Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57423

⸱

24 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do porównywania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie linie ludzkich komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą barwienia czerwienią Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji światła ultrafioletowego (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX).

Streszczenie

Ten film przedstawia użycie transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii (TEM-EDX) do porównania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie ludzkie linie komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Te linie komórkowe, po leczeniu kwasem askorbinowym (AA) i β-glicerofosforanem (β-GP), przechodzą całkowite różnicowanie osteogenne od proliferacji do mineralizacji i wytwarzają pęcherzyki macierzy (MV), które wywołują zarodkowanie apatytu w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).

Na podstawie barwienia Alizarin Red-S (AR-S) i analizy składu minerałów w lizatach komórkowych za pomocą światła ultrafioletowego (UV) lub w pęcherzykach za pomocą obrazowania TEM, a następnie kwantyfikacji EDX i mapowania jonów, możemy wywnioskować, że kostniakomięsak Saos-2 i osteoblastyczne komórki hFOB 1.19 wykazują różne profile mineralizacji. Komórki Saos-2 mineralizują się wydajniej niż komórki hFOB 1.19 i wytwarzają większe złoża mineralne, które nie są widoczne w świetle UV, ale są podobne do hydroksyapatytu (HA), ponieważ mają więcej podstawień Ca i F.

Wyniki uzyskane przy użyciu tych technik pozwalają nam stwierdzić, że proces mineralizacji różni się w zależności od typu komórki. Proponujemy, aby na poziomie komórkowym pochodzenie i właściwości pęcherzyków z góry determinowały rodzaj minerałów.

Wprowadzenie

Kość jest rodzajem tkanki łącznej składającej się z dwóch części: organicznej (komórek i włókien kolagenowych) oraz mineralnej (związków wapnia i fosforu). Głównymi składnikami mineralnymi kości są apatyty1. Różne typy komórek zdolnych do mineralizacji w kościach (osteoblasty), zębach (odontoblasty) i chrząstkach (chondrocyty) regulują początkowe etapy mineralizacji poprzez produkcję białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i uwalnianie pęcherzyków macierzy (MVs) (Rysunek 1). MVs to pęcherzyki o średnicy 100-300 nm, które gromadzą wapń i fosfor, co ułatwia nukleację apatytu, a następnie wiążą się z kolagenem2,3. Następnie pęcherzyki MVs ulegają rozpadowi, uwalniając apatyty do środowiska zewnątrzkomórkowego. Apatyty kontynuują wzrost w kontakcie z włóknami kolagenowymi i tworzą macierz kostną. Mineralizacja jest podtrzymywana przez stałą podaż Pi i Ca2+ w środowisku zewnątrzkomórkowym. Niektóre niedawno opublikowane dane wspierają nasz model4,5. Tkanki miękkie nie mineralizują się w warunkach fizjologicznych. Jednak w warunkach patologicznych może dojść do zwapnienia ektopowego, np. w przypadku zwapnienia naczyń3. Komórki naczyniowe, które nabywają fenotypu osteoblastów, mogą wytwarzać pęcherzyki MVs, które indukują nukleację apatytów i inicjują mineralizację w warstwie środkowej (media) i wewnętrznej (intima) ścian naczyń krwionośnych. Ponieważ zwapnienie ektopowe przypomina prawidłową mineralizację endochondralną3, zrozumienie mechanizmów molekularnych mineralizacji komórek kostnych i chondrocytów powinno dostarczyć wskazówek dotyczących powstawania zwapnień ektopowych w tkankach miękkich.

Rozwój tkanek szkieletowych jest regulowany przez różne enzymy, czynniki wzrostu oraz promotory lub inhibitory mineralizacji. Antagonistyczne działanie nieswoistej tkankowo fosfatazy alkalicznej (TNAP) (Rysunek 1) i ektonukleotydopirofosfatazy/fosfodiesterazy I (NPP1), wraz z ankiryną (ANK), kontroluje stężenie nieorganicznego pirofosforanu (PPi)6. PPi, silny inhibitor tworzenia HA, jest hydrolizowany przez TNAP; NPP1 hydrolizuje nukleotydotrifosforany do PPi, podczas gdy ANK eksportuje PPi z komórki do ECM. Stosunek Pi/PPi może regulować tworzenie apatytu7,8, co może prowadzić do konsekwencji patologicznych9.

