Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Podsumowanie

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Streszczenie

Pomimo obecnych postępów w leczeniu ludzkiego raka jelita grubego (CRC), niewiele radykalnych terapii jest skutecznych w późnych stadiach raka jelita grubego. Aby sprostać temu wyzwaniu klinicznemu, jako modele przedkliniczne opracowano mysie modele ksenoprzeszczepu nowotworowego przy użyciu od dawna znanych linii komórkowych ludzkiego raka oraz wiele transgenicznych modeli myszy z nowotworami. Częściowo naśladują one cechy ludzkich nowotworów, ale często nie oddają kluczowych aspektów nowotworów złośliwych u ludzi, w tym inwazji i przerzutów. W związku z tym od dawna oczekiwano alternatywnych modeli, które lepiej reprezentują złośliwą progresję raka jelita grubego u ludzi.

Pokazujemy tutaj generowanie ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDX) poprzez podskórne wszczepienie małych fragmentów CRC chirurgicznie wypreparowanych od pacjenta. Rozwijają się PDX jelita grubego, które histopatologicznie przypominają CRC u pacjenta. Jednak niewiele spontanicznych mikroprzerzutów jest wykrywalnych w konwencjonalnych przekrojach dotkniętych odległych narządów w modelu PDX. Aby ułatwić wykrycie rozsiewu przerzutów do odległych narządów, wyekstrahowaliśmy komórki organoidów nowotworowych z PDX okrężnicy w hodowli i zainfekowaliśmy je lentiwirusem GFP przed wstrzyknięciem do myszy z wysokim niedoborem odporności NOD / Shi-scid IL2Rγ^null (NOG). Ortotopowo wstrzykiwane komórki organoidowe CRC pochodzące z PDX konsekwentnie tworzą pierwotne guzy dodatnie dla GFP u myszy biorców. Co więcej, spontanicznie rozwijające się kolonie mikroprzerzutowe wykazujące ekspresję GFP są wykrywane w płucach tych myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Co więcej, wstrzyknięcie organoidów CRC do śledziony często powoduje kolonizację wątroby. Podsumowując, odkrycia te wskazują, że komórki organoidowe CRC pochodzące z PDX znakowane GFP są wizualnie wykrywalne podczas wieloetapowego procesu zwanego kaskadą inwazji-przerzutów. Opisane protokoły obejmują ustanowienie PDX ludzkiego CRC i hodowlę 3D odpowiednich komórek organoidowych CRC transdukowanych przez cząstki lentiwirusa GFP.

Wprowadzenie

Rak jelita grubego (CRC) jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka na świecie¹. Niewystarczająca odpowiedź na konwencjonalne terapie pacjentów w zaawansowanym stadium choroby wskazuje na nieskuteczność prób radykalnego wyleczenia raka jelita grubego. Aby opracować skuteczniejsze podejścia terapeutyczne, stworzono różne przedkliniczne mysie modele raka, które naśladują cechy raka jelita grubego. Różne linie komórkowe CRC są szeroko stosowane do generowania ksenoprzeszczepów nowotworowych ze względu na ich wygodę i łatwość manipulacji. Jednak długotrwała hodowla linii komórek nowotworowych często powoduje selekcję unikalnych populacji komórek, które są dość proliferacyjne w określonych warunkach hodowli, co skutkuje niewiarygodnymi wynikami i kluczowymi ograniczeniami w przedklinicznym opracowywaniu leków.

