Method Article

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

DOI:

10.3791/57421

⸱

June 14th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Immunobiology of Dendritic Cells, Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163, Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem tego protokołu jest opisanie rozwoju i walidacji testu ELISA, cyfrowego testu immunosorbentowego (ELISA) z interferonem (IFN)-α pojedynczej cząsteczki. System ten umożliwia ilościowe oznaczanie ludzkiego białka IFN-α z niespotykaną dotąd czułością i bez reaktywności krzyżowej dla innych gatunków IFN.

Pierwszym kluczowym krokiem protokołu jest wybór pary przeciwciał, następnie koniugacja przeciwciała wychwytującego z kulkami paramagnetycznymi i biotynylacja przeciwciała wykrywającego. Po tym etapie można modyfikować różne parametry, takie jak konfiguracja testu, stężenie przeciwciał w detektorze i skład buforu, aż do osiągnięcia optymalnej czułości. Na koniec ocenia się swoistość i odtwarzalność metody, aby zapewnić pewność wyników. Tutaj opracowaliśmy test macierzy jednocząsteczkowej IFN-α z granicą wykrywalności 0,69 fg / ml przy użyciu autoprzeciwciał o wysokim powinowactwie wyizolowanych od pacjentów z mutacjami biallelicznymi w białku regulatora autoimmunologicznego (AIRE) powodującym autoimmunologiczny zespół poliendokrynopatii typu 1 / autoimmunologiczną poliendokrynopatię-kandydozę-dystrofię ektodermalną (APS1 / APECED). Co ważne, przeciwciała te umożliwiły wykrycie wszystkich 13 podtypów IFN-α.

Ta nowa metodologia pozwala po raz pierwszy na wykrywanie i kwantyfikację białka IFN-α w ludzkich próbkach biologicznych przy stężeniach attomolowych. Takie narzędzie będzie bardzo przydatne w monitorowaniu poziomu tej cytokiny w ludzkim zdrowiu i stanach chorobowych, w szczególności infekcji, autoimmunizacji i autozapaleniu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IFN typu I to rodzina cytokin, które odgrywają kluczową rolę w organizowaniu przeciwwirusowych odpowiedzi immunologicznych. Po raz pierwszy zostały odkryte przez Isaacsa i Lindenmanna 60 lat temu1,2 i obecnie wiadomo, że ta niejednorodna rodzina polipeptydów obejmuje 14 różnych podklas (13 podtypów IFN-α i 1 IFN-β). IFN typu I są niezbędne do usuwania infekcji wirusowych, ale są również zaangażowane w patologię różnych stanów chorobowych człowieka, w tym zaburzeń autoimmunologicznych tocznia rumieniowatego układowego (SLE), młodzieńczego zapalenia skórno-mięśniowego (JDM) i interferonopatii typu I, w których konstytutywna sygnalizacja indukowana przez IFN typu I powoduje patologię3,4,5,6, 7.

Badanie poziomów białka IFN typu I w próbkach biologicznych było wyzwaniem od czasu jego początkowej identyfikacji jako "substancji zakłócającej"1,2. Obecnie test immunosorbentowy sprzężony z enzymem kanapkowym (ELISA) jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania białka IFN-α. Pomimo tego, że są specyficzne, proste i szybkie, testy ELISA IFN typu I mają poważne ograniczenia, takie jak ograniczona czułość. Ponadto pomiar wszystkich podtypów IFN-α wymaga użycia wielu testów, z których każdy ma własną zdolność wykrywania i czułość. Chociaż istnieją komercyjne testy ELISA, które wykrywają różne podtypy IFN-α, ich czułość jest ograniczona (odpowiednio 1,95 pg/mL, 12,5 pg/ml i 12,5 pg/ml), co często jest niewystarczające do wykrycia białka IFN-α w próbkach biologicznych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano kilka biologicznych testów zastępczych w celu ilościowego określenia IFN typu I poprzez pomiar indukowanej ekspresji genów lub aktywności funkcjonalnej8,9,10,11,12,13,14. Niemniej jednak testy te nie zapewniają bezpośredniego pomiaru białka IFN-α

.

W tym badaniu, technologia cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł została wykorzystana do opracowania testu do wykrywania pojedynczych cząsteczek białka IFN-α. Cyfrowy test ELISA wykorzystuje tę samą podstawową chemię, co konwencjonalna funkcja ELISA, jednak reakcja zachodzi w tablicach składających się z 50 000 indywidualnych studzienek o rozmiarach 46 femtolitrów15,16. Pojedyncze cząsteczki białka są wychwytywane przez kulki paramagnetyczne pokryte przeciwciałem i znakowane biotynylowanym przeciwciałem detekcyjnym, a następnie wiązane jest koniugatem enzymu, streptawidyną-β-galaktozydazą (SBG). Następnie kulki są zawieszane za pomocą fluorogennego substratu enzymatycznego, rezorufin-β-D-galaktopyranozydu (RGP), w układach jednocząsteczkowych. Zmniejszając reakcję objętościową 2 miliardy razy17, osiąga się wysokie lokalne stężenie sygnału fluorescencyjnego i liczba pojedynczych cząsteczek staje się możliwa, ponieważ każda cząsteczka generuje sygnał, który można teraz wiarygodnie zmierzyć18. Zasadniczo macierze pojedynczych cząsteczek są zdolne do zliczania pojedynczych immunokompleksów i określania średniej liczby enzymów na kulkę (AEB). Liczenie mikrostudzienek, w których wykryty jest sygnał, pozwala na kwantyfikację/digitalizację cząsteczek białka, ponieważ istnieje bezpośrednia korelacja między stężeniem białka a stosunkiem między kulkami immunokompleksowymi a całkowitą liczbą kulek obecnych w komorach o rozmiarach femtolitrów.

