Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

Podsumowanie

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Streszczenie

Długie niekodujące RNA (lncRNA), które są sekwencjami ponad 200 nukleotydów bez zdefiniowanej ramki odczytu, należą do rodziny regulatorowego niekodującego RNA. Chociaż ich funkcje biologiczne pozostają w dużej mierze nieznane, liczba tych lncRNA stale rośnie i obecnie szacuje się, że ludzie mogą mieć ponad 10 000 takich transkryptów. Wiadomo, że niektóre z nich są zaangażowane w ważne szlaki regulacyjne ekspresji genów, które zachodzą na poziomie transkrypcji, ale także na różnych etapach ko- i potranskrypcyjnego dojrzewania RNA. W tych ostatnich przypadkach należy zidentyfikować RNA, które są celem lncRNA. Z tego powodu przydatne jest opracowanie metody umożliwiającej identyfikację RNA związanych bezpośrednio lub pośrednio z interesującym nas lncRNA.

Ten protokół, który został zainspirowany wcześniej opublikowanymi protokołami pozwalającymi na izolację lncRNA wraz z powiązanymi z nim sekwencjami chromatyny, został dostosowany do umożliwienia izolacji powiązanych RNA. Ustaliliśmy, że dwa kroki mają kluczowe znaczenie dla skuteczności tego protokołu. Pierwszym z nich jest zaprojektowanie specyficznych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA, zdolnych do hybrydyzacji z interesującym lncRNA. W tym celu bioinformatyka przewidziała strukturę drugorzędową lncRNA i zaprojektowano antysensowne sondy oligonukleotydowe o silnym powinowactwie do regionów, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad. Drugi kluczowy etap procedury opiera się na warunkach utrwalania tkanki lub hodowanych komórek, które muszą zachować sieć między wszystkimi partnerami molekularnymi. W połączeniu z sekwencjonowaniem RNA o wysokiej przepustowości, ten protokół ściągania RNA może zapewnić cały interaktom RNA interesującego lncRNA.

Wprowadzenie

Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest identyfikacja molekularnych partnerów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). LncRNA odpowiadają sekwencjom ponad 200 nukleotydów bez zdefiniowanej ramki odczytu. Wykazano, że niektóre z nich są zaangażowane w regulację ekspresji genów, nie tylko na poziomie transkrypcji, ale także na różnych etapach ko- i potranskrypcyjnego dojrzewania RNA. W tych ostatnich przypadkach partnerami molekularnymi lncRNA są RNA, które należy zidentyfikować. Niezbędne byłoby wówczas opracowanie metody umożliwiającej identyfikację RNA związanych bezpośrednio lub pośrednio z lncRNA będącym przedmiotem zainteresowania.

Wcześniej opublikowane metody, takie jak Izolacja Chromatyny przez Oczyszczanie RNA (ChIRP)^1,2 oraz Analiza Hybrydyzacji Wychwytywania Celów RNA (CHART)^3,4, pozwalają na wysokoprzepustowe odkrywanie białek związanych z RNA i miejsc wiązania genomu określonego lncRNA. W tych dwóch metodach interesujący lncRNA został najpierw zhybrydyzowany z biotynylowanymi komplementarnymi oligonukleotydami, a następnie kompleks wyizolowano za pomocą kulek streptawidyny. Główna różnica między tymi dwiema technikami jest związana z konstrukcją sond, które celują w lncRNA. ChIRP, strategia zainspirowana RNA FISH, polegała na zaprojektowaniu puli krótkich komplementarnych sond oligonukleotydowych DNA, które miały pokryć całą długość lncRNA. Natomiast w CHART autorzy dostosowali test mapowania RNazy H na lncRNA, aby zbadać miejsca dostępne do hybrydyzacji.

Procedura proponowana tutaj do projektowania antysensownych sond oligonukleotydowych DNA wykorzystuje bioinformatyczne modelowanie struktury drugorzędowej lncRNA⁵ do wyboru sond o silnym powinowactwie do regionów, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad. Ta procedura ma tę zaletę, że jest tańsza niż te oparte na pulach kafelkowych sond oligonukleotydowych² i mniej czasochłonna niż te oparte na czułości RNAse-H⁴.