Błona MV jest wzbogacona w białka transportu jonowego, które ułatwiają wstępne wytrącanie wapnia i fosforanu wewnątrz MV podczas procesu nukleacji (Rysunek 1). Transporter fosforanu 1 (PiT) pomaga w wbudowywaniu Pi generowanego w przestrzeni perivesikularnej do wnętrza MV10,11. Aneksyny mogą uczestniczyć w wiązaniu i transporcie Ca2+ oraz w procesie biofizycznym, który inicjuje mineralizację w świetle MV12,13. Popieramy sugerowaną wcześniej hipotezę dotyczącą mineralizacji w pęcherzykach wewnątrzcytoplazmatycznych, zakładającą wewnętrzną nukleację apatytu wewnątrz MV przed jego propagacją w ECM14,15. Modelowanie in vitro potwierdziło indukcję tworzenia kompleksów Ca2+/Pi w proteoliposomach wykonanych z PS i AnxA516. Może to wskazywać, że akumulacja kompleksów Ca2+, Pi, AnxA5 i PS w tratwach lipidowych błon przypominających mikrokosmkach stanowi jądro nukleacji (NC) apatytu wewnątrz MVs. Aneksyny i TNAP posiadają również zdolność wiązania kolagenu, co może pomagać w rozmieszczaniu MV wzdłuż włókien kolagenowych oraz w stymulowaniu propagacji mineralizacji w ECM. Fetuina A i osteopontyna (OPN)17 są znane jako inhibitory tworzenia apatytu, które mogą spowalniać propagację mineralizacji na rusztowaniu kolagenowym. Nukleacja i propagacja są odrębnymi zjawiskami, przy czym pierwsze poprzedza drugie; oba mogą mieć znaczenie dla procesu patologicznej mineralizacji.

Aby odkryć, w jaki sposób chemia kompleksów fosforanu wapnia może zmieniać mineralizację fizjologiczną i zwapnienia ektopowe, konieczne jest zidentyfikowanie minerałów wytwarzanych przez komórki. Apatyty to grupa minerałów zawierających wapń i fosfor o ogólnym wzorze komórki jednostkowej kryształu Ca10(PO4)6X2, gdzie X = Cl, F, OH. Są one klasyfikowane w następujący sposób18: fluorapatyt (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatyt (CA) Ca10(PO4)6Cl2 oraz hydroksyapatyt (HA) Ca10(PO4)6(OH)2.

Wybór linii komórkowych osteoblastów do indukcji mineralizacji jest kluczowy, ponieważ każda linia wykazuje odmienny profil mineralizacji. W niniejszym raporcie porównano nukleację minerałów w dwóch wybranych ludzkich modelach mineralizacji: osteoblastycznych komórkach hFOB 1.19 oraz komórkach osteosarkomu Saos-2. Komórki pochodzące z osteosarkomu są powszechnie stosowane jako modele osteoblastyczne, a komórki Saos-2 zachowały najbardziej dojrzały charakter osteoblastyczny19, podczas gdy nieróżnicowane ludzkie płodowe komórki hFOB są szeroko wykorzystywane jako model prawidłowego różnicowania osteoblastycznego20. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą różnych metod: barwienia Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji w świetle ultrafioletowym (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), ilościowej mikroanalizy rentgenowskiej z detekcją energii (EDX) oraz mapowania jonowego. Przewagą metody TEM-EDX nad alternatywnymi technikami stosowanymi w poprzednich badaniach jest to, że dostarcza ona ilościowych i jakościowych wyników dotyczących podstawienia jonów w kryształach apatytu4,5,21. Ogólnym celem zastosowania TEM-EDX było znalezienie prostej metody obrazowania i ilościowego określania rozkładu jonów Ca, F i Cl w różnych minerałach pochodzących z różnych typów komórek na odrębnych etapach procesu mineralizacji. Metoda ta została z sukcesem zastosowana na przykład do monitorowania oddziaływań nanocząsteczek cynku z współistniejącymi substancjami chemicznymi oraz ich połączonych efektów na organizmy wodne22. W innym badaniu fotokatalizator miedziowy na materiałach tytanowych w roztworze wodnym został szczegółowo scharakteryzowany za pomocą spektrometrii emisyjnej z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-OES), fizysorpcji N2 (BET), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, spektroskopii Ramana, TEM-EDX oraz pomiarów fotoelektrochemicznych23. Naszym celem było porównanie pochodzenia i właściwości pęcherzyków oraz minerałów w dwóch liniach komórkowych, aby zrozumieć mechanizm kontrolujący mineralizację podczas różnicowania kostnego.