Yeung et al. przeprowadzili obszerne badanie oceniające na różnych platformach, używając dziewięciu różnych technologii i czterech testów immunologicznych cytokin w celu porównania precyzji testu, czułości i korelacji danych na różnych platformach19. Jednym z kluczowych ustaleń badania było to, że macierze pojedynczych cząsteczek i test immunologiczny zliczający pojedyncze cząsteczki wykazały najwyższą czułość wykrywania cytokin w ludzkiej surowicy w zakresie stężeń sub-pg/mL. Cyfrowe testy cytokin ELISA z pojedynczą matrycą cząsteczek zostały wykorzystane do zbadania roli TNF-α i IL-6 w chorobie Leśniowskiego-Crohna20, IFN-α u pacjentów z interferonopatią i autoimmunologią 7 oraz różne zmodyfikowane potranslacyjnie formy chemokiny motywu C-X-C 10 (CXCL10) u przewlekłego zapalenia wątroby i zdrowych dawców otrzymujących sitagliptynę21,22. Inne zastosowania obejmują pomiar rodopsyny u pacjentów z retinopatią cukrzycową23; badanie patologii mózgu poprzez pomiary surowicy/osocza światła neurofilamentu24 i peptydu amyloid-β 1-4225, odpowiednio w kontekście stwardnienia rozsianego i choroby Alzheimera. Testy z matrycą jednocząsteczkową mogą być również wykorzystywane do lepszego wykrywania patogenów, takich jak charakterystyka rezerwuaru wirusa HIV26, a także do wykrywania DNA27 i mikro RNAs28. Główną zaletą technologii macierzy pojedynczych cząsteczek jest wysoka wszechstronność, ponieważ test przeciwko dowolnemu analitowi będącemu przedmiotem zainteresowania można opracować, jeśli dostępna jest określona para przeciwciał. Ponadto na rynku dostępne są zestawy testowe homebrew, co pozwala na opracowywanie nowych testów, których protokół jest szczegółowo opisany w zmodyfikowanej formie poniżej.

Tutaj przedstawiono szczegółowy opis etapów rozwoju i walidacji testu z pojedynczą matrycą molekuł, co skutkuje zwiększoną czułością wykrywania białek IFN-α. Przeciwciała do testów z matrycą jednocząsteczkową powinny być wysoce specyficzne, unikając reaktywności krzyżowej z pokrewnymi białkami (w razie potrzeby z uwzględnieniem swoistości gatunkowej). Idealnie powinny być wybrane przeciwciała oK D mniejszym niż 10-9 M; Wysokie powinowactwo zapewnia silne wiązanie, przy produkcji wyższego sygnału. Kinetyka wiązania przeciwciało-antygen jest również ważna, a szybkiewłączanie i powolnewyłączanie K będzie sprzyjać składaniu kompleksu antygen-przeciwciało. Rozpoczęcie od pary przeciwciał, która ma dobre wyniki w klasycznym teście ELISA, z granicą wykrywalności (LOD) 1 - 100 pg/mL, zwiększa szanse na uzyskanie wysoce czułego testu macierzy pojedynczej cząsteczki. Chang i jego koledzy przeprowadzili szczegółowe badania kinetyczne interakcji biomolekularnych zachodzących na każdym etapie, proponując zestaw równań do przewidywania czułości analitycznej18. Wykazali, że cyfrowy test ELISA z pojedynczą matrycą molekularną wydaje się być skuteczny w szerokim zakresie powinowactwa przeciwciał (KD~10−11 - 10−9 M), a także, że generowanie sygnału jest bardziej zależne od szybkości takich przeciwciał.

Aby wykorzystać przeciwciała o wysokim powinowactwie, wykorzystaliśmy przeciwciała wyizolowane od pacjentów z autoimmunologicznym zespołem poliendokrynopatii typu 1/autoimmunologicznej poliendokrynopatii-kandydozy-dystrofii ektodermalnej (APS1/APECED)29. Z powodów, które nie są jeszcze zrozumiałe, zdecydowana większość osób z niedoborem AIRE rozwija podstawowy zestaw przeciwciał o wysokiej awidności przeciwko wszystkim podtypom IFN-α29, a my wybraliśmy dwa klony przeciwciał anty-IFN-α o komplementarnym powinowactwie wiązania dla różnych podtypów IFN-α, jak oszacowano przez IC50 Wartości. Połączenie tych unikalnych przeciwciał o wysokim powinowactwie z technologią macierzy jednocząsteczkowych umożliwiło bezpośrednie oznaczanie ilościowe IFN-α w stężeniach attomolowych (fg/ml). Takie ultraczułe wykrywanie białka IFN-α przyczyni się do lepszego zrozumienia natury, regulacji i biologicznego wpływu odpowiedzi indukowanej przez IFN w różnych warunkach chorobowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wybór przeciwciał

  1. Przed rozpoczęciem protokołu należy zapoznać się ze wszystkimi kluczowymi krokami (Tabela 1) i wybrać optymalne przeciwciała.
    UWAGA: Do tego protokołu wybrano przeciwciała anty-IFN-α o wysokim powinowactwie - IC50 opisano w tabeli 2. Preferencyjnie wybierz parę, która dobrze współpracuje z konwencjonalnym testem ELISA.

2. Koniugacja przeciwciała wychwytującego z kulkami paramagnetycznymi i testowanie różnych stężeń

UWAGA: Zawsze trzymaj na lodzie bufor koniugacyjny do koralików (BCB) i bufor do płukania koralików (BWB) podczas procesu koniugacji przeciwciał.

