Przedstawiamy protokół do porównywania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie linie ludzkich komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą barwienia czerwienią Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji światła ultrafioletowego (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten film przedstawia użycie transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii (TEM-EDX) do porównania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie ludzkie linie komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Te linie komórkowe, po leczeniu kwasem askorbinowym (AA) i β-glicerofosforanem (β-GP), przechodzą całkowite różnicowanie osteogenne od proliferacji do mineralizacji i wytwarzają pęcherzyki macierzy (MV), które wywołują zarodkowanie apatytu w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
Na podstawie barwienia Alizarin Red-S (AR-S) i analizy składu minerałów w lizatach komórkowych za pomocą światła ultrafioletowego (UV) lub w pęcherzykach za pomocą obrazowania TEM, a następnie kwantyfikacji EDX i mapowania jonów, możemy wywnioskować, że kostniakomięsak Saos-2 i osteoblastyczne komórki hFOB 1.19 wykazują różne profile mineralizacji. Komórki Saos-2 mineralizują się wydajniej niż komórki hFOB 1.19 i wytwarzają większe złoża mineralne, które nie są widoczne w świetle UV, ale są podobne do hydroksyapatytu (HA), ponieważ mają więcej podstawień Ca i F.
Wyniki uzyskane przy użyciu tych technik pozwalają nam stwierdzić, że proces mineralizacji różni się w zależności od typu komórki. Proponujemy, aby na poziomie komórkowym pochodzenie i właściwości pęcherzyków z góry determinowały rodzaj minerałów.
Wprowadzenie
Kość jest rodzajem tkanki łącznej składającej się z dwóch części: organicznej (komórek i włókien kolagenowych) oraz mineralnej (związków wapnia i fosforu). Głównymi składnikami mineralnymi kości są apatyty1. Różne typy komórek zdolnych do mineralizacji w kościach (osteoblasty), zębach (odontoblasty) i chrząstkach (chondrocyty) regulują początkowe etapy mineralizacji poprzez produkcję białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i uwalnianie pęcherzyków macierzy (MVs) (Rysunek 1). MVs to pęcherzyki o średnicy 100-300 nm, które gromadzą wapń i fosfor, co ułatwia nukleację apatytu, a następnie wiążą się z kolagenem
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórkowa i leczenie
- Umieść wszystkie niezbędne materiały pod okapem z przepływem laminarnym i wysterylizuj je w świetle UV. Pożywkami hodowlanymi są: mieszanina 1:1 pożywki F12 i DMEM Hama z 2,5 mM L-glutaminą uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny, 0,3 mg/ml G418 i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v/v) dla ludzkich płodów hFOB 1,19 SV40 transfekowanych antygenem T transfekowanym antygenem T oraz pożywki McCoy's 5A z 1,5 mM L-glutaminą uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 15% FBS (v/v) dla komórek ludzkiego kostniakomięsaka Saos-2.
- Hodować komórki hFOB 1,19 w temperaturze 34 °C w atmosferze ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
TEM-EDX umożliwia obrazowanie in vitro pęcherzyków macierzy (MVs) uwalnianych przez komórki mineralizujące oraz minerałów produkowanych przez MVs. Wyniki uzyskane przy użyciu tej techniki wykazują, że proces mineralizacji może przebiegać w różny sposób w zależności od rodzaju komórek. Dwie linie komórkowe poddano tej samej procedurze transdyferencjacji osteoblastycznej, jednak stymulowane komórki Saos-2 mineralizowały wydajniej niż osteoblasty hFOB 1.19, co potwierdziło .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy opisano protokoły barwienia AR-S, identyfikacji fluorapatytu światłem UV oraz obrazowania in vitro TEM-EDX MV uwalnianych przez komórki mineralizujące oraz minerałów wytwarzanych przez MV. Możliwe jest zajęcie się wszystkimi wyżej wymienionymi metodami, wykonując kilka typowych kroków rozwiązywania problemów. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, lepiej jest dodać AA (który jest kwaśny), a następnie β-GP (który jest zasadowy), ab.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.
Podziękowania
MK i ASK wykonali ręczne operacje, a LB przygotował rysunki i nakręcił film. ASK napisał rękopis, LB napisał scenariusz, a MK przygotował tabelę. SM, RB i SP krytycznie czytają tabelę, scenariusz i rękopis. Autorzy pragną podziękować Hannie Chomontowskiej za doskonałą pomoc przy ultramikrotomii oraz Szymonowi Suskiemu i Henrykowi Bilskiemu za doskonałą pomoc przy analizie TEM-EDX. Autorzy dziękują dr Patrickowi Grovesowi za profesjonalną korektę języka angielskiego oraz Barbarze Sobiak za nagranie instrukcji.
