Synteza wielościennych nanorurek węglowych modyfikowanych nanocząstkami srebra oraz ocena ich działania przeciwbakteryjnego i właściwości cytotoksycznych

Podsumowanie

W tym badaniu, nanomateriały przeciwdrobnoustrojowe zostały zsyntetyzowane przez kwasowe utlenianie wielościennych nanorurek węglowych i późniejsze redukcyjne osadzanie nanocząstek srebra. Przeprowadzono badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności z wykorzystaniem przygotowanych nanomateriałów.

Streszczenie

W tym badaniu, wielościenne nanorurki węglowe (MWCNT) zostały potraktowane wodnym roztworem kwasu siarkowego, tworząc grupę funkcyjną na bazie tlenu. Srebro MWCNT otrzymano przez redukcyjne osadzanie srebra z wodnego roztworu AgNO₃ na utlenionych MWCNT. Biorąc pod uwagę unikalny kolor nanorurek węglowych, nie było możliwe zastosowanie ich do minimalnych testów stężenia hamującego lub toksyczności mitochondrialnej w celu oceny toksyczności i właściwości przeciwbakteryjnych, ponieważ zakłócałyby one testy. Zmierzono strefę inhibicji i minimalne stężenie bakteriobójcze dla Ag-MWCNT, a do pomiaru toksyczności i właściwości przeciwbakteryjnych CNT użyto testów Żywy/Martwy i Trypan Blue.

Wprowadzenie

Ostatecznym celem tego badania jest stworzenie przyjaznych dla środowiska antybakteryjnych nanomateriałów, które mogą hamować rozwój bakterii tworzących biofilmy. Te przeciwbakteryjne nanomateriały mają potencjał, aby przezwyciężyć problemy związane z toksycznością i opornością na antybiotyki powszechnie stosowanych chemikaliów lub antybiotykowych związków chemicznych. Biofilm to uwodniona zewnątrzkomórkowa substancja polimerowa (EPS), która składa się z polisacharydów, białek, kwasów nukleinowych i lipidów^1,2. Biofilmy zapobiegają przedostawaniu się obcych substancji i pomagają bakteriom w dynamicznym rozwoju^3,4. Biofilmy powodują nieprzyjemny zapach i przewlekłe choroby zakaźne^5,6. Na przykład Methylobacterium spp. rośnie poprzez przyleganie do miejsc, w których zawsze występuje woda lub w których trudno jest zapewnić ciągłą eliminację bakterii, takich jak wymienniki ciepła klimatyzatorów, prysznice i urządzenia medyczne. Tego typu biofilmy powodują nieprzyjemny zapach i przewlekłe choroby zakaźne^5,6.

Zazwyczaj, chemikalia lub antybiotykowe związki chemiczne są używane do hamowania wzrostu bakterii, które tworzą biofilmy. Pojawienie się bakterii opornych na antybiotyki i obawy o bezpieczeństwo chemikaliów in vivo napędzają potrzebę opracowania nowych materiałów zapobiegających tworzeniu się biofilmów i hamujących rozwój bakterii.

W tym badaniu syntetyzowane są nanomateriały przeciwdrobnoustrojowe, które są wolne od oporności na antybiotyki i toksyczności. Srebro jest dobrze znaną substancją przeciwdrobnoustrojową, a ostatnie osiągnięcia w dziedzinie nanonauki i nanotechnologii doprowadziły do aktywnych badań nad przeciwdrobnoustrojowym działaniem nanocząstek metali^7,8. Ostatnie badania wykazały, że mały rozmiar i wysoki stosunek powierzchni do objętości nanocząstek skutkują zwiększoną aktywnością przeciwbakteryjną^9,10,11.

Przedstawione tutaj nanomateriały łączą nanocząstki srebra o zwiększonych właściwościach przeciwdrobnoustrojowych oraz nanorurki węglowe o wysokim współczynniku kształtu, zwiększając w ten sposób powierzchnię na jednostkę objętości. Wytworzony kompozyt nanocząstek srebra i nanorurek węglowych wykazuje znaczne właściwości przeciwdrobnoustrojowe i minimalną toksyczność dla komórek ludzkich i zwierzęcych. W procesach syntetycznych w poprzednich badaniach wykorzystuje się niebezpieczne środki redukujące, takie jak NaBH₄, formamid, dimetyloformamid i hydrazyna. Proces ten jest skomplikowany, niebezpieczny i czasochłonny. Opisany tutaj proces syntetyczny wykorzystuje etanol jako znacznie mniej niebezpieczny środek redukujący.