Bez hodowli in vitro, ksenoprzeszczepy nowotworowe (PDX) pochodzące od pacjentów zostały również wygenerowane przez implantację do zwierzęcych modeli ludzkich tkanek CRC chirurgicznie wypreparowanych od pacjentów^2,3,4. PDX są powszechnie uznawane za rekapitulację głównych cech histopatologicznych i zmian genetycznych pierwotnie obecnych w guzach pacjentów, od których pochodzą. Co więcej, organoidy nowotworowe pochodzące od pacjenta, składające się z klastrów komórek nowotworowych, zostały stworzone przez hodowlę w warunkach 3D, które ściśle naśladowały właściwości biologiczne oryginalnych guzów^5,6. Te organoidy nowotworowe zostały również zastosowane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, umożliwiając w ten sposób zaprojektowanie spersonalizowanych terapii⁵. Zakłada się jednak, że w masie guza występują wyraźnie heterogenne populacje CRC. Poszczególne populacje CRC mogą selektywnie namnażać się i rozszerzać podczas serii pasaży in vivo i in vitro odpowiednio PDX i organoidów nowotworowych. Może to również pozwolić na zmianę ogólnych profili ekspresji genów i statusu epi/genetycznego dotkniętych CRC, co skutkuje minimalnym podobieństwem do rodzicielskiego CRC.

Organoidy CRC pochodzące od pacjentów oraz te ekstrahowane z nienowotworowego ludzkiego jelita grubego, zmodyfikowane tak, aby zawierały kombinacje mutacji onkogennych, zostały również wykorzystane do zbadania cech charakterystycznych ludzkich komórek nowotworowych, których przykładem jest inwazja guza i przerzuty^6,7,8,9. Jednak bardzo niska częstość występowania spontanicznych przerzutów wynikających z ortotopowego wszczepienia raku jelita grubego pochodzącego od pacjenta myszom z niedoborem odporności utrudniła badanie wieloetapowego procesu kaskady inwazja-przerzuty, która obejmuje inwazję miejscową, wewnątrznaczynienie, transport w krwiobiegu, wynaczynienie i kolonizację odległych narządów^4,10. Mikroprzerzuty reprezentowane przez odkładanie się komórek nowotworowych o wielkości ≤2 mm, utworzone przez organoidy CRC pochodzące od pacjenta, były często pomijane w analizie histopatologicznej skrawków z odległych narządów dotkniętych chorobą w eksperymentalnych modelach mysich. Wizualizacja spontanicznych mikroprzerzutów była również minimalna in vivo ze względu na trudności w skutecznym wprowadzeniu markerów fluorescencyjnych do komórek organoidów nowotworowych przed ich wstrzyknięciem myszom biorcom. W tym badaniu opracowaliśmy protokół skutecznej transdukcji lentiwirusa GFP do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX w hodowli 3D przed wstrzyknięciem myszom biorcom i umożliwienia bardzo czułego wykrywania, za pomocą mikroskopii stereofluorescencyjnej, ich kolonizacji różnych narządów w celu utworzenia mikroprzerzutów.

Protokół

Pacjent wyraził pisemną świadomą zgodę i projekt został zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań Naukowych Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Juntendo. Eksperymenty na myszach zostały również zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań na Zwierzętach Wydziału Lekarskiego Juntendo.

1. Ustalenie CRC PDX u myszy z niedoborem odporności

Eksperymentalne procedury tworzenia CRC PDX (krok 1) są opisane w Rysunek 1A.

