Artykuł metodologiczny

Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

DOI:

10.3791/57422

⸱

15 lipca 2018

 ,  ,  , 
1Plant Molecular and Cellular Biology Program, University of Florida, 2Department of Biology, University of Florida, 3Genetics Institute (UFGI), University of Florida, 4Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University, 5Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (ICBR), University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych, która jest przydatna do badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie komórek ochronnych jest niezbędne do poznania specyficznego wkładu tego typu komórek w ogólną funkcję roślin. Jednak często trudno jest je wyizolować, a zatem ich badanie często stanowi wyzwanie.

To badanie ustanawia metodę wzbogacania komórek ochronnych aparatów szparkowych. Protokół wykorzystuje taśmę klejącą do izolowania komórek ochronnych i ekstrakcji białek z komórek. Metoda ta poprawia integralność i wydajność komórki ochronnej podczas izolacji i zapewnia wiarygodną próbkę do badania procesów sygnalizacji komórkowej i ich korelacji z fenotypami ruchu aparatów szparkowych. W tej metodzie liście rośliny zostały podzielone na dwie części taśmy i oderwane, aby usunąć stronę abaksjalną. Protokół ten zastosowano do tkanki liścia rzodkiewnika w celu wyizolowania komórek ochronnych. Komórki potraktowano dioctanem fluoresceiny (FDA) w celu określenia żywotności oraz kwasem abscysynowym (ABA) w celu oceny ruchu aparatów szparkowych w odpowiedzi na ABA. Podsumowując, protokół ten okazuje się przydatny do przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych i izolacji białek. Jakość uzyskanych tu komórek i białek umożliwia prowadzenie badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aparaty szparkowe odgrywają ważną rolę w ogólnej fizjologii i sprawności roślin. Te maleńkie struktury specyficzne dla roślin są tworzone przez dwie wyspecjalizowane komórki naskórka znane jako komórki ochronne i występują najobficiej na powierzchni liści. Aparaty szparkowe są niezbędne do wymiany gazów między rośliną a atmosferą, a także do kontroli utraty wody w wyniku transpiracji. Komórki ochronne regulują otwór aparatu szparkowego poprzez integrację różnych bodźców zewnętrznych (np. światła, wilgotności, kontaktu z patogenami, poziomu dwutlenku węgla) i wewnętrznych (np. hormonów endogennych)1,2. W ciągu ostatnich 20 lat ten typ komórek stał się modelowym systemem do badania procesów sygnalizacji komórkowej w roślinach. Komórki te stanowią niewielki ułamek wszystkich komórek liścia; Dlatego, aby zbadać ich unikalne właściwości komórkowe, biochemiczne i molekularne w sposób jednokomórkowy, konieczne jest wyizolowanie ich od innych typów komórek liści. W przeszłości badania nad komórkami ochronnymi często obejmowały przygotowanie protoplastów komórek ochronnych (GCP)3,4,5. Zazwyczaj wymaga to użycia dużych ilości enzymów rozkładających ścianę komórkową i/lub mechanicznego rozerwania poprzez mieszanie i okazało się kosztowne i czasochłonne, ponieważ przygotowanie próbki GCP zajmuje zwykle wiele godzin, często z niewielką wydajnością. Co ważniejsze, ponieważ komórki ochronne działają jak kompletne pary regulujące aperturę aparatów szparkowych, zastosowanie GCP może być postrzegane jako sztuczny system do badania sygnalizacji komórek ochronnych.

Tutaj opracowaliśmy metodę przygotowania aparatów szparkowych, w których nienaruszone komórki ochronne są wzbogacone i utrzymują fizjologiczne reakcje na bodźce. Metoda ta została zainspirowana metodą, która została użyta do wyizolowania protoplastów komórek mezofilu6,7. W naszej metodzie aparaty szparkowe są przygotowywane przy użyciu przezroczystej taśmy klejącej, aby najpierw oddzielić większość komórek mezofilu przyczepionych do warstwy adaksjalnej liścia od warstwy abaksjalnej zawierającej nawierzchnię i komórki ochronne. Odbywa się to poprzez przyklejenie kawałka taśmy z każdej strony liścia i oderwanie ich. Komórkom z warstwy abaksjalnej pozostawia się regenerację pod wpływem światła w buforze otwierającym aparaty szparkowe. Później pozostałe komórki chodnika są usuwane za pomocą niewielkiej ilości enzymów rozkładających ścianę komórkową, pozostawiając komórkę ochronną, która jest wzbogacana na taśmie.

