Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Podsumowanie

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Streszczenie

Selektywna manipulacja subpopulacjami neuronów rdzeniowych została głównie osiągnięta za pomocą dwóch różnych metod: 1) Genetyka intersekcjonalna, dzięki której generowane są podwójne lub potrójne myszy transgeniczne w celu osiągnięcia selektywnej ekspresji genu reporterowego lub efektorowego (np. z locus Rosa26) w pożądanej populacji kręgosłupa. 2) Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem zależnym od Cre (rAAV); tutaj zależne od Cre wektory AAV kodujące wybrany gen reporterowy lub efektorowy są wstrzykiwane do rdzenia kręgowego myszy eksprymujących rekombinazę Cre w pożądanej subpopulacji neuronalnej. Protokół ten opisuje, jak generować zależne od Cre wektory rAAV i jak transdukować neurony w rogu grzbietowym odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego L3-L5 za pomocą rAAV. Ponieważ odcinki kręgosłupa lędźwiowego L3-L5 są unerwione przez te obwodowe neurony czuciowe, które przekazują informacje sensoryczne z kończyn tylnych, spontaniczne zachowanie i reakcje na testy sensoryczne stosowane do kończyny tylnej ipsilateralnie po stronie iniekcji mogą być analizowane w celu zbadania funkcji manipulowanych neuronów w przetwarzaniu sensorycznym. Podajemy przykłady, w jaki sposób ta technika może być wykorzystana do analizy genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów rdzeniowych. Główne zalety ekspresji transgenu za pośrednictwem wirusa u myszy transgenicznych Cre w porównaniu z klasyczną ekspresją transgenu indukowaną przez mysz reporterową są następujące: 1) Różne zależne od Cre rAAV kodujące różne białka reporterowe lub efektorowe mogą być wstrzykiwane do jednej linii transgenicznej Cre, pokonując w ten sposób potrzebę tworzenia kilku wielu linii transgenicznych myszy. 2) Iniekcja dordzeniowa ogranicza manipulację komórkami wykazującymi ekspresję Cre do miejsca wstrzyknięcia i do czasu po wstrzyknięciu. Główne wady to: 1) Ekspresja genu reporterowego z rAAV jest bardziej zmienna. 2) Operacja jest wymagana w celu transdukcji neuronów rdzeniowych, które są przedmiotem zainteresowania. To, która z tych dwóch metod jest bardziej odpowiednia, zależy od populacji neuronów i pytania badawczego, którym należy się zająć.

Wprowadzenie

Grzbietowy rdzeń kręgowy jest niezbędny do wymiany informacji między peryferiami ciała a mózgiem. Bodźce sensoryczne, takie jak ciepło, zimno, dotyk lub bodźce szkodliwe, są wykrywane przez wyspecjalizowane neurony obwodowe, które przekazują tę informację do neuronów rogu grzbietowego rdzenia kręgowego. W tym przypadku złożona sieć interneuronów hamujących i pobudzających moduluje i ostatecznie przekazuje informacje sensoryczne za pośrednictwem neuronów projekcyjnych rdzenia do miejsc nadrdzeniowych^1,2. Obliczenia przeprowadzane przez neurony międzyrdzeniowe i projekcyjne bramkują informacje sensoryczne, określając w ten sposób, które informacje są tłumione lub przekazywane z jaką intensywnością. Zmiany w integracji bodźców sensorycznych, takie jak zmieniona równowaga między hamowaniem a pobudzeniem, mogą powodować dysfunkcje sensoryczne, takie jak nadwrażliwość lub allodynia (bolesne odczucia po normalnie niebolesnej stymulacji). Uważa się, że zmiany te są podstawową przyczyną różnych przewlekłych stanów bólowych^3,4. W związku z tym obwody rdzeniowe mają duże znaczenie w przetwarzaniu sensorycznym, a co za tym idzie, w percepcji środowiska i siebie organizmu. Wraz z niedawnym pojawieniem się i połączeniem technik molekularnych, genetycznych i chirurgicznych, które pozwalają na precyzyjną manipulację genetycznie zidentyfikowanymi subpopulacjami neuronów rdzeniowych, naukowcy zaczynają teraz rozumieć podstawowe obwody rdzeniowe odpowiedzialne za przetwarzanie różnych modalności czuciowych.

Wstrzyknięcie dordzeniowe rAAV myszom typu dzikiego lub transgenicznego znacznie przyczyniło się do manipulacji, analizy i zrozumienia funkcji określonych podzbiorów neuronów rdzeniowych5^{,6,7,8,9,10,11}. Technika ta umożliwia dostarczanie białek markerowych (takich jak białka fuzyjne GFP/GFP), białek reporterowych (takich jak GCaMP) lub białek efektorowych (takich jak toksyny bakteryjne, rodopsyna kanałowa lub receptory farmakogenetyczne) w sposób ograniczony przestrzennie do neuronów rdzeniowych. Miejscowe wstrzyknięcie zależnych od Cre rAAV do myszy transgenicznych wykazujących ekspresję rekombinazy Cre w określonym podzbiorze neuronów rdzeniowych pozwala na specyficzną analizę odpowiedniej populacji neuronów. Zastosowaliśmy tę technikę do znakowania, ablacji, hamowania lub aktywacji rdzeniowych neuronów glicynergicznych, wykazując, że są one istotną częścią bramki rdzeniowej kontrolującej transmisję bólu i swędzenia⁷. W tych eksperymentach dordzeniowe wstrzyknięcie zależnego od Cre rAAV do myszy GlyT2::Cre umożliwiło selektywną manipulację neuronami glicynergicznymi w lędźwiowym rdzeniu kręgowym. W ten sposób można uniknąć jednoczesnej manipulacji obwodami nadrdzeniowymi, które zawierają neurony glicynergiczne krytyczne dla przetrwania zwierzęcia.