1. Przygotować pierwotną tkankę CRC natychmiast po chirurgicznym wycięciu guza od pacjenta.
2. Umyj pierwotną tkankę CRC przez delikatne mieszanie kilka razy w 30 ml lodowatej sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i trzymaj ją na lodzie.
3. Umieść tkankę na 10 cm szalce Petriego za pomocą sterylnej pęsety, usuń martwicze obszary tak dokładnie, jak to możliwe za pomocą sterylnych nożyczek i pokrój tkanki guza litego na małe kawałki (5 x 5 x 5 mm³ w rozmiarze) za pomocą sterylnych żyletek.
   UWAGA: Obszary martwicze są często bielsze, bardziej miękkie i kruche niż otaczające je obszary.
4. Umieść małe kawałki guza za pomocą sterylnej pęsety w 2 ml lodowatego sterylnego PBS na 6-dołkowej płytce.
5. Hoduj 6-tygodniowe myszy NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) z wysokim niedoborem odporności w warunkach wolnych od zarazków i specyficznych patogenów.
6. Znieczulić myszy inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania wziewnego dla małych zwierząt i zdezynfekować skórę 70% etanolem. Upewnij się, że oddychanie jest normalne i głębokie oraz że nie ma odruchu szczypania palców u nóg w celu prawidłowego znieczulenia. Maść weterynaryjna na oczy jest opcją, aby zapobiec suchości oka podczas znieczulenia.
7. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizacji suchym ciepłem, a następnie używaj tych narzędzi do wszystkich procedur, aby zapobiec infekcjom ran u myszy biorców.
8. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Wykonaj małe nacięcie w dolnej części prawego i lewego boku myszy biorcy, aby wygenerować kieszenie podskórne do implantacji tkanek za pomocą sterylnych nożyczek. Uważaj, aby nie przebić błony otrzewnej. Podczas tej procedury krwawienie powinno być niewielkie.
9. Delikatnie zanurz wyżej przygotowane fragmenty guza w 50 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie wszczep je w dolną część prawej i lewej kieszonki podskórnej.
10. Zszyj nacięcie klipsami do ran u myszy poddawanych zabiegom chirurgicznym. Upewnij się, że wszczepione tkanki nowotworowe znajdują się w pewnej odległości od nacięcia pod skórą.
    UWAGA: Zgodnie z minimalizacją zabiegów chirurgicznych, w tym badaniu nie stosowano leczenia bólu pooperacyjnego i infekcji.
11. Umieść mysz na ciepłej podkładce i utrzymuj pozycję leżącą mostka, aż do przywrócenia wystarczającej świadomości. Po całkowitym wyzdrowieniu i możliwości siedzenia na wszystkich czterech nogach, myszy mogą wrócić do swoich domowych klatek. Aby zapobiec drapieżnictwu, nie zezwalaj na rozmnażanie ze zwierzętami nieoperowanymi w tej samej klatce.
12. Sprawdź, czy nie ma wycieku szwów i upewnij się, że następnego dnia myszy są w stabilnym stanie w grupie leczonej chirurgicznie. Sprawdź myszy pod kątem oznak choroby i zmierz rozmiar guza u każdej myszy, raz w tygodniu, za pomocą suwmiarki.

2. Analiza CRC PDX od myszy

Eksperymentalne procedury preparacji CRC PDX (krok 2) są opisane w Rysunek 1B.

1. Pozwól guzowi urosnąć podskórnie do wielkości ~1^cm3, co zwykle trwa około 1-3 miesięcy.
2. Znieczulić mysz inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania wziewnego dla małych zwierząt i zdezynfekować skórę 70% etanolem.
3. Umieść mysz w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Naciąć skórę, odsłonić guz i ostrożnie oderwać skórę od guza za pomocą sterylnych nożyczek. Po usunięciu guza umieść go na 10 cm szalce Petriego i usuń wszelkie rażąco martwicze obszary z guza, a następnie spłucz dwukrotnie 5 ml PBS.
   UWAGA: Obszary martwicze są często bielsze, bardziej miękkie i kruche niż otaczające je obszary.
4. Umieść guz na lodzie i podziel go równo na co najmniej 4 części do różnych zastosowań, w tym 1) hodowli organoidów CRC, 2) przeszczepu do myszy wtórnych, 3) badania histologicznego oraz 4) zamrażania i przechowywania fragmentów guza.
   1. W celu wytworzenia organoidów CRC należy umieścić litą tkankę nowotworową na 6-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 1 ml sterylnego PBS. Trzymaj chusteczkę na lodzie do czasu przetworzenia (krok 3).
   2. Aby ustalić model PDX dla ludzkiego CRC, należy przenieść świeże CRC PDX do myszy wtórnej. Pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki (5 x 5 x 5 mm o rozmiarze³) za pomocą sterylnych żyletek i delikatnie zanurz te fragmenty tkanki w 50 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie wszczepij te fragmenty w dolną część prawej i lewej kieszonki podskórnej myszy NOG, jak opisano w kroku 1.8–1.11.
   3. Do analizy histologicznej należy umieścić próbki w 5 ml 10% obojętnej buforowanej formaliny w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
   4. W celu kriokonserwacji pokrój tkankę nowotworową na małe kawałki (5 x 5 x 5 mm³ w rozmiarze) i delikatnie zanurz próbki w 500 μl roztworu do zamrażania komórek w probówkach kriowialnych o pojemności 1–1,5 ml. Następnie przenieś probówkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C.

