Artykuł metodologiczny

Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57431

⸱

27 kwietnia 2018

 ,  , 
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół izolowania neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Po wyizolowaniu RNA jest ekstrahowane z tych komórek w celu analizy ich profilu ekspresji genów. Protokół ten pozwala na zbieranie wysokiej jakości RNA do przeprowadzania dalszych analiz, takich jak qPCR i transkryptomika.

Streszczenie

Aby uzyskać szczegółowe zrozumienie roli różnych komórek OUN podczas rozwoju lub powstawania i progresji patologii mózgu, ważne jest wyizolowanie tych komórek bez zmiany ich profilu ekspresji genów. Model danio pręgowanego zapewnia dużą liczbę transgenicznych linii ryb, w których znakowane są określone typy komórek; na przykład neurony w linii NBT:DsRed lub makrofagi/mikroglej w linii mpeg1:eGFP. Ponadto opracowano przeciwciała do barwienia określonych komórek, takich jak mikroglej, przeciwciałem 4C4.

Tutaj opisujemy izolację neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego. Kluczowym elementem tego protokołu jest unikanie enzymatycznego trawienia tkanek w temperaturze 37 °C, które mogłoby modyfikować profile komórkowe. Zamiast tego stosuje się mechaniczny system homogenizacji tkanek w temperaturze 4 °C. Protokół ten pociąga za sobą homogenizację mózgów do zawiesiny komórkowej, ich barwienie immunologiczne oraz izolację neuronów, makrofagów i mikrogleju przez FACS. Następnie wyekstrahowaliśmy RNA z tych komórek i oceniliśmy ich jakość/ilość. Udało nam się uzyskać RNA o wysokiej jakości (liczba integralności RNA (RIN) > 7) do przeprowadzenia qPCR na makrofagach/mikrogleju i neuronach oraz analizy transkryptomicznej na mikrogleju. Takie podejście umożliwia lepszą charakterystykę tych komórek, a także jaśniejsze zrozumienie ich roli w rozwoju i patologiach.

Wprowadzenie

Wiedza na temat rozwoju mózgu i chorób mózgu znacznie się poprawiła w ciągu ostatniej dekady od pierwszego oznaczania ilościowego transkryptomów mózgu myszy1. Rzeczywiście, analiza ekspresji genów w całym genomie daje nam dostęp do szczegółowych informacji genetycznych na temat tkanki mózgowej i komórek, które mogą uzupełniać i ulepszać obserwacje wykonane za pomocą innych technik i narzędzi.

Danio pręgowany jest silnym modelem biologicznym, łatwym do hodowli i modyfikacji genetycznej; jego przezroczystość optyczna w stadiach larwalnych pozwala na obserwacje obrazowania na żywo2. Niestety, w porównaniu z człowiekiem i myszem, liczba dostępnych przeciwciał do barwienia immunologicznego jest raczej niska. Aby temu zaradzić, transgeniczne linie ryb danio pręgowanego są łatwo wytwarzane przez genetycznie modyfikowane ryby w celu ekspresji białek fluorescencyjnych pod promotorami specyficznymi dla typu komórki. Transgeniczne linie danio pręgowanego były w przeszłości wykorzystywane do badania roli makrofagów i mikrogleju podczas rozwoju i choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN)3,4,5,6. Jednak, aby uzyskać szczegółowe zrozumienie tych procesów, musimy zrozumieć zmiany w ekspresji genów w poszczególnych typach komórek. W tym celu opracowaliśmy eksperymentalną metodę specyficznego izolowania komórek, takich jak neurony, makrofagi i mikroglej, od 3 do 8 dni po zapłodnieniu (dpf) larwalnych mózgów danio pręgowanego. W celu ustanowienia protokołu pracowaliśmy z transgenicznymi liniami ryb, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne (GFP) w makrofagach/mikrogleju pod promotorem genu wyrażanym przez makrofagi (mpeg1:eGFP) i DsRed w neuronach pod neuronalnym promotorem ß-tubuliny (NBT:DsRed)7,8,9. Ponadto przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne mikrogleju przy użyciu 4C4, mysiego przeciwciała monoklonalnego, które specyficznie barwi mikroglej danio pręgowanego10,11. Następnie kwas rybonukleinowy (RNA) jest ekstrahowany z tych komórek w celu dalszej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) lub analiz transkryptomu. Protokół ten został opracowany w celu skutecznej homogenizacji tkanki mózgowej z larw danio pręgowanego; pobierają neurony, makrofagi/mikroglej i mikroglej bez zmiany integralności ich błony plazmatycznej, a na koniec ekstrahują RNA z tych komórek w wysokiej jakości (RIN > 7) i ilości w celu przeprowadzenia analizy genomowej. W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanych badań, w których stosuje się leczenie trypsyną w temperaturze 37 °C do trawienia tkanki mózgowej12,13, ten protokół promuje pracę w temperaturze 4 °C do etapu ekstrakcji RNA w celu zmniejszenia modyfikacji profilu ekspresji genów. Ten krok jest kluczowy, ponieważ mikroglej i makrofagi są bardzo wrażliwymi komórkami, które natychmiast reagują na zmiany w swoim mikrośrodowisku, zmieniając profil ekspresji genów i polaryzację14,15,16.