Podczas gdy dordzeniowe wstrzyknięcie rAAV ogranicza infekcję do miejsca wstrzyknięcia, transdukcja wirusa może wystąpić nie tylko w lokalnych neuronach, ale także w neuronach, które łączą się z miejscem wstrzyknięcia za pomocą projekcji aksonalnych. Ten ostatni jest często używany do śledzenia obszarów OUN dostarczających dane neuronalne do określonego jądra w mózgu. Zakażenie wypustek aksonalnych może być jednak również czynnikiem zakłócającym, gdy określona populacja neuronów ma być badana w określonym miejscu. Aby rozwiązać te problemy, przeprowadziliśmy niedawno kompleksową analizę serotypów AAV i kaset ekspresyjnych w celu zidentyfikowania serotypów i promotorów, które można wykorzystać do zminimalizowania lub maksymalizacji transdukcji wstecznej. W kontekście tych konkretnych badań w obwodach rdzeniowych przeanalizowaliśmy zdolność różnych serotypów i promotorów do wstecznej transdukcji neuronów w zwojach korzenia grzbietowego (DRG), rdzeniu rostralnym brzuszno-przyśrodkowym (RVM) i korze somatosensorycznej¹². Technika opisana w tym protokole może być zatem wykorzystana zarówno do analizy neuronów rdzeniowych w miejscu wstrzyknięcia, jak i do analizy neuronów projekcyjnych, które dostarczają dane wejściowe do miejsca wstrzyknięcia rdzenia kręgowego. W opisanym tutaj protokole wykonuje się trzy wstrzyknięcia rAAV po lewej stronie lędźwiowego rdzenia kręgowego, aby umożliwić transdukcję neuronów w trzech odcinkach lędźwiowych (L3-L5). Segmenty L3-L5 otrzymują większość bodźców czuciowych od kończyny tylnej ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia. Wykazaliśmy, że funkcjonalna manipulacja genetycznie znakowanymi neuronami w L3-L5 jest wystarczająca do wywołania silnych zmian w zachowaniu, dostarczając w ten sposób funkcjonalnych dowodów na funkcję obwodu takiego genetycznie znakowanego podtypu neuronu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez szwajcarskie kantonalne biuro weterynaryjne (Zurych) i są zgodne ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi.

UWAGA: Wszystkie materiały wraz z odpowiednimi producentami i/lub sprzedawcami są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Generowanie wektorów AAV zależnych od Cre

UWAGA: Można zakupić różne wektory zależne od Cre z różnymi promotorami (zobacz Tabelę Materiałów) lub, jeśli żądana konstrukcja wyrażenia nie jest dostępna, można ją wygenerować, modyfikując istniejące konstrukcje AAV. Należy zauważyć, że promotor i serotyp mogą mieć wpływ na rozprzestrzenianie się transdukcji wirusa (patrz ¹²). Pierwsza część tego protokołu pokrótce opisuje generowanie dwóch różnych wektorów AAV zależnych od Cre, odpowiednich do eksperymentów z wzmocnieniem i utratą funkcji.

