Artykuł metodologiczny

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57361

⸱

5 lipca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Streszczenie

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej składa się z wielu mechanicznych bodźców środowiskowych, które są dobrze znane z tego, że wpływają na zachowanie, funkcję i los komórki w ogóle. Chociaż scharakteryzowano reakcje coraz bardziej przylegających typów komórek na sztywność macierzy, w dużej mierze nieznane jest to, w jaki sposób podatność komórek przylegających na infekcje bakteryjne zależy od sztywności macierzy, podobnie jak wpływ infekcji bakteryjnej na biomechanikę komórek gospodarza. Stawiamy hipotezę, że podatność komórek śródbłonka gospodarza na infekcję bakteryjną zależy od sztywności macierzy, na której znajdują się te komórki, oraz że zakażenie komórek gospodarza bakteriami zmieni ich biomechanikę. Aby przetestować te dwie hipotezy, wykorzystano komórki śródbłonka jako modelowych gospodarzy i Listeria monocytogenes jako modelowego patogenu. Opracowując nowatorski test w formacie wielodołkowym, pokazujemy, że wpływ sztywności matrycy na zakażenie komórek śródbłonka przez L. monocytogenes można ocenić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej i barwienia immunologicznego, a następnie mikroskopii. Ponadto, za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych, można badać wpływ zakażenia L. monocytogenes na biomechanikę komórek śródbłonka gospodarza. Proponowana metoda pozwala na analizę wpływu mechaniki tkankowej na infekcję bakteryjną komórek przylegających, co jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi. Metoda ta ma również zastosowanie w wielu innych typach badań nad biomechaniką komórki i reakcją na sztywność substratu, gdzie ważna jest możliwość przeprowadzenia wielu powtórzeń równolegle w każdym eksperymencie.

Wprowadzenie

Komórki w większości tkanek zwierzęcych są zazwyczaj przylegające, przyczepiając się zarówno do sąsiednich komórek, jak i do ich macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zakotwiczenie komórek w ich ECM ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów komórkowych, począwszy od ruchliwości komórek, a skończywszy na proliferacji i przetrwaniu komórek1,2. Zakotwiczenie komórkowe do ECM zależy zarówno od składu ECM, jak i sztywności. Komórki reagują na zmiany w tym ostatnim poprzez dynamiczne przegrupowywanie swojego cytoszkieletu, adhezji komórka-ECM i komórka-komórka, co z kolei krytycznie zmienia biomechanikę i funkcje komórki3,4,5,6. Sztywność ECM może się różnić w zależności od przestrzeni (tj. lokalizacji anatomicznej), czasu (tj. starzenia się) oraz procesów patofizjologicznych (np. miażdżyca, rak, infekcje itp.). Na przykład powszechnie przyjmuje się, że komórki śródbłonka znajdujące się na sztywniejszych w porównaniu z bardziej miękkimi matrycami wywierają zwiększone siły na swoje ECM i na siebie nawzajem oraz wykazują zwiększoną ruchliwość i proliferację7,8. Podobnie, fibroblasty znajdujące się na sztywniejszych matrycach nadają swoim ECM duże siły skurczu i wykazują zwiększoną proliferację, ruchliwość i produkcję ECM9,10,11. Chociaż mechanika komórek i odpowiedź na sztywność ECM były szeroko badane dla różnych typów komórek, związek między przylegającymi komórkami gospodarza, sztywność ich ECM i infekcje bakteryjne są nadal w dużej mierze nieznane.

Aby zbadać rolę sztywności ECM w interakcjach bakteria-komórka gospodarza, L. monocytogenes (Lm) został wybrany jako modelowy patogen. Lm jest wszechobecną bakterią przenoszoną przez żywność, która może powodować infekcje ogólnoustrojowe u wielu różnych gospodarzy ssaków. Ten fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy może przemieszczać się z nabłonka jelitowego do odległych narządów, przechodząc przez różne typy śródbłonka naczyniowego. Jeśli naruszy barierę krew-mózg, Lm może spowodować zapalenie opon mózgowych, a gdy przekroczy łożysko, może spowodować samoistne poronienie12,13. Lm może infekować różne typy komórek gospodarza i może to robić przy użyciu różnych strategii patogennych. Zakażenie Lm było badane głównie w kontekście komórek nabłonkowych, podczas gdy znacznie mniej wiadomo o tym, jak Lm może infekować i omijać komórki śródbłonka wyściełające światło naczyń krwionośnych14,15,16. Co więcej, nadal w dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób sztywność ECM, w którym znajdują się komórki śródbłonka, moduluje zdolność Lm do inwazji na te komórki gospodarza, a następnie do rozprzestrzeniania się. Lm i kilka innych gatunków bakterii (np. Rickettsia parkeri) wykorzystują cytoszkielet aktynowy komórek gospodarza, które infekują, aby zarówno zaatakować ich cytoplazmę, jak i ułatwić rozprzestrzenianie się między komórkami17,18,19. Osiągają to poprzez ekspresję białek, które umożliwiają im zakłócanie szlaków polimeryzacji aktyny gospodarza i wytwarzanie ogonów komet aktynowych, które ułatwiają ich napęd do przodu16,20. W wyniku infekcji cytoszkielet aktynowy komórki gospodarza musi dynamicznie przegrupować się w sposób, który wciąż nie jest w pełni scharakteryzowany, potencjalnie wpływając na biomechanikę komórek gospodarza, w tym siły fizyczne, które wywierają na ich ECM i na siebie nawzajem. Aby zbadać te procesy, ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia (HMEC-1) zostały wybrane jako modelowe komórki gospodarza z trzech powodów: 1. komórki śródbłonka są znane z tego, że są wysoce wrażliwe mechanicznie, ponieważ są stale narażone na różne sygnały fizyczne21; 2. Strategie stosowane przez Lm do infekowania komórek śródbłonka są nadal w dużej mierze nieznane22; oraz 3. HMEC-1 są unieśmiertelnioną linią komórkową i dlatego mogą być łatwo hodowane i poddawane manipulacjom genetycznym.

Infekcja bakteryjna komórek gospodarza była głównie badana in vitro poprzez umieszczanie komórek na podłożach szklanych lub polistyrenowych, które są znacznie sztywniejsze niż fizjologiczny ECM większości komórek12,14,23. Aby zbadać infekcję komórek wysianych na matrycy, której sztywność jest fizjologicznie istotna i wyjaśnić rolę sztywności ECM w zakażeniu komórek patogenami bakteryjnymi, zastosowaliśmy innowacyjne podejście oparte na wytwarzaniu cienkich hydrożeli poliakrylamidowych zatopionych w mikrokulkach o regulowanej sztywności na płytkach wielodołkowych. Nowatorstwo proponowanego podejścia polega na tym, że umożliwia ono monitorowanie wielu warunków jednocześnie ze względu na format wielodołkowy oraz na tym, że jest kompatybilne z wieloma technikami ze względu na szczególny sposób budowy substratów. Komórki HMEC-1 wysiano na tych pokrytych białkiem hydrożelach, a następnie zainfekowano różnymi szczepami Lm, które albo stają się fluorescencyjne po internalizacji, albo są konstytutywnie fluorescencyjne. Rolę sztywności ECM w podatności komórek HMEC-1 gospodarza na infekcje oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto wykorzystano barwienie immunologiczne i mikroskopię fluorescencyjną w celu rozróżnienia bakterii przylegających od zinternalizowanych. Wreszcie, z powodzeniem przeprowadzono mikroskopię sił trakcyjnych (TFM) w celu scharakteryzowania wpływu infekcji Lm na stresy trakcyjne, które komórki śródbłonka gospodarza wywierają na swoje matryce podczas infekcji. Prezentowany test może być łatwo modyfikowany, aby umożliwić dalsze badania nad wpływem sztywności ECM na podatność na infekcje komórek adherentnych wykorzystujących różne linie komórkowe lub patogeny.

Protokół

1. Wytwarzanie cienkich dwuwarstwowych hydrożeli poliakrylamidowych (PA) na płytkach wielodołkowych

  1. Rozpuścić persiarczan amonu (APS) w destylowanej wodzie ultrapure, aby uzyskać stężenie końcowe 10 g/mL. Rozdzielić roztwór na aliquoty i przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użytku (3 tygodnie).
    UWAGA: Powyższy roztwór można przygotować przed rozpoczęciem wytwarzania hydrożelu.
  2. Aktywacja szkła w płytkach 24-dołkowych
    1. Inkubować płytki 24-dołkowe z dnem szklanym i dołkami o średnicy 13 mm (patrz Tabela materiałów) przez 1 h z 500 µL 2 M NaOH na dołek w temperaturze pokojowej.
    2. Przepłukać dołki 1x wodą ultrapure, a następnie dodać do każdego dołka 500 µL 2% (3-aminopropyl)trietoksysilanu (patrz Tabela materiałów) w 95% etanolu na 5 min.
    3. Ponownie przepłukać dołki 1x wodą i dodać do każdego dołka 500 µL 0,5% glutaraldehydu na 30 min. Przepłukać dołki 1x wodą i wysuszyć je w temperaturze 60 ˚C przy zdjętej pokrywie.