Protokół, opisany tutaj szczegółowo, pokazuje izolację neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego, ale praktycznie można go dostosować do każdej innej komórki obecnej w mózgu - albo za pomocą transgenicznych linii rybnych, albo znakowany specyficznymi przeciwciałami. Metoda ta pozwoli na lepszą charakterystykę komórek OUN poprzez analizę ekspresji genów w całym genomie i pomoże zrozumieć ich rolę podczas rozwoju i chorób mózgu.

Protokół

1. Przygotowanie próbki i podłoża

  1. Przygotować pożywkę zarodkową (E3) rozpuszczając 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2H2O, 0,33 mM MgSO4 7H2O w H2O.
  2. Zarodki danio pręgowanego należy pobrać natychmiast po zapłodnieniu (0 dpf).
    1. Podziel zarodki danio pręgowanego na 50 na 90 mm szalki Petriego. Hodować zarodki w temperaturze 28,5 °C w 50 ml pożywki dla zarodków (E3) poddanej działaniu 200 μM 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU), od końca pierwszego dnia rozwoju (0 dpf) na czas trwania doświadczenia w celu zahamowania pigmentacji.
    2. Zmieniaj pożywkę E3 + PTU codziennie na czas trwania eksperymentu.
    3. Badanie przesiewowe larw mpeg1:eGFP i NBT:DsRed przy 2 dpf przy użyciu stereomikroskopu fluorescencyjnego w celu uzyskania dodatniej ekspresji transgenu, makrofagów/mikrogleju GFP+ i neuronów DsRed+.
  3. Przygotować wszystkie pożywki na dzień przed eksperymentem pod kapturem do hodowli tkankowych, aby uniknąć zanieczyszczenia, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C.
    1. Przygotować pożywkę A, rozpuszczając 15 mM Hepes i 25 mM D-Glucose w HBSS 1x.
    2. Przygotować podłoże o gradiencie gęstości (100%) mieszając 9 objętości podłoża o gradiencie gęstości w 1 objętości HBSS 10x.
    3. Przygotować podłoże o gradiencie gęstości (22%), rozcieńczając 22 ml podłoża o gradiencie gęstości (100%) w 88 ml DPBS 1x.
    4. Przygotuj DPBS 1x.
    5. Przygotować pożywkę E3 + trikainę, mieszając pożywkę E3 z 450 μM trikainy.

2. Homogenizacja

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze 4 °C.

