ocenić odtwarzalność wyników.

Cytometria przepływowa została użyta do oceny podatności komórek HMEC-1 na zakażenie Lm zależnej od sztywności ECM (zobacz Rysunek 3). Komórki HMEC-1 zostały zakażone szczepem Lm (JAT985), który po internalizacji wykazuje ekspresję markera fluorescencyjnego (actAp::mTagRFP), co pozwala na wykrycie tylko bakterii wewnątrzkomórkowych (patrz ryc. 1L - 1N). JAT985 nie ma również ActA, co uniemożliwia bakteriom rozprzestrzenianie się z komórki do komórki, ponieważ ActA jest niezbędny do tworzenia warkoczy komety aktynowej i późniejszego rozprzestrzeniania się bakterii. 7 - 8 godzin po zakażeniu zakażenie komórkami HMEC-1 oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zapewnić analizę pojedynczych komórek, większość rozkładu liczby komórek została bramkowana przy użyciu wykresu rozproszenia do przodu i z boku, a następnie przeprowadzono drugi etap bramkowania, aby wykluczyć komórki wykazujące autofluorescencję (patrz rysunki 3A - 3C). Wstępne wyniki przedstawione w Rysunek 3 pokazuje, że zakażenie HMEC-1 Lm jest około dwukrotnie większe w przypadku komórek HMEC-1 znajdujących się na sztywnych hydrożelach o napięciu 70 kPa w porównaniu do komórek znajdujących się na miękkich hydrożelach o masie 0,6 kPa (patrz rysunki 3B - 3D). Zwiększona podatność na zakażenie Lm komórek HMEC-1 znajdujących się na sztywnych w porównaniu z miękkimi matrycami może być spowodowana: 1. zwiększoną adhezją Lm do HMEC-1; 2. zwiększona inwazja Lm na HMEC-1; lub 3. oba powyższe występują współwystępującie. Aby sprawdzić, która hipoteza jest prawdziwa, komórki HMEC-1 wysiewano na miękkich (3 kPa) i sztywnych (70 kPa) hydrożelach i zakażono konstytutywnie GFP eksprymującym Lm (patrz ryc. 4A - 4C). Próbki utrwalono wkrótce po zakażeniu, a zewnętrzne (przylegające) bakterie wybarwiono przeciwciałami. Korzystając z mikroskopii ilościowej, stwierdziliśmy, że istnieje znacznie więcej bakterii przylegających do HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na sztywno w porównaniu z miękkimi żelami (patrz Rysunek 4D). Zgodnie z danymi cytometrii przepływowej, istnieje znacznie więcej bakterii internalizowanych przez HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na sztywno w porównaniu z miękkimi żelami (patrz Rysunek 4E). Jednak skuteczność inwazji (zinternalizowane bakterie/całkowita liczba bakterii) Lm do komórek HMEC-1 jest podobna, niezależnie od sztywności podłoża (patrz Rysunek 4F).

Mikroskopia siły trakcyjnej komórek HMEC-1 zakażonych Lm:
Zakażenie Lm komórek HMEC-1 może zmienić biomechanikę zakażonych komórek gospodarza, w tym siłę przyczepienia do ich ECM lub do siebie nawzajem, wpływając na ich integralność bariery. Staraliśmy się ocenić, czy tak może być, używając Mikroskopii Sił Trakcyjnych32 do obliczenia sił trakcyjnych komórka-ECM i Monolayer Stress Microscopy41 do obliczenia wewnątrzkomórkowych sił naprężających. Rysunek 5 przedstawia mapy pola deformacji, pola naprężeń trakcyjnych i pola napięcia wewnątrzkomórkowego komórek HMEC-1 znajdujących się na hydrożelach o natężeniu 20 kPa w różnych punktach czasowych po infekcji. Rysunki 5A - 5D odnoszą się do niezakażonych kontrolnych komórek HMEC-1, podczas gdy rysunki 5E - 5H odnoszą się do komórek HMEC-1 zakażonych Lm przy wielokrotności infekcji równej 300 bakteriom / komórkę. Ta wstępna praca sugeruje, że zakażone komórki HMEC-1 zmniejszają wielkość swoich stresów komórkowych-ECM i wewnątrzkomórkowych w trakcie infekcji Lm, podczas gdy nie obserwuje się tego w przypadku niezakażonych komórek kontrolnych.