Schemat macierzy zewnątrzkomórkowej; transport fosforanów, anneksyny, wiązanie Ca²⁺, fosforan organiczny, TNAP.
Rysunek 1. Schemat początkowych etapów mineralizacji w komórkach kostnych, obejmujący syntezę białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz uwalnianie pęcherzyków macierzy (MV) z błony. Pęcherzyki MV gromadzą wapń dzięki działaniu białek wiążących wapń, anneksyn oraz fosforan poprzez działanie transportera fosforanu nieorganicznego (PiT), a następnie dzięki aktywności nieswoistej tkankowo fosfatazy zasadowej (TNAP), która defosforyluje PPi do Pi, ułatwiając tym samym nukleację apatytu. Następnie pęcherzyki MV ulegają rozpadowi i uwalniają apatyty do środowiska zewnątrzkomórkowego. Mineralizacja jest podtrzymywana przez stałą podaż Pi i Ca2+ w środowisku zewnątrzkomórkowym4,5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i leczenie

  1. Umieść wszystkie niezbędne materiały pod okapem z przepływem laminarnym i wysterylizuj je w świetle UV. Pożywkami hodowlanymi są: mieszanina 1:1 pożywki F12 i DMEM Hama z 2,5 mM L-glutaminą uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny, 0,3 mg/ml G418 i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v/v) dla ludzkich płodów hFOB 1,19 SV40 transfekowanych antygenem T transfekowanym antygenem T oraz pożywki McCoy's 5A z 1,5 mM L-glutaminą uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 15% FBS (v/v) dla komórek ludzkiego kostniakomięsaka Saos-2.
  2. Hodować komórki hFOB 1,19 w temperaturze 34 °C w atmosferze 5% CO2 i komórki Saos-2 w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2 . Przenieść hodowle komórkowe, komórki hFOB 1.19 lub Saos-2, z inkubatora do okapu z przepływem laminarnym i zmienić pożywkę na 10 ml świeżej pożywki hodowlanej z FBS.
  3. Inkubuj komórki bez stymulatorów (komórki w stanie spoczynku) lub stymuluj je za pomocą kwasu askorbinowego (AA) o stężeniu 50 μg/mL, a następnie 7,5 mM β-glicerofosforanu (β-GP), przygotowanego wcześniej w ultraczystej wodzie i przefiltrowanego przez filtry strzykawkowe 0,22 μm. Dodać stymulatory z plastikowych probówek do mikrowirówek na powierzchnię pożywki hodowlanej. Delikatnie wymieszaj naczynie hodowlane i inkubuj przez 7 dni.

2. Wykrywanie minerałów wapnia

  1. Przemyć kultury komórkowe roztworem soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).
  2. Dodaj 5 ml 2% (g: 100 ml) AR-S w PBS, pH 5,0 i inkubuj płytki przez 30 minut, aby zabarwić minerały.
  3. Umyj 3 razy PBS. Ostrożnie dodaj PBS do ścianki naczynia, staraj się nie niszczyć minerałów.
  4. Obserwuj minerały wapnia pod mikroskopem odwróconego światła i rób zdjęcia.