  1. Wychwytywanie wymiany bufora przeciwciał
    1. Weź początkowe ilości przeciwciała anty-IFN-α A, aby przetestować 3 różne proporcje koniugacji kulek (0,038 mg/ml, 0,075 mg/ml i 0,3 mg/ml).
      UWAGA: Niskie stężenia powłoki przeciwciał mogą być korzystne, jeśli test przedstawia wysoki sygnał tła. Początkowa ilość przeciwciał powinna odpowiadać szacunkowej utracie 30% podczas procesu wymiany buforu. Zgodnie z instrukcjami producenta i w celu zmniejszenia początkowego tła badano stężenia 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml i 0,3 mg/ml, choć często nie uzyskiwano tych dokładnych wartości ze względu na wspomnianą wcześniej zmienną stratę w procesie wymiany buforu.
    2. Dodać wymaganą objętość przeciwciała do kolumny filtracyjnej razem z BCB, do 500 μl.
    3. Odwirować kolumny o stężeniu >10 000 x g przez 5 minut i odrzucić przepływ.
    4. Przemyć kolumnę dwukrotnie, dodając całkowitą objętość 450 μl BCB, a następnie odwirować przy >10 000 x g przez 5 minut i odlać przepływ.
    5. Umieścić kolumnę filtracyjną zawierającą przeciwciało w czystej probówce do mikrowirówki do góry nogami - otwarta część kolumny skierowana jest do wnętrza nowej probówki - i odwirować przy 800 x g przez 1 min.
      UWAGA: Ten krok pozwoli na pobranie oczyszczonego przeciwciała. Na tym etapie nie jest wymagane dodawanie buforu.
    6. Przemyć membrany 50 μl BCB i odwirować przy 800 x g przez 1 minutę, jak w ppkt 2.1.5.
    7. Zmierzyć stężenie przeciwciał za pomocą spektrofotometru o małej objętości.
    8. Dodaj BCB, aby osiągnąć pożądane stężenie przeciwciał i zanotuj końcową objętość.
      UWAGA: Objętość 200 μL zostanie użyta do opisania pozostałej części protokołu, przy czym objętość ta jest określana jako 2 objętości (2 V). Wszystkie poniższe objętości odczynników zostaną odpowiednio dostosowane.
    9. Wiruj i trzymaj na lodzie.
  2. Przygotowanie koralików paramagnetycznych
    1. Przenieś 2,8 x 108 kulek (100 μL = 1 V) do probówki do mikrofuge.
      UWAGA: Objętość koralików jest zależna od końcowej objętości uzyskanej w 2.1.8.
    2. Wiruj pulsacyjnie i włóż do separatora magnetycznego na 1 minutę, wyrzuć rozcieńczalnik i wyjmij z magnesu.
    3. Dodaj 2V BWB i wiruj przez 5 s.
    4. Powtórzyć 2.2.2 i 2.2.3 dwa razy z BWB i jeszcze dwa razy z BCB.
    5. Na 1 V kulek dodaj 190 μL BCB, wiruj 5 s, wiruj pulsacyjnie i przechowuj umyte kulki na lodzie.
  3. Aktywacja koralików
    1. Dodać 1 ml zimnego BCB do fiolki 10 mg chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i mieszać, aż roztwór będzie jednorodny.
    2. W przypadku 1 V kulek dodaj 10 μl rozcieńczonego na zimno EDC do umytych kulek, zmieszaj i trzymaj w wytrząsarce z prędkością 1,000 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przygotowanie EDC i dodanie do kulek powinno być wykonane tak szybko, jak to możliwe ze względu na niestabilność EDC w roztworach wodnych. Ponadto, ponieważ EDC jest wysoce reaktywny, ważne jest, aby przed dodaniem EDC uzyskać jednorodną zawiesinę kulek, aby zapobiec aktywacji niejednorodnych kulek. Po dodaniu EDC kulki muszą być przechowywane w zawiesinie.
  4. Koniugacja koralików przeciwciała
    1. Wir i puls obracają aktywowane koraliki. Teraz umieść koraliki w separatorze magnetycznym na 1 minutę, wyrzuć supernatant BCB i wyjmij rurkę z magnesu.
    2. Umyj koraliki 2V BCB. Wiruj, wiruj impulsowo i umieść w separatorze magnetycznym na 1 min. Następnie wyrzuć bufor BCB i usuń koraliki z magnesu.
    3. Szybko dodaj zimne, wymieniane buforem 200 μl (2 V) przeciwciała do aktywowanych kulek.
    4. Wirować i przechowywać przez 2 godziny w shakerze w temperaturze pokojowej.
  5. Blokowanie ściegów i końcowe czyszczenie
    1. Pulsacyjnie odwirować zawiesinę kulek pokrytych przeciwciałem, umieścić w separatorze magnetycznym na 1 minutę, przenieść supernatant do nowej probówki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru o małej objętości.
      UWAGA: Ten krok dostarczy informacji o tym, czy kulki są nasycone - wszelkie wartości powyżej zera będą wskazywać na nasycenie kulek - ponieważ wykrywanie rozpuszczalnego przeciwciała, które nie jest w stanie związać się z kulkami, będzie mierzalne.
    2. Usuń sprzężone koraliki z magnesu, dodaj 2 V BWB, wiruj przez 5 s, wiruj impulsowo i włóż do separatora magnetycznego na 1 minutę.
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru o małej objętości.
      UWAGA: Ten krok dostarczy informacji o tym, czy przeciwciała są stabilnie przymocowane do kulek. Wykrywalne stężenie przeciwciał w tym supernatancie będzie wskazywać na oderwanie przeciwciała od kulek, co zdarza się regularnie. Ten test często działa nawet wtedy, gdy bardzo małe ilości wychwytywanego przeciwciała pozostają przyczepione do kulek.
    4. Usuń sprzężone koraliki z magnesu, dodaj 2 V BWB, wiruj przez 5 s, wiruj impulsowo i włóż do separatora magnetycznego na 1 minutę.
    5. Usuń sprzężone kulki z magnesu, dodaj 2 V buforu blokującego koraliki, wiruj przez 5 s i inkubuj w wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć pokryte przeciwciałem i zablokowane kulki 3x 2 V, raz BWS i 2 razy buforem rozcieńczalnika do kulek (wyrzucić wszystkie supernatanty).
    7. Przechowuj powlekane i zablokowane kulki w temperaturze 4°C do czasu użycia z 2 V buforu rozcieńczającego kulki.
      UWAGA: Tuż przed użyciem kulki należy jednokrotnie umyć detektorem/rozcieńczalnikiem do próbek o objętości 250 x objętość kulek/20, za pomocą separatora magnetycznego.

3. Wykrywanie Biotynylacji przeciwciał

  1. Wymiana bufora przeciwciał detekcji
    1. Weź 260 μg dwóch klonów anty-IFN-α Ab.
      UWAGA: Uwzględnia to 30% stratę podczas wymiany buforu i umożliwia testowanie dwóch różnych proporcji biotyny do przeciwciał.
    2. Postępować jak w 2.1, używając buforu reakcyjnego biotynylacji (BRB) zamiast BCB.
    3. Zmierzyć objętość i stężenie przeciwciał i dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/ml.
      UWAGA: Jest to sugerowane stężenie początkowe, ale można je zoptymalizować, jeśli test nie osiągnie wymaganej czułości.
  2. Wykrywanie Biotynylacja przeciwciał
    1. Doprowadź N-hydroksysukcynimid-polietylen-glikol4-biotyna (NHS-PEG4-Biotyna) do temperatury pokojowej i ponownie zawieś z łącznie 400 μl wody destylowanej, aby uzyskać stężenie 3,4 mM.
    2. Zdecyduj o stosunku biotyny do przeciwciała, aby odpowiednio przetestować i wymieszać przeciwciało wykrywające i rozcieńczoną biotynę (stosunek 60:1 równa się 100 μl przeciwciała wykrywającego i 4,5 μl biotyny).
      UWAGA: Aby rozpocząć, przetestuj proporcje 30:1 i 60:1.
    3. Zwirować mieszaninę przeciwciała i biotyny, wirować pulsacyjnie i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Nie ma potrzeby potrząsania.
  3. Biotynylowane oczyszczanie przeciwciał detekcyjnych
    1. Przenieść biotynylowane przeciwciało do nowego filtra i postępować jak w 2,1, wykonując 3 etapy przemywania z BRB (400, 450 i 450 μl) i końcową kolekcję.
    2. Zmierzyć objętość i stężenie oczyszczonego, biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

