Artykuł metodologiczny

Model z zamkniętą klatką piersiową do wywoływania poprzecznego zwężenia aorty u myszy

19K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57397

⸱

5 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anaesthesiology, University Hospital Bonn, 2Department of Cardiac Surgery, University Hospital Bonn, 3Institute of Physiology 2, University of Bonn, 4Department of Medicine - Cardiology, University Hospital Bonn

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół poprzecznego zwężenia aorty (TAC) za pomocą torakotomii bocznej. Technika ta jest minimalnie inwazyjnym, zamkniętym zabiegiem chirurgicznym klatki piersiowej, mającym na celu symulację przeciążenia ciśnieniem i niewydolności serca u myszy wykorzystujących standardowe warunki laboratoryjne TAC.

Streszczenie

Badania nad przerostem serca i niewydolnością serca często opierają się na mysich modelach przeciążenia ciśnieniem wywołanych przez TAC. Standardową procedurą jest wykonanie częściowej torakotomii w celu uwidocznienia poprzecznego łuku aorty. Jednak uraz chirurgiczny spowodowany torakotomią w modelach z otwartą klatką piersiową zmienia fizjologię układu oddechowego, ponieważ żebra są preparowane i pozostawiane nieprzymocowane po zamknięciu klatki piersiowej. Aby temu zapobiec, ustaliliśmy minimalnie inwazyjne, zamknięte podejście do klatki piersiowej za pomocą torakotomii bocznej. W tym przypadku zbliżamy się do łuku aorty przez 2.przestrzeń międzyżebrową bez wchodzenia do jam klatki piersiowej, pozostawiając mysz z mniej traumatycznym urazem, z którego może dojść do siebie. Przeprowadzamy tę operację przy użyciu standardowych warunków laboratoryjnych dla procedur TAC na otwartej klatce piersiowej z równymi wskaźnikami przeżycia. Oprócz utrzymania fizjologicznych wzorców oddychania dzięki podejściu z zamkniętą klatką piersiową, myszy wydają się odnosić korzyści z szybkiego powrotu do zdrowia, ponieważ mniej inwazyjna technika wydaje się ułatwiać szybki proces gojenia i zmniejszać odpowiedź immunologiczną po urazie.

Wprowadzenie

Modele myszy są często używane do naśladowania ludzkich chorób1. Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) służy do wywoływania przeciążenia ciśnieniowego i przerostu lewej komory2. Model TAC z otwartą klatką piersiową u myszy został zweryfikowany przez Rockmana i wsp.3, a procedura chirurgiczna jest szczegółowo opisana przez DeAlmeida et al.4. Prążkowanie aorty poprzecznej jest korzystniejsze w porównaniu do zwężenia aorty brzusznej, ponieważ większa część krążenia może zrekompensować negatywne skutki tej ostatniej procedury2.

Prążkowanie aorty poprzecznej prowadzi do zwiększonego ciśnienia tętniczego w aorcie wstępującej i tętnicy ramienno-głowowej, ale pozostawia wystarczającą perfuzję narządów przez naczynia dystalne (tj. lewą tętnicę szyjną wspólną, lewą tętnicę podobojczykową i aortę zstępującą). Prowadzi to do zwiększonego obciążenia wtórnego serca i podwyższonego obciążenia ściany serca. Naprężenie ściany następnie zmniejsza się z powodu pogrubienia włókien5. Przewlekła zmiana hemodynamiki serca powoduje nieprzystosowanie i poszerzenie lewej komory. W ten sposób TAC tworzy powtarzalny model przerostu mięśnia sercowego, który ostatecznie prowadzi do niewydolności serca.

Standardowa procedura dla TAC opisana przez DeAlmeide et al.4 zbliża się do łuku aorty poprzez częściową górną torakotomię, poprzez rozwarstwienie żeber lub mostka i wejście do śródpiersia, jak również do jamy opłucnej. Pozwala to na dobry widok łuku aorty i jej bocznych odgałęzień. Niestety, wypreparowanych żeber nie można ponownie przymocować, co sprawia, że swobodnie unoszą się w powietrzu, a tym samym zmieniają dynamikę oddychania.

