Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57383

⸱

14 maja 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Streszczenie

Obrazowanie żywych komórek to potężna technika, która może być używana do bezpośredniej wizualizacji zjawisk biologicznych w pojedynczych komórkach przez dłuższy okres czasu. W ciągu ostatniej dekady nowe i innowacyjne technologie znacznie zwiększyły praktyczność obrazowania żywych komórek. Komórki mogą być teraz utrzymywane w ostrości i ciągłe obrazowanie przez kilka dni w warunkach hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Co więcej, wiele pól widzenia reprezentujących różne warunki eksperymentalne może być pozyskiwanych jednocześnie, zapewniając w ten sposób dane eksperymentalne o wysokiej przepustowości. Obrazowanie żywych komórek zapewnia znaczną przewagę nad obrazowaniem komórek stałych, umożliwiając bezpośrednią wizualizację i czasową ocenę ilościową dynamicznych zdarzeń komórkowych. Obrazowanie żywych komórek może również zidentyfikować różnice w zachowaniu pojedynczych komórek, które w przeciwnym razie zostałyby pominięte przy użyciu testów populacyjnych. W tym miejscu opisujemy protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem. Pokazujemy metody wizualizacji, czy mitotycznie zatrzymane komórki umierają bezpośrednio z powodu mitozy, czy też wracają do interfazy. Opisujemy również, w jaki sposób system wskaźnika cyklu komórkowego oparty na ubikwitynacji (FUCCI) może być wykorzystany do oceny frakcji komórek interfazowych powstałych w wyniku poślizgu mitotycznego, które są zdolne do ponownego wejścia w cykl komórkowy. Na koniec opisujemy metodę obrazowania żywych komórek w celu identyfikacji przypadków pęknięcia otoczki jądrowej.

Wprowadzenie

Leki antymitotyczne od dawna stosowane są w schematach chemioterapeutycznych różnych typów guzów litych i często wykazują dużą skuteczność1,2,3. Mechanistycznie rzecz biorąc, leki te zakłócają normalną progresję mitotyczną i sprzyjają zatrzymaniu mitozy w szybko proliferujących komórkach rakowych. Jednak los komórki w odpowiedzi na zatrzymanie mitotyczne jest bardzo zmienny: podczas gdy część komórek przechodzi śmierć komórkową bezpośrednio w wyniku mitozy, inne wychodzą z mitozy i wracają do interfazy jako komórki tetraploidalne (proces określany jako poślizg mitotyczny)4,5,6,7,8. Te komórki interfazowe mogą wykonywać apoptozę, ulegać trwałemu zatrzymaniu cyklu komórkowego, a nawet ponownie wejść w cykl komórkowy4,5,6,7,8,9,10,11. Komórki, które unikają mitotycznej śmierci komórki, wpadając w interfazę, tylko po to, by ponownie wejść w cykl komórkowy po odstawieniu leku, mogą zatem przyczyniać się do ponownego pojawienia się populacji komórek nowotworowych. Co więcej, komórki, które wyślizgują się z mitozy, są tetraploidalne, a tetraploidia jest znana z tego, że sprzyja niestabilności chromosomów, która prowadzi do nawrotu nowotworu12,13,14,15. Zdefiniowanie czynników kontrolujących los komórek w odpowiedzi na leczenie lekami antymitotycznymi ma zatem kluczowe znaczenie dla optymalizacji obecnych terapii.

W tym protokole opisujemy metody bezpośredniej obserwacji i badania losu komórek, które ulegają długotrwałemu zatrzymaniu mitotycznemu w odpowiedzi na lek antymitotyczny paklitaksel. Paklitaksel jest uznanym lekiem klinicznym i okazał się wysoce skuteczny w wielu typach nowotworów, w tym piersi, jajników i płuc16,17,18,19,20. Paklitaksel, który jest alkaloidem roślinnym pochodzącym z kory cisa, stabilizuje mikrotubule i w ten sposób zapobiega ich dynamice21,22. Podczas gdy tłumienie dynamiki mikrotubul przez paklitaksel nie wpływa na progresję cyklu komórkowego od G1 do G2, lek prowadzi do trwałej aktywacji punktu kontrolnego montażu wrzeciona podczas mitozy poprzez utrudnienie przyczepiania kinetochoru do mikrotubul (szczegółowe informacje tutaj23,24)25. W konsekwencji zapobiega się wystąpieniu anafazy w komórkach traktowanych paklitakselem i powoduje przedłużone zatrzymanie mitotyki.

