Artykuł metodologiczny

Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

28K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57379

⸱

10 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, CRN2M-UMR7286, Faculté de Médecine Nord, Aix-Marseille Université, 2Plate-forme d'imagerie MRI, UMS3426, CNRS 141, Institut de Génétique Humaine

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Streszczenie

Długie niekodujące RNA (lncRNA), które są sekwencjami ponad 200 nukleotydów bez zdefiniowanej ramki odczytu, należą do rodziny regulatorowego niekodującego RNA. Chociaż ich funkcje biologiczne pozostają w dużej mierze nieznane, liczba tych lncRNA stale rośnie i obecnie szacuje się, że ludzie mogą mieć ponad 10 000 takich transkryptów. Wiadomo, że niektóre z nich są zaangażowane w ważne szlaki regulacyjne ekspresji genów, które zachodzą na poziomie transkrypcji, ale także na różnych etapach ko- i potranskrypcyjnego dojrzewania RNA. W tych ostatnich przypadkach należy zidentyfikować RNA, które są celem lncRNA. Z tego powodu przydatne jest opracowanie metody umożliwiającej identyfikację RNA związanych bezpośrednio lub pośrednio z interesującym nas lncRNA.

Ten protokół, który został zainspirowany wcześniej opublikowanymi protokołami pozwalającymi na izolację lncRNA wraz z powiązanymi z nim sekwencjami chromatyny, został dostosowany do umożliwienia izolacji powiązanych RNA. Ustaliliśmy, że dwa kroki mają kluczowe znaczenie dla skuteczności tego protokołu. Pierwszym z nich jest zaprojektowanie specyficznych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA, zdolnych do hybrydyzacji z interesującym lncRNA. W tym celu bioinformatyka przewidziała strukturę drugorzędową lncRNA i zaprojektowano antysensowne sondy oligonukleotydowe o silnym powinowactwie do regionów, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad. Drugi kluczowy etap procedury opiera się na warunkach utrwalania tkanki lub hodowanych komórek, które muszą zachować sieć między wszystkimi partnerami molekularnymi. W połączeniu z sekwencjonowaniem RNA o wysokiej przepustowości, ten protokół ściągania RNA może zapewnić cały interaktom RNA interesującego lncRNA.

Wprowadzenie

Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest identyfikacja molekularnych partnerów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). LncRNA odpowiadają sekwencjom ponad 200 nukleotydów bez zdefiniowanej ramki odczytu. Wykazano, że niektóre z nich są zaangażowane w regulację ekspresji genów, nie tylko na poziomie transkrypcji, ale także na różnych etapach ko- i potranskrypcyjnego dojrzewania RNA. W tych ostatnich przypadkach partnerami molekularnymi lncRNA są RNA, które należy zidentyfikować. Niezbędne byłoby wówczas opracowanie metody umożliwiającej identyfikację RNA związanych bezpośrednio lub pośrednio z lncRNA będącym przedmiotem zainteresowania.

Wcześniej opublikowane metody, takie jak Izolacja Chromatyny przez Oczyszczanie RNA (ChIRP)1,2 oraz Analiza Hybrydyzacji Wychwytywania Celów RNA (CHART)3,4, pozwalają na wysokoprzepustowe odkrywanie białek związanych z RNA i miejsc wiązania genomu określonego lncRNA. W tych dwóch metodach interesujący lncRNA został najpierw zhybrydyzowany z biotynylowanymi komplementarnymi oligonukleotydami, a następnie kompleks wyizolowano za pomocą kulek streptawidyny. Główna różnica między tymi dwiema technikami jest związana z konstrukcją sond, które celują w lncRNA. ChIRP, strategia zainspirowana RNA FISH, polegała na zaprojektowaniu puli krótkich komplementarnych sond oligonukleotydowych DNA, które miały pokryć całą długość lncRNA. Natomiast w CHART autorzy dostosowali test mapowania RNazy H na lncRNA, aby zbadać miejsca dostępne do hybrydyzacji.

Procedura proponowana tutaj do projektowania antysensownych sond oligonukleotydowych DNA wykorzystuje bioinformatyczne modelowanie struktury drugorzędowej lncRNA5 do wyboru sond o silnym powinowactwie do regionów, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad. Ta procedura ma tę zaletę, że jest tańsza niż te oparte na pulach kafelkowych sond oligonukleotydowych2 i mniej czasochłonna niż te oparte na czułości RNAse-H4.