Dlatego też ustaliliśmy minimalnie inwazyjne podejście do łuku aorty z zamkniętą klatką piersiową, stosując boczne podejście chirurgiczne przez 2.przestrzeń międzyżebrową. Największą zaletą tego modelu jest możliwość wykonania TAC nawet bez przecinania żeber. Uraz chirurgiczny ogranicza się do nacięcia skóry i rozwarstwienia mięśni międzyżebrowych. Zabieg ten minimalizuje sam uraz i pomaga utrzymać odpowiednią stabilność klatki piersiowej.

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę krok po kroku, aby przeprowadzić operację TAC u myszy bez wykonywania całkowitej lub górnej torakotomii. Doppler o wysokiej częstotliwości został użyty w celu zapewnienia sukcesu TAC zgodnie z wcześniejszym opisem 6,7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Doświadczeń na Zwierzętach LANUV Recklinghausen (#84-02.04.2016.A374). Ogólnie rzecz biorąc, procedura ta jest wykonywana na dorosłych myszach w wieku >10 tygodni. Możliwe jest jednak wykonanie tej operacji również na młodszych zwierzętach. Narzędzia chirurgiczne muszą być wysterylizowane przed użyciem, a wszystkie czynności należy wykonywać w warunkach aseptycznych.

1. Indukcja znieczulenia i intubacja

  1. Buprenorfinę należy wstrzyknąć dootrzewnowo w stężeniu 0,1 μg/g masy ciała w celu złagodzenia bólu. Powtarzać wstrzyknięcia dootrzewnowe w dawce 0,1 mg/kg buprenorfiny co 8 godzin przez następne trzy dni po zabiegu.
  2. W celu indukcji umieść mysz w skrzynce indukcyjnej znieczulenia, która jest podłączona do parownika ustawionego na 3,0% obj. izofluranu przy przepływie tlenu 1 l/min.
  3. Zapewnij głęboką narkozę poprzez wywołanie bodźca dotykowego.
    UWAGA: Zwiększ obj. izofluranu do 5%, jeśli indukcja znieczulenia nie powiedzie się lub narkoza nie jest wystarczająco głęboka.
  4. Ściśnij ogon myszy, aby zapewnić brak refleksu. W przypadku całkowitego braku odruchów, zważyć mysz w celu optymalnego ustawienia respiratora (patrz 1.12).
  5. Przesuń mysz na stół operacyjny o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu.
  6. Umieść nos myszy w plastikowym stożku, który jest połączony ze skrzynką indukcyjną znieczulenia, aby utrzymać narkozę.
  7. Zamocuj górne siekacze myszy za pomocą nylonowego szwu. Przymocuj kończyny taśmą klejącą.
  8. Uciskaj tylną łapę końcówką kleszczy, aby ponownie zapewnić odpowiednią narkozę. W przypadku braku odruchu wycofania należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
    UWAGA: Zwiększ objętość % izofluranu, jeśli indukcja znieczulenia nie powiedzie się lub narkoza nie jest wystarczająco głęboka i poczekaj na brak odruchu odstawienia.
  9. Umieść sterylny lubrykant okulistyczny na rogówce, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
  10. Nasmaruj sondę doodbytniczą, aby uniknąć urazu odbytnicy. Włóż sondę temperatury doodbytniczą, aby zapewnić temperaturę rdzenia 37 °C.
  11. Zrób depilację gardła i górnej części klatki piersiowej kremem do depilacji zgodnie z instrukcjami producenta. Zetrzyj krem po 1 min. W razie potrzeby powtarzaj ten krok, aż się powiedzie.
    UWAGA: W przypadku krwawienia używaj wacików z bawełnianą końcówką.
  12. Oczyść depilowany obszar 70% etanolem. Następnie nałóż powidon-jod do miejscowej dezynfekcji skóry 3 razy i przez co najmniej 3 minuty.
  13. Dostosuj ustawienia wentylatora do parametrów fizjologicznych. Ustaw częstość oddechów na 150/min, a objętość oddechową na 8-10 μl/g masy ciała (BW).
  14. Załóż nową parę sterylnych rękawiczek. Umieść mysz pod mikroskopem chirurgicznym i umieść na myszy sterylną zasłonę z okienkami.
  15. Naciąć skórę na linii środkowej około 3 mm pod żuchwą aż do 2. żebra. Zidentyfikuj linię środkową i tkanki łączne gruczołu podżuchwowego. Następnie użyj kątowych kleszczy wewnątrztorebkowych, aby delikatnie tępo podzielić gruczoł na linii środkowej za pomocą dwóch kleszczy i zbadać mięsień tchawicy.
  16. Delikatnie przygotuj tchawicę, rozciągając tępo mięśnie przytchawicze za pomocą kleszczy wewnątrztorebkowych.
  17. Pociągnij za język kleszczami, aby wyprostować gardło, aby ułatwić warunki intubacji i delikatnie włóż kaniulę intubacyjną (o średnicy zewnętrznej 1,2 mm) do tchawicy. Potwierdź intubację poprzez bezpośrednią wizualizację rurki wewnątrz tchawicy i sprawdzenie, czy ruch klatki piersiowej jest prawidłowy.
  18. Dostosuj stężenie izofluranu po intubacji do 2% izofluranu o przepływie 1,0 l/min i 100% O2,
    UWAGA: Jeśli ruchy oddechowe nie ustają lub myszy zaczynają się poruszać, najpierw zwiększ częstość oddechów do 180/min. W razie potrzeby należy zwiększyć stężenie izofluranu do 3,5% wtórnie, aż mysz przestanie samodzielnie oddychać. Oceń wycieki lub nieodpowiednie napełnienie waporyzatora jako najczęstsze problemy.
  19. Alternatywnie należy przeprowadzić intubację zgodnie z sugestią w poniższych krokach.
    1. Ustaw mysz na stole pod kątem 60°.
    2. Zamocuj kończyny myszy za pomocą taśmy klejącej i odchyl głowę.
    3. Umieść źródło zimnego światła bezpośrednio na skórze nad krtanią.
    4. Delikatnie pociągnij język kleszczami, aby uwidocznić struny głosowe.
    5. Przełóż plastikową rurkę kaniuli dożylnej (24 G) przez struny głosowe i podłącz plastikową rurkę do ustawień respiratora.
    6. Podłącz respirator do kaniuli, aby potwierdzić intubację poprzez synchroniczne ruchy klatki piersiowej.
      UWAGA: Jeśli ruchy oddechowe nie zatrzymują się lub myszy zaczynają się poruszać, najpierw zwiększ częstość oddechów do 180 na minutę. W razie potrzeby należy zwiększyć wtórnie stężenie izofluranu do 3,5%, aż mysz przestanie samodzielnie oddychać. Oceń wycieki lub nieodpowiednie napełnienie waporyzatora jako najbardziej prawdopodobne problemy.