4. Optymalizacja testu

UWAGA: Użycie oprogramowania do analizowania tablic pojedynczych cząsteczek w konfiguracji Homebrew30.
Analizator matryc pojedynczych cząsteczek jest sterowany przez oprogramowanie, które umożliwia przeprowadzanie standaryzacji testów, wykonywanie kwantyfikacji próbek, modyfikację parametrów zewnętrznych (stężenia, detektor, SBG, stężenia RGP; rozcieńczenia próbki...) i parametrów wewnętrznych (liczba kroków, czas inkubacji...) w celu osiągnięcia optymalnych warunków testu, a także może być używany do obliczania wyników (tło, LOD, ilości). Aby uzyskać informacje na temat konfiguracji analizatora matryc jednocząsteczkowych i obliczania objętości odczynników wymaganych dla każdej rundy optymalizacji, należy zapoznać się z instrukcjami producenta. Wykonaj pierwsze rundy optymalizacji przy użyciu konfiguracji 2-etapowej.

  1. Kombinacje testowe kulek sprzężonych z przeciwciałem wychwytującym i biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego w obu konfiguracjach.
    1. Kombinacje testowe trzech różnych stężeń przeciwciał wychwytujących anty-IFN-α A z dwoma różnymi współczynnikami biotynylacji anty-IFN-α B jako przeciwciała wykrywające i wychwytujące i odwrotnie (Rysunek 1) poprzez wybór odpowiednich warunków w oprogramowaniu analizatora.
    2. Wybierz najbardziej wrażliwą kombinację, czyli warunki, które oferują najniższy LOD, i użyj jej do dalszych kroków
      UWAGA: Rysunek 1 pokazuje, jak stężenie kulek przeciwciała anty-IFN-α A na poziomie 0,3 mg/ml i stosunek biotyny do przeciwciała 30:1 z przeciwciałem anty-IFN-α B skutkowało najwyższą czułością, o czym świadczy LOD 11,6 fg/ml. (Patrz Tabela Uzupełniająca 1). Ta kombinacja będzie używana we wszystkich przyszłych krokach. Zwróć uwagę, że duża czułość osiągnięta w tym konkretnym teście przed jakimikolwiek rundami optymalizacji.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Wybór orientacji przeciwciała, wychwytywanie stężenia przeciwciał na kulkach i współczynnik biotynylacji. Przetestowano dwie możliwe różne konfiguracje, używając anty-IFN-α A jako przeciwciała wychwytującego i anty-IFN-α B jako przeciwciała wykrywającego (A) i odwrotnie (B). Jako antygen zastosowano IFNα-2c. Dla obu konfiguracji przetestowano również różne stężenia przeciwciał wychwytujących, a także stosunek biotyny do przeciwciała (B:A). Przerywana linia pokazuje LOD dla najlepszego stanu; anty-IFN-α A 0,3 mg/ml jako wychwyt i stosunek przeciwciał anty-IFN-α B biotyna do detektora wynosi 30 (LOD = 11,6 mg/ml odpowiadający wartości AEB 0,017265). Zastosowano konfigurację 2-etapową. Biotyna:przeciwciało (B:A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Porównaj konfigurację 2 i 3-etapową.
    UWAGA: W konfiguracji 3-etapowej istnieją trzy różne etapy inkubacji, jeden z przeciwciałem wychwytującym, jeden z przeciwciałem wykrywającym i ostatni trzeci do znakowania enzymu SBG. Jednak w konfiguracji 2-etapowej przeciwciała wychwytujące i wykrywające są inkubowane jednocześnie z analitem będącym przedmiotem zainteresowania.
    1. Uruchom analizator macierzy jednocząsteczkowej z stężeniem i stosunkami przeciwciał wychwytywania i detektora z 4.1.2, wybierając konfiguracje 2- i 3-etapowe wstępnie skonfigurowane w analizatorze, postępując zgodnie z instrukcjami producenta30.
    2. Wybierz konfigurację, która pozwala na najwyższą czułość i zachowaj ją na przyszłe kroki
      UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 2 i Tabela uzupełniająca 2, konfiguracja dwuetapowa dawała nieco wyższą czułość i stosunek sygnału do tła dla każdego badanego stężenia. W związku z tym konfiguracja 2-etapowa została zachowana na przyszłe kroki.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Porównanie konfiguracji w dwóch i 3 krokach. Konfiguracje 2- i 3-etapowe oceniano przy użyciu 0,3 mg/ml przeciwciała anty-IFN-α A jako wychwytu i przeciwciała anty-IFN-α B jako przeciwciała wykrywającego w stosunku 30 biotyna do przeciwciała. Jako antygen zastosowano IFNα-2c. W 3-etapowym ustawieniu warunków istnieją trzy różne etapy inkubacji, jeden z przeciwciałem wychwytującym, jeden z przeciwciałem wykrywającym i ostatni trzeci do znakowania enzymu SBG. Jednak w konfiguracji 2-etapowej przeciwciała wychwytujące i wykrywające są inkubowane jednocześnie z analitem będącym przedmiotem zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Detektor Optymalizacja stężenia przeciwciał i SBG
    1. Przetestuj trzy różne stężenia przeciwciała detektora (0,1, 0,3 i 0,6 μg/ml) wraz z trzema różnymi stężeniami SBG (50, 150 i 250 pM), jak opisano powyżej30.
    2. Wybierz stężenia, które dają najwyższą czułość i zachowaj je na przyszłe kroki.
      UWAGA: Rysunek 3 pokazuje, że detektor 0,3 μg/ml i SBG 150 pM były warunkami, które wykazały optymalny poziom szczegółowości. Warunki te dały również niski poziom tła i średnią amplitudę, zachowanie, które daje dobre wartości odchylenia standardowego (SD) (Tabela uzupełniająca 3). Typowe stężenia wahają się w zakresie 0,1 - 1 μg/ml dla przeciwciała wykrywającego i 50 - 200 pM dla SBG, chociaż mogą być wymagane wyższe stężenia (np. do 300 pM) tego ostatniego. Ważne jest, aby unikać warunków, które będą renderować tła wyższe niż 0,02 AEB. Zwiększenie stężenia przeciwciała monoklonalnego (mAb) lub SBG w detektorze poprawi zarówno odpowiedź sygnału, jak i tło. Jeśli jednak przyrost sygnału pokona zmianę tła, LOD ulegnie poprawie. Może dojść do sytuacji, w której zmniejszenie tła pozwala na lepsze rozróżnienie między niskimi kalibratorami.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Optymalizacja stężenia detektora i SBG. Oceniono trzy różne stężenia biotynylowanego przeciwciała detektorowego (0,1, 0,3 i 0,6 μg/ml) wraz z trzema różnymi stężeniami SBG (50, 150 i 250 pM). Przerywana linia pokazuje LOD dla najlepszego stanu; przeciwciało detektora o stężeniu 0,3 mg/ml i SBG 150pM (LOD = 0,09 mg/ml odpowiadające wartości AEB 0,017184). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Dodatkowe kroki optymalizacji
    1. Jeśli wymagana czułość nie została osiągnięta, przetestuj różne czasy inkubacji dla różnych etapów, korzystając z wstępnie skonfigurowanych opcji w oprogramowaniu analizatora.
    2. Jeśli test nie jest wystarczająco czuły, zoptymalizuj liczbę kulek w teście, korzystając ze wstępnie skonfigurowanych opcji w oprogramowaniu analizatora.
      UWAGA: Po rozpoczęciu badania próbek biologicznych, objętość próbki jest dodatkowym parametrem podatnym na optymalizację. Upewnij się, że z próbkami obchodzi się zgodnie z procedurami bezpieczeństwa i higieny pracy.

