Kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach

Podsumowanie

Przedstawiamy prosty i niezawodny protokół pomiaru zawartości żelaza w tkankach roślinnych za pomocą metody kolorymetrycznej błękitu pruskiego.

Streszczenie

Żelazo, jeden z najważniejszych mikroelementów w organizmach żywych, bierze udział w podstawowych procesach, takich jak oddychanie i fotosynteza. Zawartość żelaza jest raczej niska we wszystkich organizmach i wynosi w roślinach około 0,009% suchej masy. Do tej pory jedną z najdokładniejszych metod pomiaru stężenia żelaza w tkankach roślinnych jest spektroskopia atomowa absorpcji płomienia. Takie podejście jest jednak czasochłonne i kosztowne oraz wymaga specjalnego sprzętu, który nie jest powszechnie spotykany w laboratoriach zakładowych. Dlatego potrzebna jest prostsza, ale dokładna metoda, którą można rutynowo stosować. Metoda kolorymetrycznego błękitu pruskiego jest regularnie stosowana do jakościowego barwienia żelaza w przekrojach histologicznych zwierząt i roślin. W niniejszej pracy dostosowaliśmy metodę błękitu pruskiego do ilościowych pomiarów żelaza w liściach tytoniu. Zweryfikowaliśmy dokładność tej metody przy użyciu zarówno spektroskopii atomowej, jak i barwienia błękitem pruskim w celu zmierzenia zawartości żelaza w tych samych próbkach i znaleźliśmy regresję liniową (R² = 0,988) między tymi dwiema procedurami. Dochodzimy do wniosku, że metoda błękitu pruskiego do ilościowego pomiaru żelaza w tkankach roślinnych jest precyzyjna, prosta i niedroga. Jednak przedstawiona tutaj regresja liniowa może nie być odpowiednia dla innych gatunków roślin ze względu na potencjalne interakcje między próbką a odczynnikiem. W związku z tym konieczne jest wyznaczenie krzywej regresji dla różnych gatunków roślin.

Wprowadzenie

Żelazo (Fe) jest ważnym mikroskładnikiem we wszystkich organizmach żywych. W roślinach stanowi niezbędny mikroskładnik¹ ze względu na udział w procesach podstawowych, takich jak oddychanie, fotosynteza i biosynteza chlorofilu. Wysoka akumulacja wolnych jonów żelaza jest szkodliwa dla komórek roślinnych z powodu reakcji prowadzących do uwalniania wolnych rodników, co powoduje stres oksydacyjny. Aby utrzymać homeostazę żelaza w komórce roślinnej, jony są magazynowane wakuolach i sekwestrowane w ferrytynach — białkowych klatkach bezpośrednio zaangażowanych w homeostazę żelaza² i stanowiących główną strukturę magazynową żelaza we wszystkich organizmach żywych. Jednocześnie anemia z niedoboru żelaza dotyka znaczną część populacji ludzkiej, co skutkuje rosnącą potrzebą biofortyfikacji roślin w Fe. Ze względu na unikalne właściwości ferrytyny roślinnej, wzbogacanie żywności w żelazo z ferrytyny stanowi obiecującą strategię walki z tym problemem niedożywienia³.

Jony żelaza występują głównie w dwóch stopniach utlenienia: żelazistym (dwuwartościowy Fe²⁺ lub żelazo(II)) oraz żelazowym (trójwartościowy Fe³⁺ lub żelazo(III)). W komórkach znajdują się również inne formy żelaza, takie jak klastry żelaza⁴. Fe jest magazynowane wewnątrz komórki w postaci tlenku żelaza i w warunkach fizjologicznych naturalnie tworzy hematyty (Fe₂O₃) oraz ferrihydryty ((Fe³⁺)₂O₃•0,5H₂O)⁵. Wodorotlenki powstające w tych reakcjach, zwłaszcza forma żelazowa, charakteryzują się bardzo niską rozpuszczalnością. W konsekwencji retencja żelaza zależy od pH roztworu i powyżej pH 5 występuje ono głównie w stanie stałym⁶.

