Artykuł metodologiczny

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57421

⸱

14 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Immunobiology of Dendritic Cells, Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163, Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine, University of Manchester

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Streszczenie

Głównym celem tego protokołu jest opisanie rozwoju i walidacji testu ELISA, cyfrowego testu immunosorbentowego (ELISA) z interferonem (IFN)-α pojedynczej cząsteczki. System ten umożliwia ilościowe oznaczanie ludzkiego białka IFN-α z niespotykaną dotąd czułością i bez reaktywności krzyżowej dla innych gatunków IFN.

Pierwszym kluczowym krokiem protokołu jest wybór pary przeciwciał, następnie koniugacja przeciwciała wychwytującego z kulkami paramagnetycznymi i biotynylacja przeciwciała wykrywającego. Po tym etapie można modyfikować różne parametry, takie jak konfiguracja testu, stężenie przeciwciał w detektorze i skład buforu, aż do osiągnięcia optymalnej czułości. Na koniec ocenia się swoistość i odtwarzalność metody, aby zapewnić pewność wyników. Tutaj opracowaliśmy test macierzy jednocząsteczkowej IFN-α z granicą wykrywalności 0,69 fg / ml przy użyciu autoprzeciwciał o wysokim powinowactwie wyizolowanych od pacjentów z mutacjami biallelicznymi w białku regulatora autoimmunologicznego (AIRE) powodującym autoimmunologiczny zespół poliendokrynopatii typu 1 / autoimmunologiczną poliendokrynopatię-kandydozę-dystrofię ektodermalną (APS1 / APECED). Co ważne, przeciwciała te umożliwiły wykrycie wszystkich 13 podtypów IFN-α.

Ta nowa metodologia pozwala po raz pierwszy na wykrywanie i kwantyfikację białka IFN-α w ludzkich próbkach biologicznych przy stężeniach attomolowych. Takie narzędzie będzie bardzo przydatne w monitorowaniu poziomu tej cytokiny w ludzkim zdrowiu i stanach chorobowych, w szczególności infekcji, autoimmunizacji i autozapaleniu.

Wprowadzenie

IFN typu I to rodzina cytokin, które odgrywają kluczową rolę w organizowaniu przeciwwirusowych odpowiedzi immunologicznych. Po raz pierwszy zostały odkryte przez Isaacsa i Lindenmanna 60 lat temu1,2 i obecnie wiadomo, że ta niejednorodna rodzina polipeptydów obejmuje 14 różnych podklas (13 podtypów IFN-α i 1 IFN-β). IFN typu I są niezbędne do usuwania infekcji wirusowych, ale są również zaangażowane w patologię różnych stanów chorobowych człowieka, w tym zaburzeń autoimmunologicznych tocznia rumieniowatego układowego (SLE), młodzieńczego zapalenia skórno-mięśniowego (JDM) i interferonopatii typu I, w których konstytutywna sygnalizacja indukowana przez IFN typu I powoduje patologię3,4,5,6, 7.

Badanie poziomów białka IFN typu I w próbkach biologicznych było wyzwaniem od czasu jego początkowej identyfikacji jako "substancji zakłócającej"1,2. Obecnie test immunosorbentowy sprzężony z enzymem kanapkowym (ELISA) jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania białka IFN-α. Pomimo tego, że są specyficzne, proste i szybkie, testy ELISA IFN typu I mają poważne ograniczenia, takie jak ograniczona czułość. Ponadto pomiar wszystkich podtypów IFN-α wymaga użycia wielu testów, z których każdy ma własną zdolność wykrywania i czułość. Chociaż istnieją komercyjne testy ELISA, które wykrywają różne podtypy IFN-α, ich czułość jest ograniczona (odpowiednio 1,95 pg/mL, 12,5 pg/ml i 12,5 pg/ml), co często jest niewystarczające do wykrycia białka IFN-α w próbkach biologicznych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano kilka biologicznych testów zastępczych w celu ilościowego określenia IFN typu I poprzez pomiar indukowanej ekspresji genów lub aktywności funkcjonalnej8,9,10,11,12,13,14. Niemniej jednak testy te nie zapewniają bezpośredniego pomiaru białka IFN-α

.

W tym badaniu, technologia cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł została wykorzystana do opracowania testu do wykrywania pojedynczych cząsteczek białka IFN-α. Cyfrowy test ELISA wykorzystuje tę samą podstawową chemię, co konwencjonalna funkcja ELISA, jednak reakcja zachodzi w tablicach składających się z 50 000 indywidualnych studzienek o rozmiarach 46 femtolitrów15,16. Pojedyncze cząsteczki białka są wychwytywane przez kulki paramagnetyczne pokryte przeciwciałem i znakowane biotynylowanym przeciwciałem detekcyjnym, a następnie wiązane jest koniugatem enzymu, streptawidyną-β-galaktozydazą (SBG). Następnie kulki są zawieszane za pomocą fluorogennego substratu enzymatycznego, rezorufin-β-D-galaktopyranozydu (RGP), w układach jednocząsteczkowych. Zmniejszając reakcję objętościową 2 miliardy razy17, osiąga się wysokie lokalne stężenie sygnału fluorescencyjnego i liczba pojedynczych cząsteczek staje się możliwa, ponieważ każda cząsteczka generuje sygnał, który można teraz wiarygodnie zmierzyć18. Zasadniczo macierze pojedynczych cząsteczek są zdolne do zliczania pojedynczych immunokompleksów i określania średniej liczby enzymów na kulkę (AEB). Liczenie mikrostudzienek, w których wykryty jest sygnał, pozwala na kwantyfikację/digitalizację cząsteczek białka, ponieważ istnieje bezpośrednia korelacja między stężeniem białka a stosunkiem między kulkami immunokompleksowymi a całkowitą liczbą kulek obecnych w komorach o rozmiarach femtolitrów.