5. Swoistość i odtwarzalność testu

  1. Przetestuj swoistość testu IFN-α, testując test z różnymi podtypami IFN-α i innymi powiązanymi białkami (Rysunek 4a i 4b).

figure-protocol-4
Rysunek 4: Swoistość i czułość zoptymalizowanego testu macierzy pojedynczej cząsteczki IFNα. (A) Badano białka rekombinowane IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω i IFN-γ wraz z (B) 16 podtypami IFN-α, w tym trzema typami IFN-α2 (IFN-α2a, IFN-α2b i IFN-α2c). Na podstawie Rodero i wsp. 2017. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Oceń odtwarzalność zoptymalizowanego testu, wykonując trzy niezależne eksperymenty powtórzeniowe i oceniając zmienność między testami (Rysunek 5).
  2. Obliczyć LOD testu
    UWAGA: LOD obliczono na podstawie średniej z trzech ślepych prób + 3 odchyleń standardowych (SD), uzyskując w ten sposób wartość 0,23 fg/ml. Ponieważ standardowy współczynnik rozcieńczenia próbki wynosi 1:3, włączenie współczynnika rozcieńczenia daje LOD 0,69 fg/ml.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Odtwarzalność zoptymalizowanego testu pan-IFN-α z matrycą jednocząsteczkową. Wykonano trzy niezależne serie przy użyciu dwóch różnych partii koralików. W przypadku drugiej partii przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty. Każdy pomiar został uzyskany w duplikatach. Linia przerywana reprezentuje granicę oznaczalności, zdefiniowaną przez średnią średnią ślepą próbę enzymu na kulkę + SD ze wszystkich przebiegów. Jako odniesienie wykorzystano IFN-α17, biorąc pod uwagę, że pochodna krzywa standardowa jest reprezentatywna dla wszystkich innych podtypów IFN-α, jak pokazano na rysunku Rysunek 4b. Wykres pokazuje wartość średnią i SD (słupki błędów). Linie przerywane pokazują poziom szczegółowości dla różnych przebiegów; Przebieg 1: 0,073 fg/ml AEB = 0,006238, Przebieg 2: 0,113 fg/ml AEB = 0,007119, Przebieg 3: 0,043 fg/ml AEB = 0,05518). Na podstawie Rodero i wsp. 2017. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Test konkurencji białkowej

  1. Wykonaj test konkurencji białkowej (opisany w Ilustracja 6), aby jeszcze bardziej zademonstrować specyficzność testu.
    UWAGA: Pobrano próbki osocza od pacjentów z TRU (n = 5).
    1. W przypadku podejrzenia, że wirusy są obecne w próbce biologicznej, należy przygotować bufor inaktywacyjny, dodając 200 μl niejoinowego środka powierzchniowo czynnego (0,5% substytut nonidetu P40) do 40 ml rozcieńczalnika do detektora/próbki i energicznie wirować.
    2. Odwirować próbki biologiczne zawierające badany analit w ilości 10 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych.
    3. Zmieszać 185 μl detektora/rozcieńczalnika próbki lub buforu inaktywacyjnego ze 100 μl próbki biologicznej (końcowy współczynnik rozcieńczenia 3) i 15 μl przeciwciała anty-IFN-α A (początkowe stężenie 1 mg/ml, końcowe stężenie 50 ug/ml) lub buforem. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Próbki z przeciwciałem anty-IFN-α i bez niego należy badać w analizatorze jednocząsteczkowym, jak opisano powyżej.
      UWAGA: W przypadku nasycenia sygnału, próbki należy dodatkowo rozcieńczyć. Ponadto 300 μl to objętość wymagana do powtórnej analizy.