1. Aktywacja farmakogenetyczna (wzmocnienie funkcji)
   1. Zamów pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry (patrz Tabela materiałów) dla receptorów projektanta aktywowanych wyłącznie przez aktywację za pośrednictwem (DREADD).
   2. Po otrzymaniu kultury bakteryjnej należy usunąć bakterie na płytkach LB (agar klasy bakteriologicznej rozpuszczony w płynnym podłożu Luria-Bertani) uzupełniony odpowiednim antybiotykiem. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i następnego dnia zebrać pojedynczą kolonię.
      UWAGA: Plazmidy zawierające genomy wektorów AAV mogą być niestabilne, a rekombinacja genomu wirusa, szczególnie w obrębie wirusowych powtórzeń odwróconego końca (ITR), może wystąpić podczas amplifikacji w E. coli. Sugerujemy stosowanie szczepów z niedoborem / supresją recA, takich jak MDS42 lub Stbl3, aby uniknąć rekombinacji w plazmidzie zawierającym genom AAV.
   3. Amplifikuj bakterie zgodnie z instrukcjami podanymi przez dostawcę wybranego zestawu DNA-Maxi-Kit i przygotuj wysokiej jakości plazmidowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu DNA-Maxi-Kit (np. patrz Tabela materiałów). Przeprowadzić kontrolę jakości preparatu plazmidowego DNA poprzez weryfikację integralności i tożsamości plazmidowego DNA poprzez trawienie restrykcyjne porcji plazmidowego DNA.
      UWAGA: W ITR znajdują się miejsca rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej SmaI. Włączenie skrótu SmaI do kontroli jakości w celu sprawdzenia integralności ITR.
   4. Wyślij DNA do centrum wektora wirusowego w celu wytworzenia wysokiej jakości rAAV.
      UWAGA: Wysokiej jakości preparaty wirusowe o wysokim mianie mają kluczowe znaczenie dla uniknięcia mylących fenotypów spowodowanych zanieczyszczeniami w preparacie wirusowym. W związku z tym zalecamy, aby wybrany rAAV był produkowany w uznanym zakładzie rdzeniowym dla wektorów, chyba że produkcja AAV jest dobrze ugruntowana w laboratorium.
2. Ablacja (utrata funkcji)
   UWAGA: Toksyny bakteryjne lub receptory toksyn mogą być wykorzystywane do pośredniczenia w ablacji komórek lub wyciszaniu neuronów. Wygenerowaliśmy pAAV.EF1α.flex. DTA do ekspresji fragmentu toksyny błoniczej A (DTA) w sposób zależny od Cre.
   1. Aby wygenerować wektor wirusowy zależny od Cre, należy wybrać wektor zależny od Cre z odpowiednim promotorem (np. pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplifikować wybraną sekwencję kodowania (np. DTA) przez reakcję łańcuchową polimerazy ze starterami, które zawierają AscI i NheI lub kompatybilne miejsca rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej w ich zwisach (patrz Foster i wsp.7)
   2. Korzystając ze standardowych technik biologii molekularnej, należy przeprowadzić trawienie restrykcyjne DNA wektora (pAAV.EF1α. FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) i wkładki amplifikowanej PCR (NheI-DTA-AscI) z endonukleazami restrykcyjnymi AscI i NheI. Ligować oczyszczone fragmenty.
   3. Przekształć reakcję ligacji w odpowiednie bakterie, zgodnie z protokołem dostarczonym przez dostawcę kompetentnych bakterii z wyboru, i umieść bakterie na płytkach LB. Użyj szczepów z niedoborem / supresją recA, takich jak MDS42 lub Stbl3, do klonowania, a następnie amplifikacji plazmidowego DNA.
   4. Następnego dnia po przemianie pobrać klony i zaszczepić je w pożywce LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wyekstrahuj plazmidowe DNA z hodowanych bakterii. Sprawdź, czy klonowanie zakończyło się sukcesem, poprzez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie wyekstrahowanego plazmidowego DNA.
   5. Amplifikacja wysokiej jakości, plazmidowego DNA z plazmidu bakteryjnego (patrz krok 1.1.3). Wyślij amplifikowane DNA do centrum wektora wirusowego w celu produkcji wirusa.