Yeung et al. przeprowadzili obszerne badanie oceniające na różnych platformach, używając dziewięciu różnych technologii i czterech testów immunologicznych cytokin w celu porównania precyzji testu, czułości i korelacji danych na różnych platformach19. Jednym z kluczowych ustaleń badania było to, że macierze pojedynczych cząsteczek i test immunologiczny zliczający pojedyncze cząsteczki wykazały najwyższą czułość wykrywania cytokin w ludzkiej surowicy w zakresie stężeń sub-pg/mL. Cyfrowe testy cytokin ELISA z pojedynczą matrycą cząsteczek zostały wykorzystane do zbadania roli TNF-α i IL-6 w chorobie Leśniowskiego-Crohna20, IFN-α u pacjentów z interferonopatią i autoimmunologią 7 oraz różne zmodyfikowane potranslacyjnie formy chemokiny motywu C-X-C 10 (CXCL10) u przewlekłego zapalenia wątroby i zdrowych dawców otrzymujących sitagliptynę21,22. Inne zastosowania obejmują pomiar rodopsyny u pacjentów z retinopatią cukrzycową23; badanie patologii mózgu poprzez pomiary surowicy/osocza światła neurofilamentu24 i peptydu amyloid-β 1-4225, odpowiednio w kontekście stwardnienia rozsianego i choroby Alzheimera. Testy z matrycą jednocząsteczkową mogą być również wykorzystywane do lepszego wykrywania patogenów, takich jak charakterystyka rezerwuaru wirusa HIV26, a także do wykrywania DNA27 i mikro RNAs28. Główną zaletą technologii macierzy pojedynczych cząsteczek jest wysoka wszechstronność, ponieważ test przeciwko dowolnemu analitowi będącemu przedmiotem zainteresowania można opracować, jeśli dostępna jest określona para przeciwciał. Ponadto na rynku dostępne są zestawy testowe homebrew, co pozwala na opracowywanie nowych testów, których protokół jest szczegółowo opisany w zmodyfikowanej formie poniżej.

Tutaj przedstawiono szczegółowy opis etapów rozwoju i walidacji testu z pojedynczą matrycą molekuł, co skutkuje zwiększoną czułością wykrywania białek IFN-α. Przeciwciała do testów z matrycą jednocząsteczkową powinny być wysoce specyficzne, unikając reaktywności krzyżowej z pokrewnymi białkami (w razie potrzeby z uwzględnieniem swoistości gatunkowej). Idealnie powinny być wybrane przeciwciała oK D mniejszym niż 10-9 M; Wysokie powinowactwo zapewnia silne wiązanie, przy produkcji wyższego sygnału. Kinetyka wiązania przeciwciało-antygen jest również ważna, a szybkiewłączanie i powolnewyłączanie K będzie sprzyjać składaniu kompleksu antygen-przeciwciało. Rozpoczęcie od pary przeciwciał, która ma dobre wyniki w klasycznym teście ELISA, z granicą wykrywalności (LOD) 1 - 100 pg/mL, zwiększa szanse na uzyskanie wysoce czułego testu macierzy pojedynczej cząsteczki. Chang i jego koledzy przeprowadzili szczegółowe badania kinetyczne interakcji biomolekularnych zachodzących na każdym etapie, proponując zestaw równań do przewidywania czułości analitycznej18. Wykazali, że cyfrowy test ELISA z pojedynczą matrycą molekularną wydaje się być skuteczny w szerokim zakresie powinowactwa przeciwciał (KD~10−11 - 10−9 M), a także, że generowanie sygnału jest bardziej zależne od szybkości takich przeciwciał.

Aby wykorzystać przeciwciała o wysokim powinowactwie, wykorzystaliśmy przeciwciała wyizolowane od pacjentów z autoimmunologicznym zespołem poliendokrynopatii typu 1/autoimmunologicznej poliendokrynopatii-kandydozy-dystrofii ektodermalnej (APS1/APECED)29. Z powodów, które nie są jeszcze zrozumiałe, zdecydowana większość osób z niedoborem AIRE rozwija podstawowy zestaw przeciwciał o wysokiej awidności przeciwko wszystkim podtypom IFN-α29, a my wybraliśmy dwa klony przeciwciał anty-IFN-α o komplementarnym powinowactwie wiązania dla różnych podtypów IFN-α, jak oszacowano przez IC50 Wartości. Połączenie tych unikalnych przeciwciał o wysokim powinowactwie z technologią macierzy jednocząsteczkowych umożliwiło bezpośrednie oznaczanie ilościowe IFN-α w stężeniach attomolowych (fg/ml). Takie ultraczułe wykrywanie białka IFN-α przyczyni się do lepszego zrozumienia natury, regulacji i biologicznego wpływu odpowiedzi indukowanej przez IFN w różnych warunkach chorobowych.

Protokół

1. Wybór przeciwciał

  1. Przed rozpoczęciem procedury należy przejrzeć wszystkie kluczowe kroki (Tabela 1) i wybrać optymalne przeciwciała.
    UWAGA: W tej procedurze wybrano przeciwciała przeciwko IFN-α o wysokim powinowactwie, których wartości IC50 opisano w Tabeli 2. Zaleca się wybór pary, która wykazuje dobrą skuteczność w konwencjonalnym teście ELISA.

2. Koniugacja przeciwciała przechwytującego z kuleczkami paramagnetycznymi i testowanie różnych stężeń

UWAGA: Podczas procesu koniugacji przeciwciał należy zawsze przechowywać bufor do koniugacji kulek (BCB) oraz bufor do płukania kulek (BWB) na lodzie.