3. Ekstrakcja PDX do zawiesiny komórkowej w celu hodowli organoidów CRC

Eksperymentalne procedury dysocjacji CRC PDX (krok 3) są opisane w Rysunek 1B.

1. Umieść powyższe (krok 2.4.1) przygotowane fragmenty guza na 10 cm szalce Petriego.
2. Zmiel fragmenty za pomocą sterylnych żyletek i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS)-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 80 μl bulionu enzymatycznego kolagenazy (patrz tabela materiałów).
3. Zamknij szczelnie tubkę i owiń nakrętkę parafilmem, aby zapobiec wyciekowi. Aby zdysocjować zmielone fragmenty guza do zawiesiny komórkowej, należy ją delikatnie mieszać przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Należy pamiętać, że w probówce nadal pozostanie wiele fragmentów niestrawionej tkanki.
4. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Rozpuścić osad komórkowy za pomocą 10 ml 10% FCS-DMEM, aby uzyskać zawiesinę komórek.
5. Aby wyeliminować niestrawione resztki tkanek, należy dwukrotnie przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka komórkowego o wielkości 40 μm ustawionego na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Następnie odwirować przepływ przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i utrzymać osad na lodzie.

4. Wytwarzanie organoidów CRC hodowanych na sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej

Procedury eksperymentalne dla hodowli organoidów CRC PDX jelita grubego (krok 4) są opisane w Rysunek 1B.

1. Ustalić pożywkę odpowiednią dla organoidów CRC pochodzących z PDX (patrz Tabela materiałów, "pożywka do hodowli organoidów CRC") przy użyciu pożywek wcześniej opisanych dla organoidów jelita grubego u ludzi¹¹.
2. Nałożyć 150 μl sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej (patrz tabela materiałów) na studzienkę na 12-dołkową płytkę na lodzie, a następnie inkubować ją przez 30-60 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w celu zestalenia żeli.
3. Zawiesić osad komórkowy od kroku 3.5 za pomocą pożywki do hodowli organoidów CRC (od kroku 4.1) z 5% FCS, aby uzyskać dostosowanie do 3 x 10⁵ komórek/ml. Następnie wysiewać 1 ml pożywki na sztuczną płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową, przygotowaną w kroku 4.2. i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ . Użyj hemocytometru do zliczenia liczby komórek nowotworowych, w tym pojedynczych komórek i klastrów wielokomórkowych (grupa komórek przylegających) w zawiesinie komórki.
   UWAGA: 5% FCS służy do wygaszania resztkowej aktywności enzymatycznej kolagenazy w tym badaniu.
4. Następnego dnia ostrożnie zebrać pożywkę hodowlaną, w tym pływające komórki, które odłączyły się od sztucznej płytki pokrytej matrycą zewnątrzkomórkową, do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować ją przy 1 400 x g przez 5 minut. Następnie usunąć sklarat i ponownie zawiesić osad w 70 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
5. Aby zwiększyć żywotność komórek CRC, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na komórki organoidowe guza przyczepione do sztucznej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową i inkubuj przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w celu zestalenia sztucznej powłoki macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie inkubować go z 1 ml pożywki do hodowli komórek organoidowych CRC z 1% FCS w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO_{2 .}
6. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Ponieważ organoidy CRC wypełniają pożywkę, może okazać się konieczna codzienna zmiana pożywki.

5. Wytwarzanie i wzbogacanie cząstek lentiwirusowych GFP

Eksperymentalne procedury generowania i wzbogacania cząstek lentiwirusa GFP (krok 5) są opisane w Rysunek 1C.