2. Przedoperacyjny pomiar dopplerowski

  1. Przygotuj obie tętnice szyjne, które przylegają do tchawicy, delikatnie rozsuwając tkankę łączną kleszczami.
  2. Umieść końcówkę sondy Dopplera 20 MHz ze sterylnym żelem ultradźwiękowym na prawej i lewej tętnicy szyjnej pod kątem mniejszym niż 45°.
  3. Powoli obracaj sondę, aby przesunąć ją na boki i przyśrodkowo, aby znaleźć sygnał Dopplera i przechyl sondę, aby zoptymalizować sygnał.
  4. Użyj oprogramowania Dopplera, aby wyświetlić i zapisać prędkości przepływu w prawej i lewej tętnicy szyjnej wspólnej na komputerze.

3. Torakotomia

  1. Użyj zestawu sterylnych rękawiczek dla każdej myszy z osobna, aby zapobiec zakażeniom miejsca operowanego.
  2. Rozszerz nacięcie skóry w dół do 2. przestrzeni międzyżebrowej za pomocą nożyczek.
  3. Zidentyfikuj wizualnie 2. przestrzeń międzyżebrową, licząc żebra, a następnie tępo przeniknij tę przestrzeń kleszczami wewnątrztorebkowymi.
    UWAGA: 1. żebro znajduje się pod obojczykiem i dlatego nie jest widoczne, ponieważ 2. przestrzeń międzyżebrowa znajduje się między pierwszym widocznym żebrem (tj. 2. żebrem) a 3. żebrem.
  4. Otwórz 2. przestrzeń międzyżebrową za pomocą końcówek kleszczy i włóż zwijacze.
  5. Wyreguluj zwijacze za pomocą gumki recepturki przymocowanej do stołu operacyjnego, aby mieć wyraźny view grasicy.
  6. W przypadku krwawienia należy użyć bawełnianego patyczka i uciskać powierzchowne naczynia krwionośne przez 2 minuty.