3. Wizualizacja sond w świetle UV

  1. W przypadku lizatów komórkowych należy traktować hodowle komórkowe, w stanie spoczynku lub stymulowane przez 7 dni, zgodnie z protokołem trawienia kolagenazy24.
  2. Zebrać pożywkę z kultur komórkowych i przemyć komórki PBS.
  3. Trawić komórki za pomocą 3 ml kolagenazy o stężeniu 500 U/ml w roztworze 0,25 M sacharozy, 0,12 M NaCl, 0,01 M KCl i 0,02 M buforu Tris-HCl, pH 7,45, w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  4. Mechanicznie zeskrobać komórki, przenieść je do plastikowych probówek do mikrowirówek i przepuścić 10 razy przez strzykawkę 1 ml 40 U z igłą 0,5 × 16.
  5. Odwirować próbki o masie 500 × g przez 5 minut.
  6. Odrzuć supernatant i zawieś osad komórkowy w 500 μl syntetycznej chrząstki limfatycznej (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glukozy, 63 mM sacharozy, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).
  7. Przenieś proszki hydroksyapatytu (HA), fluorapatytu (FA) i chlorapatytu (CA) z butelek na transiluminatorze UV za pomocą szpatułki i użyj jako kontroli.
  8. Przenieś lizaty komórkowe z plastikowych probówek za pomocą plastikowych końcówek i ostrożnie umieść na transiluminatorze UV.
  9. Rób zdjęcia w świetle widzialnym i UV.

4. Przygotowanie sond dla TEM-EDX

  1. Przygotowanie minerałów do barwienia ujemnego
    1. Zawiesić 2,5 mg syntetycznie wytwarzanych minerałów HA, CA i FA25 w 500 μl wody dejonizowanej i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 1 godzinę.
    2. Wyjmij siatki Formvar/Carbon 300 Mesh Ni z pudełka z kleszczami antystatycznymi, umieść na porcelanowej płytce wielodołkowej i upuść 10 μl zawiesin HA, CA i FA na kratki.
    3. Suszyć próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotowanie komórek spoczynkowych i stymulowanych do osadzania 26
    1. Zebrać pożywkę z kultur komórkowych i przemyć komórki pożywką do odczulania fizjologicznego (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glukozy, 20 mM HEPES, pH 7,4).
    2. Utrwalić komórki za pomocą 5 ml mieszaniny 3% (g: 100 ml) paraformaldehydu/1% (g: 100 ml) aldehydu glutarowego w 100 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,2 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod wyciągiem.
    3. Umyj komórki 5 ml 100 mM buforu fosforanu sodu i delikatnie usuń bufor po umyciu.
    4. W ciemnym pomieszczeniu utrwalić próbki 2 ml 1% (g: 100 ml) tetratlenku osmu w 100 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,2 przez 20 minut w temperaturze pokojowej pod wyciągiem.
    5. Usuń tetratlenek osmu i wykorzystaj go.
    6. Przemyć komórki 5 ml 100 mM buforu fosforanu sodu.
    7. Następnie odwodnić próbki w 5 ml porcji sortowanego roztworu etanolu w temperaturze pokojowej: 25% (obj.) przez 5 min, 50% (obj.) przez 10 min, 75% (obj.) przez 15 min, 90% (obj.) przez 20 min. Na koniec dwukrotnie użyj etanolu absolutnego i inkubuj przez 30 minut i 12 godzin.
    8. Mechanicznie zeskrobać komórki z plastikowych szalek do hodowli Petriego, zebrać do plastikowych probówek do mikrowirówek i odwirować próbki o masie 130 x g przez 1 minutę.
    9. Usunąć supernatanty i zawiesić komórki w 1 ml mieszaniny żywicy LR White i absolutnego etanolu w stosunku objętościowym 1:2.
    10. Przed użyciem dobrze wymieszać zawartość szklanych probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Odwirować próbki o masie 130 g przez 1 minutę.
    12. Usunąć sklarowane osady i powtórzyć poprzedni krok, używając 1 ml mieszaniny żywicy LR White i etanolu w stosunku 1:1.
    13. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    14. Odwirować próbki o masie 130 g przez 1 minutę.
    15. Usunąć supernatanty.
    16. Na koniec dwukrotnie dodać 1 ml czystej żywicy LR White do próbek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w plastikowych probówkach.
    17. Umieścić 500 μl każdej próbki w kapsułkach żelatynowych.
      UWAGA: Próbki są oznaczane za pomocą małego arkusza papieru i ołówka, aby żywica nie zniszczyła etykiet.
    18. Zamknąć kapsułki żelatynowe, umieścić je w plastikowych probówkach do mikrowirówek i wirować przy 130 x g przez 1 minutę w odchylanym wirniku.
    19. Wyjmij kapsułki z plastikowych tubek za pomocą pompy próżniowej.
    20. Przenieść próbki do pieca i polimeryzować w temperaturze 56 °C przez 48 godzin.
    21. Przygotuj klocki, montując je w uchwycie i przycinając do piramidy.
    22. Włóż uchwyt do ultramikrotomu, przymocuj diamentowy nóż Ultra 45° i napełnij go wodą dejonizowaną; pamiętaj o oczyszczeniu ostrza z przypadkowych pęcherzyków powietrza.
    23. Następnie wyciąć odcinki (700 A) za pomocą noża diamentowego na dejonizowaną łaźnię wodną.
    24. Ustaw skrawki za pomocą rzęs bydlęcych i umieść je na błyszczącej stronie siatki Ni Formvar/Carbon 300 mesh i wysusz
      25. .
    25. Przygotować octan uranylu o stężeniu 2,5% (obj.) w absolutnym etanolu w ciemności pod wyciągiem wyciągowym. Przechowuj octan uranylu w ołowianym pojemniku i pamiętaj, aby nie zbierać osadu.
    26. W ciemnym pomieszczeniu należy przebarwić siatki syntetycznych apatytów i próbek komórkowych 2,5% (obj.) octanem uranylu w etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej pod wyciągiem.
    27. Kratki umyć w 50% etanolu (obj.), następnie w wodzie dejonizowanej i suszyć w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Na koniec włóż kratki do pudełka.