  1. Wymiana buforu przeciwciała wychwytującego
    1. Przygotować początkowe ilości przeciwciała A przeciwko IFN-α, aby przetestować 3 różne stosunki konjugacji kulek (0,038 mg/mL, 0,075 mg/mL i 0,3 mg/mL).
      UWAGA: Niskie stężenia powlekania przeciwciałami mogą być korzystne, jeśli test wykazuje wysoki sygnał tła. Początkowa ilość przeciwciała powinna uwzględniać szacowaną 30% stratę podczas procesu wymiany buforu. Zgodnie z instrukcjami producenta i w celu zmniejszenia początkowego tła, przetestowano stężenia 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL i 0,3 mg/mL, choć tych dokładnych wartości często nie uzyskano ze względu na wspomnianą zmienną stratę w procesie wymiany buforu.
    2. Dodać wymaganą objętość przeciwciała do kolumny filtrującej wraz z BCB, do maksymalnie 50 µL.
    3. Wir体をć kolumny przy >10 0 x g przez 5 min i odrzucić filtrat.
    4. Przemyć kolumnę dwukrotnie, dodając całkowitą objętość 450 µL BCB, a następnie wirówkać przy >10 0 x g przez 5 min i odrzucić filtrat.
    5. Umieścić kolumnę filtrującą zawierającą przeciwciało w czystej probówce do mikrocentryfugi dnem do góry – tak, aby otwarta część kolumny była skierowana do wnętrza nowej probówki – i wirować przy 80 x g przez 1 min.
      UWAGA: Ten krok pozwoli na zebranie oczyszczonego przeciwciała. Na tym etapie nie jest wymagane dodawanie buforu.
    6. Przemyć membrany 50 µL BCB i wirować przy 80 x g przez 1 min, analogicznie do kroku 2.1.5.
    7. Zmierzyć stężenie przeciwciała za pomocą spektrofotometru do niskich objętości.
    8. Dodać BCB, aby uzyskać pożądane stężenie przeciwciała, i zapisać objętość końcową.
      UWAGA: Do opisu reszty protokołu używana będzie objętość 20 µL, określaną jako 2 objętości (2V). Wszystkie kolejne objętości odczynników zostaną odpowiednio dostosowane.
    9. Wymieszać na wortexie i przechowywać na lodzie.
  2. Przygotowanie kulek paramagnetycznych
    1. Przenieść 2,8 x 108 kulek (10 µL = 1V) do probówki do mikrocentryfugi.
      UWAGA: Objętość kulek zależy od objętości końcowej uzyskanej w kroku 2.1.8.
    2. Krótko wirować (pulse spin) i umieścić w separatorze magnetycznym na 1 min, odrzucić rozcieńczalnik i wyjąć z magnesu.
    3. Dodać 2V BWB i mieszać na wortexie przez 5 s.
    4. Powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3 dwukrotnie z BWB oraz dwa kolejne razy z BCB.
    5. Do 1V kulek dodać 190 µL BCB, mieszać na wortexie przez 5 s, krótko wirować i przechowywać przemyte kulki na lodzie.
  3. Aktywacja kulek
    1. Dodać 1 mL zimnego BCB do fiolki zawierającej 10 mg chlorku 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i mieszać na wortexie do uzyskania jednorodnego roztworu.
    2. Do 1V kulek dodać 10 µL zimnego rozcieńczonego EDC do przemytych kulek, wymieszać na wortexie i inkubować w wytrząsarce przy 10 rpm przez 30 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przygotowanie EDC i jego dodanie do kulek powinno odbywać się tak szybko, jak to możliwe, ze względu na niestabilność EDC w roztworach wodnych. Ponieważ EDC jest wysoce reaktywny, ważne jest uzyskanie jednorodnej zawiesiny kulek przed dodaniem EDC, aby zapobiec heterogenicznej aktywacji kulek. Po dodaniu EDC kulki muszą być utrzymywane w zawiesinie.
  4. Konjugacja przeciwciała z kulkami
    1. Wymieszać na wortexie i krótko wirować aktywowane kulki. Następnie umieścić kulki w separatorze magnetycznym na 1 min, odrzucić nadsącz BCB i wyjąć probówkę z magnesu.
    2. Przemyć kulki 2V BCB. Wymieszać na wortexie, krótko wirować i umieścić w separatorze magnetycznym na 1 min. Następnie odrzucić bufor BCB i wyjąć kulki z magnesu.
    3. Szybko dodać zimne, po wymianie buforu 20 µL (2V) przeciwciała do aktywowanych kulek.
    4. Wymieszać na wortexie i inkubować przez 2 h w wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  5. Blokowanie kulek i końcowe oczyszczanie
    1. Krótko wirować zawiesinę kulek powlekanych przeciwciałem, umieścić w separatorze magnetycznym na 1 min, przenieść nadsącz do nowej probówki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru do niskich objętości.
      UWAGA: Krok ten dostarczy informacji o tym, czy kulki są nasycone – każda wartość powyżej zera będzie wskazywać na nasycenie kulek – ponieważ mierzalne będzie wykrycie rozpuszczonego przeciwciała, które nie może związać się z kulkami.
    2. Wyjąć skonjugowane kulki z magnesu, dodać 2V BWB, mieszać na wortexie przez 5 s, krótko wirować i umieścić w separatorze magnetycznym na 1 min.
    3. Przenieść nadsącz do nowej probówki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru do niskich objętości.
      UWAGA: Krok ten dostarczy informacji o tym, czy przeciwciała są stabilnie przytwierdzone do kulek. Wykrywalne stężenie przeciwciała w tym nadsączu będzie wskazywać na odczepianie się przeciwciała od kulek, co zdarza się regularnie. Test ten często działa nawet wtedy, gdy do kulek przytwierdzone pozostają bardzo małe ilości przeciwciała wychwytującego.
    4. Wyjąć skonjugowane kulki z magnesu, dodać 2V BWB, mieszać na wortexie przez 5 s, krótko wirować i umieścić w separatorze magnetycznym na 1 min.
    5. Wyjąć skonjugowane kulki z magnesu, dodać 2V buforu blokującego kulki (Bead Blocking Buffer), mieszać na wortexie przez 5 s i inkubować w wytrząsarce przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć powlekane przeciwciałem i zablokowane kulki 3x objętością 2V: raz za pomocą BWS i 2x za pomocą buforu rozcieńczającego kulki (Bead Diluent Buffer) (odrzucić wszystkie nadsącze).
    7. Przechowywać powlekane i zablokowane kulki w 4°C do momentu użycia w 2V buforu rozcieńczającego kulki (Bead Diluent Buffer).
      UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem kulki muszą zostać przemyte raz rozcieńczalnikiem detektora/próbki (Detector/Sample Diluent) przy użyciu objętości 250 x objętość kulek/20, stosując separator magnetyczny.

3. Biotynylacja przeciwciała detekcyjnego

  1. Wymiana buforu przeciwciała detekcyjnego
    1. Odważyć 260 µg dwóch klonów przeciwciał anty-IFN-α.
      UWAGA: Ilość ta uwzględnia 30% ubytku podczas wymiany buforu i pozwala na przetestowanie dwóch różnych stosunków biotyny do przeciwciała.
    2. Postępować zgodnie z punktem 2.1, stosując bufor do reakcji biotinylacji (Biotinylation Reaction Buffer, BRB) zamiast BCB.
    3. Zmierzyć objętość oraz stężenia przeciwciał i dostosować objętość tak, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/mL.
      UWAGA: Jest to sugerowane stężenie początkowe, które można zoptymalizować, jeśli test nie osiągnie wymaganej czułości.
  2. Biotinylacja przeciwciała detekcyjnego
    1. Doprowadzić N-hydroksysuccynimido-polyetylenoglikol4-biotynę (NHS-PEG4-Biotin) do temperatury pokojowej i resuspendować w łącznej objętości 40 µL wody destylowanej, aby uzyskać stężenie 3,4 mM.
    2. Ustalić stosunek biotyny do przeciwciała do przetestowania i odpowiednio zmieszać przeciwciało detekcyjne z rozcieńczoną biotyną (stosunek 60:1 odpowiada 10 µL przeciwciała detekcyjnego i 4,5 µL biotyny).
      UWAGA: Na początek należy przetestować stosunki 30:1 oraz 60:1.
    3. Wymieszać mieszaninę przeciwciało-biotyna za pomocą vortexa, krótko odwirować i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Mieszanie nie jest wymagane.
  3. Oczyszczanie biotinylowanego przeciwciała detekcyjnego
    1. Przenieść biotinylowane przeciwciało na nowy filtr i postępować zgodnie z punktem 2.1, wykonując 3 etapy płukania buforem BRB (40, 450 i 450 µL) oraz końcowe zebranie próbki.
    2. Zmierzyć objętość i stężenie oczyszczonego, biotinylowanego przeciwciała detekcyjnego i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