Zmierzono strefę inhibicji i minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC) dla Ag-MWCNTs; Do pomiaru toksyczności i właściwości przeciwbakteryjnych użyto testów żywego/martwego i błękitu trypanowego. Nie przeprowadzono testów minimalnego stężenia hamującego (MIC) i toksyczności mitochondrialnej (MTT) ze względu na nietypowy kolor nanorurek węglowych, który zakłócałby testy. Na koniec określono minimalne stężenie zapobiegające wzrostowi Methylobacterium spp. bez wpływu na komórki ssaków.

Protokół

1. Utlenianie MWCNT

1. Odmierz 30 - 50 mg MWCNT do fiolki o pojemności 50 ml. Powoli dodawać 8 ml roztworu_H2SO₄:_HNO3 (90% stężenia początkowego, 3:1 obj./obj.) za pomocą pipety z końcówkami do pipet o pojemności 1 ml.
   UWAGA: Przygotowanie należy przeprowadzić w dygestoriach chemicznych.
   1. Odczekaj 30 minut, aż reakcja egzotermiczna się zakończy.
2. Sonikować roztwór w temperaturze 60 - 80 °C i mocy 160 W przez 1 godzinę, aż MWCNT osiądzie na dnie fiolki.
   UWAGA: Poziom wody w sonikatorze powinien być niższy niż górna część fiolki, aby woda nie została wprowadzona do fiolki.
3. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej.
   1. Za pomocą mikropipety dodaj kroplami 30 ml wody destylowanej do roztworu MWCNT-COOH.
      UWAGA: Podczas dodawania wody destylowanej zachodzi silna reakcja egzotermiczna. Powoli dodawaj wodę destylowaną i poczekaj na ostygnięcie.
4. Odwirować roztwór MWCNT-COOH przy 12 000 x g i temperaturze pokojowej przez 15 min.
   UWAGA: Podczas pracy wirówki upewnij się, że wirówka pozostaje zrównoważona, umieszczając probówkę o tej samej wadze naprzeciwko probówki z próbką.
5. Usunąć supernatant za pomocą pipety i końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Dodać 5 ml etanolu za pomocą pipety i 1 ml końcówki do pipety. Przepłukać ścianki fiolki dodatkowym odpipetowanym roztworem alkoholu etylowego. Odwirować roztwór o sile 12 000 x g i temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   1. Oznaczyć pH supernatantu za pomocą bibuły pH. Powtarzać mycie i odwirowywanie do momentu, aż pH sklarowanego osadu będzie neutralne.
6. Usunąć cały supernatant. Dodaj 1 ml wody destylowanej, aby wytrącić i równomiernie rozproszyć MWCNT-COOH w roztworze. Liofilizowany roztwór w temperaturze -60 °C w próżni do wyschnięcia.

2. Osadzanie nanocząsteczek srebra na MWCNT

1. Umieścić 10 mg MWCNT-COOH w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i rozcieńczyć 30 ml wody destylowanej. Sonikować roztwór w temperaturze 60 °C i 160 W przez 1 godzinę.
2. Umieścić 6 ml 0,1 N AgNO₃ w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i rozcieńczyć 18 ml wody destylowanej. Roztwór sonikacyjny w temperaturze 60 °C i 160 W przez 1 h.
   UWAGA: Dodać AgNO₃ proporcjonalnie do całkowitej masy MWCNT tak, aby całkowita masa Ag nie przekraczała 20%.
3. Dodawać roztwór AgNO₃ kroplami do roztworu MWCNTs za pomocą pipety i końcówki pipety o pojemności 1 ml podczas sonikacji mieszaniny w temperaturze 60 °C i 160 W. Kontynuuj sonikację przez 1 godzinę po dodaniu AgNO₃.
4. Odwirować roztwór o sile 12 000 x g i temperaturze pokojowej przez 15 minut i usunąć supernatant. Odwirować roztwór i usunąć supernatant jeszcze dwa razy.
5. Dodać 1 ml wody destylowanej do mieszaniny Ag-MWCNTs i równomiernie rozproszyć osad w roztworze. Dodać 5 ml etanolu i pozostawić reakcję w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
6. Odwirować roztwór o sile 12 000 x g i temperaturze pokojowej przez 15 minut i usunąć supernatant.
7. Oznaczyć pH supernatantu za pomocą bibuły pH. Powtarzać mycie i odwirowywanie do momentu, aż pH sklarowanego osadu będzie neutralne.
8. Dodaj 1 ml wody destylowanej do Ag-MWCNT i równomiernie rozproszyć w roztworze. Roztwór liofilizować w temperaturze -70 °C w próżni przez 24 godziny.