  1. Dodać 1,5 ml trikainy (15 mM) do 90-milimetrowych szalek Petriego zawierających 50 larw w 50 ml pożywki zarodkowej E3 poddanej działaniu 200 μM PTU, aby je ostatecznie znieczulić.
    1. Odessać 10 znieczulonych larw z szalek Petriego za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml.
    2. Przenieś znieczulone larwy 10 na 10 na 55-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatą pożywką zarodkową E3 + trikainą.
    3. Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw 10 larw na środku szalki Petriego. Następnie przeciąć głowy larw powyżej woreczka żółtkowego za pomocą mikronożyczek chirurgicznych (z wyłączeniem pęcherza pławnego, aby uniknąć unoszących się głów).
    4. Zassać głowice z szalek Petriego za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml. Poczekaj, aż wszystkie główki zbiorą się w końcówce pipety, a następnie przenieś je do szklanego homogenizatora zawierającego 1 ml lodowatego podłoża A (przenieść w minimalnej objętości, aby zmniejszyć rozcieńczenie pożywki A przez E3 + trikaina). Trzymaj szklany homogenizator na lodzie. Użyć jednego homogenizatora na warunki doświadczalne.
    5. Wymieniaj każdą małą szalkę Petriego zawierającą lodowatą pożywkę E3 + Trikaine na nową co 30 minut, aby upewnić się, że transsekcja odbywa się w zimnym podłożu E3 + Trikaine.
    6. Wymień lodowaty nośnik A w szklanym homogenizatorze, gdy kolor zacznie blaknąć.
      nuta: Podłoże Rozcieńczenie może zmienić tkankę głowy pod wpływem zmian temperatury.
    7. Po zebraniu wszystkich głowic (600 głowic/stan) należy usunąć maksymalną objętość pożywki A ze szklanego homogenizatora i zastąpić ją 1 ml świeżej, lodowatej pożywki A.
    8. Rozbij tkankę mózgową za pomocą szczelnego szklanego homogenizatora na lodzie. Wykonaj 40 rund miażdżenia i obrotów dla larw 3-5 dpf i 50 dla larw 7 i 8 dpf.
  2. Dodaj 2 ml pożywki A do zawiesiny komórek (1 ml pożywki A / 200 głów), która rozcieńczy komórki i zmniejszy ich aglomerację mieliną, aby ułatwić ich separację podczas wirowania w pożywce o gradiencie gęstości.
    1. Aby wyeliminować aglomerację komórek, przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm umieszczone na zimnej probówce sokoła o pojemności 50 ml utrzymywanej na lodzie. Powtórz tę operację 3 razy.
    2. Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do zimnych probówek o pojemności 1,5 ml i wirować je w temperaturze 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć supernatant za pomocą 10-mililitrowej strzykawki + igły 23G x 1''.
  3. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml lodowatego podłoża o gradiencie gęstości 22%, delikatnie pokrytego 0,5 ml lodowatego DPBS 1x (nie mieszaj ich, będzie widoczna interfaza między oboma roztworami).
    1. Rurki wirujące o masie 950 g bez hamulca i z wolnym przyspieszaniem przez 30 min w temperaturze 4 °C.
      nuta: Ten etap oddziela mielinę od innych komórek poprzez sekwestrację jej na interfazie DPBS 1x i ośrodka o gradiencie gęstości 22%, podczas gdy komórki będą osadzać się na dnie probówki. Usuwanie mieliny jest bardziej skuteczne, gdy stężenie komórek nie jest zbyt wysokie.
    2. Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki + igły 23G x 1 '' odrzuć maksimum DPBS, pożywki gradientu gęstości i mieliny uwięzionej na ich interfazie.
    3. Umyj komórki 0,5 ml pożywki A + 2% normalnej surowicy koziej (NGS), a następnie wiruj probówki o wadze 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odrzucić maksimum supernatantu, a następnie zebrać wszystkie osadki komórek z tych samych warunków doświadczalnych razem w 1 ml pożywki A + 2% NGS.
  4. Jeśli interesujące komórki wyrażają białko fluorescencyjne, takie jak makrofagi/mikroglej z mpeg1:eGFP lub neurony z transgenicznych ryb NBT:DsRed (badanie przesiewowe ryb transgenicznych, patrz 1.1.3), przepuść zawiesinę komórek przez nasadkę sitka komórkowego 35 μm i przenieś je do zimnych probówek FACS o pojemności 5 ml na lodzie, chronionych przed światłem.
    nuta: Alternatywnie można przeprowadzić barwienie immunologiczne mikrogleju.

3. Barwienie immunologiczne mikrogleju

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze 4 °C.