Biorąc pod uwagę słabą rozpuszczalność i wysoką reaktywność Fe, jego transport pomiędzy tkankami i organami roślin musi być związany z odpowiednimi cząsteczkami chelatującymi. Ponadto konieczna jest kontrola jego stanów redoks pomiędzy formami żelaza dwuwartościowego i trójwartościowego¹. W liściach około 80% żelaza znajduje się w komórkach fotosyntetyzujących, ze względu na jego kluczową rolę w systemie transportu elektronów, w biosyntezie cytochromów, chlorofilu i innych cząsteczek hemu, a także w tworzeniu klastrów Fe-S⁷. W przypadku nadmiaru żelaza w komórce, nadwyżka jest transportowana do wakuoli, gdzie metal jest magazynowany w cząsteczkach ferrytyny⁸.

Zawartość żelaza w tkankach roślinnych można pomiarzyć za pomocą kilku metod, w tym spektroskopii absorpcyjnej z atomizacją w płomieniu⁹ (FAAS) lub testów kolorymetrycznych¹⁰, przy czym pierwsza z nich jest znacznie bardziej precyzyjna. FAAS to wysoce dokładna technika, która umożliwia określenie składu pierwiastkowego próbki na podstawie emisji elektromagnetycznej poszczególnych pierwiastków. FAAS przekształca jony metali w stany atomowe poprzez ogrzewanie próbki w płomieniu, co prowadzi do wzbudzenia jonów i emisji specyficznej długości fali w momencie powrotu danego jonu do stanu podstawowego. Emisje z różnych jonów są rozdzielane przez monochromator i wykrywane przez czujnik absorpcyjny¹. W ten sposób FAAS służy do bezpośredniego oznaczania stężenia żelaza. Dostępne są jednak inne techniki wizualizacji żelaza w tkankach biologicznych. Spektrometria mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-MS)¹² jest bardzo precyzyjną techniką pomiaru żelaza i innych pierwiastków śladowych, lecz powszechnym problemem jest brak odpowiedniego sprzętu, zarówno dla FAAS, jak i ICP-MS. Z drugiej strony, pomiar żelaza metodą kolorymetrii tiocyjanianowej¹³ charakteryzuje się niską precyzją i nie pozwala na wykrycie niewielkich różnic między próbkami. Barwienie błękitem pruskim^14,15,16,17 jest metodą pośrednią opartą na reakcji ferrocyjan jodku potasu (K₄Fe(CN)₆) z kationami Fe, co prowadzi do powstania intensywnego niebieskiego zabarwienia; metoda ta jest stosowana do jakościowego wykrywania żelaza w przekrojach histologicznych tkanek zwierzęcych i roślinnych.

Żelazo metaliczne (zerowartościowe) występuje rzadko w litosferze. Dominująca niekompleksowa forma jonowa żelaza w środowisku jest w głównej mierze determinowana przez ilość tlenu w otoczeniu, przy czym żelazo dwuwartościowe jest względnie bardziej rozpowszechnione w środowiskach anoksycznych, a żelazo trójwartościowe przeważa w miejscach aerobowych. Ta druga forma dominuje również w środowiskach ekstremalnie kwasowych, choć czynniki wywołujące utlenianie żelaza dwuwartościowego często różnią się w warunkach anoksycznych i kwasowych¹⁸. Gdy żelazo zostaje rozpuszczone w 4% HCl (pH 0) w środowisku aerobowym, główna część rozcieńczonego żelaza występuje w formie trójwartościowej (Fe³⁺)^19,20.

Reakcje między jonami Fe a K₄Fe(CN)₆ przebiegają w następujący sposób:

Fe³⁺: FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl

Fe²⁺: 4 FeCl₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ = Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 KCl

W niniejszym badaniu sprawdzono, czy barwienie błękitem pruskim może być przydatne do pomiaru poziomu żelaza w roztworze.

W pierwszej kolejności zweryfikowano korelację między stężeniem Fe w roztworze wodnym a barwieniem błękitem pruskim. Stężenie Fe (w postaci FeCl₂, FeCl₃ lub mieszaniny obu w stosunku 1:1) w roztworach wodnych mierzono zarówno metodą spektroskopii atomowej, jak i za pomocą absorbancji (OD) po dodaniu błękitu pruskiego. Rysunek 1 przedstawia krzywe regresji liniowej dla pomiarów uzyskanych każdą z metod. Wyciągnięto wniosek, że metoda z użyciem błękitu pruskiego może być stosowana do analizy ilościowej stężenia żelaza w roztworze.