1. Hodowla HEK293T komórek za pomocą pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 10% FCS i przygotowanie sześciu 10-centymetrowych szalek (2 x 10⁶ komórek na szalkę) do następnej procedury transfekcji.
2. Do transfekcji na danie przygotuj 500 μl mieszaniny, w tym 20 μl odczynnika do transfekcji w DMEM z wektorem PRRL-GFP (5 μg)¹² i dwoma plazmidami lentiwirusowymi, takimi jak pCMV-VSV-G (1 μg) i pCMV-dR8,2 dvpr (5 μg), w sterylnej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie nałóż ją na każdą z 10-centymetrowych szalek i inkubuj je przez 18 godzin.
3. Usuń pożywkę, dodaj 5 ml świeżej pożywki 10% FCS-RPMI 1640 do każdego dania i odstaw na 24 godziny.
4. Zebrać kondycjonowaną pożywkę z każdej pożywki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać łącznie 30 ml pożywki w temperaturze 4 °C przez noc. Dodaj 5 ml świeżego RPMI 1640 do każdego naczynia i odstaw na 24 godziny.
5. Zebrać kondycjonowaną pożywkę z każdego naczynia do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać łącznie 30 ml pożywki na lodzie. Następnie wyrzuć komórki.
6. Przefiltrować 60 ml pożywki (od kroku 5.4–5.5) przez filtr 0,45 μm, aby usunąć komórki i podzielić tę ilość na dwanaście probówek wirówek polipropylenowych o pojemności 5 ml do ultrawirowania.
7. W celu zagęszczenia wirusa należy je odwirować za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego (patrz tabela materiałów) przy 85,327 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
8. Natychmiast usuń podłoże. W celu rozpuszczenia zagęszczonego wirusa należy umieścić 250 μl pożywki z mieszanki szynki F-12 (F12)/DMEM bez FCS w każdej z dwunastu probówek i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C przez noc. Należy pamiętać, że osad wirusa jest często niewidoczny.
9. Delikatnie odpipetować pożywkę, aby zebrać 3 ml stężonego 5 razy więcej lentiwirusa GFP, w sumie, przypuszczalnie zawierając cząstki lentiwirusa GFP z 10⁸ jednostkami transdukcyjnymi na ml (TU/ml). Następnie należy przechowywać dwanaście mikroprobówek o pojemności 1,5 ml (w tym 250 μl na probówkę) w sterylnych warunkach w temperaturze -80 °C przez okres do roku. Przygotuj wiele małych porcji oryginalnego roztworu, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

6. Znakowanie komórek organoidowych CRC cząstkami lentiwirusa GFP hodowanymi na sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej

Eksperymentalne procedury znakowania komórek organoidowych CRC lentiwirusem GFP (krok 6) są opisane w Rysunek 1C.

