Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Podsumowanie

Obecnie, barwienie immunofluorescencyjne na stałych komórkach jest metodą wyboru do określania poziomów ekspresji białek, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przewiduje alternatywną metodę immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie.

Streszczenie

Barwienie immunofluorescencyjne jest obecnie metodą z wyboru do określania poziomów ekspresji białek w systemach hodowli komórkowych, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół barwienia immunocytochemicznego na blokach komórkowych zatopionych w parafinie jest doskonałą alternatywą dla barwienia immunofluorescencyjnego na niezatopionych w parafinie komórkach stałych. W tym protokole przygotowano blok komórek parafinowych z komórek HeLa metodą tromboplastyny-osocza, a także przeprowadzono immunocytochemię w celu oceny dwóch markerów proliferacji, CKAP2 i Ki-67. Jądra i morfologia cytoplazmatyczna komórek HeLa były dobrze zachowane w szkiełkach bloków komórkowych. W tym samym czasie wzorce barwienia CKAP2 i Ki-67 w immunocytochemii były dość podobne do tych w barwieniu immunohistochemicznym w tkankach raka parafinowego. Dzięki zmodyfikowanym warunkom hodowli komórkowej, w tym wstępnej inkubacji komórek HeLa w warunkach wolnych od surowicy, efekt można ocenić przy jednoczesnym zachowaniu informacji architektonicznych. Podsumowując, immunocytochemia bloków komórkowych zatopionych w parafinie jest doskonałą alternatywą dla barwienia immunofluorescencyjnego.

Wprowadzenie

W większości laboratoriów, bloki komórkowe z zatopioną parafiną nie są powszechnie używane. Raczej utrwalone komórki hodowlane, a nie komórki zanurzone w parafinie, są stosowane w badaniach lokalizacji subkomórkowej. W przypadku tych utrwalonych komórek hodowlanych zastosowano fluorescencję zamiast chromogenu. Dlatego barwienie immunofluorescencyjne jest obecnie metodą z wyboru do oznaczania poziomów ekspresji białek w badaniach z wykorzystaniem kultur komórkowych¹. Preparaty przygotowane do barwienia immunofluorescencyjnego można jednak obserwować tylko pod mikroskopią immunofluorescencyjną, która może pokazywać obrazy zupełnie inne niż te wskazane pod mikroskopią płaską². Dodatkowo, zachowanie szkiełek do barwienia immunofluorescencyjnego wymaga ochrony przed jasnym światłem, a sygnały fluorescencyjne stają się słabsze przy wielokrotnej ekspozycji do obrazowania z powodu utraty sygnału fluorescencyjnego³. Wyniki immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie są dość podobne do tych z immunohistochemii na tkankach osadzonych w parafinie⁴ i można je łatwo przełożyć na informacje kliniczne. Dlatego immunocytochemia może być doskonałą alternatywą. Jednak preparacja bloków komórkowych nie była popularna w podstawowych laboratoriach badawczych. W niniejszym protokole przewidziano zatem przygotowanie bloku komórkowego i barwienie immunocytochemiczne w celu promowania stosowania tej metody w dziedzinie badań nad kulturami komórkowymi.

Przygotowanie bloków komórkowych i immunocytochemia nie są unikalnymi metodami, a już zostały zastosowane od diagnozy klinicznej do badań podstawowych^4,5. Chociaż opisano różne metody przygotowania bloków komórkowych^4,6 metoda tromboplastyny plazmowej jest prosta, opłacalna i łatwa do dostosowania. W związku z tym, w protokole przedstawionym w tym artykule, metoda tromboplastyny-osocza^4,5,6,7,8 jest używany do przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie.

W niniejszym badaniu zademonstrowano szczegółowe procedury przygotowania bloków komórek tromboplastynowo-plazmatycznych oraz metodę immunocytochemiczną wykorzystującą dwa markery proliferacji. Jednym z markerów jest białko 2 związane z cytoszkieletem (CKAP2), które zostało niedawno zgłoszone jako marker mitotyczny^9,10,11; drugi to Ki-67, który jest najbardziej znanym markerem proliferacji¹². Reprezentatywny schemat jest pokazany w Rysunek 1.

Protokół

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board of National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630).