Schemat procesu powlekania polimerem z etapami roztworu PA, aktywacji UV, kolagenu i wysiewania komórek.
Rycina 1: Test infekcji bakteryjnej komórek gospodarza osadzonych na cienkich, dwuwarstwowych hydrożelach poliakryloamidowych (PA) z zatopionymi fluorescencyjnymi koralikami o różnej sztywności. A. Szklane szkiełka podstawowe są modyfikowane chemicznie, aby umożliwić przytwierdzenie hydrożelu. B. 3,6 µL mieszanin PA jest nanoszonych na szklane dno. C. Mieszaninę przykrywa się okrągłym szkiełkiem podstawowym o średnicy 12 mm, aby umożliwić polimeryzację. D. Szkiełko jest usuwane za pomocą strzykawki z igłą. E. 2,4 µL roztworu PA z mikrokoralikami jest dodawanych na wierzch warstwy dolnej i przykrywanych okrągłym szkiełkiem podstawowym. F. Do dołka dodaje się bufor, a następnie usuwa szkiełko. G. Naświetlanie UV przez 1 h zapewnia sterylizację. H. Na żele nanosi się roztwór zawierający Sulfo-SANPAH, które następnie naświetla się promieniami UV przez 10 min. I. Hydrożele są przemywane buforem, a następnie inkubowane przez noc z kolagenem I. J. Hydrożel jest równoważony w pożywce komórkowej. K. Wysiewa się komórki gospodarza. L. Do roztworu dodaje się bakterie Lm, a infekcję synchronizuje się poprzez wirowanie. M. 1 h po infekcji bakterie w roztworze są wypłukiwane, a następnie dodaje się pożywkę uzupełnioną o antybiotyk. N. W 4 h po infekcji Lm (JAT985) zaczynają fluorescować. O. Komórki HMEC-1 są odrywane od macierzy, a roztwory przenoszone do probówek w celu wykonania pomiarów cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że wskazano również dni i przybliżone czasy dla każdego etapu testu. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Bastounis i Theriot59. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Wytwarzanie hydrożeli poliakrylamidowych
    UWAGA: Patrz Rycina 1.
    1. Przygotuj roztwory wodne zawierające od 3% do 10% 40%nego roztworu stokowego akryloamidu (patrz Tabela materiałów) oraz od 0,06% do 0,6% 2-procentowego roztworu zapasowego bis-akryloamidu (patrz Tabela materiałów) do wytwarzania hydrożeli o regulowanej sztywności w zakresie od 0,6 kPa do 70 kPa. Patrz Tabela 1.
      1. W celu otrzymania hydrożeli o sztywności 0,6 kPa należy zmieszać 3% akryloamidu z 0,045% bis-akryloamidu. Dla hydrożeli 3 kPa należy zmieszać 5% akryloamidu z 0,074% bis-akryloamidu. Dla hydrożeli 10 kPa należy zmieszać 10% akryloamidu z 0,075% bis-akryloamidu. Dla hydrożeli 20 kPa należy zmieszać 8% akryloamidu z 0,195% bis-akryloamidu. Dla hydrożeli 70 kPa należy zmieszać 10% akryloamidu z 0,45% bis-akryloamidu.
        UWAGA: Dalsze szczegóły dotyczące uzyskania pożądanej sztywności hydrożelu PA można znaleźć w innym miejscu24,25,26,27.
    2. Przygotować dwa roztwory wodne dla każdej pożądanej sztywności hydrożelu. Przygotować Roztwór 1 pozbawiony kulek oraz Roztwór 2 zawierający 0,03% 0,1-µm średnicy fluorescencyjne mikrokuleczki (patrz Tabela materiałów).
    3. Odgazuj roztwory 1 i 2 próżniowo przez 15 min, aby usunąć tlen, o którym wiadomo, że hamuje polimeryzację roztworów.
    4. Do roztworu 1 dodać 0,6% roztworu zapasowego APS o stężeniu 10 g/mL oraz 0,43% tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), aby zainicjować polimeryzację. Należy działać szybko.
    5. Dodaj 3.6 µL roztworu 1 do środka każdego dołka płytki 24-dołkowej (patrz krok 1.2 do jego przygotowania).
    6. Natychmiast przykryć dołki nieobrobionymi okryweczkami okrągłymi o średnicy 12 mm i pozostawić roztwór 1 na 20 min w celu jego pełnej polimeryzacji.
    7. Delikatnie uderz igłą strzykawki o powierzchnię, aby uformować na jej końcówce mały haczyk, który ułatwi zdjęcie szkiełek zakrywkowych. Podnieś szkiełka zakrywkowe za pomocą igły strzykawki.
    8. Do roztworu 2 dodać 0,6% roztworu stokowego APS o stężeniu 10 g/mL oraz 0,43% TEMED. Nanieść. 2.4 µL mieszaniny na wierzch pierwszej warstwy w każdym dołku płytki 24-dołkowej.
    9. Przykryj Roztwór 2 okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm, delikatnie dociskając je pęsetą, aby zapewnić minimalną grubość drugiej warstwy. Pozostaw Roztwór 2 do polimeryzacji na 20 min.
    10. Dodaj 500 µL do każdego z dołków 50 mM buforu HEPES o pH 7,5, a następnie usunąć szklane szkiełka nakrywki za pomocą igły strzykawki i pęsety.
  2. Sterylizacja, powlekanie kolagenem i równoważenie hydrożeli poliakrylamidowych
    1. Naświetlaj hydrożele promieniami UV przez 1 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu sterylizacji.
    2. Przygotować mieszaninę 0,5% wag./obj. sulfosukcynimidylo-6-(4′-azydo-2′-nitrofenyloamino)heksanianu (Sulfo-SANPAH, patrz Tabela materiałów) w 1% DMSO i 50 mM HEPES pH = 7,5.
    3. Dodaj 200 µL roztworu na górną powierzchnię hydrożeli. Działając szybko, naświetlaj je promieniami UV (302 nm) przez 10 min w celu ich aktywacji.
    4. Przemyć hydrożele dwukrotnie 1 ml 50 mM buforu HEPES o pH = 7,5. W razie potrzeby powtórzyć czynność, aby upewnić się, że usunięto nadmiar sieciującego.
    5. Pokryj hydrożele warstwą białka za pomocą 200 µL 0,25 mg/ml kolagenu typu I z ogona szczura (patrz Tabela materiałów) w 50 mM HEPES. Inkubować hydrożele z naniesionym na wierzch roztworem kolagenu przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Aby zapobiec odwodnieniu/odparowaniu, należy umieścić płytki wielodołkowe w pojemniku zewnętrznym, a na jego wewnętrznym obwodzie dołożyć chłonne ręczniki laboratoryjne nasączone wodą.
    6. Do pomiaru grubości hydrożeli należy użyć mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego z obiektywem 40X. W tym celu należy wyznaczyć pozycje z dolnej płaszczyzny hydrożelu (styk z powierzchnią szkła) oraz górnej płaszczyzny hydrożelu (miejsce maksymalnej intensywności świecenia kulek fluorescencyjnych). Następnie należy odjąć od siebie wartości pozycji z, aby określić wysokość.
      UWAGA: Do pomiaru grubości hydrożeli wykorzystaliśmy odwrócony mikroskop epifluorescencyjny oraz obiektyw 40X o aperturze numerycznej 0,65. Na tym etapie można również przeprowadzić pomiary za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), aby potwierdzić dokładną sztywność hydrożeli (patrz Rycina 2).
    7. Przed wysianiem badanych komórek na hydrożele, należy dodać na nie 1 ml pożywki i inkubować w temperaturze 37 ˚C przez od 30 min do 1 h, aby zapewnić równowagę osmotyczną.
      UWAGA: Dodaliśmy pełną pożywkę MCDB-131, ponieważ jest to pożywka, w której hodowano komórki gospodarza modelu (HMEC-1) (patrz krok 2.1 po szczegóły).

Wykres rozrzutu modułu Younga i mikroskopia; hydrożele 3, 20, 70 kPa; obrazy fazowe/AFM oraz obrazowanie kulek.
Rycina 2: Pomiary sztywności hydrożelu PA i rozkładu kulek metodą AFM. A. Dane przedstawiają oczekiwany moduł Younga (miara sztywności) hydrożeli PA, wyznaczony na podstawie ilości użytego akrylamidu i bis-akrylamidu, w zestawieniu z modułem Younga zmierzonym za pomocą AFM (N = 5 - 6). Poziome paski obrazują średnią. Sztywności hydrożeli 0,6 kPa nie udało się zmierzyć, ponieważ były one bardzo miękkie i przylegały do końcówki AFM. B. Jest to obraz fazowy konfluentnych komórek HMEC-1 oraz odpowiadający mu obraz kulek osadzonych na górnej powierzchni miękkiego hydrożelu 3 kPa-PA. Komórki HMEC-1 wysiano na 24 h w stężeniu 4 x 105 komórek na dołek. C. Obraz ten jest analogiczny do Ryciny 2B, ale dla komórek znajdujących się na sztywnym hydrożelu 70-kPa PA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Hodowla ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka i ich wysiew na hydrożele