Ponieważ istnieje coraz więcej dowodów na potranskrypcyjną regulację genów przez lncRNAs6, jest bardzo przydatne opracowanie podejścia umożliwiającego przechwytywanie RNA, które są celami lncRNA. Ponadto, aby można je było wykorzystać w większości zastosowań, zoptymalizowano je zarówno w przypadku hodowanych komórek, jak i ekstraktów tkankowych.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Europejską Wspólnotą Gospodarczą w zakresie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (86/609/EEC i 2010/63/UE) oraz na podstawie licencji udzielonej D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, Authorization no. 13-002).

1. Konstrukcja sondy

  1. Korzystając z pierwotnej sekwencji interesującego lncRNA, wygeneruj jego drugorzędową strukturę na serwerze internetowym "RNAstructure"5.
    UWAGA: Na tej stronie można używać różnych algorytmów. Trzy narzędzia predykcyjne, które dają najlepsze wyniki dla projektów sond, to: "Fold" (najniższa struktura energii swobodnej), "MaxExpect" (wysoce prawdopodobne pary zasad) i "Probnot" (prawdopodobne pary zasad, w tym pseudowęzły). Te trzy analizy można przeprowadzać i porównywać. Można również korzystać z innych serwerów WWW, takich jak Vienna RNA websuite7.
    1. Wybierz regiony, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad i zaprojektuj antysensowne sondy oligonukleotydowe składające się z 25 zasad o silnym powinowactwie do tych regionów.
      UWAGA: Zawartość GC tych sond powinna wynosić od 40 do 60%. Korzystając z narzędzia do wyszukiwania wyrównania (Blast), upewnij się, że wybrane antysensowne sondy oligonukleotydowe nie rozpoznają sekwencji nukleotydowych w innym RNA ulegającym ekspresji w wybranym układzie komórkowym.
  2. Zaprojektuj również niespecyficzną sondę oligonukleotydową DNA składającą się z 25 zasad, która nie wykazuje powinowactwa ani do interesującego lncRNA, ani do innych sekwencji RNA w genomie będącym przedmiotem zainteresowania.
  3. Zamów sondy z biotyną na końcu 3'.
    UWAGA: W celu zmniejszenia przeszkody sterycznej, odległość między oligonukleotydem a biotyną musi być zwiększona za pomocą przekładki trietylenoglicerowej. W celu uzyskania optymalnego wyniku, a także w celu oceny swoistości wyników pull-down, zaleca się zaprojektowanie 3 różnych antysensownych sond oligonukleotydowych, a następnie eksperymentalne porównanie ich wydajności.

2. Sieciowanie

  1. Sieciowanie komórek hodowlanych
    1. Hodowla komórek przysadki sommatolaktotropowej GH4C1 w pożywce F10 Hama uzupełnionej 15% surowicą końską i 2% płodową surowicą cielęcą. Hoduj komórki aż do zbiegu na 78,5 cm2 płytkach hodowlanych. Odpowiada to w przybliżeniu 1 x 107 komórek.
    2. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z konfluentującej się płytki hodowlanej GH4C1 o długości 78,5 cm2, a następnie przepłukać 1 x objętością pożywki roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
    3. Utrwalić komórki 1% roztworem paraformaldehydu w PBS (10 ml na szalki o długości 78,5cm2); roztwór ten musi być świeżo przygotowany z 4% roztworu podstawowego paraformaldehydu. Sieciowanie pod wpływem mieszania przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    4. Stłumić działanie paraformaldehydu, dodając 1/10 objętości glicyny 1,25 M (1 ml na 10 ml roztworu paraformaldehydu); mieszać 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Wyrzuć pożywkę przez aspirację i spłucz dwa razy (5 min) 1X objętością pożywki PBS.
    6. Dodać objętość PBS odpowiadającą 1/10 objętości pożywki, zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieść do probówki wirówkowej.
    7. Wirować z prędkością 510 g w temperaturze 4 °C przez 5 min.
    8. Usunąć jak najwięcej supernatantu.
    9. Przechowuj granulki w nieskończoność w razie potrzeby w temperaturze -80 °C.
  2. Sieciowanie tkanek
    1. Umieścić 5 mg świeżo uzyskanej tkanki przysadki mózgowej myszy w roztworze 1% paraformaldehydu rozcieńczonego w PBS (około 10x objętość tkanki), mieszać przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Stłumić działanie paraformaldehydu, dodając 1,25 M roztworu glicyny (1 ml na 10 ml roztworu paraformaldehydu) i mieszać przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Wyrzucić pożywkę przez aspirację i spłukać dwukrotnie PBS (około 10x objętość tkanki). Usunąć jak najwięcej supernatantu.
    4. Usieciowaną tkankę przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.

