Artykuł metodologiczny

Mysi model częściowej niedrożności jelit

DOI:

10.3791/57381

⸱

5 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology, Wonkwang Digestive Disease Research Institute and Institute of Wonkwang Medical Science, School of Medicine, Wonkwang University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedrożność jelit to częściowe lub całkowite zablokowanie jelita, które może powodować silne bóle brzucha, nudności, wymioty i uniemożliwiać oddawanie stolca. Ta procedura tworzenia częściowych zatkań jelit u myszy jest wiarygodna w badaniu mechanizmów leżących u podstaw patologicznego wzrostu i śmierci komórek w jelicie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedrożność jelit, która utrudnia lub blokuje ruchy perystaltyczne, może być spowodowana przez zrosty brzuszne i większość chorób przewodu pokarmowego, w tym narośla nowotworowe. Jednak mechanizmy przebudowy komórkowej zaangażowane w niedrożność jelit i spowodowane przez nią są słabo poznane. Opracowano kilka zwierzęcych modeli niedrożności jelit, ale model mysi jest najbardziej efektywny pod względem kosztów i czasu. Model mysi wykorzystuje chirurgiczną implantację częściowej niedrożności jelit (PO), która ma wysoki wskaźnik śmiertelności, jeśli nie zostanie wykonana prawidłowo. Ponadto myszy poddawane operacji PO nie rozwijają przerostu, jeśli odpowiednia blokada nie jest używana lub nie jest prawidłowo umieszczona. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół operacji PO, który powoduje wiarygodne i powtarzalne niedrożności jelit o bardzo niskiej śmiertelności. Protokół ten wykorzystuje chirurgicznie umieszczony silikonowy pierścień otaczający jelito kręte, który częściowo blokuje ruchy trawienne w jelicie cienkim. Częściowa blokada powoduje rozszerzenie jelita z powodu zatrzymania ruchu trawiennego. Rozszerzenie jelita wywołuje przerost mięśni gładkich po stronie jamy ustnej pierścienia, który stopniowo rozwija się przez 2 tygodnie, aż spowoduje śmierć. Chirurgiczny mysi model PO oferuje model in vivo przerostowej tkanki jelitowej przydatny do badania patologicznych zmian komórek jelitowych, w tym komórek mięśni gładkich (SMC), komórek śródmiąższowych Cajala (ICC), PDGFRα + i komórek neuronalnych podczas rozwoju niedrożności jelit.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedrożność jelit to częściowa lub całkowita blokada w jelicie cienkim lub grubym, która uniemożliwia przemieszczanie się strawionego pokarmu, płynów i gazów przez jelita1. Z powodu niedrożności, blokada powoduje pogrubienie ścian jelita, zwężając lumen2. Niedrożność jelit może wystąpić w wyniku operacji jamy brzusznej lub miednicy, które powodują tworzenie się tkanki adhezyjnej w jamie brzusznej lub z zaburzeń przewodu pokarmowego, takich jak choroby zapalne jelit (choroba Leśniowskiego-Crohna), zapalenie uchyłków, przepukliny, skręt jelit, zwężenie, wgłobienie, zaparcia, zaklinowanie kału, pseudo-niedrożność, nowotwory i nowotwory3,4,5. Niedrożność jelit w tych przypadkach często prowadzi do przerostu tuniki mięśniowej jelita6.

PO światła wywołuje wzdęcie jelit i zwiększa grubość warstwy mięśni gładkich wokół przeszkody w odpowiedzi na potrzebę kontynuowania perystaltyki funkcjonalnej7,8,9,10,11,12,13. Modele zwierzęce jelitowego PO zostały opracowane do badania przerostu mięśni gładkich u myszy7, rats10, świnki morskie11, dogs12, oraz cats13, u których konsekwentnie rozwija się podobny przerost w warstwach mięśni jelitowych.