3. Test strefy hamowania

1. Zmieszać 18,12 g agaru R2A i 1 l wody destylowanej w kolbie. Sterylizować mieszaninę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
2. Pozostaw żel do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Umieść 10 ml żelu na szalkach Petriego przed stwardnieniem, aby przygotować stałe podłoże.
3. Umieść 100 μl bakterii na podłożu stałym. Rozprowadzić bakterie na stałym podłożu za pomocą rozsiewacza.
   UWAGA: Procedurę tę należy przeprowadzić w dygestoriach chemicznych oświetlonym alkoholem lamp.
4. Inkubować naczynia w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
5. Wymieszać 3,12 g bulionu R2A z 1 litrem wody destylowanej w kolbie. Sterylizować mieszaninę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
6. Przenieść wyhodowane kolonie do płynnego podłoża za pomocą pętli i igły i inkubować w inkubatorze przy 180 obr./min i temperaturze 30 °C.
7. Zapisuj wartość OD (gęstości optycznej) za pomocą spektrofotometrii UV przy 600 nm co godzinę, aby zmierzyć wzrost bakterii.
   UWAGA: W tym teście użyto agaru R2A, a nie standardowego agaru Muellera-Hintona, ponieważ R2A jest preferowanym agarem do wzrostu Methylobacterium spp.
8. Umieść 10 ml przygotowanego agaru R2A na szalce Petriego, aby przygotować dolny agar.
   1. Wymieszaj 3,12 g bulionu R2A i 8 g agaru z 1 l wody destylowanej. Sterylizować mieszaninę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Umieść 10 ml tego żelu na dolnym agarze
   .
9. Załadować 50 μl roztworu Ag-MWCNTs na sterylny krążek papierowy za pomocą mikropipety.
   1. Wysuszyć i wysterylizować próbkę Ag-MWCNT w komorze próżniowej w świetle UV przez 30 minut.
10. Umieść próbkę Ag-MWCNTs na agarze .
11. Inkubować płytkę agarową w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
12. Strefa pomiaru zahamowania¹².
    UWAGA: Instrukcje dotyczące używanego oprogramowania znajdują się w bibliografiach.

4. Test antybakteryjny

1. Powtórz kroki od 3.1 do 3.7, aby przygotować kulturę bakteryjną.
2. Przy maksymalnej średnicy zewnętrznej zaszczepić 100 μl bakterii w 3 ml świeżej pożywki płynnej za pomocą pipety i końcówki mikropipety o pojemności 100 μl.
3. Przygotować pięć próbek roztworu kontrolnego o objętości 50 μl w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Do każdej probówki dodać następujące ilości: 1) metanol; 2) 1000 μg/mL MWCNT-COOH; 3) 50 μg/ml Ag-MWCNTs; 4) 40 μg/ml Ag-MWMWCNTs; 5) 30 μg/ml Ag-MWCNTs.
4. Inkubować przy 180 obr./min i w temperaturze 30 °C aż do osiągnięcia maksymalnej aktywności kontrolnej, jak określono za pomocą spektrofotometrii UV, jak opisano powyżej.
5. Zmierzyć wartość OD każdej próbki i obliczyć stężenie MIIC. Wartość OD jest bezpośrednio związana z liczbą komórek bakteryjnych w bulionie próbki.
6. Rozprowadzić wyhodowane bakterie na stałym podłożu za pomocą rozsiewacza.
7. Inkubować naczynie w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
8. Policz kolonie bakterii i zmierz wartości CFU, aby określić aktywność przeciwbakteryjną¹².
   UWAGA: Instrukcje dotyczące używanego oprogramowania znajdują się w bibliografiach.