3. Liza komórek lub tkanek

  1. Przygotuj bufor do lizy (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA, 1% SDS uzupełniony 200 U/ml roztworu inhibitora RNAzy i koktajl inhibitora proteaz 5 μL/ml).
  2. Aby uzyskać lizowane próbki bez uprzedniego rozmrażania, należy ponownie zawiesić granulki komórek lub usieciowane tkanki za pomocą tego buforu (około 1 ml na 100 mg osadu komórkowego lub tkanki). Z osadu komórkowego otrzymanego z 1 x 107 komórek powstaje próbka poddana lizie zawierająca około 20 mg białka.
    UWAGA: W zależności od użytej tkanki należy dodać etap mechanicznego rozerwania. W takim przypadku ważne jest, aby unikać podgrzewania próbek podczas tego dodatkowego etapu.

4. Sonikacja

  1. Optymalizacja warunków sonikacji
    1. Zaprogramuj sonikator z 2 do 5 seriami 30 s ON i 30 s OFF.
    2. Wykonać testy w celu optymalizacji warunków sonikacji na rozcieńczonych próbkach zlizowanych (współczynnik rozcieńczenia 1/2 lub 1/4 odpowiadający około 10 lub 5 mg białka). Umieścić rozcieńczone próbki lizy w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C i rozpocząć serię sonikacji.
    3. Oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA lub odczynnika do izolacji RNA (np. Trizol).
    4. Załaduj całość oczyszczonego RNA na 1% elektroforezę w żelu agarozowym do buforu TBE, sprawdź długość fragmentów RNA. Długość ta powinna wynosić od 200 do 800 bp.
      UWAGA: W zależności od wielkości fragmentu RNA, skuteczność antysensownych sond oligonukleotydowych może się różnić. Następnie zaleca się sprawdzenie skuteczności sond w różnych warunkach sonikacji.
  2. Sonikacja próbek poddanych lizie
    1. Umieścić próbki poddane lizie odpowiadające 20 mg białek (otrzymanych po kroku 3.2) w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C i rozpocząć serię sonikacji zgodnie z optymalizacją w kroku 4.1.
    2. Bezpośrednio po sonikacji odwirować przez 5 minut przy 12 000 g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do nowych probówek wirówkowych.
      UWAGA: Aby zapewnić jednorodność, na tym etapie można łączyć i redystrybuować replikowane supernatanty.

5. Ściąganie RNA

  1. Dzień 1 – etap hybrydyzacji
    1. Dodać 2 objętości buforu hybrydyzacyjnego (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS, 15% formamidu dodane doraźnie) do supernatantów zebranych po etapie sonikacji. Wir.
    2. Przenieść 20 μl każdej próbki do probówki wirówkowej (próbki wejściowe) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Dodać 100 pmol biotynylowanych sond oligonukleotydowych (swoistych lub niespecyficznych; patrz tabela 1) do każdej próbki. Inkubować przez 4 do 6 godzin przy umiarkowanym mieszaniu na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej.
    4. Dodać 50 μl magnetycznych kulek streptawidyny uzupełnionych 200 U/ml roztworu inhibitora RNAzy i koktajlem inhibitora proteaz 5 μL/ml.
    5. Inkubować przez noc przy umiarkowanym mieszaniu na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej.
  2. Dzień 2 – etap izolacji RNA
    1. Użyj podparcia magnetycznego, aby oddzielić kulki od lizatu komórkowego, wyrzuć supernatant i przemyj kulki 900 μl buforu do przemywania (SDS 0,5%, SSC 2x). Powtórz 5 razy przeplatane 5-minutowym mieszaniem na rotatorze w temperaturze pokojowej.
    2. Po ostatnim przemyciu zdekantować po raz ostatni i dodać do próbek 95 μl buforu Proteinease K (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) i 5 μL proteinazy-K (20 mg/ml).
    3. Na lodzie rozmrozić próbki wejściowe (20 μl) i dodać 75 μl buforu proteinazy K i 5 μl proteinazy K (20 mg/ml).
    4. Inkubować wszystkie próbki z proteinazą K przez 45 minut w temperaturze 50 °C, a następnie 10 minut w temperaturze 95 °C.
    5. Schłodzić próbkę na lodzie przez 3 minuty przed oddzieleniem kulek od RNA za pomocą nośnika magnetycznego. Zachowaj supernatant i wyrzuć koraliki.
    6. Oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, który powinien zawierać etap trawienia DNA. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
    7. Przeprowadzić qPCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) przy użyciu zestawu RT, a następnie qPCR przy użyciu określonych starterów (Tabela 1).
    8. Skonstruuj dwie biblioteki DNA odpowiadające dwóm pulom RNA uzyskanym za pomocą każdej ze specyficznych sond Neat1 (Tabela 1). Wykonuj sekwencjonowanie w systemie sekwencjonowania nowej generacji.