Ponieważ istnieje coraz więcej dowodów na potranskrypcyjną regulację genów przez lncRNAs⁶, jest bardzo przydatne opracowanie podejścia umożliwiającego przechwytywanie RNA, które są celami lncRNA. Ponadto, aby można je było wykorzystać w większości zastosowań, zoptymalizowano je zarówno w przypadku hodowanych komórek, jak i ekstraktów tkankowych.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Europejską Wspólnotą Gospodarczą w zakresie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (86/609/EEC i 2010/63/UE) oraz na podstawie licencji udzielonej D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, Authorization no. 13-002).

1. Konstrukcja sondy

1. Korzystając z pierwotnej sekwencji interesującego lncRNA, wygeneruj jego drugorzędową strukturę na serwerze internetowym "RNAstructure"⁵.
   UWAGA: Na tej stronie można używać różnych algorytmów. Trzy narzędzia predykcyjne, które dają najlepsze wyniki dla projektów sond, to: "Fold" (najniższa struktura energii swobodnej), "MaxExpect" (wysoce prawdopodobne pary zasad) i "Probnot" (prawdopodobne pary zasad, w tym pseudowęzły). Te trzy analizy można przeprowadzać i porównywać. Można również korzystać z innych serwerów WWW, takich jak Vienna RNA websuite⁷.
   1. Wybierz regiony, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad i zaprojektuj antysensowne sondy oligonukleotydowe składające się z 25 zasad o silnym powinowactwie do tych regionów.
      UWAGA: Zawartość GC tych sond powinna wynosić od 40 do 60%. Korzystając z narzędzia do wyszukiwania wyrównania (Blast), upewnij się, że wybrane antysensowne sondy oligonukleotydowe nie rozpoznają sekwencji nukleotydowych w innym RNA ulegającym ekspresji w wybranym układzie komórkowym.
2. Zaprojektuj również niespecyficzną sondę oligonukleotydową DNA składającą się z 25 zasad, która nie wykazuje powinowactwa ani do interesującego lncRNA, ani do innych sekwencji RNA w genomie będącym przedmiotem zainteresowania.
3. Zamów sondy z biotyną na końcu 3'.
   UWAGA: W celu zmniejszenia przeszkody sterycznej, odległość między oligonukleotydem a biotyną musi być zwiększona za pomocą przekładki trietylenoglicerowej. W celu uzyskania optymalnego wyniku, a także w celu oceny swoistości wyników pull-down, zaleca się zaprojektowanie 3 różnych antysensownych sond oligonukleotydowych, a następnie eksperymentalne porównanie ich wydajności.

2. Sieciowanie

1. Sieciowanie komórek hodowlanych
   1. Hodowla komórek przysadki sommatolaktotropowej GH4C1 w pożywce F10 Hama uzupełnionej 15% surowicą końską i 2% płodową surowicą cielęcą. Hoduj komórki aż do zbiegu na 78,5 cm² płytkach hodowlanych. Odpowiada to w przybliżeniu 1 x 10⁷ komórek.
   2. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z konfluentującej się płytki hodowlanej GH4C1 o długości 78,5 cm², a następnie przepłukać 1 x objętością pożywki roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
   3. Utrwalić komórki 1% roztworem paraformaldehydu w PBS (10 ml na szalki o długości 78,5^cm2); roztwór ten musi być świeżo przygotowany z 4% roztworu podstawowego paraformaldehydu. Sieciowanie pod wpływem mieszania przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
   4. Stłumić działanie paraformaldehydu, dodając 1/10 objętości glicyny 1,25 M (1 ml na 10 ml roztworu paraformaldehydu); mieszać 5 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Wyrzuć pożywkę przez aspirację i spłucz dwa razy (5 min) 1X objętością pożywki PBS.
   6. Dodać objętość PBS odpowiadającą 1/10 objętości pożywki, zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieść do probówki wirówkowej.
   7. Wirować z prędkością 510 g w temperaturze 4 °C przez 5 min.
   8. Usunąć jak najwięcej supernatantu.
   9. Przechowuj granulki w nieskończoność w razie potrzeby w temperaturze -80 °C.
2. Sieciowanie tkanek
   1. Umieścić 5 mg świeżo uzyskanej tkanki przysadki mózgowej myszy w roztworze 1% paraformaldehydu rozcieńczonego w PBS (około 10x objętość tkanki), mieszać przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Stłumić działanie paraformaldehydu, dodając 1,25 M roztworu glicyny (1 ml na 10 ml roztworu paraformaldehydu) i mieszać przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Wyrzucić pożywkę przez aspirację i spłukać dwukrotnie PBS (około 10x objętość tkanki). Usunąć jak najwięcej supernatantu.
   4. Usieciowaną tkankę przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.