Mysi model jelitowego PO jest najbardziej opłacalnym sposobem generowania i badania niedrożności jelit in vivo. Niedrożność jelita cienkiego przeprowadza się u myszy za pomocą silikonowego pierścienia chirurgicznie umieszczonego wokół jelita krętego. Myszy PO wykazały wczesny wzrost liczby komórek (hiperplazja) i wzrost grubości warstwy mięśniowej (hipertrofia) po operacji PO8,15. SMC są pierwotnymi komórkami plastikowymi, które rosną w warstwach mięśni gładkich w odpowiedzi na warunki przerostowe14, ale inne komórki, takie jak komórki ICC i PDGFRα+, które są ściśle związane z SMC, są również ponownie zasiedlane. Wcześniej informowaliśmy, że myszy PO rozwijają przerost w jelicie cienkim, w którym SMC są dedyferencjowane na komórki PDGFRα +, które są wysoce proliferacyjne7,15,16. I odwrotnie, ICC ulegają zwyrodnieniu i utracie w przerośniętych warstwach mięśni gładkich podczas rozwoju niewydolności jelitowej7. Kolejną ważną zaletą modelu PO jest jego zdolność do wywoływania zmian w jelitowym układzie nerwowym i propagowania neurogennych wzorców motorycznych. Głównym rozprzestrzeniającym się neurogennym wzorcem motorycznym w jelicie cienkim myszy jest migrujący kompleks motoryczny (MMC), który jest neurogenny i nie wymaga ICC ani elektrycznych fal wolnoobrotowych17. Model PO może dostarczyć jasnego wglądu w to, w jaki sposób MMC i nerwy jelitowe są przebudowywane przez częściową niedrożność.

Tutaj proponujemy mysi protokół do operacji PO jelita za pomocą silikonowego pierścienia. Myszy poddawane operacji PO niezawodnie wytwarzają przerost w osłonce mięśniowej jelita cienkiego. W obrębie mięśni przerostowych SMC, ICC, PDGFRα + i komórki neuronalne ulegają dramatycznej przebudowie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Nevada-Reno (UNR) ds. Zasobów Zwierzęcych i jest zgodny ze wszystkimi instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt badawczych.

1. Zwierzęta.

  1. Zdobądź dojrzałe (4-6 tygodniowe) myszy C57BL/6 o wadze od 20 do 30 g. Trzymaj kolonię myszy laboratoryjnych w scentralizowanym obiekcie dla zwierząt w UNR Animal Resources.

2. Chirurgia częściowej niedrożności

UWAGA: Operacje są wykonywane w pomieszczeniu przeznaczonym do zabiegów chirurgicznych. Wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie przed zabiegiem. Sterylne fartuchy chirurgiczne i rękawiczki powinny być noszone przez cały personel na sali operacyjnej przez cały czas.