5. Test żywotności

1. Po wyjęciu komórek hodowlanych z inkubatora, odessać pożywkę i przemyć trzykrotnie kroplami 5 ml PBS.
2. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA w PBS do umytej komórki i odessać po 1 minutach.
   1. Dotknij płytki, aby usunąć zablokowane komórki.
3. Dodaj 5 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), a następnie usuń komórki. Odwirować próbki o masie 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
   1. Dodaj 1 ml DPBS i wymieszaj.
   2. Policz komórki w 10 μl roztworu za pomocą automatycznej maszyny do liczenia komórek.
      UWAGA: Instrukcje dotyczące używanej maszyny do liczenia komórek znajdują się w przypisach¹³.
4. Umieścić 1 × 10⁵ komórek AML12 na basenie w sześciodołkowej płytce zawierającej roztwór DMEM. Pożywka zawiera 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% sterylnego antybiotyku.
5. Inkubować płytkę przez 8 - 12 godzin w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO₂/95% powietrza.
6. Zassać supernatant ze studzienek za pomocą aspiratora.
   1. Dodać każdą próbkę składającą się z kontrolnego NMS-DMSO (dimetylosulfotlenku) i 30-40 μg/ml Ag-MWCNT do 1 ml DMEM.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C w środowisku powietrza o stężeniu 5%_CO2/95% przez 8 godzin.
7. Usunąć sklarowany osad i przemyć próbki 5 ml PBS.
8. Dodaj kroplami 1 ml przygotowanego żywego/martwego zestawu (20 μl 2 mM EthD-1 z 5 μl 4 mM kalceiny AM w DMSO w 10 ml PBS) do komórki.
9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 - 45 minut lub w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zmierzyć fluorescencję za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej przy 100X lub 300X.

6. Test błękitu trypanowego

1. Przygotować próbki zgodnie z krokami od 5.1 do 5.6.2 powyżej.
2. Usunąć supernatant.
3. Umyj płytę z 1 ml 1x DPBS i dekantacją.
4. Dodaj 1 ml trypsyny na płytkę i inkubuj przez 3 minuty, aby odłączyć komórki od hodowli. Użyj pożywki do hodowli komórkowych, aby umyć płytkę i zebrać komórki. Umieść zebrane komórki w probówce o pojemności 15 ml.
5. Probówka wirówkowa o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 4 °C przez 3 min.
6. Odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml świeżej pożywki do osadu komórkowego i ponownie rozproszyć komórki.
7. Dodać 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl rozproszonych komórek i policzyć komórki za pomocą automatycznej maszyny do liczenia komórek.
   UWAGA: Instrukcje dotyczące używanej maszyny do liczenia komórek znajdują się w bibliografii.

Wyniki

Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) potwierdzają powstawanie Ag-MWCNT (Rysunek 1A i 1B). Ich udana synteza została potwierdzona zmianą ładunku powierzchniowego. Obliczono wielkość cząstek Ag zdeponowanych na MWCNT (Rysunek 1C). Średnia wielkość cząstek wynosiła około 3,83 nm. Wzorzec XRD zsyntetyzowanych Ag-MWCNT jest pokazany na Rysunek 1D. Szczyt przy 20 - 30° odpowiada MWCNT; pozost...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę przygotowania MWCNT z osadzonymi nanocząstkami Ag. Ten nanomateriał zawierający srebro wykazuje znaczne działanie przeciwbakteryjne i minimalny potencjał niekontrolowanego wchłaniania nanocząsteczek srebra w organizmie. Wykazaliśmy, że 30 μg/ml zsyntetyzowanych Ag-MWCNT to skuteczny poziom aktywności przeciwbakteryjnej przeciwko Methylobacterium spp. o znikomej cytotoksyczności dla komórek wątroby ssaków. Chociaż przed ekspansją w sektorze komercyjnym wymagane są dodatko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1 N azotan srebra	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Nanorurka węglowa, wielościenna	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
Agar R2A	MBcell	MB-R1129
R2A bulion	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	z Korei Kolekcja dla kultur typu Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
ŻYWY/MARTWY Zestaw do obrazowania komórek	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			z Chungnam University, Dajeon, Korea
ludzki PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Źródło fotonów Cu K (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC