Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57389

⸱

14 marca 2018

 ,  , 
1Division of Cellular and Gene Therapies, Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Microscopy and Imaging Core facility, Division of Viral Products, Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Streszczenie

Chromosomy muszą być niezawodnie i równomiernie segregowane na komórki potomne podczas podziału komórek mitotycznych. Wierność segregacji chromosomów jest kontrolowana przez wiele mechanizmów, w tym punkt kontrolny montażu wrzeciona (SAC). SAC jest częścią złożonego systemu sprzężenia zwrotnego, który jest odpowiedzialny za zapobieganie postępowi komórki poprzez mitozę, chyba że wszystkie kinetochory chromosomowe są przyłączone do mikrotubul wrzeciona. Opóźnienia chromosomowe i nieprawidłowa segregacja chromosomów są wskaźnikiem dysfunkcyjnych punktów kontrolnych kontroli cyklu komórkowego i mogą być wykorzystywane do pomiaru stabilności genomowej dzielących się komórek. Deregulacja SAC może spowodować przekształcenie normalnej komórki w komórkę złośliwą poprzez nagromadzenie błędów podczas segregacji chromosomów. Wdrożenie SAC i tworzenie kompleksu kinetochorowego są ściśle regulowane przez interakcje między kinazami a fosfatazą, taką jak fosfataza białkowa 2A (PP2A). Protokół ten opisuje obrazowanie żywych komórek opóźnionych chromosomów w fibroblastach embrionalnych myszy wyizolowanych od myszy, które miały nokaut podjednostki regulatorowej PP2A-B56γ. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia innych technik obrazowania kontroli cyklu komórkowego, takich jak cytometria przepływowa lub immunocytochemia, które zapewniają jedynie migawkę stanu cytokinezy komórki, zamiast dynamicznej czasoprzestrzennej wizualizacji chromosomów podczas mitozy.

Wprowadzenie

W poniższym protokole opisujemy wygodną metodę wizualizacji segregacji chromosomów i progresji mitotycznej podczas cyklu komórkowego w mysich fibroblastach embrionalnych za pomocą histonu 2B-GFP, znakowania BacMam 2.0 i obrazowania żywych komórek.

Punkty kontrolne kontroli cyklu komórkowego monitorują segregację chromosomów i odgrywają ważną rolę w utrzymaniu integralności genetycznej komórki 1,2,3. Nagromadzenie nieprawidłowo posegregowanych chromosomów może prowadzić do aneuploidii, która jest cechą charakterystyczną większości guzów litych 4. W związku z tym wykrywanie opóźnionych chromosomów może być stosowane jako metoda badania niestabilności chromosomowej.

Białka znakowane fluorescencyjnie mogą być używane do wizualizacji segregacji chromosomów na żywo i opóźnień chromosomowych, ale generowanie białka znakowanego mCherry lub H2B-GFP wymaga znacznej wiedzy na temat dostarczania genów i biologii molekularnej 5. Dla uproszczenia opisujemy zastosowanie odczynnika CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, zwanego dalej CL-HB regent. Odczynnik ten może być użyty natychmiast, co eliminuje obawy o jakość i integralność wektora. Ponadto odczynnik ten nie wymaga stosowania potencjalnie szkodliwych zabiegów ani lipidów i chemikaliów obciążających barwnikiem. W przeciwieństwie do konwencjonalnych etykiet fluorescencyjnych, regent CL-HB barwi niezależnie od funkcji (tj. potencjału błonowego). Regent CL-HB można po prostu dodać do komórek i inkubować przez noc w celu ekspresji białka. Regent CL-HB nie replikuje się w komórkach ssaków i może być stosowany w warunkach laboratoryjnych na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 1. Również ta przejściowa transfekcja może być wykryta po całonocnej inkubacji przez okres do 5 dni, co wystarcza na przeprowadzenie większości dynamicznych analiz komórkowych.

Alternatywnie, nieprawidłowości chromosomalne mogą być badane za pomocą różnych technik, takich jak cytometria przepływowa, immunohistochemia lub fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) 6. Cytometria przepływowa może być stosowana do badania aneuploidii, którą można zmierzyć na podstawie zawartości DNA i fazy komórek w cyklu komórkowym. Chociaż cytometria przepływowa może być stosowana do pomiaru aneuploidii, nie dostarcza informacji na temat błędnej segregacji chromosomów. FISH i techniki immunohistochemiczne wykorzystują sondy fluorescencyjne do wiązania się z DNA lub chromosomami. Chociaż techniki te zapewniają migawkę stanu populacji komórek, nie pozwalają na obrazowanie żywych komórek, tracąc tym samym wszelkie informacje uzyskane dzięki czasoprzestrzennej wizualizacji cytokinezy w określonych komórkach obserwowanej przez pewien okres czasu.