1. Pozwól organoidom CRC przygotowanym w kroku 4.6 rosnąć bez zakłóceń przez 7–10 dni i zbierz je mechanicznie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek, a następnie przenieś do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Wzrost organoidów CRC w hodowli zależy od charakteru pierwotnych guzów od pacjentów. Unikaj nadmiernego wzrostu organoidów CRC, utrzymując je na poziomie 60-70% zbiegu przed przeniesieniem w stosunku 1:2 na nową sztuczną 12-dołkową płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową.
2. Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g, usunąć pożywkę hodowlaną i rozpuścić osad komórkowy w 500 μl PBS przez delikatne stukanie.
3. Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g i wyeliminować PBS.
4. Aby oddzielić przylegające organoidy CRC, dodaj 500 μl roztworu enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych do oddzielania komórek do osadu komórkowego w probówce i wymieszaj go, delikatnie stukając. Następnie pozostaw probówki na 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Bardzo delikatnie odpipetować zawiesinę komórek dodatkowymi 500 μl 1% FCS-DMEM kilka razy w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, aby z grubsza zdysocjować komórki. Wytwarzanie pojedynczych komórek z organoidów CRC przez ostre pipetowanie znacznie zmniejsza żywotność komórek. W związku z tym ważne jest, aby masa komórek była wizualnie wykrywalna w zawiesinie komórek poprzez bardzo delikatne pipetowanie do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
6. Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy sile 1 400 x g i usunąć supernatant.
7. Rozpuścić osad komórkowy mieszaniną 100 μl 5x lentiwirusa GFP (>10,⁸ TU/ml) i 400 μl pożywki do hodowli organoidów CRC w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, delikatnie stukając, aby dostosować do stężenia 5 x 10⁵ zdysocjowanych komórek nowotworowych na 500 μl. Użyj hemocytometru do zliczenia liczby komórek nowotworowych, Włączenie pojedynczych komórek i grup komórek do zawiesiny komórek, jak opisano powyżej (krok 4.3).
8. Przygotować sztuczną płytkę 12-dołkową pokrytą matrycą zewnątrzkomórkową, zgodnie z opisem w kroku 4.2. Następnie umieścić 500 μl zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 6.7 na płytce i pozostawić na 18 godzin w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ .
9. Zebrać pożywkę z pływającymi komórkami odłączonymi od sztucznej płytki pokrytej matrycą zewnątrzkomórkową do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować go przy 1 400 x g, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 70 μl sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
10. Aby zwiększyć żywotność komórek CRC, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na organoidy nowotworowe przyczepione do 12-dołkowej płytki pokrytej sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową, jak opisano w kroku 4.5. Następnie inkubować płytkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w celu zestalenia powłoki sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie hodować ją z 1 ml pożywki do hodowli organoidów CRC z 1% FCS w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO_{2 .}
11. Obserwuj komórki po 3 dniach od zakażenia pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić prawie 100% dodatni wynik GFP dzięki zastosowaniu wysokiego miana cząstek lentiwirusa (patrz Rysunek 2A).
12. Hoduj organoidy CRC przez okres 7-10 dni w celu zwiększenia wzrostu komórek przed wstrzyknięciem myszom biorcy.

7. Generowanie przerzutów przez organoidy CRC znakowane GFP u myszy biorców

Eksperymentalne procedury generowania przerzutów przy użyciu organoidów CRC znakowanych GFP (krok 7) są opisane w Rysunek 1C.