  1. Hodować komórki HMEC-1 (ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia) w pełnej pożywce MCDB-131 zawierającej pożywkę MCDB-131 uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 ng/mL epidermal growth factor, 1 µg/mL hydrokortyzonu oraz 2 mM L-glutaminy (patrz Tabela materiałów).
  2. Przesiewać konfluentne kultury w stosunku 1:6 co 3–4 dni i utrzymywać komórki do 40. pasażu.
  3. Na dzień przed eksperymentem odłączyć komórki od naczynia hodowlanego przy użyciu 0,25% trypsyny/EDTA. Najpierw przemyć komórki i naczynie hodowlane 1x sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a następnie dodać odpowiednią ilość 0,25% trypsyny/EDTA (2 mL na szalkę 100-mm lub kolbę 75-cm, 1 mL na szalkę 60-mm lub kolbę 25-cm) i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5–10 min, aby umożliwić odłączenie komórek od podłoża.
  4. Zneutralizować trypsynę, dodając odpowiednią objętość pełnej pożywki MCDB-131, delikatnie pipetować w celu rozbicia skupisk komórek, a następnie przelać roztwór do stożkowej probówki wirówkowej.
  5. Delikatnie zamieszać roztwór komórek, aby zapewnić ich równomierny rozkład, a następnie pobrać 20 µL roztworu i bardzo ostrożnie wypełnić dwie komory pod szkiełkiem nakrywnym szklanego hemocytometru.
  6. Odwirować roztwór komórek znajdujący się w stożkowej probówce wirówkowej przez 10 min przy 500 x g.
  7. Podczas 10-minutowego oczekiwania policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Używając mikroskopu, ustawić ostrość na liniach siatki hemocytometru przy użyciu obiektywu 10X, a następnie za pomocą ręcznego licznika policzyć liczbę komórek w jednym kwadracie 1 mm x 1 mm.
  8. Przenieść hemocytometr na inny kwadrat 1 mm x 1 mm, policzyć tam komórki, a następnie powtórzyć ten proces jeszcze dwa razy. Obliczyć średnią z czterech pomiarów, a następnie pomnożyć średnią przez 104. Otrzymana wartość to liczba żywych komórek/mL w wirowanej zawiesinie komórkowej.
  9. Usunąć ciecz ze stożkowej probówki wirówkowej, dbając o to, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Resuspendować komórki w pełnej pożywce MCDB-131 do stężenia 4 x 105 cells/mL.
  10. Zasiać komórki w zawiesinie na hydrożelach, najpierw usuwając pożywkę, w której inkubowano hydrożele, a następnie dodając 1 mL zawiesiny komórkowej na każdy hydrożel.

3. Zakażanie ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka L. monocytogenes

  1. Przygotowanie wstępne
    Uwaga: Przygotuj następujące roztwory z wyprzedzeniem.
    1. Roztwory stokowe streptomycyny, chloramphenikolu i gentamycyny
      1. Przygotuj roztwór zapasowy streptomycyny o stężeniu 50 mg/ml, odważając 0,5 g siarczanu streptomycyny i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml wody ultrapure.
      2. Przygotować roztwór zapasowy chloramfenikolu o stężeniu 7,5 mg/ml, odważając 75 mg chloramfenikolu i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml 100% etanolu.
      3. Przygotować roztwory zapasowe gentamycyny o stężeniu 20 mg/ml, odważając 0,2 g siarczanu gentamycyny i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml wody ultrapure.
      4. Wszystkie roztwory stokowe należy wysterylizować za pomocą filtra o rozmiarze porów 0,2-µm przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania (1–2 miesiące).
    2. Pożywka Brain Heart Infusion (BHI) oraz płytki z agarem BHI
      1. Przygotować dwie kolby o pojemności 1 l i do każdej z nich włożyć magnetyczny mieszadło.
      2. W celu przygotowania pożywki BHI, należy wsypać 37 g proszku BHI do jednej kolby i uzupełnić wodą ultrapure do objętości 1 L. Roztwór należy intensywnie mieszać, umieszczając kolbę na mieszadle magnetycznym, aż do całkowitego rozpuszczenia proszku.
      3. Do płytek z agarem BHI należy dodać 37 g proszku BHI oraz 15 g agaru granulowanego (patrz Tabela materiałów) do drugiej kolby i uzupełnić wodą ultrapure do objętości 1 L. Roztwór należy intensywnie wymieszać, umieszczając kolbę na mieszadle magnetycznym, aż do całkowitego rozpuszczenia proszku.
      4. Zakręć korki kolb, nie dokręcając ich zbyt mocno, a następnie wysterylizuj roztwory w autoklawie, korzystając z programu do cieczy lub zgodnie ze specyfikacją urządzenia.
      5. Wyjmij roztwór z autoklawu, a następnie schłodź roztwór agar-BHI do 55 °CJeśli pożywka BHI w kolbie o pojemności 1 l zostanie zachowana w warunkach sterylnych, może być przechowywana do jednego miesiąca.
      6. Aby przygotować szalki z agarem BHI dla bakterii, należy najpierw dodać antybiotyki, jeśli jest to wymagane, do kolby zawierającej BHI i agar (w zależności od hodowanych szczepów bakteryjnych). Kolbę należy na krótko umieścić na mieszadle magnetycznym w celu szybkiego wymieszania składników.
        UWAGA: Antybiotyki użyte w tym protokole są specyficzne dla zastosowanych szczepów Lm, jednak na płytkach z agarem BHI można użyć dowolnych niezbędnych antybiotyków. Dodaliśmy streptomycynę do stężenia 200 µg/mL oraz chloramphenicol do stężenia 7.5 µg/mL ponieważ szczepy Lm 10403S są oporne na streptomycynę. Szczepy te zostały poddane koniugacji z plazmidem zawierającym otwartą ramkę odczytu chloramfenikol acetylotransferazy, co nadaje im oporność na chloramfenikol.
      7. Przelej mieszaninę do 10-centymetrowych polistyrenowych szalek do hodowli bakterii (około 20 ml na szalkę). Aby usunąć pęcherzyki powietrza, krótko opal powierzchnię szalek palnikiem. Pozostaw szalki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.
      8. Następnego dnia szczelnie zamknąć suche płytki i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
  2. Zakażanie ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka za pomocą L. monocytogenes
    1. Na trzy dni przed zakażeniem należy wyizolować pasmowo szczep Lm do użycia z zapasu w glicerolu (przechowywanego w temperaturze -80 °C) na płytkę z agarem BHI zawierającą 7.5 µg/mL chloramphenikolu i 200 µg/mL streptomycyny, jeżeli jest to odpowiednie.
      UWAGA: Szczep przeznaczony do wysiewania może być typem dzikim lub mutantem, konstytutywnie wykazującym fluorescencję (do immunobarwienia użyto szczepu JAT1045) lub wykazującym fluorescencję pod kontrolą promotora ActA (do cytometrii przepływowej lub mikroskopii sił trakcyjnych użyto szczepów JAT983 lub JAT985).22.
    2. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C aż do powstania oddzielnych kolonii (1–2 dni).
    3. Dzień przed infekcją należy hodować wybrany szczep przez noc, inkubując go w wytrząsaniu z prędkością 150 obr./min w temperaturze 30 °C w pożywce BHI z 7.5 µg/mL chloramfenikolu (jeśli jest to odpowiednie).
      1. Do 15-ml stożkowej probówki wirówkowej należy wprowadzić 5 ml pożywki BHI, a następnie dodać 7.5 µg/mL chloramphenikolu (jeśli jest to odpowiednie), a następnie zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki agarowej za pomocą sterylnego 10 µL końcówka
    4. Następnego dnia, bezpośrednio przed infekcją, zmierz gęstość optyczną roztworu bakterii przy 600 nm (OD600), rozcieńczając próbkę w stosunku 1:5; w celu przeprowadzenia pomiaru tła (blank) użyj kuwety zawierającej samą pożywkę BHI.
    5. Rozcieńczyć kulturę nocną do wartości OD600 wynoszącej 0,1 i inkubować z wytrząsaniem przez 2 h w temperaturze 30 °Cw pożywce BHI z 7.5 µg/mL chloramphenicolu (jeśli dotyczy), aby bakterie osiągnęły fazę logarytmicznego wzrostu.
    6. Zmierz OD600 roztworu bakteryjnego, która powinna wynosić około 0,2–0,3. Jeśli wartość OD600 jest wyższa, rozcieńcz roztwór do poziomu 0,2–0,3, używając samego podłoża BHI.
    7. Przenieś 1 ml roztworu bakterii do probówki do mikrowirówki. Wirować przez 4 min w temperaturze pokojowej przy 2 000 x g. Odpić nadsącz i w komorze z laminarnym przepływem powietrza resuspender osad bakteryjny w 1 ml PBS klasy do hodowli tkankowych. Przemyć bakterie dwukrotnie, wirując je przez 4 min przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej. Odpić nadsącz i resuspender bakterie w 1 ml PBS.
    8. Przygotować mieszaninę do infekcji, mieszając 10 lub 50 µL bakterii resuspendowanych w PBS z 1 ml pełnej pożywki MCDB-131 dla wielokrotności infekcji (MOI; t. j., liczba bakterii na komórkę gospodarza) wynoszącą około 50 bakterii na komórkę gospodarza lub 10 bakterii na komórkę gospodarza.
    9. Usunąć pożywkę z dołków płytek 24-dołkowych, uważając, aby nie uszkodzić hydrożeli ani komórek. Przemyć komórki jednokrotnie 1 ml pełnej pożywki MCDB-131, a następnie dodać 1 ml bakterii do każdego dołka.
    10. Zachować część mieszaniny infekcyjnej (przynajmniej 100 µL) do wyznaczenia MOI (patrz krok 3.3).
    11. Przykryj płytkę pokrywką i owiń ją folią spożywczą z polietylenu, aby zapobiec wyciekowi. Umieść płytki w wirówce i wiruj próbki przez 10 min przy 200 x g w celu synchronizacji inwazji. Przenieś płytki do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubuj je przez 30 min w 37 °C.
    12. Przemyć próbki czterokrotnie pełną pożywką MCDB-131 i przenieść je do inkubatora do hodowli tkankowych. Po kolejnych 30 min wymienić pożywkę na pożywkę uzupełnioną o 20 µg/mL gentamycyny.
  3. Oznaczanie wielokrotności infekcji (MOI)
    1. Podczas początkowej 30-minutowej inkubacji komórek gospodarza z bakteriami przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne mieszaniny do infekcji w celu określenia MOI. Rozcieńczenia dziesięciokrotne wykonać poprzez zmieszanie 100 µL mieszaniny infekcyjnej z 900 µL 1x PBS (10-1 rozcieńczenie). Następnie wymieszać 100 µL z 10-1 rozcieńczenie za pomocą 900 µL PBS (10-2 rozcieńczenie).
    2. Kontynuuj, aż do osiągnięcia wartości 10-5 otrzymuje się rozcieńczenie.
      UWAGA: Wszystkie roztwory należy dokładnie wymieszać przed rozcieńczeniem, a na każdym etapie należy używać świeżych, czystych końcówek do pipet.
    3. Po przygotowaniu rozcieńczeń należy umieścić 100 µL z 10-2 - 10-5 rozcieńczenia w centrum płytek BHI/agar/chloramphenicol/streptomycin (jeśli dotyczy).
    4. Wykonaj rozwieracz z pipety szklanej, nagrzewając ją w ogniu i wyginając tak, aby utworzyć haczyk. Zanurz pipetę w 100% etanolu w celu sterylizacji, a następnie wypal etanol w płomieniu.
    5. Po ostygnięciu rozcieracza, równomiernie rozprowadzić rozcieńczenia bakterii na płytkach, zaczynając od 10-5 rozcieńczenie i przejście do mieszanin o większym stężeniu. Inkubować płytki odwróconymi do dołu w 37 °C przez 2 dni.
    6. W zależności od gęstości kolonii należy określić liczbę kolonii dla 10-3 oraz 10-4 lub dla 10-4 i 10-5 płytki z rozcieńczeniami. Oblicz MOI w następujący sposób:
      liczba kolonii × czynnik rozcieńczenia ÷ objętość początkowa = liczba CFU na µL
      liczba CFU na µL × objętość mieszaniny bakterii na dołek = liczba CFU na dołek
      liczba CFU na dołek × objętość komórek na dołek = liczba bakterii na komórkę
      UWAGA: CFU oznacza jednostki tworzące kolonie.
    7. Oblicz średnią wartości MOI z dwóch płytek, aby uzyskać końcowe wartości MOI.