Ten protokół najpierw opisze podejścia do identyfikacji komórek mitotycznych w eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek. Mitozę można uwidocznić w przylegających komórkach hodowli tkankowych dzięki dwóm zauważalnym zmianom biologicznym komórki. Po pierwsze, chromosomy stają się silnie zagęszczone bezpośrednio przed rozpadem otoczki jądrowej. Chociaż często można je wykryć za pomocą standardowej mikroskopii z kontrastem fazowym, kondensacja chromosomów może być wyraźniej wykryta za pomocą znaczników fluorescencyjnych, które oznaczają chromosomy (np. znakowane fluorescencyjnie białka histonowe). Po drugie, komórki mitotyczne można również zidentyfikować na podstawie dramatycznych zmian morfologicznych, które wynikają z zaokrąglenia komórek.

Ten protokół pokaże następnie, jak używać metod obrazowania żywych komórek do śledzenia losów komórek doświadczających przedłużonego zatrzymania mitotyki. Komórki zatrzymane w mitozie przechodzą jeden z trzech różnych losów. Po pierwsze, komórki mogą ulec śmierci komórkowej podczas mitozy. Zjawisko to można łatwo zobrazować za pomocą mikroskopii świetlnej, ponieważ obserwuje się, że umierające komórki kurczą się, bledną i/lub pękają. Po drugie, komórki mogą wyjść z mitozy i powrócić z powrotem do interfazy bez segregacji chromosomów lub cytokinezy, procesu określanego jako poślizg mitotyczny. Dekondensacja chromosomów i/lub spłaszczenie komórki mitotycznej łatwo identyfikuje ten proces. Komórki, które wymykają się z mitozy, często mają również nieregularne, wielopłatkowe jądra i często zawierają kilka mikrojąder5. Po trzecie, komórki zatrzymane w mitozie mogą zainicjować anafazę i przejść przez mitozę po długim opóźnieniu. Chociaż jest to rzadkie przy wyższych stężeniach leku, takie zachowanie sugeruje, że zatrzymane komórki mogły spełnić punkt kontrolny zespołu wrzeciona lub że punkt kontrolny zespołu wrzeciona jest częściowo osłabiony lub uszkodzony. Początek anafazy można uwidocznić poprzez segregację chromosomów i późniejszą cytokinezę za pomocą obrazowania żywych komórek.

Opisane zostaną również metody obrazowania żywych komórek do śledzenia losu komórek, które unikają śmierci komórki mitotycznej poprzez proces mitotycznego poślizgu. Komórki, które przechodzą poślizg mitotyczny, albo umierają w kolejnej interfazie, wywołują trwałe zatrzymanie cyklu komórkowego G1, albo ponownie wchodzą w cykl komórkowy, aby zainicjować nową rundę podziału komórki4. Opisane zostanie podejście wykorzystujące system FUCCI (wskaźnik cyklu komórkowego oparty na ubikwitynacji) w celu określenia frakcji komórek, które ponownie wchodzą w cykl komórkowy po poślizgu mitotycznym. FUCCI pozwala na bezpośrednią wizualizację przejścia G1/S i może być używany w połączeniu z długoterminowym obrazowaniem żywych komórek zarówno in vitro, jak i in vivo26,27. System FUCCI wykorzystuje dwa znakowane fluorescencyjnie białka, skrócone formy hCdt1 (licencja chromatyny i czynnik replikacji DNA 1) oraz hGeminina, których poziomy oscylują w zależności od pozycji cyklu komórkowego. hCdt1 (połączony z białkiem czerwonej fluorescencji) jest obecny na wysokich poziomach podczas fazy G1, gdzie działa w celu licencjonowania DNA do replikacji, ale jest ubikwitynowany przez ligazę ubikwityny E3 SCFSkp2 i degradowany podczas faz S / G2 / M, aby zapobiec ponownej replikacji DNA26. Natomiast hGeminina (połączona z zielonym białkiem fluorescencyjnym) jest inhibitorem hCdt1, którego poziomy osiągają szczyt podczas S / G2 / M, ale jest ubikwitynowana przez ligazę ubikwityny E3 APCCdh1 i ulega degradacji pod koniec mitozy i w całej klasie G126. W związku z tym FUCCI zapewnia prosty odczyt fluorescencji fazy cyklu komórkowego, ponieważ komórki wykazują czerwoną fluorescencję podczas G1 i zieloną fluorescencję podczas S / G2 / M. System FUCCI stanowi znaczący postęp w stosunku do innych podejść (takich jak barwienie bromodeoksyurydyny) do identyfikacji komórek proliferacyjnych, ponieważ nie wymaga fiksacji komórek i pozwala na obrazowanie pojedynczych komórek bez konieczności stosowania dodatkowych zabiegów farmakologicznych w celu synchronizacji populacji komórek. Chociaż nie zostało to omówione w tym protokole, opracowano również dodatkowe czujniki żywych komórek do wizualizacji postępu cyklu komórkowego, w tym czujnik helikazy B dla G128, DNA ligase-RFP29 i PCDNA-GFP30 czujniki dla fazy S oraz najnowszy czujnik FUCCI-4, który wykrywa wszystkie etapy cyklu komórkowego31.