  1. Przygotowanie do myszy chirurgicznej
    1. Sprawdź system podawania środka znieczulającego, aby upewnić się, że dopływ tlenu i izofluranu jest odpowiedni do zabiegu. Włącz dopływ tlenu. Włącz przepływomierz gazu i ustaw go na 500-1000 ml/min. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i uszczelnij górę.
    2. Włącz waporyzator izofluranu na 5% i monitoruj zwierzę, aż stanie się leżące. Przełącz system podawania środka znieczulającego na stożek nosowy.
    3. Przepłukać komorę indukcyjną z resztkowego gazu tlenem, a następnie wyłączyć przewód komory indukcyjnej, pozostawiając otwartą linię stożka nosowego.
    4. Wyjmij zwierzę z komory i ostrożnie nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia.
    5. Umieść stożek nosowy na podgrzanej ciepłej podkładce, gdy gaz nadal przepływa.
    6. Zmienić przepływ tlenu na 100-200 ml/min, z 2-3% izofluranem. Jeśli zwierzę zacznie się poruszać, delikatnie przytrzymuj zwierzę ze stożkiem nosowym, aż do całkowitego znieczulenia.
    7. Monitorować oddech i reakcję na stymulację podczas zabiegu i w razie potrzeby dostosować zawartość procentową izofluranu (2-5%). Poziom znieczulenia zwierząt jest monitorowany przez brak odruchu szczypania palców u nóg przed wykonaniem operacji.
    8. Lek przeciwbólowy (buprenorfina, 1 μg/g masy ciała) wstrzyknąć dootrzewnowo z dala od miejsca nacięcia.
    9. Nałóż balsam do depilacji na brzuch za pomocą czystego bawełnianego wacika. Pozostaw balsam na 3-5 minut na myszy, a następnie usuń włosy za pomocą gazy i wacików. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie włosy zostaną usunięte z brzucha myszy.
    10. Oczyść skórę 70% etanolem za pomocą gazy i bawełnianych wacików. Zastosuj pateczki lub roztwór jodu powidonu, aby oczyścić brzuch.
  2. Operacja częściowej niedrożności
    1. Ułóż pole operacyjne za pomocą sterylnego papieru o wymiarach 25 x 50 cm z otworem o wymiarach 2,5 x 2,5 cm pośrodku na obszar operacyjny. Przymocuj serwetę do zwierzęcia, umieszczając sterylne paski na granicach otworu i skóry.
    2. Wykonaj nacięcie brzucha o długości ~3,0 cm za pomocą skalpela z ostrzem nr 15, upewniając się, że nacięta jest tylko skóra i unikając w tym czasie nacinania warstwy mięśniowo-otrzewnowej.
    3. Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych ostrożnie oddziel skórę od warstwy mięśniowo-otrzewnowej, nie powodując nacięcia warstwy mięśniowo-otrzewnowej. Po wystarczającym oddzieleniu warstw (około 1 cm x 4 cm) zidentyfikuj linię białą na warstwie mięśniowo-otrzewnowej i przetnij ~2 cm wzdłuż kresy białej, aby odsłonić jamę wewnątrzotrzewnową za pomocą mikrokleszczy i nożyczek.
    4. Ostrożnie zlokalizuj i zidentyfikuj jelito ślepe. Powoli i delikatnie wyjmij jelito ślepe z jamy wewnątrzotrzewnowej za pomocą mikrokleszczyków, przenosząc bliższą okrężnicę i jelito kręte z jelitem ślepym na zewnątrz na sterylną zasłonę. Natychmiast zwilżyć tkankę jelitową 0,9 % sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną i utrzymywać odsłoniętą tkankę w stanie zwilżonym przez cały czas, gdy znajduje się ona poza jamą brzuszną.
    5. Zlokalizuj i zidentyfikuj krezkę między jelitem krętym a bliższą okrężnicą. Wykonaj nacięcie (~1 cm) równolegle do jelita krętego i tuż pod nim w krezce i unikaj przecinania naczyń.
    6. Weź autoklawowany silikonowy pierścień (6 mm długości, 4 mm średnicy zewnętrznej, 3.5 mm średnicy wewnętrznej). Przetnij wzdłuż, aby otworzyć rurkę i otwórz pierścień za pomocą mikrokleszczyków.
    7. Przełóż jeden koniec otwartego pierścienia przez nacięcie w tkance krezki. Przywróć pierścień do gotowego kształtu pierścienia, stykając jeden koniec z drugim, przy czym jelito kręte jest otoczone pierścieniem.
    8. Upewnij się, że silikonowy pierścień całkowicie otacza jelito kręte, zamknij pierścień szwem i ostrożnie umieść jelita z powrotem w jamie wewnątrzotrzewnowej.
  3. Zamknięcie gabinetu
    1. Wykonaj prosty ciągły szew na warstwie mięśniowo-otrzewnowej wzdłuż linea alba, aby zamknąć ranę mięśniowo-otrzewnową za pomocą wchłanialnego szwu. Po wykonaniu szwu należy oczyścić krwawienie z 0,9% sterylnej gazy nasączonej solą fizjologiczną.
    2. Aby całkowicie zamknąć ranę, za pomocą oddzielnego nylonowego szwu, wykonaj prosty ciągły szew na skórze.
    3. Po wykonaniu obu szwów oczyść ranę nowym szpacikiem lub jodowidonem.
    4. Dootrzewnowo wstrzyknąć antybiotyki (gentamycyna, 150 μl na mysz w przeliczeniu na 20-30 g masy ciała).
    5. Po zakończeniu zabiegu należy wyłączyć parownik izofluranu i pozwolić zwierzęciu oddychać tylko płynącym tlenem, aż zacznie odzyskiwać przytomność.
    6. Gdy zwierzę się obudzi, umieść je w oddzielnym obszarze odzyskiwania ze wsparciem termicznym, aż w pełni wyzdrowieje.