5. Analiza TEM-EDX

  1. Obrazowanie TEM za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) wyposażonego w pełnozakresowy system mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX) i 11-megapikselową kamerę
    1. Przygotuj uchwyt na beryl do obserwacji minerałów i komórek. Używaj narzędzi antystatycznych.
    2. Wykręć parę i podnieś płytkę berylową i podkładkę berylową z reszty ustalacza.
    3. Zamontuj siatkę, błyszczącą stroną do góry, na uchwycie.
    4. Ostrożnie umieść podkładkę berylową i płytkę berylową i mocno dokręć mocujące.
    5. Włóż uchwyt do komory próżniowej i włącz pompę próżniową.
    6. Po uzyskaniu podciśnienia delikatnie włóż uchwyt do komory obrazowania i włącz wiązkę.
    7. Na monitorze fluorescencyjnym ustaw parametry przysłony mikroskopu. Wykonaj korekcję astygmatyzmu obrazu; Ustawianie powiększenia, ostrości i ramki; i rób zdjęcia TEM w powiększeniu 50 000X.
  2. Obrazowanie STEM i mikroanaliza rentgenowska do analizy spektralnej i składu
    1. Włóż detektor promieniowania rentgenowskiego z dyspersją energii (EDX) do komory obrazowania skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM).
    2. Dostosuj ostrość obrazu w trybie ostrości.
    3. Wykonuj zdjęcia STEM w powiększeniu 15 000x.
    4. Wybierz punkt w próbce do mikroanalizy rentgenowskiej i zbierz widma.
    5. Uzyskaj dane poprzez zsumowanie wszystkich mas atomowych wszystkich pierwiastków układu okresowego pierwiastków w próbce (jako 100%) i oznaczenie zawartości wybranych pierwiastków: Ca, F, Cl i P (jako atomowe%). Następnie oblicz stosunki Ca, F lub Cl do P dla każdej próbki.
  3. Mapowanie jonów
    1. Wybierz pierwiastki, takie jak wapń, fluor, chlor i fosfor, aby wykonać mapowanie jonów i wykonać mapy EDX wybranych pierwiastków w próbkach.
    2. Uzyskaj dane, wskazując lokalizację analizowanych pierwiastków: Ca, F, Cl i P (jako % atomowy) i oblicz kolokalizację (w %) Ca, F lub Cl z P dla każdej próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