2. Transdukcja komórek rdzeniowych

1. Przygotowanie roztworu wirusa
   Uwaga: Wirusy są odczynnikami zakaźnymi i należy obchodzić się z nimi zgodnie z odpowiednimi wytycznymi. W większości przypadków z rAAV można obchodzić się na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL1).
   1. W dniu wstrzyknięcia należy rozmrozić na lodzie podstawową porcję pożądanego oczyszczonego wirusa i przechowywać ją na lodzie do momentu bezpośrednio przed wstrzyknięciem. Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ obniżają one efektywne miano wirusa.
      UWAGA: W razie potrzeby rozmrożoną porcję wirusa można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.
   2. Rozcieńczyć cząsteczki wirusa w sterylnym 0,9% NaCl lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
      UWAGA: Odpowiednie miano zależy od celów doświadczenia i powinno być wyznaczone doświadczalnie. Dobra całkowita wiremia na początek to 3x10⁹ kopii genomu (3,33x10¹² GC/mL, 3x300 nL wstrzyknięte). Biorąc pod uwagę nadmiar i pewne ubytki podczas obciążania kapilary, na każdą mysz będzie potrzebne około 2,5 μl roztworu wirusa.
2. Przygotowanie mikropipet do iniekcji dordzeniowych
   1. "Pociągnij" cienkościenne szklane kapilary (średnica zewnętrzna 1 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet, aby utworzyć płytki trzpień o długości ~5,5 mm. Użyć żarnika grzałki 3.0 mm i ustawień programu 00 z P(A) dostosowanych jak w tabeli 1.
      UWAGA: Ciągnięcie można wykonać z wyprzedzeniem. Wyciągnięte kapilary należy przechowywać w zamkniętym pojemniku na plastelinie, aby uniknąć pyłu, który mógłby później zatkać mikropipetę. Autoklawowanie mikropipet nie jest konieczne.
   2. Przyciąć trzon naciągniętej kapilary za pomocą kleszczy do laminektomii na długość około 4,5 do 5 mm, aby utworzyć otwór końcówki o średnicy wewnętrznej 25-35 μm. Za pomocą mikroskopu ze skalą mikrometryczną zmierz średnicę wewnętrzną kilku mikropipet, aby wyczuć, jak duży powinien być otwór, lub zmierz dla każdej mikropipety.
      UWAGA: Mniejsza końcówka może prowadzić do zatkania; Większa końcówka może spowodować uszkodzenie tkanek i trudności z penetracją rdzenia kręgowego.
3. Przygotowanie zestawu chirurgicznego i narzędzi
   1. Upewnij się, że sprzęt jest czysty i gotowy do użycia. Zdezynfekuj obszar roboczy, przecierając 70% etanolem i sterylizuj narzędzia, sterylizując je w autoklawie lub dezynfekując. Nie pozostawiaj żadnych środków dezynfekujących na strzykawce o pojemności mikrolitrów, które mogłyby zaszkodzić wektorowi wirusowemu, który ma być użyty.
4. Znieczulenie i przygotowanie zwierzęcia do zabiegu
   UWAGA: Całkowity czas trwania zabiegu to 60-90 min.
   1. Wybierz myszy w wieku od 6 do 10 tygodni, aby ułatwić zabieg chirurgiczny.
      UWAGA: Jeśli wymaga tego projekt doświadczalny, możliwe jest wstrzyknięcie młodszym lub starszym zwierzętom. W zasadzie można użyć dowolnego szczepu i obu płci, ale użyj tego samego szczepu tła (np. C57BL/6J) do porównania zachowań między różnymi liniami myszy transgenicznych. Jeśli spodziewane są różnice między płciami lub mają być zbadane, przeanalizuj samców i samice w oddzielnych grupach.
   2. Wywołaj znieczulenie za pomocą ~5% izofluranu. Umieść zwierzę w ramce stereotaktycznej na macie grzewczej i utrzymuj znieczulenie na poziomie 1-2,5% izofluranu (przepływ powietrza 900 ml/min). Monitoruj częstość oddechów przez cały czas trwania zabiegu.
   3. Nałóż lubrykantową maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
   4. Ogol grzbiet zwierzęcia i ostrożnie usuń sierść mokrymi chusteczkami. Zdezynfekuj ogoloną skórę roztworem jodu i pozostaw skórę do wyschnięcia.
   5. Podać leki przeciwbólowe (np. 0,1-0,2 mg/kg buprenorfiny podskórnie).