4. Optymalizacja analizy

UWAGA: Stosowanie oprogramowania analizatora macierzy pojedynczych cząsteczek w konfiguracji Homebrew30.
Maszyna do analizy macierzy pojedynczych cząsteczek jest sterowana przez oprogramowanie, które umożliwia przeprowadzanie standaryzacji testu, kwantyfikację próbek, modyfikację parametrów zewnętrznych (stężenia kulek, detektora, SBG, RGP; rozcieńczenia próbek...) oraz parametrów wewnętrznych (liczbę kroków, czasy inkubacji...) w celu osiągnięcia optymalnych warunków analizy; może być również wykorzystywane do obliczania wyników (tła, LOD, ilości). W celu konfiguracji analizatora macierzy pojedynczych cząsteczek oraz obliczenia objętości odczynników wymaganych dla każdej rundy optymalizacji należy zapoznać się z instrukcjami producenta. Pierwsze rundy optymalizacji należy przeprowadzić w konfiguracji 2-stopniowej.

  1. Przetestuj kombinacje kulek sprzężonych z przeciwciałem wychwytującym oraz biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego w obu konfiguracjach.
    1. Przetestuj kombinacje trzech różnych stężeń przeciwciała wychwytującego anty-IFN-α A z dwoma różnymi stosunkami biotynylacji przeciwciała anty-IFN-α B jako przeciwciał detekcyjnych i wychwytujących oraz odwrotnie (Rycina 1), wybierając odpowiednie warunki w oprogramowaniu analizatora.
    2. Wybierz najczulszą kombinację, czyli warunki zapewniające najniższą granicę wykrywalności (LOD), i zastosuj ją w kolejnych etapach.
      UWAGA: Rycina 1 pokazuje, że stężenie kulek z przeciwciałem anty-IFN-α A wynoszące 0,3 mg/mL oraz stosunek biotyny do przeciwciała 30:1 dla przeciwciała anty-IFN-α B pozwoliły uzyskać najwyższą czułość, o czym świadczy LOD wynosząca 11,6 fg/mL (patrz Tabela uzupełniająca 1). Ta kombinacja będzie stosowana we wszystkich przyszłych etapach. Zwróć uwagę na wysoką czułość uzyskaną w tym konkretnym teście przed przeprowadzeniem jakichkolwiek rund optymalizacji.

wykres zależności odpowiedzi od dawki IFNα-2c; aktywność enzymatyczna; wykres liniowy; porównywanie stężeń; podwójne analizy.
Rysunek 1: Dobór orientacji przeciwciała, stężenia przeciwciała wychwytującego na kuleczkach oraz stopnia biotinylacji. Przetestowano dwie możliwe, różne konfiguracje, wykorzystując przeciwciało anty-IFN-α A jako przeciwciało wychwytujące i przeciwciało anty-IFN-α B jako przeciwciało detekcyjne (A), oraz odwrotnie (B). Jako antygen wykorzystano IFNα-2c. Dla obu konfiguracji przetestowano również różne stężenia przeciwciał wychwytujących oraz różne stosunki biotyny do przeciwciał (B:A). Linia przerywana wskazuje LOD dla najlepszego wariantu: przeciwciało anty-IFN-α A w stężeniu 0,3 mg/ml jako przeciwciało wychwytujące oraz stosunek biotyny do przeciwciała detekcyjnego anty-IFN-α B równy 30 (LOD = 1,6 mg/ml, co odpowiada wartości AEB 0,017265). Zastosowano konfigurację dwuetapową. Biotyna:przeciwciało (B:A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Porównaj konfigurację 2- i 3-etapową.
    UWAGA: W konfiguracji 3-etapowej występują trzy różne etapy inkubacji: jeden z przeciwciałem chwytającym, jeden z przeciwciałem detekcyjnym oraz końcowy trzeci etap znakowania enzymem SBG. Natomiast w konfiguracji 2-etapowej przeciwciała chwytające i detekcyjne są inkubowane jednocześnie z analizowanym analitem.
    1. Uruchom analizator Single molecule array, stosując stężenia i proporcje przeciwciał chwytających i detekcyjnych z punktu 4.1.2, wybierając predefiniowane w analizatorze konfiguracje 2- i 3-etapowe, zgodnie z instrukcjami producenta30.
    2. Wybierz konfigurację zapewniającą najwyższą czułość i zastosuj ją w kolejnych krokach.
      UWAGA: Jak pokazano na Rysunku 2 i w Tabeli uzupełniającej 2, konfiguracja 2-etapowa zapewniła nieco wyższą czułość oraz lepszy stosunek sygnału do tła dla każdego przetestowanego stężenia. W związku z tym w kolejnych krokach zastosowano konfigurację 2-etapową.

Wykres badania wiązania IFNα-2c, ilość enzymu na koralek w funkcji stężenia IFNα-2c, metoda 2-stopniowa vs metoda 3-stopniowa.
Rysunek 2: Porównanie konfiguracji 2- i 3-etapowej. Konfiguracje dwu- i trzystopniowe oceniono, wykorzystując przeciwciało anty-IFN-α A w stężeniu 0,3 mg/mL jako przeciwciało wychwytujące oraz przeciwciało anty-IFN-α B jako przeciwciało detekcyjne w stosunku biotyny do przeciwciała wynoszącym 30:1. Jako antygen wykorzystano IFNα-2c. W ustawieniu trzystopniowym występują trzy różne etapy inkubacji: pierwszy z przeciwciałem wychwytującym, drugi z przeciwciałem detekcyjnym i trzeci, końcowy, służący do znakowania enzymem SBG. Natomiast w konfiguracji dwustopniowej przeciwciała wychwytujące i detekcyjne są inkubowane jednocześnie z analizowanym analitem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Optymalizacja stężenia przeciwciała detekcyjnego i SBG
    1. Przetestuj trzy różne stężenia przeciwciała detekcyjnego (0,1, 0,3 oraz 0.6 µg/mL) wraz z trzema różnymi stężeniami SBG (50, 150 i 250 pM), zgodnie z opisaną powyżej procedurą30.
    2. Należy wybrać stężenia zapewniające najwyższą czułość i zastosować je w kolejnych etapach.
      UWAGA: Rysunek 3 wykazuje, że detektor 0.3 µg/mL a 150 pM SBG były warunkami, które wykazały optymalną granicę wykrywalności (LOD). Warunki te zapewniły również niski poziom tła i średnią amplitudę, co przekłada się na dobre wartości odchylenia standardowego (SD) (Tabela uzupełniająca 3). Typowe stężenia mieszczą się w zakresie od 0,1 - 1 µg/mL dla przeciwciała detekcyjnego oraz 50–20 pM dla SBG, choć wyższe stężenia (np. może być wymagane zastosowanie do 30 pM tego drugiego. Ważne jest unikanie warunków, które spowodowałyby wzrost tła powyżej 0,02 AEB. Zwiększenie stężenia detekcyjnego przeciwciała monoklonalnego (mAb) lub SBG wzmocni zarówno odpowiedź sygnału, jak i tło. Jeśli jednak przyrost sygnału przewyższy zmianę tła, granica wykrywalności (LOD) ulegnie poprawie. Może wystąpić sytuacja, w której obniżenie tła pozwoli na lepsze rozróżnienie między kalibratorami o niskich wartościach.