TEM-EDX umożliwia obrazowanie in vitro pęcherzyków macierzy (MVs) uwalnianych przez komórki mineralizujące oraz minerałów produkowanych przez MVs. Wyniki uzyskane przy użyciu tej techniki wykazują, że proces mineralizacji może przebiegać w różny sposób w zależności od rodzaju komórek. Dwie linie komórkowe poddano tej samej procedurze transdyferencjacji osteoblastycznej, jednak stymulowane komórki Saos-2 mineralizowały wydajniej niż osteoblasty hFOB 1.19, co potwierdziło ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano protokoły barwienia AR-S, identyfikacji fluorapatytu światłem UV oraz obrazowania in vitro TEM-EDX MV uwalnianych przez komórki mineralizujące oraz minerałów wytwarzanych przez MV. Możliwe jest zajęcie się wszystkimi wyżej wymienionymi metodami, wykonując kilka typowych kroków rozwiązywania problemów. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, lepiej jest dodać AA (który jest kwaśny), a następnie β-GP (który jest zasadowy), ab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

MK i ASK wykonali ręczne operacje, a LB przygotował rysunki i nakręcił film. ASK napisał rękopis, LB napisał scenariusz, a MK przygotował tabelę. SM, RB i SP krytycznie czytają tabelę, scenariusz i rękopis. Autorzy pragną podziękować Hannie Chomontowskiej za doskonałą pomoc przy ultramikrotomii oraz Szymonowi Suskiemu i Henrykowi Bilskiemu za doskonałą pomoc przy analizie TEM-EDX. Autorzy dziękują dr Patrickowi Grovesowi za profesjonalną korektę języka angielskiego oraz Barbarze Sobiak za nagranie instrukcji.