1. Aby zdysocjować organoidy CRC znakowane GFP do zawiesiny komórkowej, należy je pobrać mechanicznie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i przenieść do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml, jak opisano powyżej (krok 6.1).
2. Odwirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g, usunąć pożywkę hodowlaną i rozpuścić osad komórkowy w 500 μl PBS przez delikatne stukanie.
3. Wirować mikroprobówkę przez 3 minuty przy 1 400 x g i wyeliminować PBS.
4. Nałożyć 500 μl roztworu oddzielającego komórki na osad komórkowy w probówce i wymieszać go przez delikatne stukanie. Następnie pozostawić mieszaninę na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu enzymatycznego dysocjacji przylegających organoidów CRC, jak opisano powyżej (krok 6.4).
5. Bardzo delikatnie odpipetować zawiesinę komórek dodatkowymi 500 μl 1% FCS-DMEM kilka razy w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, aby z grubsza zdysocjować komórki, jak opisano powyżej (krok 6.5). Wytwarzanie pojedynczych komórek z organoidów CRC przez ostre pipetowanie znacznie zmniejsza żywotność komórek. W ten sposób należy pozostawić masę komórek wizualnie wykrywalną w zawiesinie komórek poprzez bardzo delikatne pipetowanie w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
6. Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy sile 1 400 x g i usunąć supernatant.
7. Aby ustalić mysi model spontanicznych przerzutów CRC PDX:
   1. Przygotuj zawiesinę komórkową zawierającą 5 x 10⁵ komórek w 50 μl PBS z 50% sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową na mysz. Przed użyciem utrzymać zawiesinę na lodzie. Użyj hemocytometru do zliczenia komórek rakowych, jak wskazano w kroku 4.3.
   2. Znieczulić mysz inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania wziewnego dla małych zwierząt i zdezynfekować skórę 70% etanolem, jak wskazano w kroku 1.6.
   3. Umieść mysz NOG w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Chwyć błonę śluzową odbytnicy sterylną pęsetą i delikatnie wyciągnij ją z odbytu. Następnie należy natychmiast wstrzyknąć zawiesinę komórkową przygotowaną w kroku 7.7.1 do błony podśluzowej odbytnicy myszy za pomocą strzykawki (rozmiar igły: 22 G). Rutynowo do oceny wyników wykorzystuje się 4-6 myszy na grupę.
8. Aby ustalić eksperymentalny model przerzutów CRC PDX:
   1. Przygotować zawiesinę komórek organoidowych CRC, zawierającą 4 x 10⁴ komórki w 50 μl PBS na mysz. Przed użyciem utrzymać zawiesinę na lodzie. Użyj hemocytometru do zliczenia komórek rakowych (krok 4.3).
   2. Znieczulić mysz inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania wziewnego dla małych zwierząt i zdezynfekować skórę 70% etanolem, jak wskazano w kroku 1.6.
   3. Umieść znieczuloną mysz NOG w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Wykonaj małe nacięcie w dolnej części lewego boku, a następnie przetnij otrzewną, aby ostrożnie odsłonić śledzionę za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety. Chwyć tkankę tłuszczową przyczepioną do śledziony sterylną pęsetą, a następnie powoli wstrzyknij 50 μl zawiesiny komórkowej (przygotowanej jak powyżej, krok 8.1) do śledziony. Należy upewnić się, że zawiesina komórkowa jest wstrzykiwana prawidłowo, bez wycieku na zewnątrz, ze śledziony. Rutynowo do oceny wyników używa się 4 myszy na grupę.
9. Po operacji umieść wszystkie myszy na ciepłej podkładce i utrzymuj ją w pozycji leżącej mostka, aż do przywrócenia wystarczającej świadomości, jak opisano w kroku 1.11. Gdy myszy w pełni wyzdrowieją, wróć do ich domowych klatek. Aby zapobiec drapieżnictwu, nie zezwalaj na rozmnażanie ze zwierzętami nieoperowanymi w tej samej klatce.
10. Sprawdź, czy nie ma wycieku szwów i upewnij się, że myszy żyją w grupie leczonej chirurgicznie następnego dnia. Sprawdzaj myszy pod kątem oznak choroby i mierz rozmiary guza za pomocą suwmiarki u wszystkich myszy raz w tygodniu.
11. Obserwuj myszy w celu wykrycia spontanicznych przerzutów (przez okres do 2,5 miesiąca) i eksperymentalnych przerzutów (1 miesiąc) po wstrzyknięciu.
12. Poświęć myszy poprzez znieczulenie i zwichnięcie szyjki macicy we wskazane dni. Wypreparuj pierwotne guzy i różne tkanki, w tym wątrobę i płuca. Umieść wypreparowane guzy i narządy w 5 ml lodowatego PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego i przechowuj je na lodzie.
13. Aby wykryć komórki organoidowe CRC GFP-dodatnie, obserwuj wypreparowane tkanki pod mikroskopem stereofluorescencyjnym. Rejestruj obrazy za pomocą kamery CCD i przygotuj je za pomocą standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazów.

Wyniki

Pierwotny gruczolakorak jelita grubego zdiagnozowany jako umiarkowanie zróżnicowany został chirurgicznie wycięty od 76-letniej kobiety z klasyfikacją TNM, stadium IIIa, a następnie poddany pooperacyjnej chemioterapii. Pierwotne komórki CRC były immunohistochemicznie wybarwione dodatnio na obecność antygenu rakowo-embrionalnego, Ki-67, pan-cytokeratyny i E-kadheryny. Fragmenty wyciętego guza zostały również podskórnie wszczepione myszom NOG w celu wygenerowania modelu PDX okrężnicy. Komórk...