3. Liza komórek lub tkanek

1. Przygotuj bufor do lizy (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA, 1% SDS uzupełniony 200 U/ml roztworu inhibitora RNAzy i koktajl inhibitora proteaz 5 μL/ml).
2. Aby uzyskać lizowane próbki bez uprzedniego rozmrażania, należy ponownie zawiesić granulki komórek lub usieciowane tkanki za pomocą tego buforu (około 1 ml na 100 mg osadu komórkowego lub tkanki). Z osadu komórkowego otrzymanego z 1 x 10⁷ komórek powstaje próbka poddana lizie zawierająca około 20 mg białka.
   UWAGA: W zależności od użytej tkanki należy dodać etap mechanicznego rozerwania. W takim przypadku ważne jest, aby unikać podgrzewania próbek podczas tego dodatkowego etapu.

4. Sonikacja

1. Optymalizacja warunków sonikacji
   1. Zaprogramuj sonikator z 2 do 5 seriami 30 s ON i 30 s OFF.
   2. Wykonać testy w celu optymalizacji warunków sonikacji na rozcieńczonych próbkach zlizowanych (współczynnik rozcieńczenia 1/2 lub 1/4 odpowiadający około 10 lub 5 mg białka). Umieścić rozcieńczone próbki lizy w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C i rozpocząć serię sonikacji.
   3. Oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA lub odczynnika do izolacji RNA (np. Trizol).
   4. Załaduj całość oczyszczonego RNA na 1% elektroforezę w żelu agarozowym do buforu TBE, sprawdź długość fragmentów RNA. Długość ta powinna wynosić od 200 do 800 bp.
      UWAGA: W zależności od wielkości fragmentu RNA, skuteczność antysensownych sond oligonukleotydowych może się różnić. Następnie zaleca się sprawdzenie skuteczności sond w różnych warunkach sonikacji.
2. Sonikacja próbek poddanych lizie
   1. Umieścić próbki poddane lizie odpowiadające 20 mg białek (otrzymanych po kroku 3.2) w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C i rozpocząć serię sonikacji zgodnie z optymalizacją w kroku 4.1.
   2. Bezpośrednio po sonikacji odwirować przez 5 minut przy 12 000 g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do nowych probówek wirówkowych.
      UWAGA: Aby zapewnić jednorodność, na tym etapie można łączyć i redystrybuować replikowane supernatanty.

5. Ściąganie RNA

1. Dzień 1 – etap hybrydyzacji
   1. Dodać 2 objętości buforu hybrydyzacyjnego (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 15% formamidu dodane doraźnie) do supernatantów zebranych po etapie sonikacji. Wir.
   2. Przenieść 20 μl każdej próbki do probówki wirówkowej (próbki wejściowe) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Dodać 100 pmol biotynylowanych sond oligonukleotydowych (swoistych lub niespecyficznych; patrz tabela 1) do każdej próbki. Inkubować przez 4 do 6 godzin przy umiarkowanym mieszaniu na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej.
   4. Dodać 50 μl magnetycznych kulek streptawidyny uzupełnionych 200 U/ml roztworu inhibitora RNAzy i koktajlem inhibitora proteaz 5 μL/ml.
   5. Inkubować przez noc przy umiarkowanym mieszaniu na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej.
2. Dzień 2 – etap izolacji RNA
   1. Użyj podparcia magnetycznego, aby oddzielić kulki od lizatu komórkowego, wyrzuć supernatant i przemyj kulki 900 μl buforu do przemywania (SDS 0,5%, SSC 2x). Powtórz 5 razy przeplatane 5-minutowym mieszaniem na rotatorze w temperaturze pokojowej.
   2. Po ostatnim przemyciu zdekantować po raz ostatni i dodać do próbek 95 μl buforu Proteinease K (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) i 5 μL proteinazy-K (20 mg/ml).
   3. Na lodzie rozmrozić próbki wejściowe (20 μl) i dodać 75 μl buforu proteinazy K i 5 μl proteinazy K (20 mg/ml).
   4. Inkubować wszystkie próbki z proteinazą K przez 45 minut w temperaturze 50 °C, a następnie 10 minut w temperaturze 95 °C.
   5. Schłodzić próbkę na lodzie przez 3 minuty przed oddzieleniem kulek od RNA za pomocą nośnika magnetycznego. Zachowaj supernatant i wyrzuć koraliki.
   6. Oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, który powinien zawierać etap trawienia DNA. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
   7. Przeprowadzić qPCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) przy użyciu zestawu RT, a następnie qPCR przy użyciu określonych starterów (Tabela 1).
   8. Skonstruuj dwie biblioteki DNA odpowiadające dwóm pulom RNA uzyskanym za pomocą każdej ze specyficznych sond Neat1 (Tabela 1). Wykonuj sekwencjonowanie w systemie sekwencjonowania nowej generacji.