1. Przygotowanie próbki (30 min)

1. Do hodowli komórek HeLa (CCL-2, ATCC) należy użyć 10 ml kompletnej pożywki DMEM (10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% paciorkowca pen) w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm. Aby przygotować komórki HeLa pozbawione surowicy, inkubuj zlewające się komórki HeLa w DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej przez 48 godzin, jak opisano w poprzednim badaniu¹¹.
2. Aby odłączyć komórki, przemyj je 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodaj 2 ml 0,25% trypsyny EDTA na 100 mm naczynie hodowlane. Następnie inkubować przez 2-3 minuty w inkubatorze CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
3. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki DMEM do naczynia hodowlanego, aby dezaktywować trypsynę, i przenieś oderwane komórki do probówki o pojemności 15 ml. Następnie odwiruj komórki o sile 300 x g przez 10 minut, aby uzyskać osad.
4. Usunąć sklarowany osad i przemyć osad dwukrotnie 2 ml zimnego PBS przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut.
5. Po usunięciu supernatantu dodać 1 ml 95% etanolu do osadu komórkowego i wymieszać osad komórkowy z etanolem przez wirowanie. Utrzymuj utrwalone komórki na lodzie do czasu przygotowania bloku komórkowego.

2. Przygotowanie bloku komórkowego (1 h 30 min)

1. W celu przygotowania zamrożonych porcji osocza, należy pobrać osocze EDTA ze zdrowej krwi dawcy i odwirować przy 13 000 x g przez 10 minut. Zebrać osocze sklarowanego osadu i podwielokrotność po 200 - 400 μl do probówek do mikrodymki. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Gdy zamrożone porcje osocza są gotowe, pobrać je i rozmrozić osocze przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
2. Odwirować utrwalone komórki o sile 700 x g przez 10 minut, a następnie odrzucić supernatant.
3. Wymieszaj osad komórkowy z 2 kroplami (około 200 μl) osocza, 2 kroplami tromboplastyny i 2 kroplami 0,025 M chlorku wapnia. Następnie wymieszaj je pipetując.
4. Pozwól mieszaninie utworzyć skrzep komórkowy w temperaturze pokojowej przez 10 minut, jak pokazano na Rysunek 2A. Następnie przemyj skrzep komórkowy PBS dwa razy, wlewając i usuwając PBS za pomocą pipety. Reprezentatywny skrzep białych krwinek jest pokazany w Rysunek 2B.
5. Zwilż kawałek bibuły filtracyjnej formaliną i owiń skrzep komórkowy wstępnie zwilżoną bibułą filtracyjną. Następnie umieść zakrzepłą mieszaninę za pomocą pincette w kasecie na tkanki, jak pokazano na rysunku Rysunek 2C.
6. Umieścić kasetę z tkankami w szklanym słoiku zawierającym 50 ml buforowanej formaliny (10% formaliny w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia formaliny.

3. Przetwarzanie tkanek i osadzanie parafiny (w nocy)

1. Załaduj na noc kasetę z tkankami zawierającą skrzep komórkowy utrwalony w formalinie do procesora tkanek, jak opisano wcześniej¹¹. Przetwarzanie tkanek ma na celu usunięcie wody i kondycjonowanie utrwalonych komórek przed zatopieniem parafiny. W przypadku badań bez przetwarzania tkanek należy przeprowadzić procedurę przetwarzania tkanek zgodnie z ilustracją w Tabeli 1.
2. Włącz podgrzewaną stację zatapiania, a 60 minut później sprawdź, czy w metalowej formie znajduje się stopiona parafina (Rysunek 2D).
3. Weź uformowany skrzep komórkowy z kasety na tkanki i umieść go w stopionej parafinie w metalowej formie.
4. Umieść nową kasetę na chusteczki bez pokrywki w metalowej formie zawierającej skrzep komórkowy w środku stopionej parafiny i wlej więcej stopionej parafiny do kasety na tkanki i na metalową formę. Następnie pozwól parafinie zestalić się na zimnej płycie przez 30 - 60 sekund.
5. Oddziel kasetę na chusteczki higieniczne od metalowej formy. Następnie blok komórki parafinowej jest gotowy do immunocytochemii. Skrzep komórkowy osadzony w bloku komórkowym zatopionym w parafinie jest oznaczony strzałką w Rysunek 2E.

4. Przygotowanie preparatów do immunocytochemii (1 h)

1. Sprawdzić obszar skrzepu komórkowego w bloku komórki parafinowej i pokroić blok komórki na plastry o grubości 3 - 4 μm za pomocą mikrotomu. Umieść skrawki parafiny na szkiełkach pokrytych silanem, jak pokazano na Rysunek 2F.
2. Umieść szkiełka w piekarniku o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby sekcje przylegały do szkiełek.