Ten protokół został użyty do badania opóźnionych chromosomów lub błędnej segregacji chromosomów u mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) leczonych nokodazolem wyizolowanych od myszy PP2A-B56γ. Oprócz powyższej aplikacji, protokół ten zapewnia proste narzędzie do oznaczania i wizualizacji segregacji chromosomów w różnych typach komórek, które można wykorzystać do badania regulacji cyklu komórkowego lub niestabilności chromosomalnej w komórkach nowotworowych. Ponadto może być również stosowany do badania niestabilności chromosomowej spowodowanej różnymi terapiami farmakologicznymi lub do badania skutków nokautu genu skutkującego błędną segregacją chromosomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone w ramach tych badań zostały wykonane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w placówce badawczej Food and Drug Administration (FDA).

1. Izolacja i hodowla fibroblastów embrionalnych myszy (MEFs)

  1. Wyizolować mysie fibroblasty embrionalne (MEF) z linii myszy PP2A-B56γ- oraz z dzikich littermates zgodnie ze standardowym protokołem 7,8,9.
  2. Namnażać MEF przez 3 pasaże, następnie zamrozić i przechowywać do czasu rozpoczęcia eksperymentów 8.

2. Hodowla MEF-ów w 2-dołkowym szkiełku nakrywkowym z komorą do obrazowania na żywo

  1. Przygotować 500 mL pożywki wzrostowej dla MEF zawierającej DMEM/F12 (Dulbecco Modified Eagle Medium) z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), antybiotykami penicylina/streptomycyna 1X, L-glutaminą (200 mM) oraz 1X nieessentialnymi aminokwasami (NEAA) w butelce na pożywki o pojemności 500 mL.
  2. Rozmrozić fiolki z zamrożonymi MEF od myszy typu dzikiego oraz myszy PP2A-B56γ- w trzecim pasażu w podgrzanej wcześniej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Przenieść rozmrożone MEF do probówek 15-mL i powoli dodawać kroplami 20 mL pożywki DMEM/F12 do probówek 15-mL, używając pipety 10-mL.
  4. Przenieść MEF wraz z 20 mL pożywki wzrostowej DMEM/F12 do kolb T75 i namnażać aż do osiągnięcia 70% konfluencji. Konfluencję ocenia się za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 4x lub 10x.
  5. Odssać pożywkę wzrostową za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego w dygestorium, dodać 3 mL 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. Dodać 3 mL pożywki wzrostowej DMEM/F12, aby zatrzymać reakcję.
  6. Odwirować komórki przy niskiej prędkości (300 x g) przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i resuspender osad komórkowy w 1 mL pożywki wzrostowej DMEM/F12 uprzednio podgrzanej do 37 °C w kąpieli wodnej.
  7. Policzyć komórki metodą wykluczania trypan blue lub inną odpowiednią metodą liczenia komórek 8.
  8. Zasiać około 20 000 MEF/studzienkę na pokrywkach szklanych z dwiema komorami. Dodać 200 µL/studzienkę pożywki wzrostowej DMEM/F12 i pozwolić komórkom przyrosnąć, inkubując je przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

3. Synchronizacja

  1. Zsynchronizuj MEF w fazie G0/G1 poprzez inkubację komórek w pożywce wzrostowej DMEM/F12 zawierającej 0,1% FBS przez 24 h, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek w fazie G0/G1.
    Uwaga: Choć preferowaną metodą było głodzenie seryjne, można zastosować różne inne metody, w zależności od etapu mitozy, na którym wymagane jest zatrzymanie cyklu komórkowego 10.