  1. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 0,3 ml pożywki A + 2% NGS. Podziel je na 3 probówki po 1,5 ml: jedna dla niebarwionych komórek w celu pomiaru autofluorescencji z komórek będących przedmiotem zainteresowania, druga dla przeciwciała drugorzędowego (1/200) w celu zmierzenia niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego z mikroglejem, a trzecia jako test (mysie przeciwciało monoklonalne 4C4 (specyficzne dla mikrogleju) (1/20) + przeciwciało drugorzędowe (1/200)).
    1. Dodaj Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) w stężeniu 1% do komórek (wszystkie probówki), aby zablokować interakcje CD16 / CD32 z domeną Fc immunoglobulin. Inkubować komórki przez 10 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.
    2. Dodać przeciwciało 4C4 (1/20) do komórek (probówka 3) i inkubować przez 30 minut z delikatnym mieszaniem co 10 minut.
    3. Wirować probówki o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić supernatant.
    4. Umyć raz 0,5 ml pożywki A + 2% NGS, a następnie wirować probówki o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Ponownie zawiesić osad komórkowy z 0,5 ml pożywki A + 2% NGS i inkubować komórki z LEAF w stężeniu 1% przez 10 minut z delikatnym mieszaniem co 5 minut.
    6. Dodać przeciwciało drugorzędowe (1/200) do komórek (probówka 2 i 3). Inkubować komórki przez 30 minut z delikatnym mieszaniem co 10 minut i lekką ochroną.
    7. Wirować probówki o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
    8. Przemyć dwukrotnie 0,5 ml pożywki A + 2% NGS, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml pożywki A + 2% NGS.
  2. Przepuścić zawiesinę komórek przez nasadkę sitka 35 μm i przenieść je do zimnych probówek FACS o pojemności 5 ml na lodzie, chronionych przed światłem.

4. Sortowanie komórek (FACS)

Uwaga: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze 4 °C.

  1. Sortuj neurony, makrofagi/mikroglej i mikroglej za pomocą FACS.
    nuta: Ten krok jest zwykle wykonywany przez członka personelu obiektu FACS, a ustawienia zależą od rodzaju używanego sprzętu.
    1. Dodaj DAPI w stężeniu 1 μg/ml do każdej probówki FACS, aby oznaczyć martwe komórki.
    2. Skonfiguruj FACS i posortuj neurony, makrofagi/mikroglej lub mikroglej ze wszystkich komórek mózgowych. Oddziel komórki od zanieczyszczeń w zależności od ich wielkości i ziarnistości, a następnie bramkuj pojedyncze komórki przez rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne. Wyklucz martwe komórki za pomocą znakowania DAPI z żywych komórek. Identyfikuj neurony, makrofagi/mikroglej lub mikroglej na podstawie ich odpowiedniego pozytywnego barwienia.
  2. Zbierz komórki w probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml lodowatego podłoża A + 2% NGS na lodzie. Używaj różnych probówek dla każdego typu ogniwa.
    1. Wirować probówki o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić supernatant.
    2. Przemyć raz 0,5 ml pożywki A, a następnie wyrzucić maksimum supernatantu.

5. Ekstrakcja RNA

  1. Wyodrębnij RNA z różnych typów komórek oddzielonych FACS. Do ekstrakcji RNA użyj specjalnego zestawu i postępuj zgodnie z wytycznymi producenta. Upewnij się, że pracujesz w środowisku wolnym od RNazy, czyszcząc przestrzeń roboczą i pipety produktem do odkażania RNazy i używając końcówek filtrujących.
    1. Świeżo przygotować 1 ml buforu do lizy uzupełnionego 50 μM β-merkaptoetanolem.
      nuta: Tutaj dodaje się β-merkaptoetanol w celu zmniejszenia degradacji RNA.
    2. Przygotuj 70% i 80% roztwór etanolu, używając wody wolnej od RNaz.
    3. Lizuj komórki za pomocą 75 μl buforu do lizy uzupełnionego 50 μM β-merkaptoetanolem. Następnie użyj niszczarki, aby poprawić rozbijanie komórek.
    4. Kontynuować ekstrakcję RNA zgodnie z instrukcją producenta.
    5. Pod koniec protokołu należy wymyć RNA za pomocą 14 μl wody wolnej od RNazy, aby uzyskać wystarczające stężenie RNA.