Rysunek 1: Regresje liniowe między stężeniem Fe zmierzonym za pomocą FAAS a absorbancją światła (OD, 715 nm) uzyskaną metodą błękitu pruskiego. Niebieskie kwadraty i linia reprezentują Fe²⁺ roztworu, czerwone kwadraty i linia reprezentują Fe³⁺ roztwór, a czarne kwadraty i linia reprezentują mieszaninę Fe w stosunku 1:1²⁺ oraz Fe³⁺Otrzymano następujące regresje: [Fe²⁺] = 3 + 123 x OD, r = 0,96, R² = 0,989; [Fe³⁺] = 1 + 292 x OD, r = 0,9, R² = 0,97; oraz [Fe^2+/3+] = 11 + 146 x OD, r = 0,983, R² = 0,956. Żelazo (Fe)²⁺ donorem był FeCl3₂ or Fe³⁺ donorem był FeCl3₃. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Aby dostosować kolorymetryczną metodę błękitu pruskiego do ilościowej analizy żelaza w tkankach roślinnych, zawartość żelaza w popiołach z liści tytoniu zmierzono za pomocą płomieniowej spektroskopii absorpcyjnej oraz barwienia błękitem pruskim. Odnotowano dobrą korelację między wynikami uzyskanymi obiema technikami.

Protokół

1. Materiał roślinny i warunki wzrostu

1. Zasiej jedno nasiono tytoniu (odmiana Samsun) do doniczki o wymiarach 5 cm x 5 cm wypełnionej standardowym podłożem doniczkowym. Umieść doniczki na tackach. Uprawiaj rośliny w pomieszczeniu wzrostowym w warunkach długiego dnia (16/8 h światło/ciemność) przy stałej temperaturze 23 °C. Podlewaj wodą z kranu do momentu, aż woda zacznie wypływać z doniczki.
2. Po 50±5 dniach rozpocznij zabiegi z Fe podczas podlewania, stosując stężenia odpowiednie dla danego eksperymentu. Przykładowo, zastosowano zakres stężeń żelaza od 0 do 6 mM, z dodatkiem rozpuszczalnego chelatora Fe (Fe EDDHA). Podlewaj rośliny odpowiednim roztworem co dwa dni (aby uniknąć odwodnienia) przez okres 6-8 dni.

2. Przygotowanie liści do pomiaru zawartości żelaza

Uwagi: Wszystkie wykorzystywane materiały muszą być wolne od żelaza, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia żelazem. Przed użyciem dwukrotnie wyczyść moździerz i tłuczek roztworem 4% HCl, za każdym razem osuszając je papierem filtracyjnym. W przypadku ponownego wykorzystania materiałów, należy je dwukrotnie wyczyścić roztworem 4% HCl i osuszyć papierem filtracyjnym.

1. Oddziel liście od łodygi ręcznie, używając rękawiczek (nie używaj żadnych metalowych narzędzi). Do każdej próbki wykorzystaj około 10 g liści (masa świeża). Oczyść każdy liść wodą dwukrotnie destylowaną (DDW) za pomocą butelki z atomizerem. Ten krok jest istotny, aby uniknąć zanieczyszczenia Fe.
2. Osusz liście na ręczniku papierowym i umieść je w papierowej torbie. Przenieś papierowe torby do susznika w stałej temperaturze 80 °C na 2-3 dni.
3. Po wysuszeniu rozetrzyj liście na proszek w moździerzu i przenieś do sterylnych plastikowych probówek o pojemności 15 mL.

3. Spalanie liści do postaci popiołu

Uwagi: Zastosowanie roztworu HCl o niskim pH (bliskim 0) ma na celu zwiększenie rozpuszczalności żelaza. Watę mineralną stosuje się, aby zapobiec ucieczce gazów z probówki podczas spalania.