5. Odsłonięcie kręgosłupa na poziomie rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym
   UWAGA: Ze względu na zróżnicowany rozwój rdzenia kręgowego i kręgosłupa, odpowiednie poziomy nie są wyrównane, ale odcinek lędźwiowy rdzenia kręgowego L4 znajduje się na tym samym poziomie co kręg piersiowy T13.
   1. Zlokalizuj najbardziej ogonową parę żeber, badając palpacyjnie wzdłuż kręgosłupa. Za pomocą skalpela wykonaj 1,5-2,5 cm podłużne nacięcie w skórze, zaczynając od samej rostralnej do najbardziej ogonowej pary żeber.
   2. Podnieś skórę kleszczami i odłącz ją od leżącego poniżej mięśnia nożyczkami. Przez cały czas trwania zabiegu utrzymuj odsłonięte tkanki wilgotne za pomocą sterylnego 0,9% NaCl.
   3. Za pomocą cienkich kleszczyków i małych nożyczek wykonaj nacięcie w kolejnej, cienkiej błoniastej warstwie tuż obok linii środkowej i odetnij ją od wyrostków kolczystych. Jest oddzielony od leżącego poniżej mięśnia przykolcowego, ale połączony z wyrostkami kolczystymi.
6. Identyfikacja kręgów na poziomie rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym
   UWAGA: Po odsłonięciu kręgosłupa więzadła poprzeczne i wyrostki kolczyste grzbietowe powinny być widoczne. Kilka anatomicznych punktów orientacyjnych może pomóc w identyfikacji właściwego kręgu do celu (Rysunek 1B).
   1. Pociągnij skórę z powrotem w kierunku ogona, aby odsłonić grzebień biodrowy. Na tym samym poziomie najbardziej ogonowa para widocznych więzadeł międzypoprzecznych łączy się z wyrostkiem kolczystym L6. Policz wstecz w kierunku ogonowym do rostralnego, aby zidentyfikować interesujący Cię kręg
   .
   2. Badanie palpacyjne wzdłuż kręgosłupa. Najbardziej ogonowa para żeber znajduje się tuż rostralnie do kręgu T13, a kość miedniczna na poziomie bioder znajduje się na poziomie kręgu L6.
   3. Zlokalizuj miejsce, w którym ścięgno wzdłuż boku kręgosłupa jest najbielsze i najbardziej przyśrodkowe. Kręg T13 znajduje się tylko w promieniu rostralnym. Odcinek lędźwiowy rdzenia kręgowego L4 znajduje się w obrębie tego kręgu.
7. Zespolenie kręgosłupa i odsłonięcie lędźwiowego rdzenia kręgowego
   1. Umieść zwierzę na poduszce ze zwiniętych tkanek, aby podnieść je do zacisków rdzeniowych ramy stereotaktycznej.
   2. Zamocuj kręg docelowy, aby uniknąć ruchów kręgosłupa spowodowanych oddychaniem. W tym celu wyrównaj zaciski przylegające do kręgu docelowego, zamocuj jeden zacisk na miejscu i przytrzymaj kręgosłup za pomocą kleszczyków Adson, jednocześnie mocując drugi zacisk.
      UWAGA: Kolumna powinna być prostopadła do płaszczyzny wtrysku i mocno zamocowana, aby nie przesuwała się pod wpływem nacisku od góry. W razie potrzeby drugą parę zacisków można przymocować do kręgosłupa. W takim przypadku przydatne jest przymocowanie dwóch par zacisków do dwóch kręgów przylegających do kręgu docelowego.
   3. Usuń mięsień przykolcowy powyżej kręgów będących przedmiotem zainteresowania. Za pomocą skalpela wykonaj równoległe nacięcie tuż przyśrodkowo do ścięgien, które są równoległe do kręgosłupa, a także prostopadłe nacięcia rostralne i ogonowe do kręgu docelowego. Uważaj, aby nie ciąć zbyt głęboko. Rozerwij/odetnij mięsień za pomocą rongeurs. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby usunąć tkankę pozostałą na kręgu lub nad oponą twardą w przestrzeni międzykręgowej.
   4. W przestrzeni międzykręgowej powinno być widoczne grzbietowe naczynie krwionośne wyznaczające linię środkową rdzenia kręgowego. W przypadku wstrzyknięć jednostronnych należy wykonać częściową laminektomię, wiercąc otwór w środku docelowej strony kręgu. Używaj precyzyjnego aparatu do wiercenia dentystycznego z nożem sferycznym 0,5 mm i wierc szczególnie ostrożnie, zbliżając się do rdzenia kręgowego. Usuń wszelkie pozostałe fragmenty kości za pomocą igły ze skosem 26G, aby odsłonić rdzeń kręgowy.