Wyniki

Kilka ostatnich badań wykazało, że lncRNA odgrywają kluczową rolę w niemal każdym istotnym procesie biologicznym i że rola ta jest realizowana poprzez kontrolę ekspresji genów zachodzącą zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i posttranskrypcyjnym, wykazując w tym drugim przypadku, że RNA mogą być celem lncRNA6.

lncRNA Nuclear enriched abundant transcript 1 (Neat1) bierze udział w różnych neuropatologiach, takich jak otępienie czołowo-skroniowe, stwardnienie zanikowe boczne lub epilepsja8,9,10, a także wykazuje nieprawidłową regulację w różnych nowotworach11,12.

Znane jest również to, że ten lncRNA stanowi komponent strukturalny specyficznych ciałek jąder komórkowych, tzw. paraspeckli, i bierze udział w potranskrypcyjnej regulacji okołodobowej ekspresji genów13. Paraspeckle, które występują w każdym jądrze komórkowym i formują się nie tylko wokół Neat1 (który jest niezbędny do ich powstania), ale także wokół kilku białek wiążących RNA (RBP)14, potrafią zatrzymywać docelowe cząsteczki RNA w obrębie jądra15. Formowanie się paraspeckli odbywa się poprzez asocjację różnych komponentów. Wykazano, że proces ten wykazuje rytm okołodobowy, co prowadzi do rytmicznego zatrzymywania docelowych RNA w jądrze13. Retencja docelowych RNA w jądrze przez paraspeckle może następować poprzez wiązanie z białkami RBP lub bezpośrednio poprzez asocjację RNA/RNA, jednak zakres cząsteczek RNA będących celami paraspeckli wymagał określenia. Aby zidentyfikować RNA będące bezpośrednimi lub pośrednimi celami Neat1, opracowano protokół pull-down RNA, który umożliwia izolację i identyfikację wszystkich celów RNA Neat1 w hodowlach komórkowych, jak i w próbkach tkanek (patrz Rysunek 1 w celu zapoznania się z graficzną prezentacją techniki).

Protokół ten został również z powodzeniem zastosowany do identyfikacji celów RNA dla innego lncRNA, Metastasis Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1 (Malat1). Malat1 jest wysoce konserwatywnym i ekspresyjnym lncRNA, który znajduje się w grudkach jądrowych wraz z kilkoma czynnikami splicingu RNA. Znane jest, że Malat1 uczestniczy w regulacji splicingu kilku nowo powstałych pre-mRNA16,17.

Swoiste (SO) i nieswoiste sondy oligonukleotydowe (NSO) zostały opracowane zgodnie z opisaną tutaj strategią projektowania sond. Strategia ta opiera się na wyborze regionów wykazujących niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad, zgodnie z przewidywaną strukturą drugorzędową lncRNA, oraz na zaprojektowaniu swoistych sond o silnym powinowactwie do tych regionów. Jako reprezentatywny wynik tych przewidywań bioinformatycznych, na Rysunku 2 przedstawiono obraz przewidywanej struktury drugorzędowej sekwencji Neat1 (nukleotydy 1480 do 2000) wraz z położeniem dwóch zaprojektowanych sond SO.

Zaprojektowane sondy były skierowane przeciwko rat Neat1 lub Malat1 dla hodowli komórek GH4C1 oraz przeciwko mouse Neat1 dla ekstraktów z tkanki przysadki (Tabela 1). Względne wzbogacenie w Neat1 lub Malat1 obliczono dla sond nieswoistych i swoistych w stosunku do próbek wejściowych (input). Rycina 3 przedstawia wydajność swoistych sond w wyłapywaniu (pull-down) Neat1 w linii komórkowej przysadki szczura GH4C1 (Rycina 3A) oraz w ekstraktach z tkanki przysadki myszy (Rycina 3B). Podczas stosowania protokołu projektowania sond w celu wytworzenia swoistych sond oligonukleotydowych (SO) skierowanych przeciwko Malat1, uzyskano jedną wydajną sondę, natomiast druga nie była wystarczająco wydajna i została odrzucona (Rycina 4A).