4. Pasowanie aorty poprzecznej

  1. Dostosuj powiększenie do 200%, aby zidentyfikować linię środkową i tkankę łączną. Następnie użyj kleszczy pod kątem, aby delikatnie podzielić grasicę. Usuń tkankę tłuszczową, aż łuk aorty będzie wyraźnie widoczny
    2. .
  2. Przygotuj tunel z kątowymi kleszczami do wiązania pod aortą poprzeczną między tętnicą ramienno-głowową a lewą tętnicą szyjną wspólną (patrz Ryc. 1). Przytrzymaj koniec szwu 6,0 za pomocą cienkich kleszczy i przełóż nić pod łukiem aorty.
  3. Weź nić z drugimi kleszczami z drugiej strony łuku.
  4. Odciąć kawałek o długości 3 mm o wadze 27 g, aby użyć igły jako przekładki do podwiązania TAC dla myszy o masie ciała od 19 do 25 g oraz igły 26 G jako przekładki dla myszy >25 g masy ciała.
  5. Ostrożnie umieść przekładkę równolegle do aorty poprzecznej.
  6. Przygotuj luźny podwójny węzeł na przekładce i zapewnij optymalne ułożenie przekładki równolegle do aorty. Następnie zremisuj pierwszy rzut i szybko wykonaj drugi rzut przeciwny. Natychmiast usuń podkładkę dystansową.
  7. Aby wykonać pozorowane myszy w celu kontroli, postępuj zgodnie z tym samym protokołem, pomijając podwiązanie aorty.
  8. Zamknij 2. przestrzeń międzyżebrową szwem polipropylenowym 6,0. Podczas podwiązywania należy zwrócić szczególną uwagę na naczynia podobojczykowe.
  9. Zszyj skórę za pomocą nici polipropylenowej 6.0 w ciągłym wzorze szwów.

5. Potwierdzenie udanego podwiązania aorty poprzecznej

  1. Umieść sondę dopplerowską 20 MHz po obu stronach szyjki pod kątem 45°, jak w sekcji 2.
  2. Udokumentuj prędkości przepływu po obu stronach.
    UWAGA: Udany TAC można zweryfikować za pomocą dopplerowskiej prędkości przepływu, jak pokazano na rysunku Rysunek 2. Stosunek prędkości przepływu 4 - 10 między prawą i lewą tętnicą szyjną zwykle gwarantuje odpowiedni TAC (patrz Rysunek 2).