Wyniki

Kilka ostatnich badań wykazało, że lncRNA odgrywają istotną rolę w prawie każdym ważnym procesie biologicznym i że rola ta jest osiągana poprzez kontrolę ekspresji genów zachodzącą zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i potranskrypcyjnym, co w tym ostatnim przypadku pokazuje, że RNA mogą być celem lncRNAs⁶.

Obfity transkrypt 1 wzbogacony jądrowo lncRNA (Neat1) jest zamieszany w różne neuropatologie, takie jak demencja czołowo-skroniowa, stwardnienie zanikowe boczne lub padaczka8^,9,10, a także jest nieprawidłowo regulowany w różnych nowotworach^11,12.

Wiadomo również, że lncRNA jest składnikiem strukturalnym określonych ciał jądrowych, paraplamek, oraz że bierze udział w potranskrypcyjnej dobowej regulacji ekspresji genów¹³. Plamki, które znajdują się w każdym jądrze komórkowym i są tworzone nie tylko wokół Neat1, który jest niezbędny do ich powstania, ale także wokół kilku białek wiążących RNA (RBP)¹⁴, są rzeczywiście znane z tego, że są w stanie zatrzymać cele RNA w jądrze¹⁵. Powstawanie paraplamek osiąga się poprzez połączenie różnych składników. Wykazano, że formacja ta wykazuje okołodobowy rytmiczny wzorzec napędzający rytmiczne zatrzymywanie jądra RNA celów¹³. Zatrzymywanie jądrowe celów RNA przez plamki może zachodzić poprzez wiązanie się z RBP lub bezpośrednio poprzez asocjację RNA/RNA, ale zakres RNA ukierunkowanych przez paraplamki musiał zostać określony. Aby zidentyfikować RNA celowane bezpośrednio lub pośrednio przez Neat1, zaprojektowano protokół RNA pull-down, który umożliwia izolację i identyfikację wszystkich celów RNA Neat1 w hodowanych komórkach, a także w próbkach tkanek (patrz Rysunek 1 dla graficznej prezentacji techniki).

Protokół został również z powodzeniem zastosowany do identyfikacji celów RNA innego transkryptu 1 gruczolakoraka płuc związanego z przerzutami lncRNA (Malat1). Malat1 jest wysoce konserwatywnym i eksprymowanym lncRNA występującym w plamkach jądrowych wraz z kilkoma czynnikami splicingowymi RNA. Wiadomo, że Malat1 bierze udział w regulacji splicingu kilku powstających pre-mRNA^16,17.

Specyficzne (SO) i niespecyficzne sondy oligonukleotydowe (NSO) zostały wygenerowane przy użyciu opisanej tutaj strategii projektowania sondy. Strategia ta opiera się na wyborze regionów, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad, zgodnie z przewidywaniami drugorzędowej struktury lncRNA oraz na zaprojektowaniu specyficznych sond o silnym powinowactwie do tych regionów. Jako reprezentatywny wynik tych przewidywań bioinformatycznych, obraz przewidywanej struktury drugorzędowej sekwencji Neat1 (nukleotydy od 1 480 do 2 000) wraz z położeniem dwóch zaprojektowanych sond SO jest podany w Rysunek 2.