Zależne od sztywności ECM rozmieszczenie Lm na monowarstwach HMEC-1:
Mikroskopia poklatkowa została wykorzystana do zbadania wpływu sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się Lm przez monowarstwy HMEC-1. Gdy Lm rozprzestrzenia się przez monowarstwę, bakterie tworzą ognisko infekcji, które rośnie w funkcji czasu (patrz Rysunek 6A i Rysunek wideo 1 i 2). Obszar ogniska infekcji został zmierzony poprzez narysowanie wypukłej powłoki, najmniejszego wypukłego wielokąta, który obejmuje zestaw punktów, wokół bacteria42. W tej dziedzinie nie ma standardowej metryki do pomiaru skuteczności rozprzestrzeniania się L. monocytogenes z komórki do komórki przez monowarstwę komórek gospodarza. Aby ocenić skuteczność rozprzestrzeniania się, niektóre z nich policzyły liczbę komórek gospodarza w infekcji focus41, a inne ręcznie wyznaczyły granice wokół grupy komórek gospodarza infekcji43. Zdecydowaliśmy się narysować wypukły wielokąt wokół bakterii, ponieważ jest to zautomatyzowany, spójny i niedrogi obliczeniowo proces pomiaru skuteczności rozprzestrzeniania się L. monocytogenes. W ten sposób stwierdziliśmy niewielki spadek obszaru ogniska infekcji w komórkach HMEC-1 wysianych na hydrożelach o natężeniu 70 kPa w porównaniu z tymi wysiewanymi na matrycach 3 kPa (patrz Rysunek 6B i Rysunki wideo 1 i 2). Aby określić tempo wzrostu ogniska infekcji, odległość promieniową wykreślono w funkcji czasu, biorąc pierwiastek kwadratowy z obszaru ogniska infekcji i dzieląc go przez liczbę pi. Ta matematyczna transformacja zakłada, że kształt ogniska infekcji jest mniej więcej okrągły44. Aby zmierzyć szybkość wzrostu ogniska, zmierzono szybkość zmian (tj. nachylenie) odległości radialnej zarówno dla matryc 3, jak i 70 kPa. Podejście to wyjaśniło, że ognisko infekcji rosło szybciej i monotonicznie w komórkach HMEC-1 wysiewanych na matrycach 3-kPa. Jednak ognisko rosło znacznie wolniej (pierwsze 200 min) i nieco wolniej (200 do 600 min) w komórkach wysiewanych na matrycach 70 kPa (patrz Rysunek 6C). Rzeczywiście, analiza dalszych danych potwierdziła, że ognisko infekcji rosło średnio dwukrotnie wolniej w matrycach 70 kPa, zwłaszcza w ciągu pierwszych 200 minut (patrz Rysunek 6D).