4. Cytometria przepływowa w celu ilościowego określenia podatności komórek gospodarza na zakażenie w zależności od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

  1. Odważyć 5 mg kolagenazy i umieścić ją w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Dodać 10 mL 0,25% trypsyny-EDTA i dokładnie wymieszać.
  2. 8 h po infekcji usunąć pożywkę z dołków płytki 24-dołkowej i wypłukać dołki 1x roztworem PBS do hodowli tkankowych. Usunąć PBS z dołków i dodać do każdego z nich 200 µL mieszaniny trypsyny-EDTA/kolagenazy. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 min, aby umożliwić całkowite odklejenie komórek.
  3. Używając nowej pipety dla każdego dołka, pipetować mieszaninę w górę i w dół 8x. Należy robić to delikatnie, aby nie uszkodzić komórek. Do każdego dołka dodać 200 µL pełnej pożywki w celu neutralizacji trypsyny.
  4. Przenieść 400 µL zawiesiny komórkowej z każdego dołka do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL z nakrętką wyposażoną w sito komórkowe 35 µm (patrz Tabela materiałów).
  5. Przeanalizować od 10 000 do 20 000 komórek na próbkę za pomocą cytometrii przepływowej. Przeprowadzić akwizycję danych za pomocą cytometrii przepływowej i wyznaczyć procent zainfekowanych komórek w każdym dołku przy użyciu odpowiedniego, dostępnego komercyjnie oprogramowania. Wykorzystać wykresy rozproszenia światła przedniego (forward scatter) względem bocznego (side scatter), aby wyznaczyć bramkę dla głównej populacji liczebności komórek.
    UWAGA: Zapewni to analizę pojedynczych komórek i wyeliminuje zanieczyszczenia oraz dublety lub triplety komórkowe.
    1. Zmierzyć sygnał fluorescencji z niezinfekowanych komórek kontrolnych i wyznaczyć bramkę dla populacji komórek zainfekowanych, wykluczając autofluorescencję.

5. Immunobarwienie bakterii zewnątrzkomórkowych, mikroskopia i przetwarzanie obrazów

Uwaga: Podejście to jest stosowane w celu odróżnienia adhezji bakteryjnej do powierzchni komórek gospodarza zależnej od sztywności ECM od internalizacji (inwazji) bakterii do wnętrza gospodarzy.

Mikroskopia komórek i bakterii wraz z wykresami analizującymi efektywność inwazji bakteryjnej przy różnych ciśnieniach.
Rycina 4: Immunobarwienie komórek HMEC-1 zainfekowanych Lm, hodowanych na hydrożelach o różnej sztywności, w celu odróżnienia adhezji bakterii od ich inwazji. Obrazy te przedstawiają reprezentatywny przykład różnicowego immunobarwienia wykazującego A. jądra komórkowe (DAPI), B. wszystkie bakterie (GFP) oraz C. bakterie zewnętrzne (Alexa-546). Komórki HMEC-1 znajdowały się na miękkim hydrożelu o sztywności 3-kPa. Strzałki wskazują bakterie, które uległy internalizacji, w związku z czym są widoczne tylko w kanale zielonym. Dane w D-F odnoszą się do N = 20 obrazów zarejestrowanych dla zainfekowanych komórek HMEC-1 hodowanych na miękkim hydrożelu 3-kPa i sztywnym hydrożelu 70-kPa i pokazują D. całkowitą liczbę bakterii na jądro; E. liczbę zinternalizowanych bakterii na jądro; oraz F. efektywność inwazji (stosunek bakterii zinternalizowanych do całkowitej liczby bakterii). Poziome paski przedstawiają średnią wartość danych. Wartość P obliczono za pomocą nieparametrycznego testu suma rang Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. 30 minut po infekcji komórki HMEC-1 zainfekowane szczepem JAT1045 (Lm konstytutywnie ekspresującym zielone białko fluorescencyjne (GFP)) należy przemyć 4-krotnie pożywką.
  2. Po czwartym przemyciu wymieszać 1 µL zmieszać 1 mg/mL barwnika Hoechst z 1 ml pełnej pożywki MCDB-131 i dodać do każdej studni w celu zabarwienia jąder komórkowych. Przenieść komórki do inkubatora do hodowli tkankowych na 10 min.
  3. Przemyj komórki raz roztworem PBS. Utwierdź je przy użyciu utrwalacza niepermeabilizującego w celu przeprowadzenia różnicowego barwienia immunocytochemicznego przez 20 min w temperaturze pokojowej.28.
    UWAGA: Utrwalacz zawiera 0,32 M sacharozy, 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl oraz 3 mM MgCl22, 2 mM EGTA oraz 4% formaldehydu (klasy do mikroskopii elektronowej).
  4. Przemyj komórki 1x w PBS. Zablokuj próbki przez 30 min, stosując 5% albuminę surowicy bydlęcej (patrz Tabela materiałów) w PBS.
  5. Inkubować próbki przez 1 h z przeciwciałem anty-Lmprzeciwciało pierwszorzędowe (patrz Tabela materiałów) rozcieńczone 1:100 w buforze PBS zawierającym 2% BSA.
  6. Próbki należy przemyć 3x w buforze PBS, a następnie inkubować przez 1 h z przeciwciałem wtórnym kozim anty-króliczym AlexaFluor-546 (patrz Tabela materiałów) rozcieńczony 1:250 w buforze PBS zawierającym 2% BSA. Próbki przemyć 3x w buforze PBS. Próbki przechowywać w 1 ml PBS do czasu obrazowania.
  7. Wykonaj obrazowanie i analizę ponad 1 000 komórek na każdą kondycję.
    1. Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z kamerą CCD (patrz Tabela materiałów) oraz obiektyw fluorytowy 40X z powietrznym ośrodkiem i aperturą numeryczną (NA) 0,6.
      UWAGA: Moc ustawiono na 25%, a czas ekspozycji na 100 ms. W przypadku mCherry zastosowano filtry mikroskopowe 470/525 nm, dla GFP 530/645 nm, a dla DAPI 395/460 nm, odpowiednio dla wzbudzenia i emisji. Użyty mikroskop był sterowany przez oprogramowanie do mikroskopii typu open source.29.
    2. W przypadku różnicowego barwienia immunocytochemicznego wszystkie „zielone” bakterie powiązane z poszczególnymi komórkami należy uznać za przylegające. Bakterie, które są jednocześnie „zielone” i „czerwone” (na skutek wiązania przeciwciał), należy uznać za niezinternalizowane.
      UWAGA: Liczbę jąder komórkowych określono za pomocą autorskiego skryptu oraz oprogramowania CellC (patrz Tabela materiałów) do wyliczania bakterii30.