Po przeprowadzeniu procedury RNA pull-down, a następnie eksperymentów RT-qPCR, wykazano, że niektóre cząsteczki RNA oceniane za pomocą specyficznych starterów (Tabela 1) są powiązane z Neat1 lub Malat1 w ekstraktach z komórek GH4C1. Wykazano również, że RNA powiązane z Neat1 w ekstraktach z komórek GH4C1 są powiązane z Neat1 w ekstraktach z tkanki przysadki. Rzeczywiście, po wykonaniu RNA pull-down dla Neat1 stwierdzono, że Malat1 jest celem dla Neat1 zarówno w linii komórkowej GH4C1, jak i w ekstraktach z tkanki przysadki myszy (Rysunek 5A). Odwrotnie, po wykonaniu RNA pull-down dla Malat1 z użyciem specyficznej sondy w komórkach GH4C1, odnotowano znaczące wzbogacenie o Neat1 (Rysunek 4B). Podkreślając bliską relację między tymi dwoma lncRNA, wyniki te są zgodne z potencjalną rolą koregulacyjną Neat1 i Malat1 sugerowaną przez myszy z nokautem Malat1, u których obserwuje się zmienność w ekspresji RNA Neat118,19. Transkrypty dwóch głównych hormonów przysadki, hormonu wzrostu (Gh) (Rysunek 5B) oraz prolaktyny (Prl) (Rysunek 5C), były znacząco wzbogacone po RNA pull-down dla Neat1 z użyciem specyficznych sond zarówno w komórkach GH4C1, jak i w ekstraktach z przysadki, co sugeruje możliwą regulację tych dwóch hormonów przez Neat1. Przy porównaniu dwóch zastosowanych specyficznych sond okazało się, że ich wydajność może się różnić w zależności od rozważanego celu RNA (Rysunek 5B oraz Rysunek 5C). Wyniki te podkreślają konieczność zaprojektowania kilku specyficznych sond w celu wybrania tych, które wykazują nie tylko najlepszą wydajność we wzbogacaniu lncRNA w procedurze pull-down, ale także najwyższą wydajność we wzbogacaniu jego celów RNA.

Metodę RNA pull-down można uzupełnić o wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA w celu uzyskania kompleksowej listy celów RNA dla badanego lncRNA13. Przeprowadzono analizę RNA-seq komórek przysadki GH4C1 po wykonaniu RNA pull-down dla Neat1 z użyciem dwóch opisanych powyżej specyficznych sond. Należy zaznaczyć, że kontrola negatywna z użyciem NSO również mogłaby zostać poddana analizie RNA-seq, gdyby ilość RNA odzyskana po RNA pull-down z NSO była wystarczająca do konstrukcji bibliotek. W poprzednich doświadczeniach nie było tak13. Biblioteki wygenerowane po użyciu specyficznych sond przeanalizowano za pomocą rurociągu Tophat/cufflinks20 i uwzględniono jedynie transkrypty o wartościach fragmentów na kilobaza na milion zmapowanych odczytów (FPKM) wyższych niż 1. Listy uzyskane za pomocą dwóch specyficznych sond skierowanych przeciwko Neat1 (Tabela 1) zestawiono w celu oceny specyficzności wyników. Znaleziono 4 268 genów powiązanych z paraspeckles, co stanowiło 28% ekspresyjne transkryptów w komórkach GH4C113. Zgodnie z wynikami uzyskanymi w analizie qPCR (Rysunek 5A-C), stwierdzono, że transkrypty Gh, Prl i Malat1 są powiązane z Neat1. Metoda RNA pull-down okazała się zatem wydajnym narzędziem do badania oddziaływań między lncRNA a ich celami RNA.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przebieg procedury RNA pull down. Pierwszego dnia komórki lub tkanki poddano sieciowaniu paraformaldehydem, lizie oraz sonikacji przed etapem hybrydyzacji, który przeprowadzono poprzez dodanie specyficznych sond biotynylowanych. Następnie dodano magnetyczne kulki z streptawidyną, aby oddzielić specyficzny materiał od pozostałej części lizatu komórkowego. Drugiego dnia kulki wyizolowano za pomocą magnesu i kilkukrotnie przemyto. Etap odsieciowania pozwolił na odzyskanie RNA, które po oczyszczeniu wykorzystano do analizy RT-qPCR lub RNA-seq. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Struktura drugorzędowa sekwencji Neat1 (nukleotydy 1 480 do 2 000) przewidziana za pomocą narzędzia bioinformatycznego (serwer sieciowy RNAstructure; struktura o najniższej energii swobodnej). Struktura jest pokolorowana zgodnie ze stopniem prawdopodobieństwa parowania zasad. Dwie sondy oligonukleotydowe (SO1 i SO2) zaznaczone na czerwono są rozmieszczone wzdłuż struktury RNA Neat1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Walidacja qPCR wzbogacenia Neat1 w stosunku do materiału wejściowego. Walidacja qPCR wzbogacenia Neat1 w stosunku do materiału wejściowego po wyciąganiu (pull down) RNA Neat1 za pomocą dwóch różnych specyficznych sond (SO1-rn i SO2-rn dla komórek GH4C1 oraz SO1-mm i SO2-mm dla tkanki przysadki) w porównaniu z sondą niespecyficzną (NSO-rn dla komórek GH4C1 oraz NSO-mm dla tkanki przysadki) w szczurzych komórkach GH4C1 (A) i w ekstraktach z mysiej tkanki przysadki (B). Wyniki przedstawiają średnią ± SEM uzyskaną w 3 do 10 eksperymentach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4