W tej prostej metodzie, komórki stomatalne ochronne, które są zarówno żywotne, jak i responsywne, mogą być szybko i efektywnie przygotowane, co zajmuje mniej niż godzinę, aby uzyskać wzbogacone komórki ochronne aparatów szparkowych z 50 peelingów przy minimalnych kosztach. Metoda ta powoduje mniejsze uszkodzenia komórek roślinnych niż poprzednie metody, w których przygotowywane są protoplasty. Ponadto materiały pobrane tą metodą dają pożądane ilości białka. Co najważniejsze, ponieważ liść nie jest poddawany mieszaniu ani długiemu trawieniu, a komórki ochronne pozostają nienaruszone, wyniki badań będą bardziej adekwatne do naturalnej biologii komórki ochronnej. Dzięki tej metodzie ruchy aparatów szparkowych mogą być skorelowane w czasie rzeczywistym ze zmianami na poziomie molekularnym. W związku z tym wiedza uzyskana z badań z wykorzystaniem tej metody przygotowania byłaby ważna dla bardziej wszechstronnego zrozumienia sygnalizacji komórek ochronnych.

Użyliśmy rośliny Arabidopsis thaliana jako modelu; jednak ten protokół może być zastosowany do wzbogacania komórek ochronnych aparatów szparkowych u innych gatunków roślin, takich jak Brassica napus, z niewielkimi modyfikacjami czasu trawienia. Jako dowód słuszności koncepcji wykazaliśmy, że komórki ochronne aparatów szparkowych wzbogacone tą metodą są żywotne i reagują na bodźce, jak wykazano odpowiednio w teście dioctanu fluoresceiny (FDA) i badaniach z wykorzystaniem hormonu roślinnego kwasu abscysynowego (ABA). Ponadto wykazaliśmy, że z tych komórek ochronnych można wyizolować wysokiej jakości białka. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół tego procesu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uprawa roślin

  1. Kiełkuj nasiona w mieszance doniczkowej. Rośliny należy uprawiać w komorze wzrostowej o natężeniu światła 140 μmol fotonów m−2 s −1 i fotoperiodzie 8 godzin światła w temperaturze 22 °C i 16 godzinach ciemności w temperaturze 18 °C przez 2 tygodnie.
  2. Przesadzaj sadzonki o podobnych rozmiarach pojedynczo do doniczek o średnicy 4 cali zawierających glebę i rosnąć przez dodatkowe 3 tygodnie w tych samych warunkach, które opisano w kroku 1.1.
    UWAGA: Podlewaj rośliny wodą z kranu dwa razy w tygodniu, aby gleba była wilgotna.

2. Przygotowanie wzbogaconych aparatów szparkowych

  1. Usuń liście 5-tygodniowych roślin A. thaliana pojedynczo za pomocą skalpela.
  2. Przymocuj każdy liść do dwóch kawałków przezroczystej taśmy klejącej, tak aby jeden kawałek przylegał do strony adoksjalnej (dolnej), a drugi przylegał do adaksjalnej (górnej) strony liścia. Pozostaw taśmę na liściu na 5 sekund.
  3. Delikatnie rozsuń dwa kawałki taśm za pomocą palca wskazującego i kciuka każdej ręki, aby oddzielić stronę abaksjalną z komórkami chodnikowymi i ochronnymi oraz stronę adaksjalną z komórkami mezofilu.
  4. Umieść skórki od strony abaksjalnej liści w 60 ml buforu otwierającego aparaty szparkowe (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, dostosowany do pH 6,2 z 1 M KOH) na płytkach Petriego o średnicy 40 mm × 12 mm podczas ich zbierania.
    1. Powtarzaj powyższe kroki, aż wszystkie skórki próbki zostaną zebrane.
  5. Umieścić szalki Petriego zawierające skórki w komorze wzrostowej w warunkach oświetleniowych określonych w kroku 1.1. Pozostaw skórki pod światłem na 2 godziny, aby aparaty szparkowe całkowicie się otworzyły.
  6. Umieść skórki na szalce Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm zawierającej 50 ml mieszaniny enzymów trawiących ścianę komórkową (0,7% celulazy R-10, 0,025% macerozymu R-10, 0,1% (w/v) poliwinylopirolidonu-40 i 0,25% (m/v) albuminy surowicy bydlęcej w 55% roztworze zasadowym (0,55 M sorbitolu, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM kwasu askorbinowego, 10 μM KH2PO4, 5 mM kwas 4-morfolinoetanosulfonowy (MES) o pH 5,7 skorygowany za pomocą 1 M KOH).
  7. Potrząsaj skórkami na wytrząsarce przeciwstawnej na szalce Petriego z prędkością 50 obr./min przez 20 minut.
  8. Po 20 minutach usuń skórki z roztworu enzymu za pomocą pęsety. Przenieś skórki na szalkę Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm zawierającą 50 ml wody.
  9. Za pomocą pipety transferowej płukać skórki przez 15 s dwukrotnie 10 ml wody, aby usunąć resztki roztworu enzymu.
  10. Za pomocą pęsety umieść skórki na szalce Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm z 50 ml świeżego buforu do otwierania aparatów szparkowych, jak opisano w kroku 2.4. Inkubować przez 1 godzinę w warunkach świetlnych określonych w kroku 1.1, aby umożliwić aparatom szparkowym regenerację.