6. Mikroskopia sił trakcyjnych w wielu dołkach oraz mikroskopia naprężeń monowarstwy

Morfologia komórek i mapowanie sił w czasie; obrazy mikroskopowe i wykresy rozkładu ciśnienia.
Rycina 5: Komórki HMEC-1 zainfekowane Lm wykazują zmniejszenie wielkości sił trakcyjnych wywieranych na ECM podczas infekcji. Panel A przedstawia obraz fazowy, B przedstawia pole deformacji, C przedstawia pole naprężeń trakcyjnych, a D przedstawia pole napięcia wewnątrzkomórkowego niezinfekowanych komórek HMEC-1 znajdujących się na hydrożelu 20-kPa. Paski kolorów map deformacji (µm), map naprężeń trakcyjnych (Pa) oraz map napięcia wewnątrzkomórkowego (nNµm-1) znajdują się w górnej części map ciepła. Kolumny przedstawiają trzy reprezentatywne punkty czasowe: 3, 8 i 18 h po infekcji. E-H. Analogicznie jak w panelach A-D, ale dla komórek zainfekowanych Lm przy MOI równym 300. Obrazy bakterii (kanał czerwony) są nałożone na obrazy fazowe komórek. Pomiary TFM przeprowadzono poprzez obrazowanie wielu dołków jednocześnie. Rozmiar okna dla PIV wynosił 32 piksele z nakładaniem 16. Pasek skali wynosi 32 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Bastounis i Theriot59. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotować hydrożele PA na płytce 24-dołkowej (patrz krok 1). Wysiać komórki HMEC-1 (patrz krok 2) i zainfekować je szczepem JAT983 zgodnie z powyższym opisem (patrz krok 3).
  2. Przygotować pożywkę do mikroskopii żywych komórek, uzupełniając pożywkę Leibovitz’s L-15 o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 ng/mL epidermal growth factor oraz 1 μg/mL hydrokortyzonu.
    UWAGA: Pożywka L-15 zawiera już 2 mM L-glutaminy, więc nie ma potrzeby dodawania jej dodatkowo, jak ma to miejsce w przypadku pożywek MCDB-131.
  3. 4 h po infekcji (gdy zinternalizowane JAT983 zaczynają fluorescować), zmieszać 1 μL barwnika Hoechst o stężeniu 1 mg/mL z 1 mL pełnej pożywki L-15 i dodać do każdego dołka w celu zabarwienia jąder komórkowych. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 min, a następnie w każdym dołku zastąpić pełną pożywkę L-15 objętością 1 mL pełnej pożywki L-15 uzupełnionej o 20 µg/mL gentamycyny.
  4. Przykryć płytkę pokrywką i umieścić ją w komorze środowiskowej mikroskopu (patrz Tabela materiałów) ustabilizowanej w temperaturze 37 ˚C.
    UWAGA: Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z kamerą CCD (patrz Tabela materiałów) oraz fluorytowego obiektywem powietrznym 40X o aperturze numerycznej 0.6 NA.
  5. Nabywać wielokanałowe obrazy time-lapse fluorescencyjnych kulek oraz fluorescencyjnych bakterii, a także obrazy w kontraście fazowym komórek gospodarza, co 10 min przez okres od 4 do 12 h.
    UWAGA: Podczas obrazowania moc ustawiono na 25%, a czas ekspozycji na 100 ms. Filtry mikroskopowe (pobudzenie/emisja) użyte dla mCherry i GFP to odpowiednio 470/525 nm i 530/645 nm.
  6. Po zakończeniu rejestracji dodać 500 µL 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie do każdego z dołków.
    UWAGA: Komórki odkleją się od hydrożelu, a hydrożel powróci do swojego początkowego, niedeformowanego stanu dzięki swojej elastyczności.
  7. Wykonać zdjęcie hydrożelu i użyć go jako referencyjnego obrazu stanu niedeformowanego.
  8. Wyznaczyć dwuwymiarową deformację hydrożelu w każdym momencie czasu, stosując welocymetrię obrazu cząstek (PIV)31, porównując każdy obraz z serii time-lapse z referencyjnym obrazem niedeformowanego hydrożelu. Dobrać odpowiednie rozmiary okien i stopień ich nakładania w zależności od eksperymentu.
    UWAGA: Użyto okien o rozmiarze 32 pikseli z nakładaniem 16 pikseli.
  9. Obliczyć dwuwymiarowe naprężenia trakcyjne, jakie komórki wywierają na hydrożel, zgodnie z opisem zamieszczonym w innej publikacji32,33.
  10. Obliczyć napięcie monowarstwy z naprężeń trakcyjnych, jak opisano wcześniej34, rozwiązując równania równowagi mechanicznej dla cienkiej elastycznej płyty poddanej siłom reakcji generowanym przez hydrożel PA na monowarstwę, które mają znak przeciwny do zmierzonych naprężeń trakcyjnych.
    UWAGA: Patrz Materiał uzupełniający 1.

7. Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozprzestrzeniania się L. monocytogenes przez komórki śródbłonka w zależności od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Analiza migracji komórek przy różnej sztywności macierzy; obrazy mikroskopowe i wykresy odległości radialnej.
Rycina 6: Ilościowe dane z mikroskopii time-lapse dotyczące rozprzestrzeniania się Lm przez monowarstwy HMEC-1 wysiane na podłożach o sztywności 3-kPa i 70-kPa. A. Ten panel przedstawia klatki z dwóch reprezentatywnych ognisk infekcji w czasie 0, 200, 400 i 600 min. Kanał fazowy obrazuje monowarstwy komórek HMEC-1, a kanał czerwony obrazuje wewnątrzkomórkowe Lm (patrz krok 7 protokołu). B. Ten panel przedstawia powierzchnię otoczki wypukłej obejmującej ognisko infekcji wykreśloną jako funkcja czasu. Powierzchnia ogniska w warunkach 3-kPa (kolor czerwony) rośnie szybciej niż w warunkach 70-kPa (kolor zielony). C. Ten panel przedstawia odległość radialną od centrum do krawędzi ogniska infekcji wykreśloną jako funkcja czasu dla reprezentatywnych ognisk infekcji rosnących w monowarstwach HMEC-1 wysianych na podłożach PA o sztywności 3-kPa (kolor czerwony) i 70-kPa (kolor zielony). Prędkość radialna (dr/dt) jest stała dla warunków 3-kPa, ale dwufazowa dla warunków 70-kPa. D. Dane te przedstawiają prędkość radialną w ciągu pierwszych 200 min dla dziesięciu niezależnych ognisk infekcji. Czerwone (3-kPa) i zielone (70-kPa) punkty danych przedstawiają nachylenia dwóch ognisk opisanych w poprzednich panelach. Poziome paski przedstawiają średnią danych. Wartość P obliczono za pomocą nieparametrycznego testu suma rang Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Przygotować hydrożele PA na płytce 24-dołkowej (patrz krok 1), wysiać komórki HMEC-1 (patrz krok 2) oraz hodować kultury JAT983 przez noc zgodnie z powyższym opisem (patrz krok 3).
  2. W dniu infekcji przygotować mieszaninę infekcyjną poprzez zmieszanie 10 µL osadu bakteryjnego na 1 mL pełnej pożywki MCDB-131. Ostrożnie usunąć pożywkę z dołków płytek 24-dołkowych, a następnie do każdego dołka dodać 1,9 mL pełnej pożywki MCDB-131 oraz 0,1 mL mieszaniny bakteryjnej.
    UWAGA: Niższa wartość MOI zastosowana w tym teście jest niezbędna do analizy zdarzeń dysseminacji rozpoczynających się od inwazji pojedynczej bakterii do komórki gospodarza.
  3. Przykryć płytkę pokrywką i szczelnie owinąć folią spożywczą, aby zapobiec wyciekom. Umieścić płytki w wirówce i wirować próbki przez 10 min przy 200 x g w celu synchronizacji inwazji.
  4. Przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez 5 min.
  5. Przemyć próbki 4x pożywką i przenieść je do inkubatora do hodowli tkankowych. Po kolejnych 5 – 7 min zastąpić pożywkę pożywką uzupełnioną o 20 µg/mL gentamycyny.
  6. Inkubować płytkę w inkubatorze przez dodatkowe 5 h, aby umożliwić aktywację promotora actA i indukcję ekspresji otwartej ramki odczytu mTagRFP35.
  7. Przygotować pożywkę do mikroskopii żywych komórek, uzupełniając pożywkę Leibovitza L-15 o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 ng/mL epidermalnego czynnika wzrostu oraz 1 µg/mL hydrokortyzonu.
    UWAGA: Pożywka L-15 zawiera już 2 mM L-glutaminy, więc nie ma potrzeby dodawania jej dodatkowo, jak w przypadku pożywek MCDB-131.
  8. Zmieszać 1 μL barwnika Hoechst w stężeniu 1 mg/mL z 1 mL pełnej pożywki L-15 i dodać do każdego dołka w celu zabarwienia jąder komórkowych. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 min, a następnie w każdym dołku zastąpić pełną pożywkę L-15 objętością 1 mL pełnej pożywki L-15 uzupełnionej o 20 µg/mL gentamycyny. Przykryć płytkę pokrywką i umieścić ją w komorze środowiskowej mikroskopu (patrz Tabela materiałów) ustabilizowanej w temperaturze 37 ˚C.
    UWAGA: Do obrazowania wykorzystano odwrócony mikroskop epifluorescencyjny z kamerą CCD (patrz Tabela materiałów) i fluorytowym obiektywem plan powietrznym 20X o aperturze numerycznej 0,75 NA. Moc ustawiono na 50%, a czas ekspozycji na 50 ms. Filtry mikroskopowe użyte dla mCherry to odpowiednio 470/525 nm dla wzbudzenia i emisji.
  9. Wykonaj obrazy wielu pozycji co 5 min, korzystając z funkcji autofokusu, aby monitorować sposób rozprzestrzeniania się Lm przez monowarstwy HMEC-1 wysiane na hydrożelach o różnej sztywności.
    UWAGA: Pożywka L-15 jest buforowana HEPES-em, więc podczas obrazowania nie ma potrzeby stosowania CO2.