Rysunek 4: Walidacja qPCR wzbogacenia Malat1 i Neat1 w stosunku do materiału wejściowego po pull-down RNA Malat1. Walidacja qPCR wzbogacenia Malat1 (A) oraz Neat1 (B) w stosunku do materiału wejściowego po pull-down RNA Malat1 za pomocą dwóch różnych specyficznych sond (SO3-rn i SO4-rn) w porównaniu z sondą niespecyficzną (NSO-rn) w szczurzych komórkach GH4C1. Wyniki stanowią średnią ± SEM uzyskaną w 3 eksperymentach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Walidacja qPCR wzbogacenia Malat1, Gh, Prl w stosunku do materiału wejściowego po immunoprecypitacji RNA Neat1. Walidacja qPCR wzbogacenia Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) w stosunku do materiału wejściowego po immunoprecypitacji RNA Neat1 przy użyciu różnych specyficznych sond w porównaniu z sondą niespecyficzną w komórkach szczura GH4C1 i ekstraktach z tkanki przysadki mysiej. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM uzyskana w 3 do 8 eksperymentach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

NAZWY SONDSekwencje
NSO-RnTAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-RnCTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-RnGCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC
SO3-RnAACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-RnAAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
NSO-mmGTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mmGCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mmCTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA
STARTERY qPCR :
Rattus norvegicus
Neat1AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
Gh1CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
PrlTGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA
Mus musculus
Neat1TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
Gh1CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
PrlTGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA

Tabela 1: Sekwencje sond oligonukleotydowych DNA i starterów do qPCR

Dyskusja

Długie niekodujące RNA (lncRNA) pod względem liczby i różnorodności stanowią dużą dziedzinę badań, a większość ich ról nie została jeszcze odkryta. Wiele z tych lncRNA ma lokalizację jądrową, a niektóre z nich są zaangażowane w regulacyjne szlaki ekspresji genów poprzez mechanizmy transkrypcyjne lub potranskrypcyjne. Jednym z obecnych wyzwań w tej dziedzinie jest zrozumienie znaczenia tych lncRNA w potranskrypcyjnym przetwarzaniu RNA. W tym celu należy zidentyfikować RNA, na które ukierunkowane są lncRNA. Zainspirowani wcześniejszymi badaniami skupiającymi się na asocjacji lncRNA z chromatyną, opracowaliśmy procedurę, która pozwala na identyfikację RNA związanych z lncRNA. Sukces tego protokołu, nazwanego RNA pull-down, zależy głównie od dwóch kluczowych etapów, a mianowicie zaprojektowania antysensownych sond oligonukleotydowych DNA, które muszą specyficznie i wyłącznie hybrydyzować z lncRNA będącym przedmiotem zainteresowania, oraz warunków utrwalenia tkanek lub komórek, które muszą zachować integralność sieci między wszystkimi partnerami molekularnymi.