3. Leczenie kwasem abscysynowym (ABA) i test ruchów aparatów szparkowych

  1. W szalce Petriego o wymiarach 150 mm x 20 mm. Wzbogacone skórki aparatów szparkowych inkubować w temperaturze 30°C przez 15 minut w 50 ml buforu do otwierania aparatów szparkowych lub w 50 ml buforu do otwierania aparatów szparkowych o końcowym stężeniu 10 μM ABA przez odpowiedni czas leczenia.
  2. Umieść peelingi na shakerze z prędkością 50 obr./min na 5, 15 i 30 minut. Po każdym przedziale czasu usuń skórkę pęsetą i postępuj zgodnie z instrukcjami obrazowania opisanymi w kroku 3.3.
  3. Wykonaj zdjęcia aparatów szparkowych przed leczeniem ABA i w różnych punktach czasowych po leczeniu ABA za pomocą mikroskopu świetlnego.
    1. Weź skórkę i umieść ją na szklanym szkiełku mikroskopowym.
    2. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wyreguluj stolik tak, aby można było zobrazować obraz skórki.
    3. Dostosuj precyzyjną i kursową ostrość na mikroskopie, aby uzyskać wyraźny obraz komórek ochronnych.
    4. Zrób kilka zdjęć wielu aparatów szparkowych w 40-krotnym powiększeniu.
  4. Zmierz 60 otworów szparkowych za pomocą ImageJ8.
  5. Oblicz błąd standardowy i istotność przy wartości p < 0,05 z 60 pomiarów apertury szparkowej.