Na koniec, opisana zostanie metoda obrazowania żywych komórek do wykrywania pęknięcia otoczki jądrowej. Ostatnie badania wykazały, że otoczki jądrowe komórek rakowych są niestabilne i podatne na pękanie, umożliwiając w ten sposób mieszanie się zawartości nukleoplazmy i cytoplazmy. Zjawisko to, określane mianem pęknięcia jądra atomowego, może sprzyjać uszkodzeniom DNA i stymulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. Chociaż podstawowe przyczyny pęknięcia jądra pozostają niew pełni scharakteryzowane, wiadomo, że deformacje struktury jądrowej korelują ze zwiększoną częstością występowania pęknięć jądrowych42. Jednym z dobrze znanych skutków leczenia paklitakselem jest wytwarzanie uderzająco nieprawidłowych struktur jądrowych po mitozie; W związku z tym opisana zostanie metoda wykorzystująca obrazowanie żywych komórek do ilościowego określenia pękania jądra atomowego, a także zbadane, czy leczenie paklitakselem zwiększa częstotliwość pęknięć jądrowych. Rozerwanie jądra można wykryć na podstawie obserwowanego wycieku białka fluorescencyjnego ukierunkowanego na jądro do cytoplazmy (np. tandemowe powtórzenie dimeru RFP połączone z sygnałem lokalizacji jądrowej, TDRFP-NLS). Nieszczelność ta jest wyraźnie widoczna gołym okiem, co umożliwia proste ilościowe określenie zdarzeń pęknięcia.

Ten protokół wymaga mikroskopu epifluorescencyjnego o szerokim polu, który jest wyposażony w zakodowany stolik i oprogramowanie do automatycznego ustawiania ostrości. Zakodowany stolik pozwala na precyzyjny, zautomatyzowany ruch do zdefiniowanych współrzędnych X-Y, podczas gdy oprogramowanie autofokusa utrzymuje ostrość komórek przez cały okres obrazowania. Ponadto protokół ten wymaga sprzętu do utrzymywania komórek w temperaturze 37 °C przy nawilżonej atmosferze 5% CO2 . Można to osiągnąć, zamykając cały mikroskop w obudowie o kontrolowanej temperaturze i atmosferze lub stosując urządzenia typu stage-top, które lokalnie utrzymują temperaturę i środowisko. Obiektyw z kontrastem fazowym używany w tym protokole to plan fluor 10x z aperturą numeryczną 0,30. Jednak obiektywy 20X są również wystarczające do identyfikacji zarówno zaokrąglonych komórek mitotycznych, jak i spłaszczonych komórek interfazowych w jednej płaszczyźnie ogniskowej. W przypadku obrazowania z kontrastem fazowym (zgodnie z opisem w tej metodzie) osłona może być szklana lub plastikowa. Jeśli używana jest mikroskopia kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC), konieczne jest użycie szklanej osłony, aby zapobiec depolaryzacji światła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu nieprzekształconej i stabilnej chromosomalnie linii komórkowej nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE-1) do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek. Jednak protokół ten można dostosować do dowolnej przylegającej linii komórkowej, o ile warunki hodowli komórkowej zostaną dostosowane w razie potrzeby. Wszystkie procedury muszą być zgodne z instytucjonalnymi wytycznymi i przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz etyki.

1. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek

  1. Użyj świeżo rozmrożonych i wcześnie pasażujących komórek RPE-1 wyrażających ludzki histon H2B połączony z białkiem fluorescencyjnym (np. H2B-GFP) lub system FUCCI (szczegółowy protokół dotyczący generowania komórek eksprymujących FUCCI można znaleźć w reference45) w celu oceny losu komórki mitotycznej.
    1. Aby zmierzyć częstotliwość pękania jądra, użyj komórek RPE-1 eksprymujących zarówno H2B-GFP, jak i tandemowy dimer czerwonego białka fluorescencyjnego połączonego z pojedynczym sygnałem lokalizacji jądrowej (TDRFP-NLS).
      UWAGA: Konstrukty trzech zielonych białek fluorescencyjnych połączonych w tandemie z pojedynczym sygnałem lokalizacji jądrowej (GFP3-NLS) zostały również użyte do zademonstrowania pęknięcia (jak w referencji42).
    2. Utrzymuj komórki na 10 cm płytkach do hodowli tkankowych w odpowiednim pożywce wzrostowej. Komórki RPE-1 są utrzymywane w wolnym od czerwieni fenolowej, zmodyfikowanej mieszance Eagle Medium / Nutrient F-12 firmy Dulbecco (DMEM: F12) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny.
  2. Odessać pożywkę z komórek, przemyć naczynie do hodowli tkankowej 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w temperaturze pokojowej (PBS) w celu usunięcia pozostałej pożywki, a następnie odessać PBS.
    1. Dodać 2 ml 0,25% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty lub do momentu, gdy większość komórek oderwie się od płytki.
      UWAGA: Nie trzymaj komórek w trypsynie dłużej niż to konieczne.
  3. Dodać 10 ml kompletnej pożywki, aby zebrać trypsynizowane komórki za pomocą 10 ml pasetki serologicznej i dozować do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    1. Granulować komórki przez odwirowanie przy 180 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu, a następnie dokładnie zawiesić osad w 10 ml świeżej pożywki, delikatnie pipetując pożywkę w górę i w dół w paskach serologicznych.
  5. Użyj hemocytometru lub automatycznej maszyny do liczenia komórek, aby policzyć komórki46.
    1. Rozcieńczyć komórki w nowej stożkowej probówce do 30 000 komórek/ml kompletnego podłoża.
    2. Płytka 30 000 komórek RPE-1 (objętość 1 ml) na studzienkę 12-dołkowej naczynia do obrazowania ze szklanym dnem (#1,5 grubości), aby osiągnąć wymaganą gęstość komórkową następnego dnia (30-50% konfluencji).
      UWAGA: Zawsze należy obchodzić się z płytką w rękawiczkach i uważać, aby nie dotknąć szklanego dna.
  6. Pozwolić komórkom rosnąć w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, aż całkowicie się przyczepią i spłaszczą na płytce obrazowej ze szklanym dnem. Chociaż komórki mogą przyczepić się w ciągu zaledwie 4 godzin, zaleca się, aby komórki nie były leczone lekami i obrazowane do następnego dnia.
  7. Dodać paklitaksel (rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO)) do pożądanego stężenia końcowego w kompletnym pożywce i dokładnie wymieszać.
    1. Przygotuj kompletną pożywkę z równą objętością samego DMSO do użycia jako kontrola.
    2. Podgrzać pożywkę zawierającą lek lub DMSO do temperatury 37 °C przed dodaniem do komórek. Zapobiegnie to dryfowaniu ogniskowej z powodu nagłej zmiany temperatury.
    3. Dodać 1 ml pożywki zawierającej sam paklitaksel lub DMSO do poszczególnych dołków 12-dołkowej czaszy do obrazowania.