figure-protocol-6
Rysunek 6: Test konkurencji białek. Eksperymenty konkursowe przeprowadzono na próbkach pobranych od pięciu różnych pacjentów z TRU. Próbki biologiczne odwirowywano w temperaturze 10 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Rozcieńczono je w 1/3 rozcieńczalnikiem do detektora/próbki zawierającym NP40 w celu inaktywacji wirusa. Do całkowitej objętości 300 μl dodano 15 μl przeciwciała anty-IFN-α A (początkowe stężenie 1 mg/ml, stężenie końcowe 50 μg/ml) lub buforu. Inkubację prowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 min. Grupa kontrolna jest pokazana w kolorze szarym, a próbki poddane działaniu przeciwciała anty-IFN-α A są pokazane w kolorze czarnym. Wykres przedstawia wartość średnią i SD (słupki błędów). Linia przerywana oznacza LOD (AEB = 0,024774, 0,8037 fg/ml). Na podstawie Rodero et al. 2017 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowując, opracowano test z pojedynczą matrycą cząsteczkową pan-IFN-α z granicą wykrywalności 0,69 fg/ml, przy użyciu konfiguracji 2-etapowej z kulkami wychwytującymi pokrytymi 0,3 mg/ml przeciwciała anty-IFN-α A i przeciwciała wykrywającego anty-IFN-α B biotynylowanego w stosunku biotyna do przeciwciała 30. Stężenia użyte do biotynylowanego wykrywania przeciwciał i SBG wynosiły odpowiednio 0,3 μg/ml i 150 pM. Ten wysoce specyficzny test jest w stanie wykryć wszystkie 13 podtypów IFN-α i nie reaguje krzyżowo z innymi typami IFN. W związku z tym, chociaż nie jest możliwe zidentyfikowanie i ilościowe określenie każdego poszczególnego gatunku IFN-α, wszystkie z nich mogą być wykryte i zmierzone razem, co daje całkowitą wartość stężenia IFN-α, która obejmuje 13 różnych podklas.

Aby zbadać potencjalną wartość diagnostyczną tego nowo opracowanego testu, zmierzono białko IFN-α w osoczu i surowicy od zdrowych osób i porównano je z próbkami pobranymi od pacjentów cierpiących na SLE i MZSM. Jak pokazano w Rysunek 7, wysoki poziom białka IFN-α wykryto w obu kohortach choroby w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Przerywana linia wskazuje LOD konwencjonalnego komercyjnie dostępnego testu ELISA, ilustrując, dlaczego to podejście nie wykryłoby białka IFN-α w tych grupach pacjentów, pomimo znanych powiązań tej cytokiny z tymi fenotypami. Co więcej, IFN-α można określić ilościowo na 5 logarytmach wielkości, co ilustruje szeroki zakres dynamiczny testu, z wykrywalnymi poziomami w zakresie od 1 do 10 fg/ml, co potwierdza bardzo czuły charakter testu.

figure-results-1
Rycina 7: Kwantyfikacja białka IFN-α w osoczu i surowicy z kohort pacjentów. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Rodero i wsp. 2017. Osocze od zdrowych osób z grupy kontrolnej (n = 20) oraz pacjentów cierpiących na TRU (n = 72) i MZSD (n = 43) badano testem pan-IFNα z matrycą jednocząsteczkową. Analizę przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA (Kruskala-Wallisa) oraz wielokrotnych testów porównawczych Dunna między grupami. Przedstawiono medianę. Linia przerywana wskazuje LOD referencyjnego ludzkiego testu ELISA anty-IFN-α (1,95 pg/ml = 1950 fg/ml). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

krokZagadnienia dotycząceodniesienie
1. Wybór pary przeciwciałCeluj w różne epitopyTabela 2
Wysokie powinowactwo
Szybkie Kwłączone / Wolne Kwyłączone
2. Orientacja pary przeciwciałWybierz warunki z najniższą granicą wykrywalnościRysunek 1
3. Wychwyć stężenie przeciwciał
4. Biotyna: Stosunek przeciwciał detektora
5. Konfiguracja 2 i 3-etapowaWybierz warunek o najwyższym stosunku sygnału do tłaWykres 2
6. Stężenie przeciwciał w detektorzeWybierz warunki z najniższą granicą wykrywalnościRysunek 3
7. Stężenie SBG
8. SpecyfikaOcena reaktywności krzyżowejRysunek 4
9. WrażliwośćOcena rozpoznawalności podtypów (w stosownych przypadkach)
10. OdtwarzalnośćOcena zmienności testuWykres 5

Tabela 1: Podsumowanie kroków do opracowania i optymalizacji testu z pojedynczą cząsteczką. Poniższa tabela podsumowuje różne etapy wymagane do opracowania i optymalizacji testu z matrycą pojedynczych cząsteczek, od początkowego wyboru pary przeciwciał do oceny odtwarzalności.

) pkt. pkt. szt. powiedział: TGL roku powiedział: TGL pkt. powiedział: pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. szt. szt. pkt. TGL pkt. pkt. TGL pkt. pkt. zł
antygen8H1 (a)12H5 (B)SifalimumabRontalizumab
IFNα1 (Niezależna od standarduZ dnia 28,351,3460O godz. 22.63
IFNα22563Rozdział 10.7Godzina 9.02Informacja o tym, że 2,15
IFNα4Klasa 5.11Do godziny 2,99Godzina 35,35325,3
IFNα5Pozycja 2.01Rozdział 19,6Nr 93,29Wynik 2,49
IFNα664,73,03Norma 4,97-
IFNα70,90,63233,1-
IFNα83020,83Okręg wyborczy 691Godzina 10,86
IFNα10Godzina 2,540,7143,2-
IFNα1432242.1godz. 14.520,9
IFNα16Rejon 1,83Dnia 32,99Klasa 59,18Godzina 28,65
IFNα17Pytanie 2,210,77890,9Godzina 23,86
IFNα21Godzina 2,78Godzina 12.87Rok 17695,8

Tabela 2: Wybór przeciwciał Pan-alfa. IC50 (ng / ml) oznaczone za pomocą testu neutralizacji elementu odpowiedzi stymulowanej interferonem (ISRE) i lucyferazy. Tabela przedstawia wartości IC50 mAb stosowanych w teście jednocząsteczkowym dla wszystkich podtypów IFN-α. 10 000 komórek MSR HEK 293 wysiano na białych 96-dołkowych płytkach o półpowierzchni i odwrócono transfekcję 50 ng wstępnie zmieszanymi konstruktami reportera lucyferazy ISRE-Firefly i lucyferazy Renilla przy użyciu odczynników do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Konstrukt wyrażający lucyferazy służył jako wewnętrzna kontrola normalizacji. Komórki inkubowano przez noc w zredukowanym pożywce surowicy uzupełnionej 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM pirogronianu sodu, 0,5% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Po całonocnej inkubacji komórki stymulowano przez 24 godziny pożywką zawierającą mieszaniny rekombinowanych ludzkich IFN-α z lub bez przeciwciał anty-IFN-α lub kontrolnych IgG, które były wstępnie inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach stymulacji wykonano testy podwójnej reporterowej lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta. « - » Nie określono. Sifalimumab jest w pełni ludzkim przeciwciałem monoklonalnym immunoglobuliny G1 κ, które wiąże się i neutralizuje większość podtypów IFN-α; Rontalizumab jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko IFN-α. Na podstawie Meyer i in. 2016 oraz Rodero i wsp. 2017 roku.