figure-results-1
Rysunek 3: Podatność komórek HMEC-1 na inwazję Lm w zależności od sztywności ECM mierzona za pomocą cytometrii przepływowej.Komórki HMEC-1 zostały zakażone Lm (JAT985), a infekcję analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. A. Ten panel przedstawia wykres punktowy boczny w stosunku do przodu dla reprezentatywnych komórek HMEC-1 pochodzących z pojedynczego dołka. Rozmieszczenie komórek zostało wybrane za pomocą bramkowania, aby wykluczyć szczątki (po lewej) i dublety lub trojaczki komórek (po prawej). B. Ten wykres przedstawia histogram logarytmu intensywności fluorescencji Lm na komórkę dla HMEC-1 posianego na miękkim 0,6 kPa. C. Ten wykres przedstawia histogram logarytmu intensywności fluorescencji Lm na komórkę dla HMEC-1 posianego na sztywnych hydrożelach o natężeniu 70 kPa. Histogramy dla N = 4 - 6 powtórzeń są pokazane w różnych kolorach. Histogram niezainfekowanych komórek kontrolnych jest fioletowy. Bramka używana do definiowania, co jest zainfekowane, jest pokazana na czerwono. MOI wynosi 100, a infekcję oceniono 8 godzin po zakażeniu. D. Dane pokazują odsetek zakażonych komórek HMEC-1 w porównaniu ze sztywnością hydrożelu (N = 5). Poziome paski przedstawiają średnią danych. Wartość P obliczono za pomocą nieparametrycznego testu sumy rang Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Wideo Rysunek 1: Rozprzestrzenianie się wewnątrzkomórkowego Lm (kanał czerwony) przez monowarstwę (fazę) komórki HMEC-1 wysianą na podłożu 3 kPa. Komórki zobrazowano w pożywce L-15 Leibovitz (10% FBS, 20 μg/ml gentamycyny) w komorze środowiskowej o temperaturze 37 °C. Zdjęcia były zbierane co 5 minut. Prędkość filmu wynosi 15 klatek/s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-3
Wideo Rysunek 2: Rozprzestrzenianie się wewnątrzkomórkowego Lm (kanał czerwony) przez monowarstwę (fazę) komórki HMEC-1 wysianą na podłożu o natężeniu 70 kPa. Komórki zobrazowano w pożywce L-15 Leibovitz (10% FBS, 20 μg/ml gentamycyny) w komorze środowiskowej o temperaturze 37 °C. Zdjęcia były zbierane co 5 minut. Prędkość filmu wynosi 15 klatek/s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Moduł Younga (E, kPa) Akrylamid % (z 40% magazynu) Bisakryloamid % (z 2% zapasu) 0,6 3 0,045 pkt. 3 5 0,075 pkt. 10 10 0,075 pkt. 20 8 0,195 70 Rozdział 10 0,45 pkt.

Tabela 1. Skład hydrożeli poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności. W tej tabeli w różnych kolumnach wskazano procentową zawartość podstawowego 40% roztworu akryloamidu i zawartość procentową 2% roztworu bis-akrylamidu w celu uzyskania danej sztywności (moduł Younga, E).

figure-results-4
Materiał uzupełniający 1. Obliczanie napięcia wewnątrzkomórkowego na podstawie obliczonych naprężeń trakcyjnych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki mogą wyczuwać różne fizyczne sygnały środowiskowe, które mogą wpływać nie tylko na morfologię komórek, ale także na ich ekspresję genów i aktywność białek, wpływając w ten sposób na krytyczne funkcje i zachowania komórek45,46. Sztywność ECM komórek jest coraz bardziej doceniana jako ważny modulator ruchliwości komórek, różnicowania, proliferacji i ostatecznie losu komórki 47,48,49. Chociaż w ostatnim czasie poczyniono wiele postępów w zrozumieniu złożonej interakcji biomechanicznej między komórkami a ich ECM, niewiele wiadomo na temat tego, jak sztywność środowiska wpływa na podatność komórek na infekcje bakteryjne. Aby ułatwić takie badania, opracowaliśmy ten nowatorski test wielodołkowy oparty na dobrze znanym wytwarzaniu hydrożeli poliakrylamidowych o regulowanej sztywności, która jest zgodna z testami infekcji50. Tradycyjnie, infekcja bakteryjna komórek w hodowli tkankowej była badana na powierzchniach szklanych lub polistyrenowych, które są o około 1 - 3 rzędy wielkości sztywniejsze niż naturalny ECM większości przylegających komórek 8,51. Opisany tutaj test otwiera nowe autostrady, umożliwiając badanie interakcji bakteria-gospodarz w fizjologicznie istotnym reżimie sztywności środowiskowej.

W celu potwierdzenia słuszności koncepcji przedstawionego testu, wybrano komórki HMEC-1 jako modelowe przylegające komórki gospodarza oraz Lm jako modelowy patogen bakteryjny. Test może jednak zostać rozszerzony o dalsze badania, jeśli zostanie odpowiednio zmodyfikowany. Takie badania mogą obejmować zakażenie różnych typów przylegających komórek gospodarza ssaków przez dodatkowe patogeny, w tym bakterie i wirusy. W tym konkretnym teście żele były pokryte białkiem kolagenu I, ale w zależności od typu komórki gospodarza możliwe jest zastosowanie innej powłoki białkowej ECM, takiej jak laminina lub fibronektyna, aby ułatwić przyczepienie komórek gospodarza będących przedmiotem zainteresowania do hydrożelu52. Dodatkową kwestią, która zależy od typu komórki gospodarza, jest badany zakres sztywności hydrożelu. Zakres sztywności powinien zależeć od tego, co jest fizjologicznie istotne dla konkretnego typu komórki gospodarza i jak dobrze ten gospodarz przyczepia się, tworząc monowarstwę przy danej sztywności hydrożelu. Podobnie, w zależności od modelowego patogenu, który ma być badany, może być konieczne wprowadzenie niewielkich modyfikacji w opisanym w niniejszym dokumencie teście infekcji.