4. Ekstrakcja białek i separacja stron SDS

  1. Miel skórki przez 15 s w wystarczającej ilości ciekłego azotu, aby pokryć skórki za pomocą schłodzonego moździerza i tłuczka.
  2. Na 50 skórek dodać pipetą do moździerza 3 ml fenolu nasyconego Tris (pH 8,8) i 3 ml buforu do ekstrakcji białek (0,9 M sacharozy, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4% 2-merkaptoetanolu, 10 μl 1 mM proteazy i inhibitora fosfatazy) pipetą, a następnie mielić skórki przez dodatkowe 5 minut w dygestorium.
  3. Przenieść ekstrakt za pomocą pipety, a skórki za pomocą metalowej pęsety do probówki wirówkowej Oakridge i mieszać na wytrząsarce z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  4. Usuń skórki z probówki wirówkowej Oakridge i odwiruj ekstrakt o stężeniu 5 000 x g przez 10 minut. Następnie przenieś górną fazę fenolową do nowej, czystej probówki mikrowirówki za pomocą pipety.
  5. Wytrącić białka wyekstrahowane fenolem, dodając 5 objętości lodowatego octanu 0,1 M amonu w 100% metanolu. Krótko wirować i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
  6. Odwirować przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, zdekantować supernatant powoli wylewając go z probówki i zatrzymać osad białkowy w probówce.
  7. Przemyć osad białkowy dwukrotnie 0,1 M octanem amonu w metanolu, a następnie dwukrotnie 80% acetonem i raz 100% zimnym acetonem.
    UWAGA: Mycie odbywa się poprzez dodanie 10 ml określonego odczynnika do probówki z białkiem. Mieszać na wytrząsarce przy 50 obr./min przez 5 min, a następnie odwirować przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Następnie wylej odczynnik z probówki, zachowując tylko osad białka.
  8. Dodaj 1 ml 100% zimnego acetonu do osadu i ponownie zawiesij, powoli pipetując w górę iw dół.
  9. Przenieść zawiesinę białkową za pomocą pipety do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml, a następnie odwirować w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  10. Usuń aceton, dekantując go z rurki i susz granulki w dygestorium przez 10 minut.
  11. Rozpuścić białko w probówce do mikrowirówki z 200 μl buforu do rozpuszczania (8 M mocznika, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl o pH 8,5) i wirować przez 30 minut. Wirować w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 15 °C przez 20 minut i zebrać supernatant do nowej probówki.
  12. Określ ilościowo stężenie białka zgodnie z protokołem kwantyfikacji białka9.
  13. Użyj próbek białek do separacji białek za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie z protokołem10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywny obraz komórek ochronnych Arabidopsis przed i po trawieniu komórek mezofilu i naskórka jest pokazany w Rysunek 1. Żywotność komórek ochronnych przed i po usunięciu mezofilu i komórek naskórka można zaobserwować za pomocą FDA do pomiaru aktywności enzymatycznej i integralności błony komórkowej (Rysunek 1B i 1D). Rysunek 2 ilustruje ruchy aparatów szparkowych Arabidopsis w odpowiedzi na lec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki ochronne są modelowym systemem do badania mechanizmów transdukcji sygnału u roślin i ważne jest, aby upewnić się, że przygotowanie próbek użytych w badaniu jest najbardziej odpowiednie do udzielenia odpowiedzi na pytania biologiczne. Pomimo rosnącego zainteresowania komórkami ochronnymi w środowisku badaczy roślin, nie ma uniwersalnej metody przygotowania komórek ochronnych aparatów szparkowych, która pozwoliłaby na badanie zarówno ruchu szparkowego i fizjologii, jak i zmian molekularnych w jednym systemie. Wyzwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Danielowi Chenowi z Zespołu Produkcji Cyfrowej Wideo w Buchholz High School za pomoc w edycji filmu. Badania nad komórkami ochrony aparatów szparkowych, proteomiką i metabolomiką w laboratorium Chen zostały wsparte grantami amerykańskiej Narodowej Fundacji Nauki (0818051, 1158000 i 1412547). Wenwen Kong jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną. Dr Qiuying Pang jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną i Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31570396).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pióro skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej  
NC9999403 Taśma klejąca (3M)ULINES-9781
szalka PetriegoSigma-AldrichBR455701
celulaza (Onozuka R-10) Yakult Przemysł farmaceutyczny Co., Ltd.21560003-3
Macerozyme R-10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.21560003-4
Mikroskop DM6000B Leica Microsystems
Thermo Fisher Scientific  
Szybkie probówki wirówkowe PPCO Oak Ridge Zestaw doThermo Fisher Scientific3119-0030
EZQ ThermoFisher ScientificR33200
Dioctan fluoresceiny (FDA)Thermo Fisher ScientificF1303
Kwas abscysynowySigma-AldrichA4906
Metro Mix 500BWI Firmy TX-500
Laemmli Bufor do próbekBio-Rad161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250)Bio-Rad161-0786
Probówka do mikrowirówek (2 ml)USA Scientific, Inc.1620-2700
Oprogramowanie ImageJNarodowego Instytutu Zdrowia
 Sigma-AldrichF4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żelBio-Rad456-1043
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550-A3
Koktajle inhibitorów proteaz i fosfatazy PI78443 oznaczania ilości białek Pęseta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
  2. Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
  3. Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
  4. Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
  5. Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
  6. Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10(2009).
  7. Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
  8. Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  9. Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
  10. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
  11. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
  12. Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek szparkowychekstrakcja bia ekdiadacety fluoresceinytraktowanie kwasem abscysynowymanaliza SDS PAGEtrawienie ciany kom rkowejekstrakcja fenolowatest ruchu szparekpomiar st enia bia ka

Powiązane artykuły