1. Zważ nową, szczelną fiolkę scyntylacyjną o pojemności 20 mL bez nakrętki. Zapisz wartość lub ustaw ją na zero za pomocą przycisku tary. Przenieś rozkruszone wysuszone liście (próbkę) do fiolki.
2. Zważ próbkę wraz z pojemnikiem i zapisz wartość. Zamknij fiolkę wełną mineralną.
3. Zważ 3 dodatkowe fiolki bez dodawania próbek i zapisz ich wartości. Fiolki te posłużą jako kontrole do oceny ilości wełny mineralnej, która mogłaby doprowadzić do zwiększenia masy próbki.
4. Umieść fiolki z próbką oraz kontrolne w piecu i rozpocznij spalanie, stosując następujące etapy temperatury: temperatura pokojowa, szybki wzrost do 425 °C, a na koniec 425°C przez 4 godziny. Po tym czasie suche liście zamienią się w popiół.
5. Pozostaw próbki do ostygnięcia do około 10 °C, ale nie poniżej tej temperatury w dwóch kolejnych krokach, aby uniknąć wilgoci, która mogłaby wpłynąć na końcową masę próbki. Używając grubych rękawic, wyjmij próbki z pieca za pomocą pęsety, trzymając fiolkę z zewnątrz.
6. Postaw fiolki na płaskiej powierzchni, usuń wełnę mineralną i zamknij fiolki oryginalnymi nakrętkami.
7. Zważ 3 fiolki kontrolne (patrz pkt 3.3) i oblicz średni przyrost ich masy. Jeśli przyrost masy jest równy lub przekracza 1% masy popiołu (patrz krok 4.2), przyjmij tę wartość jako szacunek błędu pomiarowego.

4. Przygotowanie popiołów do oznaczenia żelaza

Uwagi: Końcowe stężenie żelaza w próbce początkowej oblicza się jako masę popiołów podzieloną przez dodaną objętość HCl.

1. Przygotować 1 M roztwór HCl (4% HCl), dodając 12,5 mL roztworu stokowego 37% HCl do 87,5 mL DDW (w kolbie plastikowej lub szklanej).
2. Zważyć plastikową probówkę o pojemności 15 mL i zapisać wartość lub ustawić wartość na zero za pomocą przycisku tary. Przenieść popiół do probówki, zważyć i zapisać wartość. Jest to masa popiołu.
3. Dodać 5 mL 1 M HCl do popiołu. Przefiltrować popiół przez filtr 2 µm i dodać kolejne 5 mL 1 M HCl przez ten sam filtr.
4. Objętość końcowa powinna wynosić 10 mL. Należy pamiętać, że część roztworu zostanie utracona w filtrze.
   UWAGA: Próbki są teraz gotowe do pomiaru Fe za pomocą FAAS lub metodą błękitu pruskiego.
5. Sporządzić krzywą kalibracyjną z koncentracją Fe zmierzoną spektrometrią atomową oraz metodą błękitu pruskiego (patrz Rysunek 4) dla każdego gatunku rośliny. Następnie koncentrację Fe można mierzyć wyłącznie metodą błękitu pruskiego.

5. Pomiar stężenia Fe za pomocą FAAS

1. Pobrać 4 mL z każdej próbki do pomiaru metodą FAAS.
2. Wyniki otrzymane z pomiaru FAAS podzielić przez wagę popiołu. Otrzymaną wartość podzielić przez 0,01 (ponieważ popioły zostały rozpuszczone w 10 mL). Wynikowa wartość stanowi stężenie żelaza na gram popiołu (ppm).

6. Przygotowanie roztworu do barwienia błękitem pruskim

1. Przygotować 4% roztwór błękitu pruskiego, dodając 4 g K₄Fe(CN)₆ do 10 mL DDW i mieszając w wibromikserze (w zależności od potrzeb można zastosować inne objętości i/lub stężenia). Należy zauważyć, że w niniejszym badaniu zastosowano mniej skoncentrowany roztwór błękitu pruskiego niż zgłoszono we wcześniejszych publikacjach (20%)¹⁴.
2. Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu użycia. W takich warunkach roztwór pozostaje stabilny przez 6 miesięcy.

7. Tworzenie krzywej kalibracyjnej dla metody błękitu pruskiego z wykorzystaniem wyników FAAS

UWAGA: Oblicz stężenie żelaza w popiołach, korzystając z następującego wzoru
             Równanie 1
C: stężenie, V: objętość próbki, W: masa popiołu (g).