5. Immunocytochemia bloków komórkowych (6 h)

UWAGA: Do barwienia immunocytochemicznego na odcinkach bloku komórkowego można użyć różnych zestawów (zobacz Tabelę Materiałów). Wszystkie takie zestawy mają różną czułość i specyfikę w zależności od ich modyfikacji.

1. Inkubować skrawki w 50 ml ksylenu przez 4 minuty w celu odparafinowania.
2. Inkubuj szkiełka w 100% etanolu przez 2 minuty w celu odwodnienia, a następnie dwa razy w 95% etanolu i w 80% etanolu przez 2 minuty. Następnie usuń etanol z bieżącej wody na 10 minut.
3. W celu pobrania antygenu umieść szkiełka w słoiku zawierającym 40 ml buforu do pobierania Tris-EDTA, pH 9,0 i gotuj w szybkowarze przez 30 minut.
4. Umyć szkiełka pod bieżącą wodą i inkubować je w 95% etanolu przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie zaznacz obszar barwienia komórek na szkiełkach pisakiem Pap, aby ułatwić identyfikację.
5. Umyć szkiełka w soli fizjologicznej buforowanej trisem zawierającej 0,2% Tween 20 (TBS-T) i inkubować w bloku nadtlenku wodoru (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby usunąć pozostałości aktywności peroksydazy. Następnie umyj szkiełka w TBS-T trzy razy po 2 minuty każde.
6. Przygotować rozcieńczony roztwór przeciwciała, rozcieńczając przeciwciało pierwszorzędowe w bloku białkowym (patrz tabela materiałów). Na przykład przeciwciało pierwszorzędowe CKAP2 można rozcieńczyć w stosunku 1:100, a przeciwciało Ki-67 w stosunku 1:500. Następnie inkubować szkiełka w 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał przez 1 godzinę.
7. Po umyciu w TBS-T pięć razy przez 2 minuty każde, inkubować szkiełka w głównym wzmacniaczu przeciwciał w zestawie przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
8. Po przemyciu w TBS-T czterokrotnie przez 2 minuty każde, dodać 2 krople polimeru HRP (przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową) i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 min.
9. Po pięciokrotnym umyciu w TBS-T przez 2 minuty każde, dodać 100 μl roztworu diaminobenzydyny (DAB) (patrz tabela materiałów) i inkubować szkiełka przez 3 minuty.
10. Po dwukrotnym umyciu w TBS-T dodać 100 μl roztworu Hematoksyliny (mieszanina 100 μL Hematoksyliny i 600 μL wody destylowanej) i inkubować szkiełka przez 1 min.
11. Po jednokrotnym umyciu szkiełek w TBS-T odwodnić się, inkubując w 95% etanolu przez 2 minuty, zanurzając raz w 95% etanolu i dwukrotnie zanurzając w 100% etanolu. Następnie inkubuj szkiełka w 40 ml ksylenu w szklanym słoiku przez 5 minut.
12. Gdy szkiełka wyschną z ksylenu, zamontuj odpowiednie szkiełka nakrywkowe.
13. Obserwuj wzory barwienia za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wyniki

Na szkiełku barwionym hematoksyliną i eozyną z bloku komórkowego zatopionego w parafinie (Rysunek 3A,B), większość jąder i cytoplazmy komórek jest nienaruszona, co sugeruje, że zachowanie morfologiczne jest doskonałe przy obecnym protokole (Rysunek 3A). W barwieniu immunocytochemicznym dodatnie barwienie CKAP2 zaobserwowano w skondensowanej chromatynie, wrzecionie mitotycznym i cytoplazmie (Rysunek 4), jak wcześniej podano¹⁰. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano barwienie Ki-67 w jądrach komórkowych (Ryc. 4). Tylko komórki z barwieniem CKAP2 w skondensowanej chromatynie (patrz strzałki w Rysunek 4A, B) były komórkami mitotycznymi. Wiele komórek CKAP2-dodatnich wykazano w wysoce mitotycznych komórkach HeLa, które zostały przygotowane po inkubacji w kompletnym pożywce (Figura 4A). Dla porównania, w pozbawionych surowicy komórkach HeLa było niewiele komórek CKAP2-dodatnich (Figura 4B). Większość wysoce mitotycznych komórek HeLa była Ki-67 dodatnia (Figura 4C). W przeciwieństwie do tego, wskaźnik Ki-67-dodatni w komórkach HeLa pozbawionych surowicy utrzymywał się na poziomie ~50% (Ryc. 4D). Wyniki te są dość porównywalne z tymi z poprzedniego raportu^11, co sugeruje, że CKAP2 jest bardziej wiarygodnym markerem proliferacji w komórkach nowotworowych niż Ki-67.