Wyniki

Opisany protokół stanowi prostą metodę izolacji neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw zebrafish. Z tych wyizolowanych komórek wyekstrahowano znaczne ilości wysokiej jakości RNA (RIN > 7). Celem niniejszego protokołu jest izolacja różnych typów komórek z OUN przy minimalnej modyfikacji ich profilu ekspresji genów, aby umożliwić analizę i charakterystykę właściwości oraz funkcji komórkowych. Dlatego cały protokół jest przeprowadzany w temperaturze 4 °C z mechaniczną homogenizacją tkanki mózgowej. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w dwóch badaniach przeprowadzonych w laboratorium. W pierwszym badaniu neurony oraz makrofagi/mikroglej wyizolowano z larw mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ w 8 dpf (Rysunek 1). Metoda FACS pozwoliła na oddzielenie komórek od debris w zależności od ich wielkości (FSC-A) i ziarnistości (SSC-A) (Rysunek 1A). Następnie pojedyncze komórki oddzielono od dubletów lub aglomeratów komórkowych (Rysunek 1B). Z populacji pojedynczych komórek wyznaczono bramkę w celu wyeliminowania martwych komórek (DAPI+). Odpowiedni wykres kropkowy wykazał, że opisany protokół eksperymentalny zachowuje integralność błony plazmatycznej komórek, ponieważ odsetek martwych komórek wynosi zaledwie 26,7% (Rysunek 1C). Ostatecznie neurony (DsRed+) i makrofagi/mikroglej (GFP+) zostały łatwo wyodrębnione z bramek populacji żywych komórek. Populacja neuronów (23,1%) okazała się bardziej liczna niż populacja makrofagów/mikrogleju (1,56%) w obrębie mózgu (Rysunek 1D). Protokół ten umożliwił izolację RNA z tych komórek w celu przeprowadzenia późniejszych analiz qPCR, aby porównać ekspresję specyficznych genów między neuronami a makrofagami/mikroglejem. Rysunek 2 przedstawia jako przykład poziomy ekspresji genu proliferating cell nuclear antigen (pcna) w neuronach i makrofagach/mikrogleju w odniesieniu do genu referencyjnego β-actin.

W drugim badaniu metoda ta koncentrowała się na izolacji mikrogleju z mózgów larw w 3., 5. i 7. dniu po zapłodnieniu (dpf). W przeciwieństwie do opisanego powyżej eksperymentu, komórki izolowano poprzez immunobarwienie z użyciem 4C4, przeciwciała specyficznie znakującego mikroglej (Rycina 3 A-D). Zgodnie z wcześniejszym opisem, mikroglej (4C4+) wyselekcjonowano z żywych komórek i zebrano (Rycina 3D). Liczba komórek mikrogleju w mózgach larw danio pręgowanego jest zmienna (Tabela 1) i bardzo niska w 3. dpf (∼ 25 na rybę). Jakość i ilość RNA wyekstrahowanego z tych komórek zmierzono za pomocą systemu opartego na elektroforezie mikrokapilarnej. Wyniki uzyskane dla RNA wyekstrahowanego z mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w 5. dpf przedstawiono jako przykład analizy RNA (Tabela 1 (5 dpf; eksperyment 4)). Rycina 4 przedstawia ślad elektroforetyczny oraz jego reprezentację graficzną uzyskaną dla tej próbki, z wyraźną wizualizacją RNA rybosomalnego (28s i 18s). Dane te są niezbędne do obliczenia wskaźnika RIN próbki oraz oznaczenia stężenia RNA. Tabela 1 podsumowuje liczbę wyizolowanego mikrogleju na rybę, ilość RNA na komórkę mikrogleju oraz wynik RIN uzyskany dla każdego z różnych eksperymentów w 3., 5. i 7. dpf. Ilość i jakość RNA wyekstrahowanego z wyizolowanego mikrogleju za pomocą tej metody pozwoliły na amplifikację RNA do cDNA przy użyciu zestawu. Testy jakościowe i ilościowe przeprowadzone przez Edinburgh Genomics potwierdzają, że amplifikowany cDNA posiada wystarczającą jakość do przygotowania biblioteki i późniejszego sekwencjonowania. Rycina 5 przedstawia rozkład wielkości fragmentów cDNA oraz ich ilość zmierzoną za pomocą systemu elektroforetycznego. W tej próbce cDNA miał średnią wielkość 299bp przy stężeniu 36100 pmol/l. Tabela 2 ilustruje odpowiednio testy jakościowe i ilościowe wykonane na amplifikowanym cDNA z próbek RNA (Tabela 1 (5 dpf; eksperyment 4)). Amplifikowany cDNA został z sukcesem wykorzystany do sekwencjonowania.