Innowacyjność testu w porównaniu z poprzednimi metodami wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych 24,50,53 polega na pewnych unikalnych cechach zintegrowanych z proponowanym testem infekcji. Po pierwsze, hydrożele są budowane na wielodołkowych szklanych płytkach dennych, co umożliwia jednoczesne badanie przesiewowe wielu warunków, a także automatyzację niektórych procedur. Monitorowanie wielu warunków w tym samym czasie lub badanie wielu kontrprób ma kluczowe znaczenie, ponieważ na wynik takiego podejścia mogą mieć wpływ takie czynniki, jak pasaż komórek gospodarza i dokładna liczba bakterii dodanych w celu zakażenia gospodarzy, które często zmieniają się między niezależnymi eksperymentami. Dodatkową unikalną cechą tego testu jest to, że hydrożele mają wysokość około 40 μm, która jest wystarczająco cienka, aby można było ją obrazować za pomocą konwencjonalnej mikroskopii. Wykazaliśmy, że możemy z powodzeniem przeprowadzić zarówno mikroskopię żywych komórek i ich utrwalanie, jak i barwienie immunologiczne, a następnie obrazowanie, bez wprowadzania wysokiej fluorescencji tła. Wreszcie, hydrożele są wykonane z dwóch warstw, z których górna ma osadzone mikrokulki fluorescencyjne, zamknięte w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Ten atrybut gwarantuje, że podczas obrazowania nie będzie zakłócania ostrego światła. Obecność kulek umożliwia zarówno badanie topografii powierzchni żeli w celu upewnienia się, że są one jednolite, jak i poprawia wydajność TFM i MSM 24,32,41. Za pomocą TFM i MSM możliwe jest obliczenie odpowiednio sił komórka-ECM i komórka-komórka komórek znajdujących się na matrycach o różnej sztywności. Korzystając z tego nowatorskiego testu, możliwe jest wykonanie takich pomiarów sił fizycznych, porównując jednocześnie zarówno wpływ sztywności środowiskowej, jak i infekcji. Stosując takie podejście, można określić wpływ infekcji na mechanikę komórek gospodarza w całym jej przebiegu. Ponadto ewolucję naprężeń wewnątrzkomórkowych komórek można obliczyć za pomocą MSM i można ją wykorzystać jako miarę integralności bariery monowarstwy. Wreszcie, biorąc pod uwagę wielodołkowy charakter testu, możliwe jest jednoczesne wprowadzenie zaburzeń farmakologicznych i genetycznych związanych z infekcją bakteryjną, aby bardziej dogłębnie zbadać złożone zależności między mechaniką komórek gospodarza a infekcją.