Wcześniej opublikowane protokoły zawierały procedury izolacji lncRNA wraz z powiązanymi z nim sekwencjami chromatyny (ChIRP 1,2, WYKRES 3,4). W tych protokołach zastosowano różne strategie w celu zaprojektowania antysensownych sond oligonukleotydowych biotynylowanych DNA. W procedurze ChIRP autorzy wykorzystali pulę biotynylowanych sond oligonukleotydowych DNA obejmujących całą długość interesującego lncRNA po wykluczeniu wszystkich nadmiarowych i niespecyficznych sond 1,2. W protokole CHART autorzy zidentyfikowali regiony lncRNA, które są bardziej dostępne do hybrydyzacji i zaprojektowali oligonukleotydy wychwytujące, które celują w te regiony. Regiony te zostały wybrane na podstawie ich czułości na RNazę-H. Rzeczywiście, wykorzystując właściwość RNAse-H do hydrolizy RNA w miejscach wiązania RNA-DNA, oligonukleotydy, które hybrydyzują z dostępnymi miejscami w lncRNA, wytwarzają hybrydy RNA-DNA i prowadzą do enzymatycznego rozszczepienia lncRNA. Autorzy wybrali trzy z tych kandydujących oligonukleotydów wychwytujących i wykorzystali je w koktajlu 3,4.

Procedura, którą zastosowaliśmy do zaprojektowania antysensownych sond oligonukleotydowych biotynylowanych DNA, była zbliżona do tej zastosowanej w protokole CHART, ale dostępne do hybrydyzacji regiony pożądanego lncRNA nie zostały wybrane na podstawie ich wrażliwości RNAse-H, ale zgodnie z ich niskim prawdopodobieństwem wewnętrznego parowania zasad, jak określono za pomocą bioinformatycznego modelowania struktury drugorzędowej lncRNA. Należy zauważyć, że różne struktury drugorzędowe będą przewidywane przy użyciu różnych algorytmów, a sondy do wyboru powinny to te, które hybrydyzują z dostępnymi sekwencjami lncRNA w największej liczbie przewidywanych struktur drugorzędowych. Te same wyniki uzyskano przy użyciu koktajlu trzech zaprojektowanych, specyficznych sond lub pojedynczej sondy indywidualnie. Skłoniło to do zastosowania dwóch oddzielnych, specyficznych sond i rozważenia pozytywnych wyników jako tych, które są wspólne dla tych dwóch sond. Wreszcie, zaleca się zatem na początku opracowywania metody, w celu uzyskania optymalnego wyniku i możliwości oceny swoistości wyników pull-down, zaprojektowanie 3 różnych antysensownych sond oligonukleotydowych, a następnie porównanie eksperymentalne ich wydajności, zwłaszcza że wydajność sondy może ulec zmianie przez przygotowanie lizatu komórkowego. Niemniej jednak zastosowana przez nas procedura projektowania sondy w oparciu o bioinformatyczne modelowanie struktury drugorzędowej lncRNA pozostała tańsza niż ta oparta na pulach kafelkowych sond oligonukleotydowych2 i była mniej czasochłonna niż metoda oparta na czułości RNAse-H4.

Kontrolę ujemną należy również przeprowadzić przy użyciu oligonukleotydu wychwytu ujemnego albo biotynylowanych sond oligonukleotydowych sensownego DNA, albo zaszyfrowanych sond oligonukleotydowych, albo oligonukleotydów skierowanych przeciwko niespokrewnionemu RNA. Ze względu na istnienie naturalnych transkryptów antysensownych lncRNA, użycie sensownych sond oligonukleotydowych może być czasami niewystarczające. Niezależnie od sondy oligonukleotydowej wybranej do kontroli ujemnej, konieczne jest sprawdzenie za pomocą blasku, czy nie hybrydyzuje ona ze znanym RNA i należy pamiętać, że ten oligonukleotyd może hybrydyzować do wciąż nieoznaczonego lncRNA.

Lizaty komórkowe użyte w tych eksperymentach z RNA pull-down uzyskano z 106 do 107 komórek podczas pracy z hodowanymi komórkami i od 1 do 10 mg podczas pracy z tkanką. Przygotowanie lizatów komórkowych musi być dostosowane do użytej tkanki lub typu komórki, z dwoma głównymi etapami, które należy zoptymalizować: a mianowicie etapem sieciowania, który umożliwia tworzenie wiązań kowalencyjnych między lncRNA a jego partnerami molekularnymi, oraz etapem sonikacji, który zmniejsza lepkość poprzez rozdrabnianie chromatyny.

Celem etapu sieciowania jest zapewnienie, że wszystkie cele RNA pozostaną zamknięte dla lncRNA poprzez indukowanie tworzenia sieci między wszystkimi partnerami molekularnymi. Etap obróbki paraformaldehydem, który utworzy wiązania kowalencyjne między lncRNA a jego partnerami, pozwala na siateczkowanie sieci. W protokole CHART zasugerowano, aby w przypadku pracy z jądrowym lncRNA przeprowadzić pierwszą obróbkę paraformaldehydem na lizacie całej komórki i drugą obróbkę na izolowanej frakcji jądrowej 3,4. Zaobserwowaliśmy, że ten dodatkowy krok zmniejszył wydajność sond, prawdopodobnie poprzez zmniejszenie dostępności lncRNA w komórkach. W związku z tym stopień siateczkowania przez paraformaldehyd musi być dostosowany z uwzględnieniem użytego typu komórki lub tkanki, lokalizacji interesującego lncRNA oraz wydajności zaprojektowanych sond.