Wykres krzywej dawka-odpowiedź dla IFNα17 z aktywnością enzymatyczną na kuleczkę, wykorzystany do analizy molekularnej.
Rycina 3: Optymalizacja detektora i stężenia SBG. Trzy różne stężenia biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego (0,1, 0,3 i 0.6 µg/ml) oceniono wraz z trzema różnymi stężeniami SBG (50, 150 i 250 pM). Linia przerywana wskazuje LOD dla najlepszych warunków; przeciwciało detekcyjne w stężeniu 0,3 mg/ml oraz SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/ml, co odpowiada wartości AEB wynoszącej 0,017184). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Dodatkowe kroki optymalizacji
    1. Jeśli nie osiągnięto wymaganej czułości, należy przetestować różne czasy inkubacji dla poszczególnych etapów, korzystając z prekonfigurowanych opcji w oprogramowaniu analizatora.
    2. Jeśli czułość analizy jest niewystarczająca, należy zoptymalizować liczbę kulek na analizę, korzystając z prekonfigurowanych opcji w oprogramowaniu analizatora.
      UWAGA: Po rozpoczęciu testowania próbek biologicznych dodatkowym parametrem podlegającym optymalizacji jest objętość próbki. Należy upewnić się, że próbki są obsługiwane zgodnie z procedurami dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.

5. Specyficzność i powtarzalność analizy

  1. Zweryfikuj specyficzność testu IFN-α, przeprowadzając analizę z użyciem różnych podtypów IFN-α oraz innych białek pokrewnych (Rysunek 4a i 4b).

Wykres stężenia enzymu przedstawiający średnią na kuleczkę, wiele markerów, skala logarytmiczna.
Rysunek 4: Specyficzność i czułość zoptymalizowanego testu single molecule array dla IFNα. (A) Przetestowano rekombinowane białka IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω i IFN-γ wraz z (B) 16 podtypami IFN-α, w tym trzema typami IFN-α2 (IFN-α2a, IFN-α2b oraz IFN-α2c). Adaptacja z Rodero i wsp.. 2017. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Oceń powtarzalność zoptymalizowanego testu, przeprowadzając trzy niezależne eksperymenty powtórne i analizując zmienność międzytestową (Rycina 5).
  2. Oblicz granicę wykrywalności (LOD) testu
    UWAGA: LOD obliczono jako średnią z trzech próbek blanków + 3 odchylenia standardowe (SD), co dało wartość 0,23 fg/mL. Ponieważ standardowy czynnik rozcieńczenia próbki wynosi 1:3, uwzględnienie tego czynnika daje LOD na poziomie 0,69 fg/mL.

Wyniki analizy enzymatycznej; wykres stężenia IFNα w zależności od średniej dla enzymu/kulek, porównanie wielu serii pomiarowych.
Rysunek 5: Powtarzalność zoptymalizowanego testu pan-IFN-α z wykorzystaniem macierzy pojedynczych cząsteczek. Przeprowadzono trzy niezależne serie pomiarów z wykorzystaniem dwóch różnych partii kulek. Dla drugiej partii wykonano dwa niezależne eksperymenty. Każdy pomiar wykonano w dubletach. Linia przerywana przedstawia granicę wykrywalności (LOD), zdefiniowaną jako średnia wartość ilości enzymu na kulkę dla próby blank oraz odchylenie standardowe (SD) wszystkich serii pomiarowych. Jako referencję wykorzystano IFN-α17, przyjmując, że uzyskana krzywa wzorcowa jest reprezentatywna dla wszystkich pozostałych podtypów IFN-α, co wykazano w Rycina 4bWykres przedstawia wartość średnią i SD (słupki błędów). Linie przerywane wskazują LOD dla poszczególnych serii pomiarowych; Seria 1: 0,073 fg/mL AEB = 0,06238, Seria 2: 0,113 fg/mL AEB = 0,00719, Seria 3: 0,043 fg/mL AEB = 0,0518). Adaptacja z Rodero i wsp.. 2017. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

6. Test konkurencji białek

  1. Wykonaj test konkurencji białek (opisany w legendzie do Rysunku 6), aby dodatkowo wykazać swoistość analizy.
    UWAGA: Wykorzystano próbki osocza od pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE) (n = 5).
    1. W przypadku podejrzenia obecności wirusów w próbce biologicznej, przygotuj bufor inaktywujący, dodając 20 µL surfaktanta niejonowego (substytutu nonidetu P40 0,5%) do 40 mL rozcieńczalnika detektora/próbki, a następnie energicznie wymieszaj na wortexie.
    2. Odwiruj próbki biologiczne zawierające analizowany analit przy 10 0 g przez 15 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych.
    3. Wymieszaj 185 µL rozcieńczalnika detektora/próbki lub buforu inaktywującego z 10 µL próbki biologicznej (końcowy czynnik rozcieńczenia 3) oraz 15 µL przeciwciała anty-IFN-α A (stężenie początkowe 1 mg/mL, stężenie końcowe 50 ug/mL) lub buforu. Inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    4. Przeanalizuj próbki z przeciwciałem anty-IFN-α i bez niego w analizatorze typu single molecule array zgodnie z powyższym opisem.
      UWAGA: W przypadku nasycenia sygnału próbki należy dodatkowo rozcieńczyć. Również 30 µL to objętość wymagana do analizy w dubletach.