2. Konfiguracja mikroskopu do obrazowania żywych komórek

  1. Wyczyść szklane dno naczynia obrazowego za pomocą optycznego środka czyszczącego, aby usunąć wszelkie odciski palców lub kurz, które mogą zakłócać obrazowanie. Użyj wystarczającej ilości środka do czyszczenia optycznego, aby zwilżyć całą powierzchnię szkła.
  2. Umieść naczynie ze szklanym dnem na stoliku mikroskopowym w adapterze naczynia do obrazowania, zdejmij plastikową osłonę z naczynia i przykryj naczynie szklaną komorą. Upewnij się, że komora ma zawór umożliwiający stały przepływ powietrza składającego się z 5% CO2.
    UWAGA: Aby nawilżyć 5% CO2 , gaz przepływa przez rurkę włożoną do sterylnej obudowy kąpieli wodnej. Pozwala to na zrównoważenie gazu do wilgotności 95%.
  3. Zainicjować/skalibrować zakodowany stolik za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopem. Zapewni to dokładne współrzędne X-Y i zapobiegnie dryfowi ogniskowej.
  4. Skoncentruj się na komórkach za pomocą optyki z kontrastem fazowym i wykonaj oświetlenie Kohlera (opisane szczegółowo w referencji47), aby skupić światło i zapewnić optymalny kontrast.
  5. Użyj oprogramowania do akwizycji, aby określić optymalne czasy ekspozycji dla światła białego i wszystkich używanych kanałów fluorescencyjnych (ekspozycje, które dają 75% nasycenia pikseli w aparacie, są idealne, pod warunkiem, że taka ilość światła nie jest toksyczna dla komórek).
    1. Użyj oprogramowania do akwizycji, aby wybrać kilka, nienakładających się na siebie pól widzenia z każdej studzienki do obrazowania. Wybierz obszary obrazowania, w których komórki dobrze przylegają do szklanego dna i są zlewające się w 50% do 70%. Unikaj obszarów zbitych komórek, ponieważ utrudni to późniejszą analizę.
      UWAGA: Ważne jest, aby pola widzenia z każdej studzienki nie nakładały się na siebie, aby uniknąć dwukrotnego śledzenia tych samych komórek. Jeśli komórki są bardzo ruchliwe, może być konieczne uzyskanie kilku obrazów rozchodzących się promieniście z centralnego punktu i zszycie ich z powrotem, aby uzyskać jedno duże pole widzenia.
  6. Aktywuj funkcję automatycznego ustawiania ostrości mikroskopu, aby upewnić się, że wszystkie punkty są ostre przez cały czas trwania eksperymentu.
  7. Aby ocenić los komórki mitotycznej, ustaw oprogramowanie do obrazowania tak, aby zbierało obrazy z każdego wybranego pola widzenia co 10 minut przez maksymalnie 96 godzin. Niezakłócona mitoza trwa 20–40 minut, a zatem 10-minutowe odstępy czasu zapewnią wystarczającą ilość próbek, aby określić, kiedy komórki się dzielą. Aby zidentyfikować pęknięcie jądra atomowego, które jest zdarzeniem przejściowym, należy wykonywać zdjęcia co 5 minut
    UWAGA: Upewnij się, że komputer obsługujący oprogramowanie do akwizycji obrazów ma wyłączone automatyczne aktualizowanie, wygaszacze ekranu i tryby oszczędzania energii, ponieważ mogą one często zakłócać pozyskiwanie obrazu podczas długich eksperymentów.
  8. Rozpocznij eksperyment z obrazowaniem. Od czasu do czasu sprawdzaj, czy akwizycja obrazu przebiega płynnie w trakcie trwania filmu.