Wyniki

Zależność podatności komórek HMEC-1 na zakażenie Lm od sztywności ECM:
Hydrożele PA o różnej sztywności, wszystkie pokryte powierzchniowo kolagenem I, przygotowano na szklanych płytkach wielodołkowych zgodnie z opisem w kroku 1 protokołu (patrz Rysunek 1). W celu potwierdzenia dokładnej sztywności hydrożeli przeprowadzono pomiary AFM, zgodnie z wcześniejszym opisem26,27 (patrz Rysunek 2). Poprzednie badania wykazały, że lokalna podatność błony podstawnej komórek śródbłonka może wynosić od 1 kPa (np. tkanka mózgu) do 70 kPa (np. aorta)36,37,38,39,40. W związku z tym zdecydowano się zbadać zakażenie komórek HMEC-1 bytujących na macierzach o następującej sztywności: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa i 70 kPa. Dla każdej sztywności hydrożelu wykonano sześć hydrożeli, aby ocenić powtarzalność wyników.

Cytometrię przepływową wykorzystano do oceny podatności komórek HMEC-1 na zakażenie Lm w zależności od sztywności ECM (patrz Rycina 3). Komórki HMEC-1 zainfekowano szczepem Lm (JAT985), który po internalizacji wykazuje ekspresję markera fluorescencyjnego (actAp::mTagRFP), co umożliwia detekcję wyłącznie bakterii wewnątrzkomórkowych (patrz Ryciny 1L - 1N). JAT985 nie posiada również białka ActA, co uniemożliwia bakteriom rozprzestrzenianie się z komórki do komórki, ponieważ ActA jest niezbędne do tworzenia aktynowych „ogonów komet” i późniejszej dysseminacji bakterii. W 7–8 h po zakażeniu oceniono stopień infekcji komórek HMEC-1 za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zapewnić analizę pojedynczych komórek, główną część rozkładu liczby komórek wyodrębniono za pomocą bramkowania na wykresie rozproszenia w przód (forward scatter) względem rozproszenia bocznego (side scatter), a następnie wykonano drugi etap bramkowania w celu wykluczenia komórek wykazujących autofluorescencję (patrz Ryciny 3A - 3C). Wstępne wyniki przedstawione na Rycini 3 wskazują, że zakażenie komórek HMEC-1 przez Lm jest około dwukrotnie większe w przypadku komórek HMEC-1 znajdujących się na sztywnych hydrożelach 70 kPa w porównaniu do komórek znajdujących się na miękkich hydrożelach 0.6 kPa (patrz Ryciny 3B - 3D). Zwiększona podatność komórek HMEC-1 na zakażenie Lm na macierzach sztywnych w porównaniu do miękkich mogłaby wynikać z: 1. zwiększonej adhezji Lm do HMEC-1; 2. zwiększonej inwazji Lm do wnętrza HMEC-1; lub 3. współwystępowania obu powyższych czynników. Aby sprawdzić, która hipoteza jest słuszna, komórki HMEC-1 wysiano na miękkie (3 kPa) i sztywne (70 kPa) hydrożele i zainfekowano Lm konstytutywnie ekspresującym GFP (patrz Ryciny 4A - 4C). Próbki utrwalono krótko po zakażeniu, a bakterie zewnętrzne (przylegające) zabarwiono przeciwciałami. Przy użyciu mikroskopii ilościowej stwierdzono, że znacznie więcej bakterii przylega do HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na żelach sztywnych w porównaniu do miękkich (patrz Rycina 4D). Zgodnie z danymi z cytometrii przepływowej, znacznie więcej bakterii zostaje zinternalizowanych przez HMEC-1, gdy komórki gospodarza znajdują się na żelach sztywnych w porównaniu do miękkich (patrz Rycina 4E). Jednakże wydajność inwazji (liczba zinternalizowanych bakterii/całkowita liczba bakterii) Lm do komórek HMEC-1 jest podobna, niezależnie od sztywności podłoża (patrz Rycina 4F).

Mikroskopia sił trakcyjnych komórek HMEC-1 zainfekowanych Lm:
Infekcja komórek HMEC-1 przez Lm może zmieniać biomechanikę zainfekowanych komórek gospodarza, w tym siłę przylegania do ich ECM lub do siebie nawzajem, co wpływa na integralność bariery. Postanowiliśmy ocenić, czy tak jest w rzeczywistości, wykorzystując mikroskopię sił trakcyjnych (Traction Force Microscopy)32 do obliczenia sił trakcyjnych komórka-ECM oraz mikroskopię naprężeń monowarstwy (Monolayer Stress Microscopy)41 do obliczenia wewnątrzkomórkowych sił napięciowych. Rysunek 5 przedstawia mapy pola deformacji, pola naprężeń trakcyjnych oraz pola napięcia wewnątrzkomórkowego komórek HMEC-1 znajdujących się na hydrożelach o sztywności 20 kPa w różnych punktach czasowych po infekcji. Rysunki 5A - 5D odnoszą się do niezainfekowanych kontrolnych komórek HMEC-1, natomiast Rysunki 5E - 5H odnoszą się do komórek HMEC-1 zainfekowanych Lm przy wielokrotności infekcji równej 300 bakterii/komórkę. Te wstępne prace sugerują, że zainfekowane komórki HMEC-1 zmniejszają wielkość naprężeń komórka-ECM oraz naprężeń wewnątrzkomórkowych w przebiegu infekcji Lm, podczas gdy nie obserwuje się tego w przypadku niezainfekowanych komórek kontrolnych.

Rozprzestrzenianie się Lm przez monowarstwy HMEC-1 zależnie od sztywności ECM:
W celu zbadania wpływu sztywności macierzy na rozprzestrzenianie się Lm przez monowarstwy HMEC-1 wykorzystano mikroskopię poklatkową. W miarę jak Lm rozprzestrzenia się przez monowarstwę, bakterie tworzą ognisko infekcji, które powiększa się w czasie (patrz Rysunek 6A oraz Filmy 1 i 2). Powierzchnię ogniska infekcji mierzono poprzez wyznaczenie otoczki wypukłej, czyli najmniejszego wypukłego wielokąta obejmującego zbiór punktów, wokół bakterii42. W tej dziedzinie nie istnieje standardowa metoda pomiaru wydajności rozprzestrzeniania się komórek L. monocytogenes z komórki na komórkę przez monowarstwę komórek gospodarza. Aby ocenić wydajność rozprzestrzeniania, niektórzy badacze liczyli liczbę komórek gospodarza w ognisku infekcji41, a inni ręcznie wyznaczały granice wokół grupy zainfekowanych komórek gospodarza43. Zdecydowaliśmy się na wyznaczenie wielokąta wypukłego wokół bakterii, ponieważ jest to zautomatyzowany, spójny i niewymagający dużych zasobów obliczeniowych proces pomiaru wydajności rozprzestrzeniania się L. monocytogenes. W ten sposób stwierdzono niewielki spadek powierzchni ogniska infekcji w komórkach HMEC-1 wysianych na hydrożele o sztywności 70 kPa w porównaniu do tych wysianych na macierzach 3 kPa (patrz Rysunek 6B oraz Filmy 1 i 2). Aby określić szybkość wzrostu ogniska infekcji, odległość promieniową przedstawiono jako funkcję czasu, wyciągając pierwiastek kwadratowy z powierzchni ogniska infekcji i dzieląc wynik przez pi. Ta transformacja matematyczna zakłada, że kształt ogniska infekcji jest w przybliżeniu okrągły44. Aby zmierzyć prędkość wzrostu ogniska, zmierzono tempo zmian (t.j. nachylenie) odległości promieniowej dla macierzy 3 i 70 kPa. Podejście to wykazało, że ognisko infekcji rosło szybciej i monotonicznie w komórkach HMEC-1 wysianych na macierzach 3 kPa. Natomiast w komórkach wysianych na macierzach 70 kPa ognisko rosło znacznie wolniej (pierwsze 200 min) i nieco wolniej (od 200 do 600 min) (patrz Rysunek 6C). Rzeczywiście, analiza dalszych danych potwierdziła, że ognisko infekcji rosło średnio dwukrotnie wolniej w macierzach 70 kPa, szczególnie w ciągu pierwszych 200 min (patrz Rysunek 6D).