3. Obserwacja pooperacyjna.

  1. Po zakończeniu operacji przenieś zwierzęta do inkubatora w pomieszczeniu pooperacyjnym, w którym regulowana jest temperatura i wilgotność. Monitoruj zwierzęta po operacji co 15 minut przez pierwszą godzinę, a następnie co 30 minut przez drugą godzinę, gdy zwierzęta znajdują się w inkubatorze.
  2. Jak tylko zalecana obserwacja zostanie zakończona, przenieś zwierzęta do ich indywidualnej klatki i monitoruj je codziennie pod kątem klinicznych oznak bólu18 oraz upewnij się, że rana pooperacyjna goi się prawidłowo, bez żadnych oznak powikłań (rozejścia się).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częściowa niedrożność (PO) została chirurgicznie wywołana u jednomiesięcznych myszy poprzez umieszczenie silikonowego pierścienia wokół jelita krętego w pobliżu zwieracza krętniczo-kątniczego. Pierścień ten spowodował częściową blokadę w jelicie krętym. Operacje pozorowane (SO) przeprowadzono również bez pierścienia na myszach dopasowanych pod względem wieku i płci, a myszy te nie wykazywały żadnych objawów podobnych do tych znalezionych u myszy PO. Myszy szybko wróciły do zdrowia po oper...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazaliśmy, że myszy poddawane operacji PO jelita konsekwentnie i powtarzalnie rozwijają przerost mięśni gładkich jelit, który naśladuje ludzką niedrożność jelit. Operacje niedrożności jelit zostały opracowane dla różnych zwierząt, w tym myszy7, szczurów10, świnek morskich11, psów12 i kotów13. Mysi model niedrożności jelit ma przewagę czasową, kosztową, rozmiarową i fenotypową nad innymi większymi mode...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Benjaminowi J. Weiglerowi, doktorowi nauk medycznych i Waltowi Mandeville'owi, doktorowi medycyny (Animal Resources & Campus Attending Veterinarian, University of Nevada, Reno) za doskonałe usługi dla zwierząt, które świadczyły myszy, a także za ich porady dotyczące procedur chirurgicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Serweta chirurgicznaArtykuły medyczne i weterynaryjneSMS4040" X100 jardów
Podkład, econ, pro plusArtykuły medyczne i weterynaryjneMSC28122417x24"
Nożyczki do tęczówkiBraintree scientific, IncSC-i-130
Nożyczki do tęczówkiVantageV95-304
Pęseta elektroniczna i jubilerska DumontDumont 98-180-3
Pleciony wchłanialny szewCovidien polysorbSL-5687G5-0, poliglaktyna
Nylon niewchłanialny monofilamentAD chirurgicznyS-N618R136-0, nylon
Ostrze chirurgiczneDynarexNo.15
Uchwyt igłyJacobson mikronaczyniowy36-1342TC8,5 cala
Rękojeść skalpelaFlinn scientificAB1049
Nożyczki mikrochirurgiczneWPI503305
Wazelina maść okulistycznaPuralube VET3,5 g
Fluriso (izofluran)VetoneV1 502017250 ml
Zamknięcie ze skórą wzmocnioną paskiem Steri-strip3MR1547
Rękawice chirurgiczneMedlineMSG2270
Maska na twarz z pętlą na uszyStrefa bezpieczeństwaRS700
Gąbki włókninowe z gazy AvantPRM25444pielęgnacyjny
Admiral  craft OYC-2725-A422,5 uncji
wacikaChloraPrep2601032% w/v chlorheksydyny  Glukonian (CHG) i 70% v/v Alkohol izopropylowy (IPA)
Aplikator z bawełnianą końcówkąPuritan806-WC
BuprenorfinaZoo pharmBZ80693171 mg/ml
Siarczan gentamycynyVetoneG-6336-04100 mg/ml
Szybko działający żelowy zmywacz w kremieVeet8111002
StrzykawkaAHSAH01T25161 ml z igłą
Pierścień silikonowyVWR60985-720o długości 6 mm, średnica zewnętrzna 4 mm, średnica wewnętrzna 3,5 mm
myszy C57BL/6The Jackson Laboratory4-6 tygodni