Ta praca była wspierana przez grant N N401 140639 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego dla ASK, przez granty z Narodowego Centru....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczynnik | |||
| szynka" s mieszanina pożywek DMEM / F12 | PAA | E15-813 | 1:1, dla ludzkiego płodu hFOB 1.19 SV40 transfekowane osteoblasty z dużym antygenem T (ATCC CRL-11372) |
| McCoy' s 5A medium | PAA | E82312-0025 | dla ludzkich komórek kostniakomięsaka Saos-2 (ATCC HTB-85) |
| Mieszanina antybiotyków (penicylina / streptomycyna) | Sigma | P0781-100ML | 100 U / ml każdy |
| G-418 | Sigma | 68168 | 0,3 mg / ml |
| FBS | Gibco | 10270 | 10% dla hFOB 1,19 i 15% dla Saos-2 |
| AA | Sigma | A-5960 | 50 i mikro; g/mL |
| ß-GP | Sigma | G9422-100G | 7,5 mM |
| Bio-Gel HTP Gel | Bio-Rad | 130-0420 | dla HA |
| FA | syntetyzowany przez nas | ||
| CA | syntetyzowany przez nas | ||
| Bufor fosforanu sodu Na2HPO4/NaH2PO4 mieszanina | Sigma | S7907/S8282 | 0,1 M, pH 7,2 |
| PBS | pH 7,0, przygotowany przez nas | ||
| AR-S w PBS | Sigma | A5533-25G | 0,5 g/100 mL, pH 5,0 |
| Kolagenaza typu IA | Sigma | C2674 | 500 U/ml |
| bufor | przygotowany przez nas | ||
| dejonizowana | produkowana przez nas | ||
| Etanol | POCh | BA6480111 | absolut 99,8% i roztwory 25, 50, 75, 90% |
| octan uranylu w 50% etanolu | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0,25 g/10 mL |
| PD pH | 7,4, przygotowane przez nas | ||
| Mieszanina utrwalająca (paraformaldehyd / aldehyd glutarowy) | Sigma | 158127 / G-6257 | 3%: 1% |
| Po utrwaleniu OsO4 | Sigma | 75633 | 1% |
| LR Biała żywica w etanolu | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1:2, 1:1, 100% |
| aceton | CHEMPUR | 111024800 | fiolki pure |
| Tool | |||
| Cryogenic | Corning Inc. | 430487 | 1,2 ml |
| Plastikowe szalki do hodowli Petriego | Falcon | 353003 | 100 mm |
| Probówki plastikowe | Falcon | 352096 i 352070 | 15 i 50 ml |
| Falcon i VWR | 357521 i 612-3700 | 1 i 10 ml | |
| Probówki do mikrowirówek z tworzywa sztucznego | Sigma | Z688312 i Z628034 | 1,5 ml czarne i przezroczyste 2 ml |
| Końcówki plastikowe | VWR | 613-0364, 613-0239 i 613-1050 | 0,1-10 i mikro; L naturalny, 1-200 i mikro; L żółty i 200-1000 &mikro; L niebieski |
| Stojaki plastikowe | Light Labs | A-7055-Z, A-7053-C | zielony do probówek, pomarańczowy do mikroprobówek i niebieski do sond TEM |
| Laminar, Hera, Save | Thermo Scientific Co. | KS12 | (H14 zgodnie z DIN EN 1822) |
| Inkubatory Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | 34° C dla hFOB 1.19 i 37° C dla Saos-2 |
| Dygestorium | POLON | WCS-2 | do barwień TEM |
| Butelki szklane | SIMAX | 1632414501050 i 1632414501100 | 50 i 100 ml |
| Rurki ze szkła kwarcowego | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm, L 100 mm |
| Pompa | IBS Integra Biosciences | VACUSAFE komfort | do odkurzacza |
| Piekarnik | Memmert | UNE 400 | 56° C |
| Porcelanowa płytka wielodołkowa | Rosenthal technik | 229/12 | 12 dołków |
| Zlewki szklane | SIMAX | 632417010025 | 25 ml |
| Butelki szklane | Pocord | DIN22 | 10 ml |
| Pudełko plastikowe | Agar Scientific Ltd. | na ciemność | |
| Snap Fit Kapsułki żelatynowe | Agar Scientific Ltd. | G3741 | rozmiar 1 |
| Siatki Form / Carbon 300 Mesh Ni w pudełku | Agar Scientific Ltd. | Folia S162N3 | po błyszczącej stronie |
| Skrobak do ogniw silikonowych | Sigma | SIAL0010-100EA | rozmiar 1,8/25 cm |
| Strzykawka z igłą | BogMark | 007 | 1 ml 40 U, igła 0,5 x 16 |
| Strzykawka | Chirana | CH005L | mL |
| Wirówka | MPW Medical Instruments | MPW-350R | 130 x g i 500 x g |
| Transluminator UVP | M-20 | do światła widzialnego i UV | |
| Ultramikrotom | LKB | NOVA | 700Å Sekcje |
| Uchwyt blokowy | LKB | E6711 | okrągły |
| kształt Nóż diamentowy | DiATOME | Ultra 45° | rozmiar 3 |
| Uchwyt na | bydlęcy, przygotowany przez nas | ||
| Kleszcze | ROTH | 2855.1 | antystatyczne do siatek |
| Zestaw szpatułek | ROTH | E286.1 | antystatyczne do pudrów |
| Obrazowanie | |||
| Mikroskop światła odwróconego | Zeiss z Canon | AxioObserver Z1 wyposażony w PowerShot G9 | Kontrast fazowy, Światło przechodzące, obiektyw 20 x, filtry RGB |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | TEM Jeol Co. z Oxford Instruments i SiS-Olympus | JEM-1400 TEM wyposażony w pełnozakresowy system mikroanalizy rentgenowskiej INCA z dyspersją energii (EDX) i 11-megapikselowy zoom kamery MORADA G2 | 50 000X dla TEM i 15 000X dla STEM i EDX |
| Korpus aparatu i obiektywy | Nikon | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D | do nagrywania filmów |
| Mikrofon | MXL Mics | Tempo | do nagrań głosowych |
Bibliografia
- Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
- Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
- Anderson, H. C. Matrix v....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