Wykresy cytometrii przepływowej, analiza rozkładu komórek; wykresy kropkowe pokazują fluorescencję, wpływ modułu.
Rysunek 3: Zależna od sztywności ECM podatność komórek HMEC-1 na inwazję Lm zmierzona za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki HMEC-1 zainfekowano Lm (JAT985), a infekcję przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. A. Ten panel przedstawia wykres rozproszenia bocznego względem przedniego dla reprezentatywnych komórek HMEC-1 pochodzących z jednej studzienki. Główny rozkład komórek został wybrany za pomocą bramkowania w celu wykluczenia zanieczyszczeń (lewo) oraz dubletów lub tripletów komórek (prawo). B. Wykres ten przedstawia histogram logarytmu intensywności fluorescencji Lm na komórkę dla komórek HMEC-1 posianych na miękkim podłożu 0.6 kPa. C. Wykres ten przedstawia histogram logarytmu intensywności fluorescencji Lm na komórkę dla komórek HMEC-1 posianych na sztywnych hydrożelach 70 kPa. Histogramy dla N = 4 - 6 powtórzeń są przedstawione w różnych kolorach. Histogram dla niezinfekowanych komórek kontrolnych jest koloru fioletowego. Bramka służąca do zdefiniowania komórek zainfekowanych jest zaznaczona na czerwono. MOI wynosi 100, a infekcję oceniono 8 h po zainfekowaniu. D. Dane przedstawiają procent zainfekowanych komórek HMEC-1 w zależności od sztywności hydrożelu (N = 5). Poziome paski obrazują średnią z danych. Wartość P została obliczona za pomocą nieparametrycznego testu suma rang Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej z wyróżnionymi strukturami komórkowymi; badania nad dynamiką wzrostu komórek.
Wideo Rycina 1: Rozprzestrzenianie się wewnątrzkomórkowych Lm (kanał czerwony) przez monowarstwę komórek HMEC-1 (fazowy) wysianych na podłożu o sztywności 3-kPa. Komórki obrazowano w pożywce Leibovitz's L-15 (10% FBS, 20 µg/mL gentamycyny) w komorze inkubacyjnej ustalonej na 37 ˚C. Obrazy gromadzono co 5 min. Prędkość filmu wynosi 15 klatek/s. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Obraz z mikroskopu hodowli komórkowych; mikroskopia fluorescencyjna uwydatnia struktury komórkowe w kolorze różowym.
Wideo Rycina 2: Rozprzestrzenianie się wewnątrzkomórkowych Lm (kanał czerwony) poprzez monowarstwę komórek HMEC-1 (fazowy) wysianych na podłożu o sztywności 70 kPa. Obrazowanie komórek przeprowadzono w pożywce Leibovitza L-15 (10% FBS, 20 µg/mL gentamycyny) w komorze środowiskowej ustabilizowanej w temperaturze 37 °C. Obrazy gromadzono co 5 min. Prędkość filmu wynosi 15 klatek/s. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Moduł Younga (E, kPa)% akryloamidu (z roztworu zapasowego 40%)% bisakryloamidu (z roztworu stokowego 2%)
0.630.045
350.075
10100.075
2080.195
70100.45

Tabela 1. Skład hydrożeli poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności. W tabeli tej, w oddzielnych kolumnach, wskazano procentową zawartość roztworu akrylamidu stężenia 40% oraz roztworu bis-akrylamidu stężenia 2% niezbędnych do uzyskania określonej sztywności (modułu Younga, E).

Równania równowagi statycznej w biomechanice; tensor naprężeń i bilans sił; schemat badawczy.
Materiały uzupełniające 1. Obliczanie napięcia wewnątrzkomórkowego na podstawie obliczonych naprężeń trakcyjnych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Komórki mogą wyczuwać różne fizyczne sygnały środowiskowe, które mogą wpływać nie tylko na morfologię komórek, ale także na ich ekspresję genów i aktywność białek, wpływając w ten sposób na krytyczne funkcje i zachowania komórek45,46. Sztywność ECM komórek jest coraz bardziej doceniana jako ważny modulator ruchliwości komórek, różnicowania, proliferacji i ostatecznie losu komórki 47,48,49. Chociaż w ostatnim czasie poczyniono wiele postępów w zrozumieniu złożonej interakcji biomechanicznej między komórkami a ich ECM, niewiele wiadomo na temat tego, jak sztywność środowiska wpływa na podatność komórek na infekcje bakteryjne. Aby ułatwić takie badania, opracowaliśmy ten nowatorski test wielodołkowy oparty na dobrze znanym wytwarzaniu hydrożeli poliakrylamidowych o regulowanej sztywności, która jest zgodna z testami infekcji50. Tradycyjnie, infekcja bakteryjna komórek w hodowli tkankowej była badana na powierzchniach szklanych lub polistyrenowych, które są o około 1 - 3 rzędy wielkości sztywniejsze niż naturalny ECM większości przylegających komórek 8,51. Opisany tutaj test otwiera nowe autostrady, umożliwiając badanie interakcji bakteria-gospodarz w fizjologicznie istotnym reżimie sztywności środowiskowej.

W celu potwierdzenia słuszności koncepcji przedstawionego testu, wybrano komórki HMEC-1 jako modelowe przylegające komórki gospodarza oraz Lm jako modelowy patogen bakteryjny. Test może jednak zostać rozszerzony o dalsze badania, jeśli zostanie odpowiednio zmodyfikowany. Takie badania mogą obejmować zakażenie różnych typów przylegających komórek gospodarza ssaków przez dodatkowe patogeny, w tym bakterie i wirusy. W tym konkretnym teście żele były pokryte białkiem kolagenu I, ale w zależności od typu komórki gospodarza możliwe jest zastosowanie innej powłoki białkowej ECM, takiej jak laminina lub fibronektyna, aby ułatwić przyczepienie komórek gospodarza będących przedmiotem zainteresowania do hydrożelu52. Dodatkową kwestią, która zależy od typu komórki gospodarza, jest badany zakres sztywności hydrożelu. Zakres sztywności powinien zależeć od tego, co jest fizjologicznie istotne dla konkretnego typu komórki gospodarza i jak dobrze ten gospodarz przyczepia się, tworząc monowarstwę przy danej sztywności hydrożelu. Podobnie, w zależności od modelowego patogenu, który ma być badany, może być konieczne wprowadzenie niewielkich modyfikacji w opisanym w niniejszym dokumencie teście infekcji.

Innowacyjność testu w porównaniu z poprzednimi metodami wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych 24,50,53 polega na pewnych unikalnych cechach zintegrowanych z proponowanym testem infekcji. Po pierwsze, hydrożele są budowane na wielodołkowych szklanych płytkach dennych, co umożliwia jednoczesne badanie przesiewowe wielu warunków, a także automatyzację niektórych procedur. Monitorowanie wielu warunków w tym samym czasie lub badanie wielu kontrprób ma kluczowe znaczenie, ponieważ na wynik takiego podejścia mogą mieć wpływ takie czynniki, jak pasaż komórek gospodarza i dokładna liczba bakterii dodanych w celu zakażenia gospodarzy, które często zmieniają się między niezależnymi eksperymentami. Dodatkową unikalną cechą tego testu jest to, że hydrożele mają wysokość około 40 μm, która jest wystarczająco cienka, aby można było ją obrazować za pomocą konwencjonalnej mikroskopii. Wykazaliśmy, że możemy z powodzeniem przeprowadzić zarówno mikroskopię żywych komórek i ich utrwalanie, jak i barwienie immunologiczne, a następnie obrazowanie, bez wprowadzania wysokiej fluorescencji tła. Wreszcie, hydrożele są wykonane z dwóch warstw, z których górna ma osadzone mikrokulki fluorescencyjne, zamknięte w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Ten atrybut gwarantuje, że podczas obrazowania nie będzie zakłócania ostrego światła. Obecność kulek umożliwia zarówno badanie topografii powierzchni żeli w celu upewnienia się, że są one jednolite, jak i poprawia wydajność TFM i MSM 24,32,41. Za pomocą TFM i MSM możliwe jest obliczenie odpowiednio sił komórka-ECM i komórka-komórka komórek znajdujących się na matrycach o różnej sztywności. Korzystając z tego nowatorskiego testu, możliwe jest wykonanie takich pomiarów sił fizycznych, porównując jednocześnie zarówno wpływ sztywności środowiskowej, jak i infekcji. Stosując takie podejście, można określić wpływ infekcji na mechanikę komórek gospodarza w całym jej przebiegu. Ponadto ewolucję naprężeń wewnątrzkomórkowych komórek można obliczyć za pomocą MSM i można ją wykorzystać jako miarę integralności bariery monowarstwy. Wreszcie, biorąc pod uwagę wielodołkowy charakter testu, możliwe jest jednoczesne wprowadzenie zaburzeń farmakologicznych i genetycznych związanych z infekcją bakteryjną, aby bardziej dogłębnie zbadać złożone zależności między mechaniką komórek gospodarza a infekcją.