Wykres słupkowy porównujący aktywność enzymatyczną w przeliczeniu na koralik pomiędzy dawcami, przedstawiający wartości średnie w skali logarytmicznej.
Rysunek 6: Test konkurencji białek. Przeprowadzono eksperymenty konkurencyjne z wykorzystaniem próbek pobranych od pięciu różnych pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE). Próbki biologiczne wirowano z prędkością 10 00 g przez 15 min w temperaturze 4 °CRozcieńczono je 1:3 rozcieńczalnikiem do detektora/próbek (Detector/Sample diluent) zawierającym NP40 w celu inaktywacji wirusów. 15µl przeciwciała anty-IFN-α A (stężenie początkowe 1 mg/mL, stężenie końcowe 50 µg/mL) lub buforu dodano do objętości końcowej wynoszącej 300 µLInkubację przeprowadzono w temperaturze pokojowej przez 30 min. Grupę kontrolną przedstawiono w kolorze szarym, a próbki traktowane przeciwciałem anty-IFN-α A w kolorze czarnym. Wykres przedstawia wartość średnią i SD (słupki błędów). Linia przerywana oznacza LOD (AEB = 0,02474, 0,8037 fg/mL). Adaptacja na podstawie Rodero i wsp. 2017 Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Podsumowując, opracowano pan-IFN-α test macierzy pojedynczych cząsteczek z granicą wykrywalności 0,69 fg/mL, wykorzystujący dwuetapową konfigurację z kuleczkami wychwytującymi pokrytymi przeciwciałem anty-IFN-α A w stężeniu 0,3 mg/mL oraz przeciwciałem detekcyjnym anty-IFN-α B biotynilowanym w stosunku biotyny do przeciwciała wynoszącym 30. Stężenia zastosowane dla biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego i SBG wynosiły odpowiednio 0,3 µg/mL oraz 150 pM. Ten wysoce specyficzny test umożliwia wykrywanie wszystkich 13 podtypów IFN-α i nie wykazuje reakcji krzyżowej z innymi typami IFN. W związku z tym, choć nie jest możliwe zidentyfikowanie i ilościowe oznaczenie każdego poszczególnego gatunku IFN-α, wszystkie one mogą być wykrywane i mierzone wspólnie, co daje całkowitą wartość stężenia IFN-α, obejmującą 13 różnych podklas.

Aby zbadać potencjalną wartość diagnostyczną nowo opracowanego testu, zmierzono poziom białka IFN-α w osoczu i surowicy zdrowych osób i porównano go z próbkami pobranymi od pacjentów cierpiących na SLE i JDM. Jak pokazano na Ryc. 7, w obu grupach z chorobami wykryto wysokie poziomy białka IFN-α w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. Linia przerywana oznacza LOD konwencjonalnego, dostępnego komercyjnie testu ELISA, co ilustruje, że podejście to nie wykryłoby białka IFN-α w tych grupach pacjentów, pomimo znanych powiązań tej cytokiny z tymi fenotypami. Ponadto białko IFN-α można było kwantyfikować w zakresie 5 rzędów wielkości, co wykazuje szeroki zakres dynamiczny testu, a wykrywalne poziomy między 1 - 10 fg/mL potwierdzają wysoką czułość tej metody.

Wykres stężenia IFNα; wykres rozrzutu porównujący grupę zdrową, SLE i JDM wraz z analizą rozkładu danych.
Rycina 7: Ilościowe oznaczenie białka IFN-α w osoczu i surowicy z kohort pacjentów. Rysunek zmodyfikowano na podstawie publikacji Rodero i wsp.. 2017. Plazmę od zdrowych osób kontrolnych (n = 20) oraz pacjentów cierpiących na SLE (n = 72) i JDM (n = 43) przebadano za pomocą testu pan-IFNα w technologii single molecule array. Analizę przeprowadzono z wykorzystaniem jednoczynnikowego testu ANOVA (Kruskal-Wallis) oraz testu wielokrotnych porównań Dunna pomiędzy grupami. Przedstawiono medianę. Linia przerywana wskazuje granicę wykrywalności (LOD) referencyjnego testu ELISA dla ludzkiego anty-IFN-α (1,95 pg/ml = 1950 fg/ml). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

KrokUwagi i wskazówkiBibliografia
1. Wybór pary przeciwciałCelowanie w różne epitopyTabela 2
Wysokie powinowactwo
Szybki Kwłączony Wolna kinetyka (Slow K)wyłączony
2. Orientacja pary przeciwciałWybierz warunki z najniższą granicą wykrywalnościRycina 1
3. Stężenie przeciwciała wychwytującego
4. Stosunek biotyny do przeciwciała detekcyjnego
5. Konfiguracja 2- a 3-etapowaWybierz warunek z najwyższym stosunkiem sygnału do tłaRycina 2
6. Stężenie przeciwciała detekcyjnegoWybierz warunki z najniższą granicą wykrywalnościRysunek 3
7. Stężenie SBG
8. SpecyficznośćOcena reaktywności krzyżowejRycina 4
9. CzułośćOcena rozpoznania podtypów (jeśli dotyczy)
10. PowtarzalnośćOcena zmienności analizyRycina 5

Tabela 1: Podsumowanie etapów opracowania i optymalizacji testu macierzy pojedynczych cząsteczek. Tabela ta podsumowuje poszczególne kroki niezbędne do opracowania i optymalizacji testu macierzy pojedynczych cząsteczek, od wstępnego wyboru pary przeciwciał aż po ocenę powtarzalności.

Antygen8H1 (A)12H5 (B)SifalimumabRontalizumab
IFNα128.351.34602.63
IFNα2256310.79.022.15
IFNα45.12.935.35325.3
IFNα52.0119.693.292.49
IFNα664.73.034.97-
IFNα70.90.6323.1-
IFNα83020.8369110.86
IFNα102.540.7143.2-
IFNα1432242.114.520.9
IFNα161.8332.959.1828.65
IFNα172.210.7890.923.86
IFNα212.7812.8717695.8