Tabela uzupełniająca 1: Wybór orientacji przeciwciał, wychwytywanie stężenia przeciwciał na kulkach i współczynnik biotynylacji. Przetestowano dwie możliwe różne konfiguracje, używając anty-IFN-α A jako przeciwciała wychwytującego i anty-IFN-α B jako przeciwciała wykrywającego (A) i odwrotnie (B). Jako antygen zastosowano IFNα-2c. Dla obu konfiguracji przetestowano również różne stężenia przeciwciał wychwytujących, a także stosunek biotyny do przeciwciała (B:A). Nasycenie (sob.). Pomarańczowy: wartości sekwencji naświetlania, które zostały użyte do obliczenia poziomu szczegółu; stężenia te uznano za ślepe, ponieważ wartości AEB pozostały stałe. LOD obliczono jako średnią ślepą próbę + 3SD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Test konfiguracji 2 vs 3-etapowej. Konfiguracje 2- i 3-etapowe oceniano przy użyciu IFNα-2c jako antygenu. Wartości sekwencji naświetlania, a także współczynniki sygnału/tła (S/B) są wyświetlane dla obu warunków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Optymalizacja stężenia detektora i SBG. Oceniono trzy różne stężenia biotynylowanego przeciwciała detektorowego (0,1, 0,3 i 0,6 μg/ml) wraz z trzema różnymi stężeniami SBG (50, 150 i 250 pM). Wartości sekwencji naświetlania są pokazane dla dziewięciu badanych warunków. Pomarańczowy: wartości sekwencji naświetlania, które zostały użyte do obliczenia poziomu szczegółu; stężenia te uznano za ślepe, ponieważ wartości AEB pozostały stałe. LOD obliczono jako średnią ślepą próbę + 3SD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Specyficzność i czułość zoptymalizowanego testu macierzy pojedynczych cząsteczek IFNα. Średnie wartości enzymu na kulki pokazano, gdy testowano białka rekombinowane IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω i IFN-γ (A) wraz z 16 podtypami IFN-α (B). « - » Nie określono. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 5: Odtwarzalność zoptymalizowanego testu macierzy pojedynczych cząsteczek IFNα. Średnie wartości AEB dla wszystkich trzech niezależnych serii są pokazane do stężenia 10 000 fg/ml. « - » Nie określono. Nasycenie (sob.). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 6: Test konkurencji białek. Średnie wartości enzymu na kulki są pokazane dla wszystkich badanych warunków. Pomiary wykonano w dwóch egzemplarzach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisaliśmy rozwój i walidację wysoce powtarzalnego, ultraczułego cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł do bezpośredniego oznaczania ilościowego białka IFN-α w próbkach ludzkich (kroki podsumowane w tabeli 1). Jednym z najważniejszych etapów rozwoju testu jest wybór pary przeciwciał16, przy czym charakterystyka pod względem kinetyki i wiązania epitopów jest kluczem do udanego testu. Ważne jest, aby unikać stosowania sparowanych przeciwciał monoklonalnych, które są ukierunkowane na ten sam epitop lub powodują utrudnienie steryczne. Przeciwciała poliklonalne mogą być stosowane jako przeciwciała wykrywające w celu przezwyciężenia takich ograniczeń. Jeśli na którymkolwiek etapie pożądana czułość nie zostanie osiągnięta, należy rozważyć dalsze możliwości optymalizacji. Może to obejmować stosowanie alternatywnych par przeciwciał, zmiany parametrów, takich jak typ białka (np. BSA < kazeina), pH (6,0 - 8,5), siła jonowa, zdolność buforowa (np. stężenie NaCl i fosforanów), kulki nośnikowe i/lub obecność środków powierzchniowo czynnych. Szeroki zakres parametrów może być zoptymalizowany podczas opracowywania testu z matrycą pojedynczych cząsteczek. Jednak ogólnie rzecz biorąc, preferowane są warunki, które dają wysokie proporcje sygnału do tła i minimalne poziomy szczegółowości (zob. rys. 1, rys. 2 i rys. 3).

Jeśli chodzi o swoistość, test IFN-α nie wykazał reaktywności krzyżowej dla żadnych innych badanych IFN (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figura 4a) i był w stanie wykryć wszystkie 13 podtypów IFN-α (Rysunek 4b). Jednak test wykazał mniejsze powinowactwo do podtypu IFN-α2 (Figura 4b i Tabela Uzupełniająca 4). Co ciekawe, zaobserwowano również różne czułości dla różnych klas IFN-α2 (a, b, c), co może wynikać z odmiennych procedur wytwarzania lub różnych sekwencji aminokwasów, ponieważ podtypy IFN-α2 uzyskano od różnych dostawców komercyjnych. Z tym jedynym wyjątkiem, wszystkie gatunki IFN-α dawały bardzo podobne odpowiedzi. Specyficzność testu została dodatkowo wykazana przez wstępne potraktowanie próbek klonem anty-IFN-α A, który zniósł sygnał (rysunek 6 i tabela uzupełniająca 6).

Jedną z głównych zalet tej technologii jest to, że każdy analit będący przedmiotem zainteresowania może być potencjalnie ukierunkowanyna 16. Ponadto można badać różne próbki biologiczne, takie jak surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, lizaty komórkowe, supernatanty hodowlane31 , a nawet oddech32. Zwykle przeprowadza się rozcieńczenie osocza w stosunku 1:3, aby uniknąć potencjalnego zatkania analizatora macierzy jednocząsteczkowej. Jednak analit będący przedmiotem zainteresowania może być obecny w bardzo niskich stężeniach w odpowiedniej próbce biologicznej i mogą być wymagane wyższe stężenia próbki (w zależności od czułości testu)33. Chociaż istnieje potencjał multipleksowania przy zachowaniu dobrej czułości34, jest to trudniejszy proces, a testy do pomiaru więcej niż 6 białek w tych samych eksperymentach nie zostały jeszcze opracowane35.