Jednym z nieodłącznych ograniczeń tej techniki jest wpływ, jaki sztywność substratu może mieć na szybkość proliferacji komórek. Zazwyczaj w testach infekcji musimy upewnić się, że gęstość komórek gospodarza w różnych warunkach jest taka sama. Dzieje się tak, ponieważ gęstość komórek sama w sobie może mieć wpływ na podatność gospodarzy na infekcje. Komórki HMEC-1, które zostały użyte jako komórki gospodarza, nie wykazują znaczącej różnicy w swojej liczbie po wysiewie przez 24 godziny na hydrożelach. Jednak różne typy komórek mogą wykazywać zróżnicowaną proliferację, w zależności od sztywności hydrożelu, co może zniekształcać badania nad infekcjami. Podobnie, błąd infekcji może powstać, gdy komórki nie tworzą monowarstw lub nie przyczepiają się dobrze do hydrożeli, jak ma to miejsce, gdy niektóre typy komórek są wysiewane na bardzo miękkich matrycach (np. Ludzkie komórki śródbłonka pępowiny lub komórki nabłonka nerki psów Madin-Darby wysiane na hydrożelach 0,6-kPa54,55). Jeśli chodzi o patogeny, niektóre bakterie (np. Borrelia burdgorferi) mogą przyczepiać się do komórek gospodarza i atakować je, ale mogą również migrowaćprzez nie. Nie sprawdziliśmy jeszcze, czy ten test zadziała w badaniach nad transmigracją patogenów, ale wydaje się to możliwe, ponieważ poprzednie badania na neutrofilach transmigrujących komórkach śródbłonka wysianych na hydrożelach PA zostały udokumentowane, że działają z powodzeniem57. Przeprowadzono wiele badań pokazujących, jak wytwarzać hydrożele poliakrylamidowe o danym module Younga poprzez mieszanie odpowiednich stężeń akrylamidu i bis-akrylamidu 24,25,26,27. Jednakże, zwłaszcza gdy chce się przeprowadzić eksperymenty TFM na komórkach znajdujących się na hydrożelach o różnej sztywności, ważne jest, aby potwierdzić oczekiwaną sztywność hydrożeli za pomocą AFM lub innych technik wgłębiania58. Niewielkie odchylenia od wartości oczekiwanej mogą wynikać z użycia innego rozpuszczalnika lub starzonego roztworu podstawowego akryloamidu lub ze sposobu, w jaki wykonywane są pomiary AFM (np. kształt końcówki AFM). Wreszcie, przedstawione tutaj podejście opiera się na wysiewaniu komórek gospodarza na matrycach 2D, które mogą różnić się od bardziej realistycznego i fizjologicznie istotnego scenariusza 3D. Jednak wytwarzanie żeli 3D o regulowanej sztywności, zasiewanie ich komórkami gospodarza, a następnie infekowanie ich patogenami, nadal wiąże się z pewnymi trudnościami technicznymi. Niemniej jednak przewidujemy, że w niedalekiej przyszłości będziemy w stanie rozszerzyć obecny test do badania infekcji w warunkach 3D.