Dyskusja

Chociaż model CRC PDX jest szeroko stosowany do badania wzrostu guza pierwotnego, to, czy model ten ma również zastosowanie do badania przerzutów nowotworowych, nie zostało jeszcze w pełni wyjaśnione. Spontaniczne przerzuty były również ledwo wykrywalne w wątrobie i płucach różnych zgłoszonych modeli PDX jelita grubego ^4,10. Aby wykryć mikroprzerzuty z wysoką czułością, opracowaliśmy protokół transdukcji cząstek lentiwirusa GFP do organoidów CRC pochodzących z PD...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NOD/Shi-scid IL2Rγ myszy zerowe (NOG)	Centralny Instytut Zwierząt Doświadczalnych, Kanagawa, Japonia		Hoduj 6-tygodniowe samce myszy w warunkach wolnych od zarazków i specyficznych
patogenów klipsy do ran 2 razy; Produkcja 10 mm	Natsume, Japonia	#C-21-S	Autoklaw przed użyciem
Strzykawka Hamilton rozmiar igły: 22 gauge	Tokyo Science, Japonia		Dezynfekować 70% alkoholem i sterylnym PBS.
Płytka 6-dołkowa	BMBio	#92006
Płytka 12-dołkowa	BMBio	#92412
Probówka stożkowa 15ml	Sumitono Bakelit	MS-57150
50ml probówka stożkowa	Sumitomo Bakelit	MS-57500
	Eppendorf	#0030120086	Autoklaw przed użyciem
Hemocytometr	Erma	#03-202-1
40μ m sitko komórkowe	Corning	#352340
Matrigel matryca błony podstawnej	Corning	#354234	Przechowywać aliqupts w temperaturze -20°C. Umieścić na lodzie do czasu użycia
Kolagenaza typu 1	Sigma	#C1030	150 mg / ml kolagenazy typu 1 w 1 i razy; PBS. Przechowuj aliqupts w temperaturze -20° C przez okres do 1 roku
Accutase	Innovate Cell Technologies	#5V2623A	Przechowywać w temperaturze 4°C.
DMEM/F-12 z GlutaMAX&handel;	Gibco	#10565018	Sklep w 4°C. Ciepły w 37° C przed użyciem
Cell banker 1plus	ZENOAQ	#628	Przechowywać w temperaturze 4°C. Zużyć w ciągu 1 miesiąca
Penicylina	Gibco	#15140122	Przechowywać w temperaturze 4°C. Zużyć w ciągu 1 miesiąca
Streptomycyna	Gibco	#15140122	Przechowywać w temperaturze 4°C. Zużyć w ciągu 1 miesiąca
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Przechowywać w temperaturze -20°C. Dodać do podłoża w tym samym dniu, w którym użyto
Y27632, inhibitor ROCK	Wako	#253-00591	Przechowywać w temperaturze -20°C. Dodać do podłoża na tego samego dnia, w którym użyto
pożywki Podłoże	hodowlane Gibco		DMEM/F-12 z GlutaMAX™ suplement uzupełniony o 5% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 &mikro; g/ml streptomyciny. Przechowywać w temperaturze 4&st;C. Zużyć w ciągu 1 miesiąca.
Pożywka do hodowli organoidów CRC z 1% lub 5% FCS			DMEM/F-12 z GlutaMAX™ suplement (Gibco #10565018) uzupełniony 1% lub 5% FCS, 100 U/ml penicyliny, 100 &mikro; g/ml streptomycyny, 2 ng/ml hEGF i 10 &mikro; M Y27632, inhibitor ROCK. Przechowywać w temperaturze 4&st. C. Zużyć w ciągu 1 miesiąca.
regent transfekcji FuGENE 6	Roche	11814 443001
Minisart 0,45 &mikro; Filtr m	Sartorius stedim	17598-K
5 ml polipropylenowe probówki	Beckman Coulter	326819
wektor PRRL-GFP	Prezent od dr Roberta A. Weinberga
pCMV-VSV-G	Prezent od dr Roberta A. Weinberga
pCMV-dR8.2 dvpr	Prezent od dr Roberta A. Weinberga
Łyżka wahadłowa SW55Ti rotor	Beckman Coulter
a mikroskop stereofluorescencyjny Zeiss Axioplan 2	Zeiss