4. znakowanie

  1. Przygotować roztwór zapasowy nocodazolu w DMSO o stężeniu 1,5 mg/mL. Nocodazol zatrzymuje komórki w fazie G2/M poprzez hamowanie tworzenia mikrotubul 10.
  2. Trzy dni po synchronizacji dodać 200 µL pożywki wzrostowej (z 10% FCS), 200 ng/mL nocodazolu oraz odczynnik CL-HB (Histone 2B-GFP BacMam 2.0).
  3. Obliczyć liczbę cząsteczek na komórkę (Particles Per Cell – PPC) odczynnika CL-HB, które należy dodać do komórek, według następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    Gdzie liczba komórek to szacowana całkowita liczba komórek w momencie znakowania, PPC to liczba cząsteczek na komórkę, a 1 × 108 to liczba cząsteczek na mL odczynnika. Na przykład, aby oznakować 20 000 komórek przy PPC wynoszącym 30:
    figure-protocol-2
    UWAGA: Odczynnik CL-HB działa dobrze w większości typów komórek przy PPC od 10 do 50. Jednak w niniejszym badaniu najlepsze wyniki uzyskano dla 30 PPC.
  4. Inkubować MEF przez 18 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    UWAGA: W obecnym eksperymencie wizualizacja chromosomów w komórkach mitotycznych omijających punkt kontrolny montażu wrzeciona nastąpiła 18 h po zatrzymaniu cyklu komórkowego za pomocą nocodazolu.

5. Wizualizacja chromosomów opóźnionych

  1. Wizualizuj embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) przy użyciu konfokalnego systemu mikroskopowego z dyskiem wirującym, wyposażonego w komorę inkubacyjną oraz obiektyw imersyjny 63x.
    1. Do akwizycji obrazów w kanale GFP zastosuj długość fali wzbudzenia 488 nm oraz długość fali emisji 450 nm.
    2. W tej technice wykorzystaj konfokalny system mikroskopowy z dyskiem wirującym, posiadający zmotoryzowane stoły skanujące, wkładki Z-Piezo, inkubator na stole oraz funkcję bezpośredniego odzyskiwania fluorescencji po fotobleachingu.
  2. Na jeden dzień przed obrazowaniem włącz zasilanie komory inkubacyjnej i pozostaw ją do ogrzania do 37 °C przez całą noc.
  3. Włącz zasilanie statywu mikroskopu, kamery, jednostki dysku wirującego, iluminatora, lasera argonowego, komputera oraz zmotoryzowanego stołu.
  4. Pozostaw system do rozgrzania na 3 min; uruchom laser argonowy, przekręcając kluczyk zapłonowy. Przełącz przełącznik lasera argonowego z pozycji "standby" na "laser run".
  5. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania danych.
  6. Uruchom kontroler CO2 inkubatora na stole i ustaw stężenie CO2 na poziomie 5%. Należy to zrobić przed rozpoczęciem obrazowania.
  7. Wyjmij szkiełko nakrywki z komorą z inkubatora i umieść je na stole w celu wizualizacji. Obserwuj komórki przez obiektyw imersyjny 63x (NA1.4).
  8. Patrząc przez okularowe soczewki, ustaw ostrość obrazu i zidentyfikuj komórkę w fazie rozpadu otoczki jądrowej (NEBD).
  9. Uruchom odpowiedni laser (laser argonowy 488 nm do wizualizacji Histone2B-GFP).
  10. Otwórz okno sterowania akwizycją i ustaw czas ekspozycji dla kanału GFP. Zidentyfikuj komórkę w fazie NEBD.
    1. Ręcznie określ górną i dolną płaszczyznę ogniskową komórki docelowej, a następnie wprowadź ustawienia sekcjonowania optycznego xyz.
    2. Obserwuj komórkę przez 20 min; jeśli komórka nie przejdzie do podziału, przerwij akwizycję obrazu po 20 min i przejdź do kolejnej komórki w fazie NEBD.
  11. Obrazowanie chromosomów zapóźnionych podczas mitozy w komórkach PP2A-B56γ-, które uniknęły działania SAC, zajmuje około 1 h na komórkę. Aby uzyskać materiał do filmu, wykonuj zdjęcia co 3 min.
    UWAGA: Komórki typu dzikiego ulegają zatrzymaniu i nie posuwają się poza fazę NEBD po potraktowaniu nocodazolem.
  12. Zapisz obrazy w formacie pliku zvi do dalszej analizy.

6. Przetwarzanie i analiza obrazów

Uwaga: Przetwarzanie i analizę obrazów trójwymiarowych należy przeprowadzić przy użyciu dowolnego dostępnego oprogramowania, takiego jak Axiovision wersja 4.8.2 lub Imaris wersja 8.2. W niniejszym badaniu wykorzystano oprogramowanie ImageJ.