3. Analiza wideo w celu określenia losu komórki w odpowiedzi na paklitaksel

  1. Upewnij się, że zobrazowane komórki są zdrowe przez cały czas trwania eksperymentu obrazowego. Komórki kontrolne leczone DMSO powinny być żywotne i aktywnie się rozmnażać.
    UWAGA: Jeśli komórki wykazują oznaki stresu, nie oznaczaj ilościowo wideo, a zamiast tego skup się na optymalizacji warunków obrazowania48. Oznaki stresu związanego z obrazowaniem obejmują pęcherzyki/obumieranie komórek, komórki, które nie przyczepiają się/rozprzestrzeniają na płytce oraz komórki, które wykazują niski indeks mitotyczny i / lub przedłużoną mitozę. Możliwe źródła stresu to wahania temperatury lub poziomu CO2 wewnątrz komory obrazowania lub fototoksyczność48.
  2. Podczas obrazowania całego pola widzenia za pomocą obiektywu 10X lub 20X mogą być obecne setki pojedynczych komórek. Dlatego, aby pomóc w ocenie ilościowej, podziel pole widzenia na mniejsze ćwiartki za pomocą dostępnych narzędzi programowych. Oceniaj komórki w każdym kwadrancie osobno (zgodnie z opisem w krokach 3.3.1–3.6.2).
  3. Analizując wideo, śledź każdą komórkę w scalonym widoku, korzystając z obrazów z kontrastem fazowym i/lub obrazów fluorescencyjnych. Użyj narzędzi do analizy oprogramowania, aby utworzyć scalony widok.
    1. Zaczynając od początku filmu, zidentyfikuj pojedynczą komórkę międzyfazową i śledź jej postęp w cyklu komórkowym za pomocą optyki fazowej. Aby śledzić pojedynczą komórkę, obserwuj ją od klatki do klatki po oku. Zidentyfikuj komórki interfazowe ze względu na ich spłaszczoną morfologię (ocenianą za pomocą kontrastu fazowego) i brak kondensacji DNA (ocenianą przez H2B-GFP) (Rysunek 1A).
  4. Zidentyfikuj komórki, które wchodzą w mitozę, obserwując zaokrąglenie komórek (przy użyciu optyki kontrastu fazowego) i/lub kondensację chromosomów (przy użyciu H2B-GFP) (Rysunek 1A-C). Zarówno zaokrąglenie komórek, jak i kondensacja chromosomów są łatwo widoczne gołym okiem.
    1. Opisz czas, w którym komórka wchodzi w mitozę. Kontynuuj śledzenie komórki, aż osiągnie swój los (anafaza jak w kroku 3.5, śmierć komórki w wyniku mitozy jak w kroku 3.6.1 lub poślizg mitotyczny jak w kroku 3.6.2).
  5. Komórki kontrolne powinny skutecznie wyrównać swoje chromosomy i wejść w anafazę w ciągu 1 godziny (Ryc. 1D). Wizualizacja anafazy za pomocą optyki kontrastu fazowego, gdy komórka zaczyna zaciskać się na dwie części lub poprzez wizualizację chromosomów poruszających się w kierunku bieguna oznaczonych H2B-GFP (Figura 1A). Opisz czas, w którym komórka przechodzi anafazę.
  6. W przeciwieństwie do tego, komórki traktowane paklitakselem pozostaną zaokrąglone ze skondensowanymi chromosomami przez kilka godzin (3-40 godzin) (Rysunek 1B-D).
    1. Zidentyfikuj komórki zatrzymane mitotycznie, które przechodzą śmierć komórkową.
      UWAGA: Komórki, które umierają podczas mitozy, są wizualizowane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, ponieważ komórki będą błyszczeć, kurczyć się i/lub pękać (Rysunek 1B). W przypadku obrazowania H2B-GFP chromosomy również ulegną fragmentacji podczas śmierci komórki.
    2. Zidentyfikuj mitotycznie zatrzymane komórki, które przechodzą poślizg komórkowy.
      UWAGA: Komórki, które przechodzą poślizg mitotyczny, są obserwowane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, gdy spłaszczają się z powrotem do interfazy i dekondensują chromosomy bez poddawania ich anafazie (Rysunek 1C). Komórki, które ulegają poślizgowi mitotowemu, powodują powstawanie dużych komórek tetraploidalnych, które często są wielojądrowe (Rysunek 1C).
  7. Kontynuuj śledzenie komórek od oryginalnego pola widzenia. Gdy śledzone jest całe pole widzenia, przejdź do oddzielnego pola widzenia uzyskanego z tej samej studni i kontynuuj śledzenie komórek.