6. Żniwa serca

  1. Wywołać narkozę zgodnie z krokami 1.2 i 1.3.
  2. Umieść mysz w komorze eutanazyjnej i dostosuj natężenie przepływu dwutlenku węgla tak, aby wyparło 10 - 30% objętości na minutę.
  3. Unieruchomij mysz na stole operacyjnym. Otwórz brzuch nożyczkami i zbierz krew z żyły głównej dolnej za pomocą kaniuli do dalszej analizy.
  4. Przetnij przeponę i kość mostka mocnymi nożyczkami i usuń serce.
  5. Usuń całą tkankę tętniczą i łączną przed ważeniem serca.
  6. Oddzielić prawą komorę i przegrodę od lewej komory i zważyć obie próbki.
  7. Zamrozić obie próbki tkanek w ciekłym azocie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne przeprowadzenie TAC gwarantuje indukcję przeciążenia ciśnieniowego oraz przerostu lewej komory. Ad hoc walidację przeciążenia ciśnieniowego można przeprowadzić, mierząc prędkość przepływu metodą Dopplera, jak pokazano na Rysunku 2. Podczas gdy przedoperacyjna prędkość przepływu krwi jest taka sama w obu tętnicach szyjnych, TAC powoduje zwiększenie prędkości przepływu krwi w prawej tętnicy szyjnej ze względu na podwyższone ciśnienie w lewej komorze i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szybki początek nadciśnienia tętniczego spowodowany TAC różni się od klinicznie istotnego przerostu spowodowanego zwężeniem zastawki aortalnej lub nadciśnieniem. Niemniej jednak wykorzystanie małych modeli zwierzęcych do wywoływania niewydolności serca ma wiele zalet i dlatego jest wybierane przez wielu badaczy11. Ten zamknięty model klatki piersiowej ulepsza już istniejące modele techniki chirurgicznej w celu wywołania poprzecznego zwężenia aorty u myszy4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Stilli Frede i Susanne Schulz za ich pomoc techniczną. Badanie to nie otrzymało dofinansowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cewnik ciśnieniowo-objętościowyMillar Instruments, USASPR-839
Respirator myszyHarvard Apparatus GmbH, NiemcyMinivent - TYP 845
Respiratormyszy Harvard Apparatus GmbH, NiemcyZłącze Y z kaniulą intubacyjną OD 1,2mm 73-2844
ParownikDrä ger Medical AG&CO. KG, Niemcy19.3 Isofluran-Vaporizer (nowsza wersja dostępna pod numerem katalogowym  D-877-2010)Mikroskop
 Leica Microsystems, NiemcyMZ 7.5
Źródło światła Schott AG, NiemcyKL 1500 LCD
6-0 ProleneEthicon, USASzew polipropylenowy BV-1 9,3 mm 3/8cszew do chirurgii
SeraflexSerag Wiessner, NiemcyUSP 5/0;   IC108000 szew do zwężenia
Stoły operacyjne sterowane homeotermicznieHarvard Apparatus GmbH, NiemcyTyp 872/3 HT ze statywem i kontrolerem homeotermicznym Typ 874; 73-4233
Elastyczna sonda doodbytniczaHarvard Apparatus GmbH, Niemcy1,6 mm OD; 55-7021
Przyrząd do wizualizacji sygnału dopplerowskiego IndusInstruments, USAStacja robocza przetwarzania sygnałów dopplerowskich (DSWP) z modułem impulsowego Dopplera 20 MHz
Kleszcze wewnątrztorebkowe ArrugaAltomed, Wielka BrytaniaA5400
Sonda dopplerowskaIndus Instruments, USA20MHz Sonda
Jaffe Retraktor z pokrywąAltomed, Wielka BrytaniaA3513
montowana na rurkach

Bibliografia

  1. Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods Mol Biol Clifton NJ. 573, 115-137 (2009).
  2. Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16 (3), 349-360 (2004).
  3. Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 8277-8281 (1991).
  4. deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. T. Transverse Aortic Constriction in Mice. J Vis Exp JoVE. (38), (2010).
  5. Grossman, W., Jones, D., McLaurin, L. P. Wall stress and patterns of hypertrophy in the human left ventricle. J Clin Invest. 56 (1), 56-64 (1975).
  6. Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffet, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med Biol. 34 (6), 892-901 (2008).
  7. Reddy, A. K., et al. Pulsed Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (10), 1771-1783 (2005).
  8. Shioura, K. M., Geenen, D. L., Goldspink, P. H. Assessment of cardiac function with the pressure-volume conductance system following myocardial infarction in mice. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 293 (5), H2870-H2877 (2007).
  9. Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. JoVE J Vis Exp. (100), e52618(2015).
  10. Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (5), H2119-H2130 (2007).
  11. Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
  12. Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K. W., Chow, B. K. C. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. J Vis Exp JoVE. (121), (2017).
  13. Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. J Vis Exp. (127), (2017).
  14. Kim, S. -C., Boehm, O., Meyer, R., Hoeft, A., Knüfermann, P., Baumgarten, G. A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion. J Vis Exp JoVE. (65), (2012).
  15. Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines. Eur Respir J. 17 (3), 488-494 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przerost serca u myszyma oinwazyjna chirurgiaboczna torakotomiapomiar przep ywu metod Doppleraprzerost lewej komoryodpowied makrofag w sercowychtechnika dystansora szwuprotok opieki pooperacyjnej

Powiązane artykuły