Podsumowując, opisany protokół wraz ze wstępnymi wynikami dostarczają dowodów na to, że ten nowatorski test może stać się niezwykle użytecznym narzędziem do badania infekcji przylegających komórek gospodarza bakteriami chorobotwórczymi w sposób ilościowy i w znacznie bardziej fizjologicznie istotnym środowisku niż dotychczas badane. Moc wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych w proponowanej konfiguracji polega na tym, że test jest kompatybilny z wydajnością wielu technik, takich jak cytometria przepływowa, barwienie immunologiczne, a następnie mikroskopia świetlna i mikroskopia sił trakcyjnych. Test może być wykorzystany do badań obejmujących zakażenie różnymi przylegającymi typami komórek gospodarza przez patogeny, co, jak przewidujemy, będzie miało znaczący wpływ zarówno na rozwikłanie strategii, za pomocą których patogeny infekują gospodarzy, jak i na ułatwienie opracowania interwencji terapeutycznych przeciwko infekcjom.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze podziękowania dla M. Footera, R. Lamasona, M. Rengaranjana i członków Theriot Lab za ich dyskusje i eksperymentalne wsparcie. Praca ta była wspierana przez NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam Fellowship for Advanced Study (F.E.O.), Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.), American Heart Association (E.E.B.), NIH 1R01HL128630 (RS) i NIH 1R01HL130840 (RS). Cytometrię przepływową wykonano w Stanford Shared FACS Facility.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Odczynniki
Granulki wodorotlenku soduFisherS318-500
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigmaA3648
25% aldehyd gluterowySigmaG6257-100ML
40% akryloamidSigmaA4058-100ML
Roztwór bis-akrylamidu (2% w/v)Fisher ScientificBP1404-250
Fluorosfery mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,1 μ m, żółto-zielony fluorescencyjny (505/515)InvitrogenF8803
Nadsiarczan amonuFisherBP17925
TEMEDSigmaT9281-25ML
Sulfo-SANPAHProteochemc1111-100mg
Kolagen, Typ I Roztwór ze szczuraSigmaC3867-1VL
Dimetylosulfotlenek (DMSO)J.T. Baker9224-01
HEPES, Wolny kwasJ.T. Baker4018-04
Pożywka L-15 Leibovitza, bez czerwieni fenolowejThermofischer21083027
MCDB 131 Podłoże, bez glutaminyTechnologie życia10372019
Fundacja Płodowa surowica bydlęca, Partia: A37C48AGemini Bio-Prod900108 500ml
Naskórkowy czynnik wzrostu, EGFSigmaE9644
HydrokortyzonSigmaH0888
L-Glutamina 200mMFisherSH3003401
DPBS 1XFisherSH30028FS
Siarczan gentamycynyMP biomedicals194530
CloramphenicolSigmaC0378-5G
DifcoTM Agar, granulowanyBD214530
BBL TM Napar mózgowo-sercowyBD211059
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg/ul roztwór w wodzieInvitrogenH3570
Formaldehyd 16% klasy EMMikroskopia elektronowa15710-S Przeciwciało
anty-Listeria monocytogenesAbcamab35132
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędowe, Alexa Fluor® 546 koniugatThermofischerA-11035
0,25% trypsyna-EDTA, czerwień fenolowaThermofischer25200056
KOLAGENAZA Z CLOSTRIDIUM HISTOLITICSigmaC8051
Siarczan streptomycynyFisher Scientific3810-74-0
SacharozaCalbiochem8510
DodecylosiarczansoduThermofischer28364
MES proszekSigmaM3885
KClJ.T. Baker3040-05
MgCl2J.T. Baker2444-1
EGTAAcros40991
Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
12 mm szkło okrągłe Szkiełka nakrywkoweFisherbrand12-545-81Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 10 mm | Niepowlekane
szklane płytki 24-dołkoweMattekP24G-1.5-13-F
5 ml probówki polistyrenowe z 35 μ Nasadka z filtrem siatkowym M Kolby Falcon352235
T-25Falcon353118
50 ml probówki stożkoweFalcon352070
Probówki stożkowe 15 mlJednorazowe
(1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)Pipety357551
PasteurVWR14672-380
Końcówki do pipet (1-200 μ l, 101-1000 μ l)DenvilleP1122, P1126
Bezpudrowe rękawice diagnostyczneMicroflexXC-310
Kuwety bakterieSarstedt67.746
Maszynki do goleniaVWR55411-050
Igła strzykawkowaBD305167
Butelki sterylizujące 0,2umThermo Scientific566-0020
20 ml strzykawkiBD302830
Filtry 0,2umThermo Scientific723-2520
drewniane patyczkiGrainger42181501
Saran wrapSanta Cruz Biotechnologiessc-3687
Płytki bakterieFalcon351029
Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Kaptur do hodowli tkankowychBakerSG504
HemacytometrSigmaZ359629
Inkubator bakteriiThermo ScientificIGS180
Inkubator do kultur tkankowychNuAireNU-8700
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny Nikon Diaphot 200NikonNIKON-DIAPHOT-200
Inkubator klatkowyHaisonNiestandardowy
analizator Scanford FACScan Stanford i Cytek zmodernizowali niestandardowy
przyrząd do pipetPipetory Drummond4-000-110
(10 μ l, 200 μ l, 1000ul)pH-metr GilsonF144802, F123601, F123602
Kleszczedo 30019028Mettler Toledo
FST11000-12
Kolba 1 LFisherbrandFB5011000 
AutoklawAmsco3021
Płyta magnetyczna z mieszadłemBellco7760-06000
Mieszadła magnetyczneBellco1975-00100
SpektrofotometrBeckmanDU 640
Analizator Scanford FACScanCytek BiosciencesCustom Stanford i Cytek zmodernizowany FACScan
< strong>Software
Microscope Software (μ Menedżer)Open Imaging
Matlab Matlab Inc
FlowjoFlowJo, LLC
Oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu, CellChttps://sites.google.com/site/cellcsoftware/Oprogramowanie jest dostępne bezpłatnie. Pliki wykonywalne i kody źródłowe MATLAB można uzyskać pod adresem https://sites.google.com/site/cellcsoftware/
pipety serologiczne Falcon 352196 szklane Falcon FACScan

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001(2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603(2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005(2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112(2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889(2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978(2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717(2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632(2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Matrix StiffnessBacterial InfectionPolyacrylamide HydrogelsAdherent CellsFlow CytometryTraction Force MicroscopyHost Pathogen BiomechanicsEndothelial CellsImmunostaining MicroscopyListeria Monocytogenes

Related Articles