Zaprojektowane sondy zostały skierowane do szczura Neat1 lub Malat1 w celu hodowli komórek GH4C1 oraz do mysiego Neat1 w celu pobrania ekstraktów z tkanki przysadki mózgowej (Tabela 1). Względne wzbogacenie w Neat1 lub Malat1 obliczono dla sond niespecyficznych i specyficznych względem próbek wejściowych. Rysunek 3 pokazuje skuteczność konkretnych sond do ściągania Neat1 w linii komórkowej przysadki GH4C1 szczura (Rysunek 3A) oraz w ekstraktach z tkanki przysadki mysiej (Rysunek 3B). Podczas korzystania z protokołu projektowania sondy do generowania specyficznych sond oligonukleotydowych (SO) skierowanych do Malat1, uzyskano jedną wydajną sondę, podczas gdy inna nie była wystarczająco wydajna i została odrzucona (Rysunek 4A).

Po procedurze ściągania RNA, a następnie eksperymentach RT-qPCR, wykazano, że niektóre RNA oceniane za pomocą specyficznych starterów (Tabela 1) są związane z Neat1 lub Malat1 w ekstraktach GH4C1. Wykazano również, że RNA związane z Neat1 w ekstraktach komórkowych GH4C1 są związane z Neat1 w ekstraktach z tkanki przysadki. Rzeczywiście, po wycofaniu RNA Neat1, stwierdzono, że Malat1 jest celem Neat1 zarówno w linii komórkowej GH4C1, jak i w ekstraktach z tkanek myszy przysadki mózgowej (Figura 5A). Z drugiej strony, Neat1 został znacznie wzbogacony po ściągnięciu RNA Malat1 przeprowadzonym za pomocą specyficznej sondy w komórkach GH4C1 (Figura 4B). Podkreślając bliski związek między dwoma lncRNA, wyniki te są zgodne z potencjalną współregulacyjną rolą Neat1 i Malat1 sugerowaną przez myszy z nokautem Malat1, które wykazują różnice w ekspresji RNA Neat1^18,19. Transkrypty dwóch głównych hormonów przysadki mózgowej, hormonu wzrostu (Gh) (Figura 5B) i prolaktyny (Prl) (Figura 5C) zostały znacznie wzbogacone po ściągnięciu RNA Neat1 za pomocą specyficznych sond zarówno w komórkach GH4C1, jak i ekstraktach przysadki, co sugeruje możliwą regulację dwóch hormonów przez Neat1. Porównując dwie konkretne użyte sondy, okazało się, że ich skuteczność może się różnić w zależności od rozważanego celu RNA (Rysunek 5B i Rysunek 5C). Wyniki te wskazują na konieczność zaprojektowania kilku specyficznych sond w celu wybrania tych, które wykazują nie tylko najlepszą skuteczność we wzbogacaniu pull-down lncRNA, ale także najlepszą skuteczność we wzbogacaniu jego celów RNA.

Metoda pull-down RNA może być również poprzedzona sekwencjonowaniem RNA o wysokiej przepustowości w celu uzyskania wyczerpującej listy celów RNA interesującego lncRNA¹³. Przeprowadzono analizę sekwencyjną RNA na komórkach przysadki GH4C1 po pobraniu Neat1 RNA przy użyciu dwóch specyficznych sond opisanych powyżej. Należy zauważyć, że kontrola ujemna z wykorzystaniem NSO może być również poddana analizie sekwencyjnej RNA, jeżeli poziom RNA odzyskany po ekstrakcji RNA za pomocą NSO jest wystarczający, aby umożliwić budowę bibliotek. Nie miało to miejsca w poprzednim doświadczeniu¹³. Biblioteki, które zostały wygenerowane po użyciu określonych sond, zostały przeanalizowane za pomocą Tophat/spinki do mankietów pipeline²⁰ i uwzględniono tylko transkrypcje o wartościach fragmentu na kilobazę na milion zmapowanych odczytów (FPKM) wyższych niż 1. Listy uzyskane za pomocą dwóch specyficznych sond skierowanych do Neat1 (Tabela 1) zostały skrzyżowane w celu oceny swoistości wyników. Stwierdzono 4 268 genów związanych z paraspeckles, które stanowiły 28% wyrażonych transkryptów w komórkach GH4C1¹³. Zgodnie z wynikami uzyskanymi za pomocą analizy qPCR (Figura 5A-C), stwierdzono, że transkrypty Gh, Prl i Malat1 są związane z Neat1. Udowodniono zatem, że metoda RNA pull-down jest skutecznym narzędziem do badania interakcji między lncRNA a ich celami RNA.