Kilka badań przeprowadzonych w laboratorium potwierdziło, że jakość i ilość RNA wyekstrahowanego z neuronów, makrofagów i mikrogleju mogą być wykorzystane do późniejszych analiz qPCR oraz analizy ekspresji genów w całym genomie. W związku z tym niniejszy protokół eksperymentalny może być stosowany do wiarygodnej izolacji różnych typów komórek OUN bez naruszania integralności ich błon i przy ograniczonym wpływie na modyfikację profilu ekspresji genów.

Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej analizujące populacje komórek, schemat danych FSC/SSC i fluorescencji.
Rycina 1: Sortowanie FACS neuronów oraz makrofagów/mikrogleju z larw zebrafish mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ w 8. dniu po zapłodnieniu (dpf). (A-C) Kolejne bramkowanie pokazuje sekwencyjną selekcję wszystkich komórek mózgu (A) oraz pojedynczych komórek na podstawie rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter) (B). (C) Komórki martwe zostały wykluczone poprzez znakowanie DAPI. (D) Neurony i makrofagi/mikroglej zidentyfikowano odpowiednio na podstawie dodatniego barwienia DsRed i GFP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres względnej ekspresji β-actin, PCNA w neuronach i makrofagach wraz z wartościami p oraz danymi o krotności zmiany.
Rycina 2: Analiza ekspresji genów pcna i β-actin w neuronach oraz makrofagach/mikrogleju. RNA z wyizolowanych neuronów i makrofagów/mikrogleju można przepisać na cDNA do wykorzystania w analizie ilościowej PCR. Poziomy ekspresji mRNA pcna względem genu referencyjnego β-actin w wyizolowanych neuronach i makrofagach/mikrogleju określone za pomocą qPCR (N = 3). Krotność zmiany zmierzono metodą porównawczą (ΔΔCT). Słupki błędu reprezentują średnią ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy cytometrii przepływowej do sortowania komórek; wykresy A-D przedstawiają analizę danych FSC, SSC, DAPI oraz 4C4 dla singletów.
Rycina 3: Sortowanie FACS mikrogleju z larw zebrafish w 3. dniu po zapłodnieniu (dpf). (A-C) Kolejne bramkowania przedstawiają sekwencyjną selekcję wszystkich komórek mózgu (A) oraz pojedynczych komórek na podstawie rozpraszania światła w przód (forward scatter) i pod kątem (side scatter) (B). (C) Martwe komórki wykluczono za pomocą znakowania DAPI. (D) Mikroglej zidentyfikowano na podstawie dodatniego barwienia 4C4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik chromatografii RNA; elektroferogram, analiza integralności RNA (RIN); stężenie próbki, piki.
Rysunek 4: Wyniki mikrokapilarnej elektroforezy wyekstrahowanego RNA z mikrogleju zarodków zebrafish w 5 dpf. Dwa wysokie piki to rybosomalne RNA 18S i 28S. Wskaźnik integralności RNA (RIN) został automatycznie obliczony przez oprogramowanie bioanalizatora na podstawie wygenerowanego stosunku podjednostek rybosomalnych 18S i 28S oraz analizy całego zapisu elektroforetycznego. RNA z mikrogleju ma wartość RIN 8,6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres elektroforezy; analiza stężenia DNA; tabela danych szczytów; identyfikacja wielkości fragmentów.
Rysunek 5: Testy jakości i ilości cDNA amplifikowanego z próbki RNA mikrogleju zebrafiszki w 5 dpf. Obraz przedstawia rozkład wielkości fragmentów cDNA analizowanej próbki ze średnią wielkością 299 bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

WarunekEksperymentLiczba rybLiczba komórekLiczba komórek na rybęStężenie RNA (pg/ul)Całkowite RNA (pg)Ilość RNA na komórkę (pg)Wskaźnik RIN
3dpf17001192217.0312615120.138
3dpf26002252737.5525330360.137.9
3dpf36001868831.1525530600.167.7
3dpf46001112118.5418922680.207.8
3dpf56001558125.9713115720.108.4
3dpf66001196519.9425630720.268.2
 5dpf16005862997.7236243440.077.4
 5dpf26003251054.1834841760.138.1
 5dpf360077884129.8159471280.098.3
 5dpf46005075584.5930536600.078.6
 5dpf56004496774.9513416080.047.6
 5dpf66005103185.0516319560.047.9
7dpf160060496100.8318321960.047.6
7dpf245055517123.3718321960.047.8
7dpf360088897148.1646555800.068.1
7dpf460063008105.0135642720.078.4
7dpf53503495699.8724529400.088.1
7dpf660063887106.4834140920.067.8

Tabela 1: Podsumowanie danych dotyczących izolacji mikrogleju i ekstrakcji RNA z larw zebrafish w 3, 5 i 7 dpf.