   5. Za pomocą igły ze skosem 26G przebij oponę twardą w wywierconym otworze oraz w przestrzeni międzykręgowej rostralnej i ogonowej do kręgu docelowego, wszystko około 200 μm bocznie do grzbietowego naczynia krwionośnego. Płyn mózgowo-rdzeniowy powinien uciekać z otworów, a rdzeń kręgowy powinien być lekko wybrzuszony.
8. Przygotowanie strzykawki iniekcyjnej
   UWAGA: Strzykawkę do wstrzykiwań należy przygotować bezpośrednio przed rozpoczęciem wstrzykiwania, aby zmniejszyć ryzyko zatkania mikropipety przez cząsteczki kurzu.
   1. Zamontuj szklaną kapilę na mikrolitrowej strzykawce za pomocą zestawu do wyjmowanego zaciskania igły. Mocno dokręć nakrętkę, aby zapewnić mocne i bezpieczne dopasowanie.
   2. Napełnić strzykawkę o pojemności mikrolitrów sterylną wodą destylowaną i zacząć wyciskać ją tłokiem.
      UWAGA: Jeśli opór jest zbyt duży, przez co woda nie wydostaje się łatwo z końcówki, mikropipeta prawdopodobnie jest zablokowana i należy ją wymienić.
   3. Zamontować strzykawkę na mikromanipulatorze podłączonym do elektronicznie sterowanego mikroiniektora. Uważaj, aby niczego nie dotknąć mikropipetą.
   4. Za pomocą mikrowstrzykiwacza pobrać około 1 μl powietrza, aby utworzyć pęcherzyk między wodą a wirusem.
   5. Umieść kroplę roztworu wirusa o wielkości 2,5 μl na kawałku folii parafinowej, ostrożnie wsuń końcówkę mikropipety do kropli za pomocą ramki stereotaktycznej i wyciągnij ją do góry. Następnie ostrożnie dociśnij dozowanie, aż na końcówce pojawi się odrobina roztworu wirusa.
   6. Wyjąć strzykawkę i za pomocą wstrzykiwacza oznaczyć mikropipetę skalą i zanotować zawartość roztworu wirusa; ułatwi to monitorowanie, czy infuzja przebiega zgodnie z planem.
9. Iniekcje dordzeniowe
   1. Przesuń końcówkę mikropipety nad jeden z otworów w oponie twardej, a następnie w dół, aż zauważysz lekkie wgniecenie w oponie twardej. Aby ukierunkować wstrzyknięcie do rogu grzbietowego kręgosłupa, należy przesuwać się w dół o 500 μm w kolejnych krokach co 100 μm (prędkość 1 mm/s), a następnie 200 μm w górę, aby umożliwić mechaniczną stabilizację tkanki.
      UWAGA: Ostateczna głębokość końcówki wynosi w tym przypadku 300 μm, ale można ją dostosować w zależności od obszaru docelowego.
      1. Jeśli tkanka jest odporna na penetrację, mikropipeta może zaczepiać się o oponę twardą. W takim przypadku cofnij się i lekko przesuń, aby przykryć otwór, lub ponownie użyj igły, aby prawidłowo przebić oponę twardą przed powtórzeniem próby penetracji.
   2. Zaprogramować pompę na docelową objętość wstrzyknięcia 300 nL przy prędkości wstrzykiwania 50 nL/min i nacisnąć przycisk start, aby rozpocząć infuzję.
   3. Po zakończeniu wstrzykiwania należy sprawdzić wagę, aby zobaczyć, czy poziom wirusa spadł i pozostawić mikropipetę na miejscu przez dodatkowe 3 minuty, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia przed powolnym chowaniem strzykawki.
   4. Powtórzyć kroki 2.9.1-2.9.3 dla pozostałych dwóch miejsc wstrzyknięcia.
10. Szycie i rekonwalescencja
    1. Usuń zaciski kręgosłupa i poduszkę pod myszą.
    2. Zamknij ranę warstwami przerywanymi szwami, zszywając powierzchowne warstwy tkanek szwami wchłanialnymi, a skórę szwami niewchłanialnymi. Nałóż jodowy środek dezynfekujący na zszytą ranę.
    3. Przerwij znieczulenie i pozostaw zwierzę na macie grzewczej, aż dojdzie do siebie, zanim wróci do swojej domowej klatki.
11. Opieka pooperacyjna
    1. Monitoruj stan zdrowia zwierzęcia w dniu zabiegu, następnego dnia, a następnie co 2-3 dni. Upewnij się, że zwierzę ma normalny chód, zdrowy wygląd (waga, oczy, sierść i zachowanie) oraz że rana się goi.
    2. W razie potrzeby należy kontynuować leczenie przeciwbólowe (np. 0,1-0,2 mg/kg buprenorfiny podskórnie), trzy razy na dobę.