Tabela 2: Wybór przeciwciała pan-alfa. IC50 (ng/mL) wyznaczono za pomocą testu neutralizacji z wykorzystaniem elementu odpowiedzi stymulowanej interferonem (ISRE)-lucyferazy. Tabela przedstawia wartości IC50 dla przeciwciał monoklonalnych (mAbs) użytych w teście Single Molecule Array dla wszystkich podtypów IFN-α. 10 0 komórek HEK 293 MSR wysiano na białe płytki 96-dołkowe o zredukowanej powierzchni i poddano odwrotnej transfekcji 50 ng gotowych konstruktów raportujących ISRE-lucyferaza świetlikowa oraz lucyferaza Renilla, stosując odczynniki do transfekcji zgodnie z instrukcją producenta. Konstrukt wykazujący ekspresję lucyferazy służył jako wewnętrzna kontrola normalizacji. Komórki inkubowano przez noc w pożywce Reduced Serum Medium uzupełnionej o 0,1 mM niezbędnych aminokwasów, 1 mM pirogronianu sodu i 0,5% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 w atmosferze zwilżonej. Po inkubacji nocnej komórki stymulowano przez 24 h pożywką zawierającą mieszaniny rekombinowanego ludzkiego IFN-α z lub bez przeciwciał monoklonalnych anty-IFN-α lub kontrolnego IgG, które poddano wstępnej inkubacji przez 1 h w 37 °C. Po 24 h stymulacji przeprowadzono podwójne testy raportujące lucyferazą zgodnie z instrukcją producenta. « - » Nie wyznaczono. Sifalimumab jest w pełni ludzkim przeciwciałem monoklonalnym klasy immunoglobulin G1 κ, które wiąże i neutralizuje większość podtypów IFN-α; Rontalizumab jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko IFN-α. Zaadaptowano z Meyer et al. 2016 oraz Rodero et al. 2017.

Tabela uzupełniająca 1: Dobór orientacji przeciwciał, stężenia przeciwciała wychwytującego na kulkach oraz stopnia biotynylacji. Przetestowano dwie możliwe konfiguracje, stosując anty-IFN-α A jako przeciwciało wychwytujące i anty-IFN-α B jako przeciwciało detekcyjne (A) oraz odwrotnie (B). Jako antygen zastosowano IFNα-2c. Dla obu konfiguracji przetestowano różne stężenia przeciwciał wychwytujących oraz różne stosunki biotyny do przeciwciała (B:A). Saturation (Sat). Kolor pomarańczowy: wartości AEB wykorzystane do obliczenia LOD; stężenia te uznano za tło, ponieważ wartości AEB pozostały stałe. LOD obliczono jako średnia z tła + 3SD. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Test konfiguracji 2- i 3-etapowej. Konfiguracje 2- i 3-etapowe oceniono, wykorzystując IFNα-2c jako antygen. Dla obu warunków przedstawiono wartości AEB oraz stosunki sygnału do tła (S/B). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Optymalizacja stężenia detektora i SBG. Oceniono trzy różne stężenia biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego (0,1, 0,3 i 0,6 µg/mL) wraz z trzema różnymi stężeniami SBG (50, 150 i 250 pM). Przedstawiono wartości AEB dla dziewięciu badanych warunków. Kolor pomarańczowy: wartości AEB wykorzystane do obliczenia LOD; stężenia te uznano za tło, ponieważ wartości AEB pozostały stabilne. LOD obliczono jako średnia tła + 3SD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Specyficzność i czułość zoptymalizowanego testu Single Molecule Array dla IFNα. Przedstawiono średnie wartości liczby enzymów na kuleczkę dla przetestowanych białek rekombinowanych IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω oraz IFN-γ (A), wraz z 16 podtypami IFN-α (B). « - » Nie określono. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 5: Powtarzalność zoptymalizowanego testu pojedynczych cząsteczek (Simoa) dla IFNα. Średnie wartości AEB dla trzech niezależnych serii pomiarowych przedstawiono dla stężeń do 10.0 fg/mL. « - » Nie określono. Nasycenie (Sat). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 6: Analiza konkurencji białek. Przedstawiono średnie wartości ilości enzymu na kuleczki dla wszystkich badanych warunków. Pomiary wykonano w duplikacie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym artykule opisaliśmy rozwój i walidację wysoce powtarzalnego, ultraczułego cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł do bezpośredniego oznaczania ilościowego białka IFN-α w próbkach ludzkich (kroki podsumowane w tabeli 1). Jednym z najważniejszych etapów rozwoju testu jest wybór pary przeciwciał16, przy czym charakterystyka pod względem kinetyki i wiązania epitopów jest kluczem do udanego testu. Ważne jest, aby unikać stosowania sparowanych przeciwciał monoklonalnych, które są ukierunkowane na ten sam epitop lub powodują utrudnienie steryczne. Przeciwciała poliklonalne mogą być stosowane jako przeciwciała wykrywające w celu przezwyciężenia takich ograniczeń. Jeśli na którymkolwiek etapie pożądana czułość nie zostanie osiągnięta, należy rozważyć dalsze możliwości optymalizacji. Może to obejmować stosowanie alternatywnych par przeciwciał, zmiany parametrów, takich jak typ białka (np. BSA < kazeina), pH (6,0 - 8,5), siła jonowa, zdolność buforowa (np. stężenie NaCl i fosforanów), kulki nośnikowe i/lub obecność środków powierzchniowo czynnych. Szeroki zakres parametrów może być zoptymalizowany podczas opracowywania testu z matrycą pojedynczych cząsteczek. Jednak ogólnie rzecz biorąc, preferowane są warunki, które dają wysokie proporcje sygnału do tła i minimalne poziomy szczegółowości (zob. rys. 1, rys. 2 i rys. 3).

Jeśli chodzi o swoistość, test IFN-α nie wykazał reaktywności krzyżowej dla żadnych innych badanych IFN (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figura 4a) i był w stanie wykryć wszystkie 13 podtypów IFN-α (Rysunek 4b). Jednak test wykazał mniejsze powinowactwo do podtypu IFN-α2 (Figura 4b i Tabela Uzupełniająca 4). Co ciekawe, zaobserwowano również różne czułości dla różnych klas IFN-α2 (a, b, c), co może wynikać z odmiennych procedur wytwarzania lub różnych sekwencji aminokwasów, ponieważ podtypy IFN-α2 uzyskano od różnych dostawców komercyjnych. Z tym jedynym wyjątkiem, wszystkie gatunki IFN-α dawały bardzo podobne odpowiedzi. Specyficzność testu została dodatkowo wykazana przez wstępne potraktowanie próbek klonem anty-IFN-α A, który zniósł sygnał (rysunek 6 i tabela uzupełniająca 6).

Jedną z głównych zalet tej technologii jest to, że każdy analit będący przedmiotem zainteresowania może być potencjalnie ukierunkowanyna 16. Ponadto można badać różne próbki biologiczne, takie jak surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, lizaty komórkowe, supernatanty hodowlane31 , a nawet oddech32. Zwykle przeprowadza się rozcieńczenie osocza w stosunku 1:3, aby uniknąć potencjalnego zatkania analizatora macierzy jednocząsteczkowej. Jednak analit będący przedmiotem zainteresowania może być obecny w bardzo niskich stężeniach w odpowiedniej próbce biologicznej i mogą być wymagane wyższe stężenia próbki (w zależności od czułości testu)33. Chociaż istnieje potencjał multipleksowania przy zachowaniu dobrej czułości34, jest to trudniejszy proces, a testy do pomiaru więcej niż 6 białek w tych samych eksperymentach nie zostały jeszcze opracowane35.