Zdolność do wykrywania i ilościowego oznaczania cytokin i innych biologicznie istotnych białek w tak niskich stężeniach otwiera zupełnie nowy zakres zastosowań33,36. Powszechnie wiadomo, że wiele białek wywiera swoje działanie nawet przy bardzo niskich stężeniach, które do tej pory znajdowały się poniżej granicy wykrywalności najlepszych testów ELISA37. Podczas gdy inne technologie testów immunologicznych oferują przewagę nad konwencjonalnym testem ELISA19, wykazaliśmy tutaj, że cyfrowy test ELISA z pojedynczą matrycą molekuł jest powtarzalną i solidną platformą do ultraczułego wykrywania cytokin o niskim stężeniu w próbkach ludzkich. W związku z tym technologia ta oferuje ogromny potencjał w zakresie odkrywania biomarkerów i lepszego zarządzania pacjentami w szerokim zakresie chorób.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DD i YJC potwierdzają wsparcie ze strony ANR (Projekt IFNX, no. CE17001002) oraz ImmunoQure AG za dostarczanie przeciwciał monoklonalnych. Dziękujemy Brigitte Bader-Meunier, Nathalii Bellon, Christine Bodemer, Alexowi Belotowi, Isabelle Melki i Pierre'owi Quartierowi za dostarczenie próbek klinicznych. YJC przyjmuje do wiadomości Europejską Radę ds. Badań Naukowych (GA 309449: Fellowship to YJC) oraz dotację państwową zarządzaną przez Narodową Agencję Badawczą (Francja) w ramach programu "Investments for the Future" o numerze referencyjnym ANR-10-IAHU-01.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciało anty-IFN-&alpha A (klon 8H1)ImmunoQure AGNANiedostępne w handlu
Przeciwciało anty-IFN-&alfa B (klon 12H5)ImmunoQure AGNANiedostępne na rynku
Przeciwciało anty-IFN-&alfa Klon EBI-1eBioscienceBMS216C
Przeciwciało anty-IFN-&alfa BMS216BK kloneBioscienceBMS216BKNie zestaw ELISA, ale masowy abs
IFN i alfa; 2ceBioscienceBMS305OK
IFN α I (17)PBL11150-1
IFN α 2aPBL11100-1
IFN α 2aPeproTechNie jest już dostępny
IFN i alfa; 2bPBL11105-1
IFN α 1PBL11175-1
IFN α 4a (M1)PBL11177-1
IFN α 4b (a4)PBL11180-1
IFN α B2 (a8)PBL11115-1
IFN α C (a10)PBL11120-1
IFN α D (a1)PBL11125-1
IFN α G (a5)PBL11135-1
IFN α F (a21)PBL11130-1
IFN α H2 (a14)PBL11145-1
IFN α J1 (a7)PBL11160-1
IFN α K (a6)PBL11165-1
IFN α WA (a16)PBL11190-1
IFN λ 1PeproTech300-02L
IFN i lambda; 2PeproTech300-02K
IFN i omega;PeproTech300-02J
IFN & beta;PeproTech300-02BC
IFN γPeproTech300-02
Anty-IFN-&alfa; ELISAPBL41115.1
96-dołkowe płytkiCorning3904
ISRE-ReporterQiagenCCS-008L
Fu-GENE HD Odczynnik do transfekcjiPromegaE2311
Opti-MEM Zredukowana surowica MediuemThermoFischer Scientific31985062
Test reporterowy z podwójną lucyferazyPromegaE1910
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Spektrofotometr NanoDrop 1000Thermo ScientificNie jest już dostępny
Probówki mikocentryczne Amicon - filtry 0,5 mlMerck MilliporeUFC505096
Bead Conjugation BufferQuanterix102040Nie można zamówić osobno
Niekodowany Koraliki paramagnetyczneQuanterix101360
Bufor do płukania koralikówQuanterix102040Nie można zamówić osobno
EDCFisher Scientific11844071
Bufor blokujący koralikiQuanterix102040Nie można zamówić osobno
Bufor rozcieńczalnika kulekQuanterix101362
Detektor i próbka DiluentQuanterix101359
Bufor reakcyjny biotynylacjiQuanterix102040Nie można zamówić osobno
NHS-PEG4-BiotinFisher Scientific11891195
Wirówka diH2O
do probówek do mikrowirówek 1,7 ml (wirówka Heraens Fresco 21)Thermo Scientific75002478
Standardowy laboratoryjny mieszalnik wirowy (MS2 Minishaker)Pipety IKAMS2
(10, 20, 200 i 1000 μ l)Wskazówki Thermo Scientific
(10, 20, 200 i 1000 μ l)Probówki do
1,7 mlEppendorf
Separator magnetyczny, który mieści probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml (Life Technologies DynaMag-2)ThermoFisher Scientific12321D
Mini wirówka stołowa (Galaxy MinisStar)VWR521-2844
Mieszarka/wytrząsarka (Eppendorf Thermomixer Comfort)Eppendorf
Single Molecule Array: odczynniki
SBG, etykiety z kodami kreskowymi z kulkami i detektorami
15 mlQuanterix102411
Płytki 96-dołkowe do próbek SimoaQuanterix101457
Krążki SimoaQuanterix
Simoa 2.0 końcówki przewodząceKuwety Quanterix101726
SimoaQuanterix100803
Odczynnik Simoa SBGQuanterix102295
Odczynnik Simoa RGPQuanterix101736
Simoa System Buffer 1Quanterix100486
Simoa System Buffer 2Quanterix100487
Olej uszczelniającyQuanterix100206
ddH2O
Analizator Simoa HD-1Quanterix100032
Technologies
Tablica jednocząsteczkowa (Simoa)Quanterix
Zliczanie pojedynczych cząsteczek Systemy testów immunologicznych ErennaSingluex
mikrowirówek Thermo Scientific Butelki z odczynnikami Quanterix 101652 100001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).">Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).">Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).">Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).">Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).">Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).">Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).">Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).">Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).">Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).">Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).">Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).">Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).">Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858(2011).">Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858(2011).
  15. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).">Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).">Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Whitepaper 1.0. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).">Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).
  18. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).">Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).">Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).">Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236(2015).">Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236(2015).
  22. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).">Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).">Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).">Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).">Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296(2017).">Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296(2017).
  27. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).">Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).">Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).
  29. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).">Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).
  31. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).">Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108(2015).">Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108(2015).
  33. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).">Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).">Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).">Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).">Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).">Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ArrayDigital ELISAInterferon Alpha DetectionAntibody ConjugationParamagnetic BeadsAssay OptimizationLimit Of DetectionSpecificity ValidationReproducibility AssessmentCytokine Quantification

Related Articles