W źle przygotowanych blokach komórkowych jądra są oddzielane od cytoplazmy, co również powoduje słabe zachowanie morfologiczne. Inkubacja stałych komórek w lodówce trwająca dłużej niż noc może spowodować tak słabe wyniki. Innym ważnym problemem jest to, że komórki nie są dobrze barwione przez immunocytochemię, pomimo doskonałej morfologii. Ten problem pojawia się częściej, gdy skrzep komórkowy jest mały. Zazwyczaj intensywność barwienia jest nieregularna, jak pokazano na Rysunek 3B; Ale gdy skrzep komórkowy jest większy, istnieje znacznie mniejsza szansa na nieregularne barwienie. Dlatego w tym protokole zwiększyliśmy objętość osocza, tromboplastyny i chlorku wapnia, aby utworzyć duży skrzep komórkowy.

Rysunek 1: Schemat przygotowania bloku komórkowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ilustracja przedstawiająca przygotowanie bloku parafinowego. (A) Skrzep komórek tromboplastyny-plazmatyny w probówce. (B) Skrzep komórek TP po myciu PBS. (C) Skrzep komórkowy na zwilżonej bibule filtracyjnej. (D) Stacja zatapiania tkanek ze stopionym woskiem. Metalowa forma (strzałka) utrzymuje stopiony wosk do zestalenia. (E) Skrzep komórkowy zatopiony w parafinie (strzałka) osadzony w parafinie lub bloku komórkowym zatopionym w parafinie. (F) Cienki przekrój parafiny na środkowej części powlekanego szkiełka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Przygotowanie bloku komórkowego i potwierdzenie jakości za pomocą hematoksyliny i eozyny oraz barwienia immunologicznego. (A) Barwiony hematoksyliną i eozyną obraz komórek HeLa w zatopionym w parafinie skrawku komórkowym. (B) Nieregularne barwienie Ki-67 w immunocytochemii na źle przygotowanym fragmencie bloku komórkowego zatopionym w parafinie. Podziałka skali to (A) 100 i (B) 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Barwienie immunocytochemiczne na bloku komórkowym zatopionym w parafinie dla komórek HeLa. (A) Barwienie CKAP2 w warunkach wysoce mitotycznych. (B) Barwienie CKAP2 w warunkach niedoboru surowicy. (C) Barwienie Ki-67 w warunkach wysoce mitotycznych. (D) Barwienie Ki-67 w warunkach głodu surowicy. Pokazane są paski skali 100 μm. Groty strzałek wskazują komórki CKAP2-dodatnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

procedura	Kroki	rozwiązanie	Czas/Temperatura
Odwodnienie	1	70% alkoholu	15 min/obr.
	cyfra arabska	80% alkoholu	15 min/obr.
	3	95% alkoholu	15 min/obr.
	4	100% alkoholu	15 min/obr.
Czyszczenie	1	ksylen	60 min/4 °C
	cyfra arabska	ksylen	10 min/obr
	3	ksylen	10 min/obr
	4	ksylen	10 min/obr
*RT, temperatura pokojowa

Tabela 1. Procedura przetwarzania tkanek.

Dyskusja

Barwienie immunofluorescencyjne na utrwalonych hodowanych komórkach jest obecnie metodą z wyboru do oznaczania poziomu ekspresji białek w komórkach przy jednoczesnym zachowaniu informacji morfologicznej¹. Jednak immunocytochemia na blokach komórkowych zatopionych w parafinie może być doskonałą alternatywą. Szczegółowe procedury przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie oraz immunocytochemii zostały opisane w niniejszym protokole i mamy nadzieję, że ułatwi on zastosowanie immunocytochemii w badaniach komórkowych.

Immunocytochemia ma kilka zalet w porównaniu z barwieniem immunofluorescencyjnym. Barwienie immunofluorescencyjne komórek zwykle wymaga świeżo wyhodowanych komórek, ale bloki komórek parafinowych można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka lat¹³. Ponadto immunocytochemia na blokach komórkowych może badać wewnątrzkomórkowe wzorce ekspresji, wykorzystując to samo przeciwciało, które jest używane w rutynowej immunohistochemii na tkankach ludzkich⁴. Co więcej, może badać zmiany w poziomach białek lub modyfikacje potranslacyjne poprzez wstępną inkubację komórek z różnymi lekami lub w różnych warunkach hodowli¹¹.