Zdolność do wykrywania i ilościowego oznaczania cytokin i innych biologicznie istotnych białek w tak niskich stężeniach otwiera zupełnie nowy zakres zastosowań33,36. Powszechnie wiadomo, że wiele białek wywiera swoje działanie nawet przy bardzo niskich stężeniach, które do tej pory znajdowały się poniżej granicy wykrywalności najlepszych testów ELISA37. Podczas gdy inne technologie testów immunologicznych oferują przewagę nad konwencjonalnym testem ELISA19, wykazaliśmy tutaj, że cyfrowy test ELISA z pojedynczą matrycą molekuł jest powtarzalną i solidną platformą do ultraczułego wykrywania cytokin o niskim stężeniu w próbkach ludzkich. W związku z tym technologia ta oferuje ogromny potencjał w zakresie odkrywania biomarkerów i lepszego zarządzania pacjentami w szerokim zakresie chorób.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

DD i YJC potwierdzają wsparcie ze strony ANR (Projekt IFNX, no. CE17001002) oraz ImmunoQure AG za dostarczanie przeciwciał monoklonalnych. Dziękujemy Brigitte Bader-Meunier, Nathalii Bellon, Christine Bodemer, Alexowi Belotowi, Isabelle Melki i Pierre'owi Quartierowi za dostarczenie próbek klinicznych. YJC przyjmuje do wiadomości Europejską Radę ds. Badań Naukowych (GA 309449: Fellowship to YJC) oraz dotację państwową zarządzaną przez Narodową Agencję Badawczą (Francja) w ramach programu "Investments for the Future" o numerze referencyjnym ANR-10-IAHU-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-IFN-&alpha A (klon 8H1)ImmunoQure AGNANiedostępne w handlu
Przeciwciało anty-IFN-&alfa B (klon 12H5)ImmunoQure AGNANiedostępne na rynku
Przeciwciało anty-IFN-&alfa Klon EBI-1eBioscienceBMS216C
Przeciwciało anty-IFN-&alfa BMS216BK kloneBioscienceBMS216BKNie zestaw ELISA, ale masowy abs
IFN i alfa; 2ceBioscienceBMS305OK
IFN α I (17)PBL11150-1
IFN α 2aPBL11100-1
IFN α 2aPeproTechNie jest już dostępny
IFN i alfa; 2bPBL11105-1
IFN α 1PBL11175-1
IFN α 4a (M1)PBL11177-1
IFN α 4b (a4)PBL11180-1
IFN α B2 (a8)PBL11115-1
IFN α C (a10)PBL11120-1
IFN α D (a1)PBL11125-1
IFN α G (a5)PBL11135-1
IFN α F (a21)PBL11130-1
IFN α H2 (a14)PBL11145-1
IFN α J1 (a7)PBL11160-1
IFN α K (a6)PBL11165-1
IFN α WA (a16)PBL11190-1
IFN λ 1PeproTech300-02L
IFN i lambda; 2PeproTech300-02K
IFN i omega;PeproTech300-02J
IFN & beta;PeproTech300-02BC
IFN γPeproTech300-02
Anty-IFN-&alfa; ELISAPBL41115.1
96-dołkowe płytkiCorning3904
ISRE-ReporterQiagenCCS-008L
Fu-GENE HD Odczynnik do transfekcjiPromegaE2311
Opti-MEM Zredukowana surowica MediuemThermoFischer Scientific31985062
Test reporterowy z podwójną lucyferazyPromegaE1910
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Spektrofotometr NanoDrop 1000Thermo ScientificNie jest już dostępny
Probówki mikocentryczne Amicon - filtry 0,5 mlMerck MilliporeUFC505096
Bead Conjugation BufferQuanterix102040Nie można zamówić osobno
Niekodowany Koraliki paramagnetyczneQuanterix101360
Bufor do płukania koralikówQuanterix102040Nie można zamówić osobno
EDCFisher Scientific11844071
Bufor blokujący koralikiQuanterix102040Nie można zamówić osobno
Bufor rozcieńczalnika kulekQuanterix101362
Detektor i próbka DiluentQuanterix101359
Bufor reakcyjny biotynylacjiQuanterix102040Nie można zamówić osobno
NHS-PEG4-BiotinFisher Scientific11891195
Wirówka diH2O
do probówek do mikrowirówek 1,7 ml (wirówka Heraens Fresco 21)Thermo Scientific75002478
Standardowy laboratoryjny mieszalnik wirowy (MS2 Minishaker)Pipety IKAMS2
(10, 20, 200 i 1000 μ l)Wskazówki Thermo Scientific
(10, 20, 200 i 1000 μ l)Probówki do
1,7 mlEppendorf
Separator magnetyczny, który mieści probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml (Life Technologies DynaMag-2)ThermoFisher Scientific12321D
Mini wirówka stołowa (Galaxy MinisStar)VWR521-2844
Mieszarka/wytrząsarka (Eppendorf Thermomixer Comfort)Eppendorf
Single Molecule Array: odczynniki
SBG, etykiety z kodami kreskowymi z kulkami i detektorami
15 mlQuanterix102411
Płytki 96-dołkowe do próbek SimoaQuanterix101457
Krążki SimoaQuanterix
Simoa 2.0 końcówki przewodząceKuwety Quanterix101726
SimoaQuanterix100803
Odczynnik Simoa SBGQuanterix102295
Odczynnik Simoa RGPQuanterix101736
Simoa System Buffer 1Quanterix100486
Simoa System Buffer 2Quanterix100487
Olej uszczelniającyQuanterix100206
ddH2O
Analizator Simoa HD-1Quanterix100032
Technologies
Tablica jednocząsteczkowa (Simoa)Quanterix
Zliczanie pojedynczych cząsteczek Systemy testów immunologicznych ErennaSingluex
mikrowirówek Thermo Scientific Butelki z odczynnikami Quanterix 101652 100001

Bibliografia

  1. Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858(2011).
  15. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).
  18. Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236(2015).
  22. Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296(2017).
  27. Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).
  29. Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).
  31. Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108(2015).
  33. Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cyfrowy test ELISAdetekcja interferonu alfakonjugacja przeciwciakoraliki paramagnetyczneoptymalizacja testugranica wykrywalno ciwalidacja specyficzno ciocena powtarzalno ciilo ciowe oznaczenie cytokin

Powiązane artykuły