4. Analiza wideo w celu identyfikacji losu komórki po poślizgu mitotycznym

  1. Oceń los komórki po poślizgu mitotycznym (jak opisano w kroku 3.6.2) przy użyciu komórek RPE-1 eksprymujących system FUCCI. Oprócz obrazowania z kontrastem fazowym konieczne jest uzyskanie zarówno obrazów fluorescencji czerwonej (wskazującej na fazę G1), jak i fluorescencji zielonej (wskazującej na S/G2/M)).
    1. Śledź komórki FUCCI RPE-1 zgodnie z opisem w krokach od 3.3 do 3.7.
      1. Aby potwierdzić, że system FUCCI działa prawidłowo, sprawdź, czy komórki kontrolne naprzemiennie wyrażają czerwone i zielone białka fluorescencyjne odpowiednio na podstawie analizy danych obrazowania żywych komórek. Komórki kontrolne powinny przejść od wykazywania całkowicie czerwonej fluorescencji jądrowej do wykazywania całkowicie zielonej fluorescencji jądrowej podczas interfazy, w miarę postępu komórek z fazy G1 do S. Komórki powinny nadal wykazywać zieloną fluorescencję przez cały czas trwania mitozy. Bezpośrednio po mitozie komórki powinny ponownie wykazywać całkowicie czerwoną fluorescencję podczas interfazy.
        UWAGA: Chociaż istnieją metody ilościowego określania intensywności fluorescencji zarówno RFP, jak i GFP z systemu FUCCI w pojedynczych komórkach przy użyciu śladów fluorescencyjnych49, często nie jest to konieczne, ponieważ zmiana koloru fluorescencji jest solidna i widoczna gołym okiem.
  2. Zidentyfikuj komórki zatrzymane w mitozie za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym i śledź je, aż ulegną poślizgowi mitotycznemu, jak opisano w 3.4 i 3.6.2. Komórki, które wyślizgną się z mitozy i powrócą do interfazy, zmienią się z wykazującej zieloną fluorescencję podczas mitozy na czerwoną fluorescencję podczas fazy G1 (Rysunek 2A-C).
    1. Śledź te wysunięte komórki za pomocą kontrastu fazowego i obrazowania epifluorescencyjnego za pomocą oka, aby ocenić ich los komórek (Rysunek 2D).
      1. Zidentyfikuj komórki, które ponownie wchodzą w cykl komórkowy. Komórki te są identyfikowane przez zmianę ekspresji fluorescencji z czerwonej na zieloną przy użyciu systemu FUCCI, który wskazuje przejście G1 / S (Figura 2A).
      2. Zidentyfikuj komórki, które przechodzą zatrzymanie cyklu komórkowego G1. Komórki te są identyfikowane na podstawie ekspresji czerwonej fluorescencji, która utrzymuje się przez >24 godziny (Rysunek 2B).
      3. Zidentyfikuj komórki, które umierają w interfazie. Komórki te są identyfikowane na podstawie pękania/pęcherzyków/kurczenia się komórek za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym (Rysunek 2C).

5. Analiza wideo w celu określenia częstotliwości pękania otoczki jądrowej

  1. Użyj komórek RPE-1 eksprymujących H2B-GFP i TDRFP-NLS do oceny pęknięcia otoczki jądrowej. Oprócz obrazowania z kontrastem fazowym należy rejestrować obrazy fluorescencji czerwonej (TRITC), jak i fluorescencji zielonej (FITC). Pobieraj obrazy co 5 minut, aby zobrazować pęknięcie.
    UWAGA: Bardzo ważne jest wygenerowanie linii komórkowych, w których TDRFP-NLS jest skutecznie importowany do jądra przy minimalnej fluorescencji cytoplazmatycznej.
  2. Komórki obrazu zgodnie z opisem w krokach od 3.3 do 3.4. Sygnał fluorescencyjny TDRFP-NLS i H2B-GFP powinny kolokalizować się podczas interfazy. Po mitozie (wizualizowanej przez zaokrąglanie komórek za pomocą optyki fazowej i / lub kondensacji chromosomów przez H2B-GFP), otoczka jądrowa rozpadnie się, a sygnał TDRFP-NLS stanie się cytoplazmatyczny (Figura 3A). Po mitozie otoczka jądrowa zreformuje się w komórkach potomnych, a sygnał TDRFP-NLS stanie się jądrowy.
  3. Śledź komórki potomne przez całą kolejną interfazę za pomocą obrazowania żywych komórek. Zidentyfikuj przypadki pęknięcia jądra, obserwując przejściowy wybuch zlokalizowanego jądrowo TDRFP-NLS w otaczającej cytoplazmie. W ciągu kilku minut otoczka jądrowa zostanie naprawiona, a TDRFP-NLS zostanie przeniesiony do jądra (Rysunek 3A).
    UWAGA: Często jądrowe DNA, jak uwidoczniono za pomocą H2B-GFP, będzie postrzegane jako wystające poza miejsce pęknięcia jako mały pęcherzyk.
  4. Ocenia się frakcję jąder, w których dochodzi do pęknięcia podczas interfazy. Aby ocenić tę frakcję, policz liczbę komórek, które przechodzą zdarzenie pęknięcia, w stosunku do całkowitej liczby śledzonych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, komórki RPE-1 wykazujące ekspresję H2B-GFP poddano działaniu leku przeciwmitotycznego lub kontroli nośnika (DMSO), a następnie analizowano je za pomocą obrazowania żywych komórek. Analiza wykazała, że 100% kontrolnych komórek RPE-1 w fazie mitozy rozpoczęło anafazę średnio 2 min po wejściu w mitozę (Rysunek 1A, 1D). W przeciwieństwie do nich, komórki RPE-1 traktowane paklitakselem wykazywały głębokie zatrzym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym aspektem długoterminowego obrazowania żywych komórek jest zapewnienie zdrowia obrazowanych komórek. Istotne jest, aby komórki były narażone na minimalne zewnętrzne czynniki stresogenne, takie jak niespełniające norm warunki dotyczące temperatury, wilgotności i/lub poziomu CO2 . Ważne jest również, aby ograniczyć fotouszkodzenia spowodowane fluorescencyjnym oświetleniem wzbudzenia, ponieważ wiadomo, że stres związany z obrazowaniem wpływa na zachowanie komórek50. Ogranicze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