  1. Otwórz sekwencję obrazów. Jeśli obrazy są już w formacie stosu (stack), przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie połącz wszystkie odpowiednie obrazy w stos, korzystając z opcji „Image > Stacks > Images to Stack” w pasku menu.
  2. Wykonaj ewentualne niezbędne korekty jasności/kontrastu oraz poziomów.
  3. Aby dodać znacznik czasu do filmu:
    1. Przejdź do „Image > Stacks > Label…” w pasku menu.
    2. Wybierz odpowiedni format, wartość czasu początkowego oraz interwał czasowy między poszczególnymi obrazami.
    3. Zaznacz pole „Preview” i dostosuj ustawienia lokalizacji oraz formatu. Naciśnij „OK”, aby zastosować znacznik czasu.
  4. Aby dodać pasek skali do filmu:
    1. Ustaw skalowanie obrazu w menu „Analyze > Set Scale” w pasku menu.
    2. W polu „Distance in pixels” wprowadź liczbę pikseli dla znanej odległości, a w polu „Known distance” wprowadź tę odległość. Ustaw odpowiednią jednostkę długości, np. µm. Naciśnij „OK”, aby zastosować skalę do stosu.
    3. Przejdź do „Analyze > Tools > Scale Bar…”, aby dodać pasek skali. Ustaw rozmiar paska w polu „Width in µm” i dostosuj pozostałe opcje formatowania. Zaznacz pole „Label all slices”, aby dodać pasek skali do całego stosu.
  5. Przejrzyj film, klikając trójkątny przycisk odtwarzania w lewym dolnym rogu okna obrazu. Dostosuj liczbę klatek na sekundę, korzystając z opcji „Image > Stacks > Animation > Animation Options” w pasku menu.
  6. Wyeksportuj plik filmu, wybierając „File > Save As > AVI…”, a następnie określ liczbę klatek na sekundę i kompresję.
  7. Naciśnij „OK”, aby wybrać lokalizację zapisu i nazwę pliku. Naciśnij „Save”, aby zapisać plik filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

MEF z myszy typu dzikiego oraz myszy PP2A-B56γ- wysiano na szkiełka nakrywkowe w komorach dwudzielnych i pozostawiono do przywarcia. W 2. dniu MEF zsynchronizowano, stosując 0,1% FBS przez 24 h. W 3. dniu MEF w pożywce z dodatkiem 200 ng/mL nocodazolu i 30 PPC CL-HB reagent inkubowano przez 18 h w temperaturze 37°C and 5% CO2. W 4. dniu komórki obrazowano przy użyciu konfokalnego systemu mikroskopowego z dyskiem obrotowym (Rysunek 1). Ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Punkty kontrolne kontroli cyklu komórkowego, które zapewniają dokładną segregację chromosomów, zapobiegają aneuploidii i transformacji komórek 1,2,3. W niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że inaktywacja PP2A-B56γ spowodowała osłabienie punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Obrazowanie żywych komórek pozwoliło zaobserwować błędną segregację chromosomów podczas mitozy u MEF-ów PP2A-B56γ leczonych nokodazolem 9

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Guo-Chiuan Hung i Dr. Bharatkumar Joshi za cenne komentarze, które poprawiły rękopis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F12Gibco11320082
L-glutaminaGibco25030081
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Gibco11140050
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140122
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanemGibco14190144
Trypsyna-EDTAGibco25300054
Płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS11150
DMSOEMD MilliporeMX 1458-6
Kriogeniczne pudełka do przechowywania fiolekFisherbrand10-500-28
Fiolki kriogeniczneCorning/costar431416
Kolby T75Cellstar658175
2 dobrze komorowe szkło nakrywkoweNunc155380PK
Cellometer Vision Cell ProfilerNexcelom Bioscience LLCCellometer Vision Trio
NocodazoleSigmaM1404
CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0Thermo Fisher Scientific Inc.C10594
System mikroskopu konfokalnego Zeiss Cell Observer z wirującym dyskiemZeiss MikroskopiaZeiss Cell Observer SD
Łaźnia wodnaInkubatorThermoscientific 280
Rozwiązania komercyjne SanyoMCO-18AIC (UV)
Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThe Baker CompanySterilGard
Oprogramowanie AxiovisionZeissVer.4.8.2
Oprogramowanie ImageJNational Institute of HealthVer. 1.51r
Carl serii

Bibliografia

  1. Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
  2. Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
  3. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
  4. Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
  5. Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
  6. Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
  7. Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
  8. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).
  9. Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
  10. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
  11. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
  12. Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).
  13. Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
  14. Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
  15. Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki mitotyczneHistone 2B-GFPkonfokalny mikroskop z dyskiem obrotowymembrionalne fibroblasty mysienokaut PP2A-B56-gammatraktowanie nocodazolemopóźnienie chromosomówpunkt kontrolny zgromadzenia wrzeciona
Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.