Rysunek 1: Graficzne przedstawienie procedury ściągania RNA. Pierwszego dnia komórki lub tkanki usieciowano paraformaldehydem, poddano lizie i sonikacji przed etapem hybrydyzacji, który przeprowadzono przez dodanie biotynylowanych specyficznych sond. Następnie dodano magnetyczne kulki streptawidyny, aby oddzielić określony materiał od reszty lizatu komórkowego. Drugiego dnia koraliki zostały odizolowane magnesem i kilkakrotnie umyte. Etap de-sieciowania pozwolił na odzyskanie RNA, które zostały oczyszczone i wykorzystane do analizy RT-qPCR lub RNA-seq. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Drugorzędowa struktura sekwencji Neat1 (nukleotyd od 1 480 do 2 000) zgodnie z przewidywaniami bioinformatyki (serwer sieciowy RNAstructure; najniższa struktura swobodnej energii). Struktura jest pokolorowana zgodnie ze stopniem prawdopodobieństwa parowania zasad. Dwie sondy oligonukleotydowe (SO1 i SO2) w kolorze czerwonym są umieszczone wzdłuż struktury RNA Neat1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: walidacja qPCR wzbogacenia Neat1 w porównaniu z wejściem. Walidacja qPCR wzbogacenia Neat1 w porównaniu z wejściem po ściągnięciu Neat1 RNA za pomocą dwóch różnych specyficznych sond (SO1-rn i SO2-rn dla komórek GH4C1 oraz SO1-mm i SO2-mm dla tkanki przysadki mózgowej) w porównaniu z niespecyficzną (NSO-rn dla komórek GH4C1 i NSO-mm dla tkanki przysadki mózgowej) w komórkach szczurów GH4C1 (A) i w ekstraktach z tkanki przysadki myszy (B). Wyniki są średnie, ± SEM uzyskano w 3 do 10 eksperymentach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: walidacja qPCR wzbogacenia Malat1 i Neat1 w porównaniu z danymi wejściowymi po wycofaniu RNA Malat1. Walidacja qPCR wzbogacenia Malat1 (A) i Neat1 (B) w porównaniu z wejściem po pobraniu RNA Malat1 przez dwie różne specyficzne sondy (SO3-rn i SO4-rn) w porównaniu do niespecyficznej (NSO-rn) w komórkach szczurów GH4C1. Wyniki są średnie± SEM uzyskane w 3 eksperymentach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: walidacja qPCR wzbogacenia Malat1, Gh, Prl w porównaniu z danymi wejściowymi po ściągnięciu RNA Neat1. Walidacja qPCR wzbogacenia Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) w porównaniu z wejściem po ściągnięciu RNA Neat1 przy użyciu różnych specyficznych sond w porównaniu z niespecyficzną w komórkach szczura GH4C1 i ekstraktach tkanki przysadki myszy. Wyniki są średnie ± SEM uzyskanych w 3 do 8 eksperymentach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

NAZWY SOND	Sekwencje
NSO-Rn	TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-Rn	CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-Rn	GCCTTCCCACATTTAAAAACACAACAAC
SO3-Rn	AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-Rn	AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
NSO-mm	GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mm	GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mm	CTCACCCGACCCCGACTCCTTCAA
STARTERY qPCR:
Rattus norvegicus (Rattus norvegicus)
schludny1	AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
	TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1	GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
	TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
Gh1	CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
	GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
Prl	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTTTTCCTCAA
Mus musculus
schludny1	TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
	CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
Gh1	CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
	TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
Prl	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTTTTCCTCAA

Tabela 1: Sekwencje sond oligonukleotydowych DNA i starterów qPCR

Dyskusja

Długie niekodujące RNA (lncRNA) pod względem liczby i różnorodności stanowią dużą dziedzinę badań, a większość ich ról nie została jeszcze odkryta. Wiele z tych lncRNA ma lokalizację jądrową, a niektóre z nich są zaangażowane w regulacyjne szlaki ekspresji genów poprzez mechanizmy transkrypcyjne lub potranskrypcyjne. Jednym z obecnych wyzwań w tej dziedzinie jest zrozumienie znaczenia tych lncRNA w potranskrypcyjnym przetwarzaniu RNA. W tym celu należy zidentyfikować RNA, na które ukierunkowane są lncRNA. Zainspirowani wcześniejszymi badaniami skupiającymi się na asocjacji lncRNA z chromatyną, opracowaliśmy procedurę, która pozwala na identyfikację RNA związanych z lncRNA. Sukces tego protokołu, nazwanego RNA pull-down, zależy głównie od dwóch kluczowych etapów, a mianowicie zaprojektowania antysensownych sond oligonukleotydowych DNA, które muszą specyficznie i wyłącznie hybrydyzować z lncRNA będącym przedmiotem zainteresowania, oraz warunków utrwalenia tkanek lub komórek, które muszą zachować integralność sieci między wszystkimi partnerami molekularnymi.

Wcześniej opublikowane protokoły zawierały procedury izolacji lncRNA wraz z powiązanymi z nim sekwencjami chromatyny (ChIRP ^1,2, WYKRES ^3,4). W tych protokołach zastosowano różne strategie w celu zaprojektowania antysensownych sond oligonukleotydowych biotynylowanych DNA. W procedurze ChIRP autorzy wykorzystali pulę biotynylowanych sond oligonukleotydowych DNA obejmujących całą długość interesującego lncRNA po wykluczeniu wszystkich nadmiarowych i niespecyficznych sond ^1,2. W protokole CHART autorzy zidentyfikowali regiony lncRNA, które są bardziej dostępne do hybrydyzacji i zaprojektowali oligonukleotydy wychwytujące, które celują w te regiony. Regiony te zostały wybrane na podstawie ich czułości na RNazę-H. Rzeczywiście, wykorzystując właściwość RNAse-H do hydrolizy RNA w miejscach wiązania RNA-DNA, oligonukleotydy, które hybrydyzują z dostępnymi miejscami w lncRNA, wytwarzają hybrydy RNA-DNA i prowadzą do enzymatycznego rozszczepienia lncRNA. Autorzy wybrali trzy z tych kandydujących oligonukleotydów wychwytujących i wykorzystali je w koktajlu ^3,4.

Procedura, którą zastosowaliśmy do zaprojektowania antysensownych sond oligonukleotydowych biotynylowanych DNA, była zbliżona do tej zastosowanej w protokole CHART, ale dostępne do hybrydyzacji regiony pożądanego lncRNA nie zostały wybrane na podstawie ich wrażliwości RNAse-H, ale zgodnie z ich niskim prawdopodobieństwem wewnętrznego parowania zasad, jak określono za pomocą bioinformatycznego modelowania struktury drugorzędowej lncRNA. Należy zauważyć, że różne struktury drugorzędowe będą przewidywane przy użyciu różnych algorytmów, a sondy do wyboru powinny to te, które hybrydyzują z dostępnymi sekwencjami lncRNA w największej liczbie przewidywanych struktur drugorzędowych. Te same wyniki uzyskano przy użyciu koktajlu trzech zaprojektowanych, specyficznych sond lub pojedynczej sondy indywidualnie. Skłoniło to do zastosowania dwóch oddzielnych, specyficznych sond i rozważenia pozytywnych wyników jako tych, które są wspólne dla tych dwóch sond. Wreszcie, zaleca się zatem na początku opracowywania metody, w celu uzyskania optymalnego wyniku i możliwości oceny swoistości wyników pull-down, zaprojektowanie 3 różnych antysensownych sond oligonukleotydowych, a następnie porównanie eksperymentalne ich wydajności, zwłaszcza że wydajność sondy może ulec zmianie przez przygotowanie lizatu komórkowego. Niemniej jednak zastosowana przez nas procedura projektowania sondy w oparciu o bioinformatyczne modelowanie struktury drugorzędowej lncRNA pozostała tańsza niż ta oparta na pulach kafelkowych sond oligonukleotydowych² i była mniej czasochłonna niż metoda oparta na czułości RNAse-H4.

Kontrolę ujemną należy również przeprowadzić przy użyciu oligonukleotydu wychwytu ujemnego albo biotynylowanych sond oligonukleotydowych sensownego DNA, albo zaszyfrowanych sond oligonukleotydowych, albo oligonukleotydów skierowanych przeciwko niespokrewnionemu RNA. Ze względu na istnienie naturalnych transkryptów antysensownych lncRNA, użycie sensownych sond oligonukleotydowych może być czasami niewystarczające. Niezależnie od sondy oligonukleotydowej wybranej do kontroli ujemnej, konieczne jest sprawdzenie za pomocą blasku, czy nie hybrydyzuje ona ze znanym RNA i należy pamiętać, że ten oligonukleotyd może hybrydyzować do wciąż nieoznaczonego lncRNA.

Lizaty komórkowe użyte w tych eksperymentach z RNA pull-down uzyskano z 10⁶ do 10⁷ komórek podczas pracy z hodowanymi komórkami i od 1 do 10 mg podczas pracy z tkanką. Przygotowanie lizatów komórkowych musi być dostosowane do użytej tkanki lub typu komórki, z dwoma głównymi etapami, które należy zoptymalizować: a mianowicie etapem sieciowania, który umożliwia tworzenie wiązań kowalencyjnych między lncRNA a jego partnerami molekularnymi, oraz etapem sonikacji, który zmniejsza lepkość poprzez rozdrabnianie chromatyny.

Celem etapu sieciowania jest zapewnienie, że wszystkie cele RNA pozostaną zamknięte dla lncRNA poprzez indukowanie tworzenia sieci między wszystkimi partnerami molekularnymi. Etap obróbki paraformaldehydem, który utworzy wiązania kowalencyjne między lncRNA a jego partnerami, pozwala na siateczkowanie sieci. W protokole CHART zasugerowano, aby w przypadku pracy z jądrowym lncRNA przeprowadzić pierwszą obróbkę paraformaldehydem na lizacie całej komórki i drugą obróbkę na izolowanej frakcji jądrowej ^3,4. Zaobserwowaliśmy, że ten dodatkowy krok zmniejszył wydajność sond, prawdopodobnie poprzez zmniejszenie dostępności lncRNA w komórkach. W związku z tym stopień siateczkowania przez paraformaldehyd musi być dostosowany z uwzględnieniem użytego typu komórki lub tkanki, lokalizacji interesującego lncRNA oraz wydajności zaprojektowanych sond.

Podczas lizy komórek chromatyna jest uwalniana w lizacie i zwiększa jego lepkość; następnie konieczne jest rozdrobnienie chromatyny za pomocą sonikacji, aby zwiększyć płynność próbek, a tym samym ułatwić dostęp sond oligonukleotydowych do interesującego lncRNA. Jednak sonikacja rozdrobni również RNA wyekstrahowane za pomocą lncRNA, które są przedmiotem zainteresowania. Ważne jest więc, aby zminimalizować czas sonikacji w taki sposób, aby skutecznie zmniejszał lepkość lizatu, ale pozwalał również na uzyskanie fragmentów RNA o długości mieszczącej się w przedziale 200-800 pz. Należy pamiętać, że czas sonikacji będzie w dużym stopniu zależał zarówno od ilości, jak i rodzaju użytej tkanki lub hodowanych komórek.

Podsumowując, opisana tutaj procedura umożliwia w ciągu 2-3 dni wychwycenie celów RNA pożądanego lncRNA. W połączeniu z RT-qPCR, metody te pozwolą na poszukiwanie specyficznego związku i regulacji mRNA przez pożądane lncRNA jako podejście kandydujące. W przypadku podejścia obejmującego cały genom, eksperymenty z RNA pull-down mogą być analizowane za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, co pozwala na odzyskanie wszystkich RNA związanych z pożądanym lncRNA. Niezależnie od wybranej strategii analitycznej, procedura RNA pull-down powinna dostarczyć nowej istotnej wiedzy na temat regulacji RNA przez lncRNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetyczne kulki streptawidyny
Formamid	Thermo-Fisher	15515-026
Aparat do elektroforezy żelowej	Advance	Mupid-One	Aparatura do elektroforezy żelowej
Proteinaza K	Sigma	P2308
Zestaw do oczyszczania RNA XS	Macherey-Nagel	740902	do oczyszczania RNA
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	Inhibitor RNAzy
Trizol	Thermo-Fisher	15596018	Probówka do oczyszczania RNA
		SB2	Eppendorf rotator
RNA do DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse zestaw do transkrypcji
iTaq Uniwersalny SYBR Green Supermix	Odczynnik	1725124	qPCR
BioRad Zastosowany aparat 7500 Fast	Thermo-Fisher	4351107	qPCR
Zestaw do przygotowania próbki mRNA Illumina TruSeq Zestaw do	budowy biblioteki DNA	Illumina
20020594 System NextSeq 500	Illumina	SY-415-1002	NGS