AFB, MAV i NJG pragną podziękować Ryanowi Quintonowi za komentarze do manuskryptu i Adrianowi Salicowi za konstrukcję TDRFP-NLS. AFB i MAV są finansowane przez NIGMS Biomolecular Pharmacology Training Grant 5T32GM008541. NJG jest członkiem Laboratoriów Badań nad Rakiem Piersi Shamim and Ashraf Dahod i jest wspierany przez granty NIH GM117150 i CA-154531, Fundację Karin Grunebaum, Smith Family Awards Program, Searle Scholars Program oraz Melanoma Research Alliance.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
bez czerwieni fenolowej, pożywka DMEM:F12HyklonSH3027202
10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)Gibco10438026
100 j.m./ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.Gibco15070063
PBSGibco10010049
0,25% trypsyna / EDTAGemini50-753-3104
12-dołkowa miska do obrazowania ze szklanym dnemCellvisP12-1.5H-N
PaklitakselTSZ ChemRS036
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaNC0215085
Środowiskowe KomoraIn Vivo Scientific
5% CO2AirgasZ03NI7432000201
15 mL Probówki stożkoweFisherbrand05-539-12
10 cm polistyrenowe płytki do hodowli tkanekFalcon08772E
10 ml Jednorazowa pipeta serologicznaFisherbrand4488
5804R 15 amp WirówkaEppendorf97007-370
1000 mikrolitrów PipetaGilsonPipetman Classic
20 mikrolitrów PipetaGilsonPipetman Classic
p1000 Końcówki do pipetSharpp1126
p20 Końcówki do pipetSharpP1121
RPE-1 KomórkiATCCCRL-4000
Inkubator Galaxy 170SEppendorfCO17011005
Pipette BoyIntegra156401
HemacytometrFisher Scientific0267110
Nikon Ti-E-PFS Mikroskop odwrócony do obrazowania żywych komórekMicro Video Instruments, Inc.
Wcześniejszy system sceniczny X-Y i oświetlacz LED z białym światłemMicro Video Instruments, Inc.500-H117P1N4
Wcześniejszy kontroler Proscan 3 XYZ z enkoderamiMicro Video Instruments, Inc.500-H31XYZE
Aparat cyfrowy Andor MicroVideo Instruments, Inc.D10NLC
Nikon NIS Elements AR OprogramowanieMicro Video Instruments, Inc.
Oświetlacz LED SOLA do fluorescencjiMicro Video Instruments, Inc.Komora środowiskowa SOLA-E
InVivo z kontrolą przepływu CO2Micro Video Instruments, Inc.Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Zmotoryzowany nosek o doskonałej ostrościMicro Video Instruments, Inc.
System Ti-C Kondensator TurretMicro Video Instruments, Inc.
Obiektyw Ti-C LWD LWD do systemowej głowicy rewolwerowejMicro Video Instruments, Inc.
Moduł Te-C LWD Ph1 MicroVideo Instruments, Inc.
CFI Plan Fluor DLL 10X Obiektywna 0,3 wd 16mmMicro Video Instruments, Inc.
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM ObiektywMicro Video Instruments, Inc.
MEA53100MQS31000MEP59391MEL51000MEL56200MEH41100MRH10101MRH48230

Bibliografia

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411(2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724(2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564(2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101(2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Leczenie paklitakselemocena losów komórekpoślizg mitotycznyprzerwanie otoczki jądrowejsystem FUCCIznakowanie H2B-GFPmikroskopia fazokontrastowaobrazowanie długoterminoweanaliza pojedynczych komórek
Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.