Podczas lizy komórek chromatyna jest uwalniana w lizacie i zwiększa jego lepkość; następnie konieczne jest rozdrobnienie chromatyny za pomocą sonikacji, aby zwiększyć płynność próbek, a tym samym ułatwić dostęp sond oligonukleotydowych do interesującego lncRNA. Jednak sonikacja rozdrobni również RNA wyekstrahowane za pomocą lncRNA, które są przedmiotem zainteresowania. Ważne jest więc, aby zminimalizować czas sonikacji w taki sposób, aby skutecznie zmniejszał lepkość lizatu, ale pozwalał również na uzyskanie fragmentów RNA o długości mieszczącej się w przedziale 200-800 pz. Należy pamiętać, że czas sonikacji będzie w dużym stopniu zależał zarówno od ilości, jak i rodzaju użytej tkanki lub hodowanych komórek.

Podsumowując, opisana tutaj procedura umożliwia w ciągu 2-3 dni wychwycenie celów RNA pożądanego lncRNA. W połączeniu z RT-qPCR, metody te pozwolą na poszukiwanie specyficznego związku i regulacji mRNA przez pożądane lncRNA jako podejście kandydujące. W przypadku podejścia obejmującego cały genom, eksperymenty z RNA pull-down mogą być analizowane za pomocą wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, co pozwala na odzyskanie wszystkich RNA związanych z pożądanym lncRNA. Niezależnie od wybranej strategii analitycznej, procedura RNA pull-down powinna dostarczyć nowej istotnej wiedzy na temat regulacji RNA przez lncRNA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Aix-Marseille i CNRS oraz finansowana przez grant z Laboratoriów Pfizer.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bioruptor PlusDiagenodeB01020001Sonicator
Dynabeads My OneThermo-Fisher65001Magnetyczne kulki streptawidyny
FormamidThermo-Fisher15515-026
Aparat do elektroforezy żelowejAdvanceMupid-OneAparatura do elektroforezy żelowej
Proteinaza KSigmaP2308
Zestaw do oczyszczania RNA XSMacherey-Nagel740902do oczyszczania RNA
RNAseOUTThermo-Fisher10777-019Inhibitor RNAzy
TrizolThermo-Fisher15596018Probówka do oczyszczania RNA
SB2Eppendorf rotator
RNA do DNAThermo-Fisher4387405Reverse zestaw do transkrypcji
iTaq Uniwersalny SYBR Green SupermixOdczynnik1725124qPCR
BioRad Zastosowany aparat 7500 FastThermo-Fisher4351107qPCR
Zestaw do przygotowania próbki mRNA Illumina TruSeq Zestaw dobudowy biblioteki DNAIllumina
20020594 System NextSeq 500IlluminaSY-415-1002NGS
zestaw Stuart

Bibliografia

  1. Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol Cell. , 667-678 (2011).
  2. Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp. , e3912(2012).
  3. Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).
  4. Simon, M. D. Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART). Curr Protoc Mol Biol. , Unit 21.25 (2013).
  5. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
  6. Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions. Biochem J. , 2925-2935 (2017).
  7. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).
  8. Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., König, J., Hortobágyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nat Neurosci. , 452-458 (2011).
  9. Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis. Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).
  10. Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O'Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states. Sci Rep. , 40127(2017).
  11. Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity. Nat Med. , (2016).
  12. Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer. Oncotarget. , (2017).
  13. Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., François-Bellan, A. M. Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. Elife. , (2016).
  14. Fox, A. H., Lamond, A. I. Paraspeckles. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , Available from: http://cshperspectives.cshlp.org/content/2/7/a000687.long (2010).
  15. Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. Alu element-mediated gene silencing. EMBO J. , 1694-1705 (2008).
  16. Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Mol Cell. , 925-938 (2010).
  17. Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites. Cell. , 188-199 (2014).
  18. Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice. RNA. , (2012).
  19. Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult. Cell Rep. , 111-123 (2012).
  20. Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sondy oligonukleotydowemodelowanie bioinformatycznesieciowanie kom reksieciowanie tkanekkulki magnetyczneizolacja RNAsekwencjonowanie wysokoprzepustowe
Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.