Ta praca była wspierana przez grant N N401 140639 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego dla ASK, przez granty z Narodowego Centrum Nauki, Polska 2016/23/N/NZ4/03313 dla LB i 2016/23/N/NZ1/02449 dla MK, Projekt EU 7PR BIOIMAGINE: BIO-IMAGing in research INnovation and Education, GA nr 264173, oraz przez fundusze statutowe Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, Polskiej Akademii Nauk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik
szynka" s mieszanina pożywek DMEM / F12PAAE15-8131:1, dla ludzkiego płodu hFOB 1.19 SV40 transfekowane osteoblasty z dużym antygenem T (ATCC CRL-11372)
McCoy' s 5A mediumPAAE82312-0025dla ludzkich komórek kostniakomięsaka Saos-2 (ATCC HTB-85)
Mieszanina antybiotyków (penicylina / streptomycyna)SigmaP0781-100ML100 U / ml każdy
G-418Sigma681680,3 mg / ml
FBSGibco1027010% dla hFOB 1,19 i 15% dla Saos-2
AASigmaA-596050 i mikro; g/mL
ß-GPSigmaG9422-100G7,5 mM
Bio-Gel HTP GelBio-Rad130-0420dla HA
FAsyntetyzowany przez nas
CAsyntetyzowany przez nas
Bufor fosforanu sodu Na2HPO4/NaH2PO4 mieszaninaSigmaS7907/S82820,1 M, pH 7,2
PBSpH 7,0, przygotowany przez nas
AR-S w PBSSigmaA5533-25G0,5 g/100 mL, pH 5,0
Kolagenaza typu IASigmaC2674500 U/ml
buforprzygotowany przez nas
dejonizowanaprodukowana przez nas
EtanolPOChBA6480111absolut 99,8% i roztwory 25, 50, 75, 90%
octan uranylu w 50% etanoluPolysciences Inc.21447-250,25 g/10 mL
PD pH7,4, przygotowane przez nas
Mieszanina utrwalająca (paraformaldehyd / aldehyd glutarowy)Sigma158127 / G-62573%: 1%
Po utrwaleniu OsO4Sigma756331%
LR Biała żywica w etanoluPolysciences Inc.17411-MUNC 500g1:2, 1:1, 100%
acetonCHEMPUR111024800fiolki pure
Tool
CryogenicCorning Inc.4304871,2 ml
Plastikowe szalki do hodowli PetriegoFalcon353003100 mm
Probówki plastikoweFalcon352096 i 35207015 i 50 ml
Falcon i VWR357521 i 612-37001 i 10 ml
Probówki do mikrowirówek z tworzywa sztucznegoSigmaZ688312 i Z6280341,5 ml czarne i przezroczyste 2 ml
Końcówki plastikoweVWR613-0364, 613-0239 i 613-10500,1-10 i mikro; L naturalny, 1-200 i mikro; L żółty i 200-1000 &mikro; L niebieski
Stojaki plastikoweLight LabsA-7055-Z, A-7053-Czielony do probówek, pomarańczowy do mikroprobówek i niebieski do sond TEM
Laminar, Hera, SaveThermo Scientific Co.KS12(H14 zgodnie z DIN EN 1822)
Inkubatory Hera CellThermo Scientific Co.15034° C dla hFOB 1.19 i 37° C dla Saos-2
DygestoriumPOLONWCS-2do barwień TEM
Butelki szklaneSIMAX1632414501050 i 163241450110050 i 100 ml
Rurki ze szkła kwarcowegoSIMAX638422010100Ø 10 mm, L 100 mm
PompaIBS Integra BiosciencesVACUSAFE komfortdo odkurzacza
PiekarnikMemmertUNE 40056° C
Porcelanowa płytka wielodołkowaRosenthal technik229/1212 dołków
Zlewki szklaneSIMAX63241701002525 ml
Butelki szklanePocordDIN2210 ml
Pudełko plastikoweAgar Scientific Ltd.na ciemność
Snap Fit Kapsułki żelatynoweAgar Scientific Ltd.G3741rozmiar 1
Siatki Form / Carbon 300 Mesh Ni w pudełkuAgar Scientific Ltd.Folia S162N3po błyszczącej stronie
Skrobak do ogniw silikonowychSigmaSIAL0010-100EArozmiar 1,8/25 cm
Strzykawka z igłąBogMark0071 ml 40 U, igła 0,5 x 16
StrzykawkaChiranaCH005LmL
WirówkaMPW Medical InstrumentsMPW-350R130 x g i 500 x g
Transluminator UVPM-20do światła widzialnego i UV
UltramikrotomLKBNOVA700Å Sekcje
Uchwyt blokowyLKBE6711okrągły
kształt Nóż diamentowyDiATOMEUltra 45°rozmiar 3
Uchwyt nabydlęcy, przygotowany przez nas
KleszczeROTH2855.1antystatyczne do siatek
Zestaw szpatułekROTHE286.1antystatyczne do pudrów
Obrazowanie
Mikroskop światła odwróconegoZeiss z CanonAxioObserver Z1 wyposażony w PowerShot G9Kontrast fazowy, Światło przechodzące, obiektyw 20 x, filtry RGB
Transmisyjny mikroskop elektronowyTEM Jeol Co. z Oxford Instruments i SiS-OlympusJEM-1400 TEM wyposażony w pełnozakresowy system mikroanalizy rentgenowskiej INCA z dyspersją energii (EDX) i 11-megapikselowy zoom kamery MORADA G250 000X dla TEM i 15 000X dla STEM i EDX
Korpus aparatu i obiektywyNikonNikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		do nagrywania filmów
MikrofonMXL MicsTempodo nagrań głosowych
SCL Woda Pipety serologiczne Filtr HEPA Strzykawka 5 rzęsy

Bibliografia

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38 (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27 (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. , (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

P cherzyki macierzyanaliza mineralizacjikom rki hFOB 1 19barwienie alizaryn czerwonwiat o ultrafioletowemapowanie jon wnukleacja apatytu
Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.