1. Wymieszaj 0,50 mL roztworu błękitu pruskiego i 0,50 mL 1 M HCl. Posłuży to jako roztwór ślepy.
2. Wymieszaj poprzez pipetowanie 0,5 mL próbki (popioły w 4% HCl, zgodnie z opisem w sekcji 3) oraz 0,5 mL roztworu błękitu pruskiego (krok 6.1). Odczekaj co najmniej 1 minutę, ale nie więcej niż 5 minut. Po upływie 5 minut w próbkach nastąpi sedymentacja.
3. Przenieś mieszaninę do kuwety i zmierz OD przy 715 nm za pomocą spektrofotometru. Zapisz otrzymaną wartość.
4. Podziel wartość OD (krok 7.3) przez masę popiołu (krok 3.2) próbki. Wynik reprezentuje OD na gram popiołu.
5. Wyznacz regresję liniową między stężeniami żelaza otrzymanymi z pomiarów FAAS (oś Y) a wartościami OD (oś X). Wykorzystaj wyniki uzyskane w krokach 5.2 i 7.4. Oblicz wzór regresji Y = a + bX, gdzie Y oznacza stężenie żelaza, a oznacza punkt przecięcia absorbancji, b oznacza nachylenie krzywej absorbancji, a X oznacza OD.

8. Wykorzystanie metody błękitu pruskiego do oznaczania poziomu żelaza w innych próbkach z tego samego gatunku rośliny

Uwagi: Ponieważ dla tego rodzaju roślin opracowano już krzywą kalibracyjną, stężenie żelaza w nowych próbkach pobranych z tego samego rodzaju roślin można obliczyć bezpośrednio, korzystając ze wzoru regresji liniowej.

1. Wykonaj czynności opisane w sekcjach 3 i 4, a następnie kroki od 7.1 do 7.4.
2. Oblicz stężenie żelaza w roztworze, korzystając ze wzoru uzyskanego z regresji liniowej (krok 7.5).

Wyniki

Przy prawidłowym przeprowadzeniu tego protokołu powinno uzyskać się doskonałą korelację między wynikami otrzymanymi metodą błękitu pruskiego a metodą spektroskopii atomowej. W związku z tym metodę błękitu pruskiego można z łatwością zastosować do dokładnego pomiaru stężenia żelaza w próbkach roślinnych, co wykazano w poniższym doświadczeniu.

Rośliny tytoniu uprawiano zgodnie z opisem w protokole i podlewano wodą o różnych stężen...

Dyskusja

Pomiar żelaza w tkankach roślinnych jest bardzo ważny dla oceny skutków nawadniania lub innych warunków środowiskowych. W tym miejscu opisaliśmy łatwą i dokładną metodę kolorymetryczną pomiaru zawartości żelaza w liściach tytoniu, którą można łatwo dostosować do innych gatunków roślin i tkanek.

Optymalizując warunki dla metody kolorymetrycznej, użyliśmy podłoża o niskim pH (pH < 1,0), aby umożliwić rozpuszczalność żelaza. Proces spalania przeprowadzono w celu uwolnienia wszystkich form żelaza ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Heksacyjanożelazian(II)	potasu Fisher Chemical	14459-95-1	Odczynnik do
filtra strzykawkowego Pussian Blue Millex, odpowietrznik fiolki 0,22 i mu; m	Millec	SLGP033RS	Filtr służący do filtrowania popiołu + 4% HCl Roztwór
Fiolki scyntylacyjne	Fisherbrand	03-337-4	Służy do utrzymywania suchego sproszkowanego materiału roślinnego podczas procedury spalania.
Jednorazowa strzykawka 10 ml	Medi-Plus	1931	Strzykawka używana podczas filtracji
Kwas solny	Sigma-Aldrich	231-595-7	Stosowany w 4% roztworze HCl do rozcieńczania popiołów i czyszczenia materiałów
Tytoń, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Uzyskany od prof. Simona Baraka i rutynowo stosowany w laboratorium	ZaccaiBarak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Regulacja transkrypcji i potranskrypcji genu oksydazy glikolanowej w sadzonkach tytoniu. Biologia molekularna roślin. 1 marca 2001; 45(4):399-407.	Odmiana tytoniu użyta w tym protokole
Wełna szklana (wełna mineralna)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Stosowana w procedurze spalania próbek w piecu.