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Millat, B., Guillon, F. Physiopathology and principles of intensive care in intestinal obstructions. Rev Prat. 43, 667-672 (1993).
  2. Tonelli, P. New developments in Crohn's disease: solution of doctrinal mysteries and reinstatement as a surgically treatable disease. 1. The process is not a form of enteritis but lymphedema contaminated by intestinal contents. Chir Ital. 52, 109-121 (2000).
  3. Limsrivilai, J. Meta-analytic Bayesian model for differentiating intestinal tuberculosis from Crohn's disease. Am J Gastroenterol. 112, 415-427 (2017).
  4. Dvorak, D., Adamova, Z., Bar, T., Slovacek, R. Internal hernia as a cause of small bowel obstruction. Rozhl Chir. 96, 34-36 (2017).
  5. Massani, M., Capovilla, G., Ruffolo, C., Bassi, N. Gastrointestinal stromal tumour (GIST) presenting as a strangulated inguinal hernia with small bowel obstruction. BMJ Case Rep. , (2007).
  6. Chen, J., Chen, H., Sanders, M., Perrino, B. A. Regulation of SRF/CArG-dependent gene transcription during chronic partial obstruction of murine small intestine. Neurogastroenterol Motil. 20, 829-842 (2008).
  7. Chang, I. Y., et al. Loss of interstitial cells of Cajal and development of electrical dysfunction in murine small bowel obstruction. J Physiol. 536 (Pt 2), 555-568 (2001).
  8. Liu, D. H., et al. Voltage dependent potassium channel remodeling in murine intestinal smooth muscle hypertrophy induced by partial obstruction. PLoS One. 9 (2), e86109(2014).
  9. Guo, X., et al. Down-regulation of hydrogen sulfide biosynthesis accompanies murine interstitial cells of Cajal dysfunction in partial ileal obstruction. PLoS One. 7, e48249(2012).
  10. Yang, J., Zhao, J., Chen, P., Nakaguchi, T., Grundy, D., Gregersen, H. Interdependency between mechanical parameters and afferent nerve discharge in hypertrophic intestine of rats. Am J Physiol-Gastr L. 310, G376-G386 (2016).
  11. Zhao, J., Liao, D., Yang, J., Gregersen, H. Biomechanical remodeling of obstructed guinea pig jejunum. J Biomech. 43, 1322-1329 (2010).
  12. Bowen, E. J., et al. Duodenal Brunner's glade adenoma causing chronic small intestinal obstruction in a dog. J Small Anim Pract. 53, 136-139 (2012).
  13. Bettini, G., et al. Hypertrophy of intestinal smooth muscle in cats. Res Vet Sci. 75, 43-53 (2003).
  14. Macdonald, J. A. Smooth muscle phenotypic plasticity in mechanical obstruction of the small intestine. J Neurogastroenterol Motil. 20, 737-740 (2008).
  15. Ha, S. E., et al. Transcriptome analysis of PDGFRα+ Cells identifies T-types Ca2+ channel CACNA1G as a new pathological marker for PDGFRα+ cell hyperplasia. PLoS One. 12, e0182265(2017).
  16. Park, C., et al. Serum response factor is essential for prenatal gastrointestinal smooth muscle development and maintenance of differentiated phenotype. J Neurogastroenterol Motil. 21, 589-602 (2015).
  17. Spencer, N. J., Sanders, K. M., Smith, T. K. Migrating motor complexes do not require electrical slow waves in the mouse small intestine. J Physiol. 553, 881-893 (2003).
  18. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7, 447-449 (2010).
  19. Terez, S. D., Notari, L., Sun, R., Zhao, A. Mechanisms of smooth muscle responses to inflammation. Neurogastroenterol Motil. 24, 802-811 (2012).
  20. Chen, W., et al. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. J Crohns Colitis. 11, 92-104 (2017).
  21. Huizinga, J. D., Chen, J. H. Interstitial Cells of Cajal: Update on Basic and Clinical Science. Curr Gastroenterol Rep. 16, 363(2014).
  22. Jirkof, P., Touvieille, A., Cinelli, P., Arras, M. Buprenorphine for pain relief in mice: repeated injections vs sustained-release depot formulation. Lab Animal. 49, 177-187 (2015).
  23. Spencer, N. J., Dinning, P. J., Brookes, S. J., Costa, M. Insights into the mechanisms underlying colonic motor patterns. J Physiol. 594, 4099-4116 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Implantacja pier cienia silikonowegohipertrofia mi ni g adkichkom rki Cajalakom rki PDGFR alfaanaliza tkanek przewodu pokarmowegoprotok procedury chirurgicznejmodel in vivoprzebudowa kom rkowa

Powiązane artykuły