3. Analizy behawioralne i morfologiczne

1. Analiza behawioralna
   UWAGA: Przed rozpoczęciem pomiarów należy pozwolić zwierzętom przystosować się do odpowiedniego stanowiska przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić im przystosowanie się do nowego środowiska doświadczalnego.
   1. Test von Freya
      1. Umieszczaj zwierzęta pojedynczo w oddzielnych przegródkach o wymiarach około 10 cm x 10 cm na podłodze z metalowej siatki.
      2. Stymuluj podeszwową powierzchnię tylnej łapy ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia za pomocą dynamicznego włókna von Freya. Zwróć uwagę na siłę, z jaką zwierzę wycofuje łapę z bodźca.
      3. Powtórzyć te czynności pięć razy i obliczyć średni próg wycofania z sześciu pomiarów dla każdego zwierzęcia.
   2. Test nakłucia szpilki
      1. Umieść zwierzęta w indywidualnych przegródkach o wymiarach około 10 cm x 10 cm na podłodze z metalowej siatki.
      2. Stymulować powierzchnię podeszwową tylnej łapy ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia za pomocą igły 26-G bez penetracji skóry. Oceniaj zachowanie jako zero (brak reakcji) lub jeden (reakcja).
      3. Powtórz 9 razy w odstępach 3 minut między stymulacjami i oblicz procentową odpowiedź z 10 pomiarów dla każdego zwierzęcia.
   3. Wstrzyknięcie ligandu DREADD-N-tlenku klozapiny (CNO)
      1. Rozpuścić CNO w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 0,2 mg/μl, który można przechowywać w temperaturze pokojowej.
      2. W dniu eksperymentu rozcieńczyć roztwór podstawowy w sterylnym 0,9% NaCl do 0,2 μg/μL i wstrzyknąć dootrzewnowo 10 μl/g masy ciała. Wstrzyknąć zwierzętom kontrolnym podłoże (0,2% DMSO w 0,9% NaCl).
         UWAGA: Zgodnie z doświadczeniem, szczytowego wpływu na zachowania można spodziewać się 1-3 godzin po wstrzyknięciu, a efekty powinny całkowicie ustąpić po 24 godzinach. W przypadku aktywacji neuronów glicynergicznych obserwowane zachowania obejmują zmniejszenie reakcji na ból i swędzenie. Zachowania wywołane przez aktywację neuronów za pośrednictwem DREADD będą zależeć od docelowego podzbioru neuronów rdzeniowych.
   4. Wstrzykiwanie świądów w celu wywołania swędzenia
      1. Rozpuścić świdrojady w 0,9% NaCl do roztworów 8 mg/ml (chlorochina) lub 10 mg/ml (histamina). 2 godziny po podaniu CNO wstrzyknąć podskórnie 10 μl świądu lub roztworu nośnika w podeszwową powierzchnię tylnej łapy ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia kręgosłupa. Alternatywnie, wstrzyknąć świąd śródskórnie do cielęcia, które zostało ogolone dzień wcześniej, aby zmniejszyć awersyjne zachowania spowodowane samym goleniem.
   5. Nagrywanie wideo w celu analizy spontanicznych zachowań związanych ze swędzeniem wywołanym przez nocyfenywny lub świąd
      1. Umieść zwierzęta pojedynczo w przezroczystych przegródkach (o średnicy około 10 cm) z odrobiną ściółki z ich odpowiedniej klatki domowej na podłodze.
      2. Nagrywaj zwierzęta na wideo przez 5 minut, aby nagrywać spontaniczne i przez 30 minut, aby nagrywać zachowania wywołane przez świdryzm. Analizuj filmy w trybie off-line w pojemnikach po 5 minut.
   6. Ból a swędzenie
      1. Obserwuj i notuj zachowania związane z wzdryganiem się, lizaniem i gryzieniem.
         UWAGA: Drganie i lizanie dotkniętego miejsca są uważane za reakcje na ból, podczas gdy gryzienie wiąże się ze swędzeniem.
      2. Analizuj filmy z normalną prędkością, mierz czas, jaki mysz spędziła na lizaniu lub gryzieniu dotkniętego miejsca, lub mierz w zwolnionym tempie, aby dokładniej odróżnić odruchy lizania i gryzienia. Alternatywnie policz liczbę napadów lizania/gryzienia/wzdrygania się.
2. Analiza morfologiczna
   1. Wykonaj analizy morfologiczne od jednego do trzech tygodni po wstrzyknięciu wirusa lub pod koniec eksperymentu behawioralnego.
      UWAGA: Wykryliśmy ekspresję eGFP już po 48 godzinach od wstrzyknięcia, ale stwierdziliśmy również, że ekspresja znacznie wzrasta w ciągu następnych dni, a nawet tygodni. W przypadku komórek o silnej ekspresji reporterowej może wystarczyć jeden tydzień inkubacji (od wstrzyknięcia dordzeniowego do perfuzji). W przypadku komórek o słabej ekspresji transgenu, wirusów ze słabymi promotorami lub słabszymi fluoroforami, może być wymagana dłuższa ekspresja, aby zapewnić wykrywalne poziomy.
   2. Utrwalenie tkanek
      1. Każdą mysz należy przeprowadzić transfuzję przezsercową, najpierw z 20 ml lodowatego roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) (NaCl 125 mM, NaHCO₃ 25 mM, NaH₂PO₄ 1,25 mM, D-glucose 20 mM, KCl 2,5 mM i CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), a następnie ze 100 ml 4% lodowatego paraformaldehydu (w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH 7,4).
         Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
      2. Natychmiast wypreparuj rdzeń kręgowy w odcinku lędźwiowym i przez 2 godziny utrwalaj tkankę 4% paraformaldehydem na lodzie. Krótko przemyć tkankę po utrwaleniu 0,1 M buforem fosforanu sodu (pH 7,4), a następnie inkubować ją w 25% roztworze sacharozy (w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH 7,4) przez noc w temperaturze 4 °C.
      3. Przeciąć kriochronioną tkankę pod kątem 30 μm na kriostacie i zamontować skrawki na szkiełkach mikroskopowych.
   3. Barwienie immunofluorescencyjne
      1. Po krótkim przemyciu w PBS nanieść 300 μl roztworu blokującego (10% normalnej surowicy osła w 0,3% Triton-PBS) na skrawki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      2. Inkubować szkiełka z 300 μl odpowiednich kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C. Przemywać skrawki 3 razy przez 5 minut każda w PBS.
      3. Inkubować szkiełka z odpowiednimi kombinacjami przeciwciał drugorzędowych w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje 3 razy po 5 minut w PBS.
      4. Krótko przepłukać szkiełka w ddH₂O, a następnie zamontować szkiełka nakrywkowe za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego.
      5. Uzyskuj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 20x i 40x.

Wyniki

Aby zilustrować poziomy ekspresji, jakie można uzyskać poprzez wewnątrzrdzeniowe wstrzyknięcie rAAV kodującego białko markerowe, w pierwszej kolejności wstrzyknięto AAV1.CAG.eGFP do lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego myszy typu dzikiego. Trzy iniekcje wykonane w odstępach około 1 mm doprowadziły do niemal ciągłej infekcji lędźwiowych segmentów rdzenia od L3 do L5 (Rysunek 1A-C). Iniekcja wirusa na głębokości 300 µm z powierzchni rdzenia pr...