Jednym z nieodłącznych ograniczeń tej techniki jest wpływ, jaki sztywność substratu może mieć na szybkość proliferacji komórek. Zazwyczaj w testach infekcji musimy upewnić się, że gęstość komórek gospodarza w różnych warunkach jest taka sama. Dzieje się tak, ponieważ gęstość komórek sama w sobie może mieć wpływ na podatność gospodarzy na infekcje. Komórki HMEC-1, które zostały użyte jako komórki gospodarza, nie wykazują znaczącej różnicy w swojej liczbie po wysiewie przez 24 godziny na hydrożelach. Jednak różne typy komórek mogą wykazywać zróżnicowaną proliferację, w zależności od sztywności hydrożelu, co może zniekształcać badania nad infekcjami. Podobnie, błąd infekcji może powstać, gdy komórki nie tworzą monowarstw lub nie przyczepiają się dobrze do hydrożeli, jak ma to miejsce, gdy niektóre typy komórek są wysiewane na bardzo miękkich matrycach (np. Ludzkie komórki śródbłonka pępowiny lub komórki nabłonka nerki psów Madin-Darby wysiane na hydrożelach 0,6-kPa54,55). Jeśli chodzi o patogeny, niektóre bakterie (np. Borrelia burdgorferi) mogą przyczepiać się do komórek gospodarza i atakować je, ale mogą również migrowaćprzez nie. Nie sprawdziliśmy jeszcze, czy ten test zadziała w badaniach nad transmigracją patogenów, ale wydaje się to możliwe, ponieważ poprzednie badania na neutrofilach transmigrujących komórkach śródbłonka wysianych na hydrożelach PA zostały udokumentowane, że działają z powodzeniem57. Przeprowadzono wiele badań pokazujących, jak wytwarzać hydrożele poliakrylamidowe o danym module Younga poprzez mieszanie odpowiednich stężeń akrylamidu i bis-akrylamidu 24,25,26,27. Jednakże, zwłaszcza gdy chce się przeprowadzić eksperymenty TFM na komórkach znajdujących się na hydrożelach o różnej sztywności, ważne jest, aby potwierdzić oczekiwaną sztywność hydrożeli za pomocą AFM lub innych technik wgłębiania58. Niewielkie odchylenia od wartości oczekiwanej mogą wynikać z użycia innego rozpuszczalnika lub starzonego roztworu podstawowego akryloamidu lub ze sposobu, w jaki wykonywane są pomiary AFM (np. kształt końcówki AFM). Wreszcie, przedstawione tutaj podejście opiera się na wysiewaniu komórek gospodarza na matrycach 2D, które mogą różnić się od bardziej realistycznego i fizjologicznie istotnego scenariusza 3D. Jednak wytwarzanie żeli 3D o regulowanej sztywności, zasiewanie ich komórkami gospodarza, a następnie infekowanie ich patogenami, nadal wiąże się z pewnymi trudnościami technicznymi. Niemniej jednak przewidujemy, że w niedalekiej przyszłości będziemy w stanie rozszerzyć obecny test do badania infekcji w warunkach 3D.

Podsumowując, opisany protokół wraz ze wstępnymi wynikami dostarczają dowodów na to, że ten nowatorski test może stać się niezwykle użytecznym narzędziem do badania infekcji przylegających komórek gospodarza bakteriami chorobotwórczymi w sposób ilościowy i w znacznie bardziej fizjologicznie istotnym środowisku niż dotychczas badane. Moc wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych w proponowanej konfiguracji polega na tym, że test jest kompatybilny z wydajnością wielu technik, takich jak cytometria przepływowa, barwienie immunologiczne, a następnie mikroskopia świetlna i mikroskopia sił trakcyjnych. Test może być wykorzystany do badań obejmujących zakażenie różnymi przylegającymi typami komórek gospodarza przez patogeny, co, jak przewidujemy, będzie miało znaczący wpływ zarówno na rozwikłanie strategii, za pomocą których patogeny infekują gospodarzy, jak i na ułatwienie opracowania interwencji terapeutycznych przeciwko infekcjom.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Nasze podziękowania dla M. Footera, R. Lamasona, M. Rengaranjana i członków Theriot Lab za ich dyskusje i eksperymentalne wsparcie. Praca ta była wspierana przez NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam Fellowship for Advanced Study (F.E.O.), Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.), American Heart Association (E.E.B.), NIH 1R01HL128630 (RS) i NIH 1R01HL130840 (RS). Cytometrię przepływową wykonano w Stanford Shared FACS Facility.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Granulki wodorotlenku soduFisherS318-500
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigmaA3648
25% aldehyd gluterowySigmaG6257-100ML
40% akryloamidSigmaA4058-100ML
Roztwór bis-akrylamidu (2% w/v)Fisher ScientificBP1404-250
Fluorosfery mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,1 μ m, żółto-zielony fluorescencyjny (505/515)InvitrogenF8803
Nadsiarczan amonuFisherBP17925
TEMEDSigmaT9281-25ML
Sulfo-SANPAHProteochemc1111-100mg
Kolagen, Typ I Roztwór ze szczuraSigmaC3867-1VL
Dimetylosulfotlenek (DMSO)J.T. Baker9224-01
HEPES, Wolny kwasJ.T. Baker4018-04
Pożywka L-15 Leibovitza, bez czerwieni fenolowejThermofischer21083027
MCDB 131 Podłoże, bez glutaminyTechnologie życia10372019
Fundacja Płodowa surowica bydlęca, Partia: A37C48AGemini Bio-Prod900108 500ml
Naskórkowy czynnik wzrostu, EGFSigmaE9644
HydrokortyzonSigmaH0888
L-Glutamina 200mMFisherSH3003401
DPBS 1XFisherSH30028FS
Siarczan gentamycynyMP biomedicals194530
CloramphenicolSigmaC0378-5G
DifcoTM Agar, granulowanyBD214530
BBL TM Napar mózgowo-sercowyBD211059
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg/ul roztwór w wodzieInvitrogenH3570
Formaldehyd 16% klasy EMMikroskopia elektronowa15710-S Przeciwciało
anty-Listeria monocytogenesAbcamab35132
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) drugorzędowe, Alexa Fluor® 546 koniugatThermofischerA-11035
0,25% trypsyna-EDTA, czerwień fenolowaThermofischer25200056
KOLAGENAZA Z CLOSTRIDIUM HISTOLITICSigmaC8051
Siarczan streptomycynyFisher Scientific3810-74-0
SacharozaCalbiochem8510
DodecylosiarczansoduThermofischer28364
MES proszekSigmaM3885
KClJ.T. Baker3040-05
MgCl2J.T. Baker2444-1
EGTAAcros40991
Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
12 mm szkło okrągłe Szkiełka nakrywkoweFisherbrand12-545-81Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 10 mm | Niepowlekane
szklane płytki 24-dołkoweMattekP24G-1.5-13-F
5 ml probówki polistyrenowe z 35 μ Nasadka z filtrem siatkowym M Kolby Falcon352235
T-25Falcon353118
50 ml probówki stożkoweFalcon352070
Probówki stożkowe 15 mlJednorazowe
(1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)Pipety357551
PasteurVWR14672-380
Końcówki do pipet (1-200 μ l, 101-1000 μ l)DenvilleP1122, P1126
Bezpudrowe rękawice diagnostyczneMicroflexXC-310
Kuwety bakterieSarstedt67.746
Maszynki do goleniaVWR55411-050
Igła strzykawkowaBD305167
Butelki sterylizujące 0,2umThermo Scientific566-0020
20 ml strzykawkiBD302830
Filtry 0,2umThermo Scientific723-2520
drewniane patyczkiGrainger42181501
Saran wrapSanta Cruz Biotechnologiessc-3687
Płytki bakterieFalcon351029
Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Kaptur do hodowli tkankowychBakerSG504
HemacytometrSigmaZ359629
Inkubator bakteriiThermo ScientificIGS180
Inkubator do kultur tkankowychNuAireNU-8700
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny Nikon Diaphot 200NikonNIKON-DIAPHOT-200
Inkubator klatkowyHaisonNiestandardowy
analizator Scanford FACScan Stanford i Cytek zmodernizowali niestandardowy
przyrząd do pipetPipetory Drummond4-000-110
(10 μ l, 200 μ l, 1000ul)pH-metr GilsonF144802, F123601, F123602
Kleszczedo 30019028Mettler Toledo
FST11000-12
Kolba 1 LFisherbrandFB5011000 
AutoklawAmsco3021
Płyta magnetyczna z mieszadłemBellco7760-06000
Mieszadła magnetyczneBellco1975-00100
SpektrofotometrBeckmanDU 640
Analizator Scanford FACScanCytek BiosciencesCustom Stanford i Cytek zmodernizowany FACScan
< strong>Software
Microscope Software (μ Menedżer)Open Imaging
Matlab Matlab Inc
FlowjoFlowJo, LLC
Oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu, CellChttps://sites.google.com/site/cellcsoftware/Oprogramowanie jest dostępne bezpłatnie. Pliki wykonywalne i kody źródłowe MATLAB można uzyskać pod adresem https://sites.google.com/site/cellcsoftware/
pipety serologiczne Falcon 352196 szklane Falcon FACScan

Bibliografia

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001(2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603(2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005(2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112(2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889(2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978(2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717(2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632(2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hydro ele poliakrylamidowecytometria przep ywowamikroskopia si trakcyjnychbiomechanika interakcji gospodarz patogenkom rki r db onkamikroskopia z immunobarwieniemListeria monocytogenes

Powiązane artykuły