W przeciwieństwie do zalet barwienia immunocytochemicznego, przygotowanie bloków komórkowych zatopionych w parafinie jest czasochłonne i kosztowne¹⁴. Ponadto większość laboratoriów badawczych nie ma doświadczenia w tej technice, a błędy techniczne w takich okolicznościach są powszechne. Najczęstszymi błędami są słabe zachowanie morfologii komórek oraz słabe lub nieregularne barwienie immunocytochemiczne na skrawkach bloku komórkowego parafiny. Tych i większości innych można uniknąć, tworząc bloki komórkowe w najlepszych warunkach komórkowych i używając wystarczającej ilości roztworu do utworzenia skrzepów komórkowych.

Jako demonstrację obecnego protokołu, przygotowano bloki komórkowe dla komórek HeLa, a następnie przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne dla dwóch markerów proliferacji, CKAP2 i Ki-67, jak wcześniej informowano¹¹. Do celów immunocytochemicznych manipulowano komórkami przez inkubację w pożywce z płodową surowicą bydlęcą i bez niej, i można było zaobserwować efekt głodu surowicy. Te przygotowane bloki komórkowe zatopione w parafinie mogą być stosowane do dużej liczby przeciwciał, ponieważ wiele szkiełek można przygotować z bloku komórkowego przy użyciu tylko sekcji bloku komórkowego o grubości 4 - 5 μm na szkiełko. W związku z tym wzorce ekspresji odpowiadające dwóm różnym warunkom można ocenić za pomocą kilku różnych przeciwciał. Wzorce barwienia immunologicznego dla CKAP2 i Ki-67 w tkankach nowotworowych zostały już opisane 9,10,11,12, a wyniki barwienia immunocytochemicznego można było łatwo ocenić, ponieważ wzorce barwienia były dość podobne do tych z immunohistochemii.

Podsumowując, barwienie immunocytochemiczne na blokach komórek parafinowych może być doskonałą alternatywą dla barwienia immunofluorescencyjnego; Co więcej, można go łatwo i niezawodnie wykorzystać w badaniach podstawowych do profilowania ekspresji w liniach komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu informacji morfologicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki HeLa	ATCC	HeLa (ATCC  CCL-2)
Przeciwciało Ki-67	Thermo Fisher Scientific	RM-9106-S1
Parafina	Leica	39601006
Xylene	Fisher SCientific	1330-20-7,100-41-4
Ethenol	GD Chem	DJ16016
Hematoxylin	Agilent	10118581
DAB Quanto Kit	Thermo Fisher Naukowy	zestaw detekcji LP TA-125-QHDX, QHCX 170405
Ultravision Thermo	Fisher Scientific	PBQ141209, LPB141209, LPH141210	Zestaw do immunocytochemii; zawiera blok białkowy
TintoRetriever Szybkowar	Bio SB Corporation	BSB 7008
Sól fizjologiczna buforowana trisem	iNtRON Biotechnology	IBS-BT008
Tween 20	USB Corporation	115106
Tromboplastyna	Neoplastyna Cl Plus	NC0591432
Tris-EDTA Retrival Bufor	Dignostic Biosystem	E625-A
Trypsyna EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Płodu  surowica bydlęca (FBS)	Hyclone Laboratories Inc	SH30910.03
DMEM	Hyclone Laboratories Inc	SH30243.01
Antybiotyk-Antybiotyk, 100X	Thermo Fisher Scientific	15240062
Ultra vision blok nadtlenkowy H2O2	Thermo Fisher Scientific	02Q141212
Medium montażowe	Thermo Fisher Scientific	363313
Pap-Pen	Vector Laboratories	H-4000
	GE Healthcare Life Sciences	1001-0155
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	21115-100ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	PAA Laboratories	H21-002
Formalina	Daejung	50-00-0
Probówka 15 ml	SPL Life Sciences	50015
kaseta do przetwarzania tkanek	Simport	M492-5
Naczynia hodowlane 100 mm	BD Biosciences	08-772E
Szkiełko szklane	Muto Pure Chemicals	140712
Szkło nakrywkowe	Marienfeld	2262817
Glass Zar	Hyunil Lab-Mate	HIP-1027
Wirówka	Eppendorf	5810R
Okap laminarny klasy II	Termo Fisher Scientific	1300 seria A2
Inkubator CO2	Thermo Fisher Scientific	Series A2
Procesor tkanek	Leica BioSystem	TP1020
Microtome	Thermo Fisher Scientific	HM340E
Mikroskop	Olympus	CX-21
Stacja do zatapiania parafiny	Thermo Fisher Scientific	EC 350-1, EC 350-2
Kąpiel w sekcji tkanek (okrągła)	CellPath	HCP-JAW-0100-00AEU
Wyciąg	Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd.	FH-150