Dyskusja

Dordzeniowe wstrzyknięcie AAV może stać się potężną techniką w laboratorium badawczym, umożliwiającą analizę komórek rdzenia kręgowego z wysokim roztworem czasowym i przestrzennym. Protokół ten umożliwia transdukcję trzech głównych segmentów kręgosłupa unerwionych przez neurony czuciowe, przedłużając ich aksony obwodowe do kończyny tylnej. Przekształcenie trzech segmentów daje solidne i powtarzalne dane behawioralne. Umożliwia również badanie większego obszaru czuciowego niż jest to możliwe po pojedynczym wstrzyknięciu d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt
ściągacz do mikropipet: DMZ-Uniwersalny-ściągacz elektrod	Zeitz	NA
jednostka anestezjologiczna: Koncentrator tlenu Oxymat3	Weinmann	NA
anestezjologiczna: VIP 3000 Waporyzator weterynaryjny	Midmark	NA
Mata grzewcza: Mio Star Thermocare 100	Migros
Golarka elektryczna	Mikroskop	Philips BT9290
(OPMI pico)	Zeiss	NA
Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt	Kopf	NA
Neurostar StereoDrive (opcjonalnie)	Neurostar	NA
Model 51690 Adapter kręgosłupa myszy Cunningham	Aparat Harvard	72-4811
Pompa strzykawkowa PHD Ultra z nanoroztami	Aparat Harvard	70-3601
Hamilton 701 RN 10 μ l szklana strzykawka mikrolitrowa	Hamilton	7635-01
Hamilton Wyjmowana igła (RN) złączka kompresyjna 1 mm	Hamilton	55750-01
aparatura do wiercenia w stomatologii precyzyjnej: Osada success 40	Frez sferyczny Osada	OS-40
, 0,5 mm	Busch	12001005B
elektroniczny anestezjometr von Freya	IITC	23905
von Frey	IITC	#7
LSM710 Pascal	Zeiss	NA
0.8 NA & times; 20 Obiektyw planapochromatyczny	Zeiss	NA
1.3 NA & times; 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion	Zeiss	NA
strong>Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia chirurgiczne
	Fine Science Tools	10004-13
Extra Fine Bonn Nożyczki	Fine Science Tools	14084-08
Kleszcze Adson, 1 x 2 zęby, 12 cm	Fine Science Tools	11027-12
Rongeurs Friedmana-Pearsona, zakrzywione, miseczka 0,7 mm	Fine Science Tools	16121-14
Kleszcze do laminektomii Dumont #2	Fine Science Tools	11223-20
Uchwyty do igieł Olsen-Hegar, ząbkowane, długość zacisku 8,5 mm	Fine Science Tools	12002-12
Szczypce do drobnych drobnoustrojów #5	Narzędzia do nauki o nauce	11254-20
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Materiały eksploatacyjne i chemikalia
Cienkościenna szklana kapilara, średnica zewnętrzna 1 mm	World Precision Instruments	TW 100-3
Strzykawki (1, 5 i 20 ml)	B. Braun	(9166917V, 4606051V, 4606205V)
Igła skośna 26G	B. Braun	4665457
Sterylne ostrza skalpela	B. Braun	BB523
Nici chirurgiczne Safil Quick+ 4/0, wchłanialne	B. Braun	C1046220
Nici chirurgiczne Premilene 5/0, niewchłanialne	B. Braun	C0932191
Sterylny PBS lub sól fizjologiczna (0,9%)		BRAK DANYCH
Etanol, 70% (środek dezynfekujący)		NA
Roztwór jodu (np. Braunol)	B. Braun	18380
Środki znieczulające (np. Attane isoflurane)	Provet	2222
Aldasorber	Provet	333526
leki przeciwbólowe (np. buprenorfina: temgesic)	Indywidualny	GTIN: 7680419310018
Okulistyczny maść (np. vita-pos)	Pharma medica	GTIN: 4031626710635
Waciki bawełniane (np. z)	IVF Hartmann	1628100
Chusteczki do twarzy (np. z)	Uehlinger AG	2015.10018
Preparaty mikroskopowe Superfrost plus	ThermoScientific	J1800AMNZ
Nazwa	Company	Numer katalogowy	>Komentarze
Myszy
Myszy C57BL/6J (typ dziki)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:000664
Myszy Rorbtm1.1(cre)Hze/J (RORβ Cre)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Myszy Hze/J (R26Tom)	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:007914
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>Wektory wirusowe
AAV1. Zobacz materiał CB7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)	Rdzeń wektorowy Penn	AV-1-PV1963
AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)	Rdzeń wektorowy Penn	AV-1-ALL854
AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)	Penn Vector Core	AV-1-ALL864
AAV1. Akcje EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)	Penn Vector Core	Produkcja
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))	Penn Vector Core	Produkcja
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Plasmidy
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361
pAAV.EF1α. flex.hChR2(H134R)-eYFP	Addgene	20298
Nazwa	>Firma	Numer katalogowy	>Komentarze
Bacteria
MDS42	ScarabGenomics
Stbl3	ThermoScientific	C737303
Nazwa<	strong>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Quiagen	12362
NucleoBond PC 500	Machery & Nagel	740574
N-tlenek klozapiny (CNO)	Enzo Life Sciences	BBL-NS105-0025
sól difosforanu chlorochiny	Sigma	C6628
histamina	Sigma	H7125
Dapi	Invitrogen	D3571
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała (rozcieńczenie)
Rabbit anty-GFP (1:1000)	Sondy molekularne	RRID:AB_221570
Anty-NeuN królika (1:3000)	Abcam	RRID:AB_10711153
Koza anty-Pax2 (1: 200)	R & D Systems	RRID:AB_10889828
Anty-Lmx1b świnka morska (1 : 10 000)	Dr Carmen Birchmeier	Muller i in. 2002
Anty-GFAP królika (1 : 1000)	DakoCytomation	RRID:AB_10013382
Przeciwciała drugorzędowe wyhodowane u osła (1:800)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	NA