Wewnętrzny identyfikator próbkiZewnętrzny identyfikator próbkiQubit (ng/µl)Qubit (ng/µl)Średnie stężenie (ng/µl)Objętość (µl)otrzymano μgKryterium zaliczenia/niezaliczenia dla stężenia minimalnegoZaliczenie/niezaliczenie dla ilości minimalnejZaliczenie/niezaliczenie dla zalecanej ilości
10907SD00105 dpf (eksperyment 4)58.858.458.6301.76PrzejdźPrzejdźZatwierdź
Wymagania dotyczące próbek do przygotowania biblioteki:
Przygotowanie bibliotekiMinimalna ilość (ng)Zalecana ilość (ng)Minimalne stężenie ng/µL
Biblioteka TruSeq Nano bez żelowania z insertem 350 bp z cDNA600110010

Tabela 2: Testy ilościowe amplifikowanego cDNA z próbki RNA mikrogleju zebrafish w 5 dpf.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół eksperymentalny stanowi solidną i skuteczną metodę izolowania komórek mózgowych od larw danio pręgowanego od 3 do 8 dpf. Co ważne, jest to pierwszy protokół, który pozwala na specyficzną izolację mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego. Protokół ma na celu zachowanie integralności błony komórkowej i zminimalizowanie potencjalnych modyfikacji ekspresji genów występujących podczas przetwarzania. Ten ostatni punkt ma kluczowe znaczenie dla istotności wyników opartych na analizie tych izolowanych profili genomu komórkowego. Rzeczywiście, na polaryzację mikrogleju i makrofagów duży wpływ ma ich mikrośrodowisko. W temperaturze 37 °C komórki te zmieniłyby swój profil ekspresji genów w odpowiedzi na warunki eksperymentalne (odpowiedź na uszkodzenie (przecięcie)). Dlatego tak ważne było przeprowadzenie tego eksperymentu w temperaturze 4 °C przed ekstrakcją RNA, aby spowolnić procesy komórkowe i aktywność metaboliczną. Ponadto wybrano mechaniczną homogenizację tkanki mózgowej w temperaturze 4 °C zamiast enzymatycznego trawienia tkanek w temperaturze 37 °C, aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu na profile ekspresji genów.

Należy podkreślić, że ta metoda jest bardzo szybka; w ciągu jednego dnia można wyizolować kilka populacji komórek mózgowych z co najmniej dwóch różnych warunków eksperymentalnych i wyekstrahować ich RNA. Całkowita długość protokołu zależy od liczby larw użytych do każdego stanu, ponieważ przecięcie głów larw jest etapem granicznym (∼ 350 głów/h). Ogólnie rzecz biorąc, do pracy z mikroglejem od 3, 5 i 7 dpf zaleca się transekt ∼ 600 głów na test, aby uzyskać wystarczającą ilość RNA do ekstrakcji (Tabela 1). Ponieważ mikroglej reprezentuje typ komórek o najniższej wydajności (ok. 112 komórek na głowę przy 7 dpf), liczba głów może być zmniejszona w przypadku innych typów komórek, w tym makrofagów (ok. 170 komórek na głowę przy 7 dpf).

Kolejną zaletą tego protokołu jest to, że po ustaleniu ustawień w sorterze FACS, te same ustawienia mogą być używane do różnych eksperymentów. Zaobserwowano, że populacje komórek idealnie pasują do siebie w każdym eksperymencie z wcześniej zaprojektowanymi bramkami, co pokazuje powtarzalność eksperymentów z użyciem tej metody.

Niewielką wadą tej metody jest stosunkowo niewielka ilość zbieranego RNA. Jednak to ograniczenie jest bardziej kwestią biologiczną niż techniczną, ponieważ liczba mikrogleju jest bardzo niska na wczesnych etapach rozwoju mózgu (Tabela 1). Ze względu na tak małą ilość pobranego RNA, należy rozważyć etapy amplifikacji w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów w całym genomie. Na szczęście te etapy amplifikacji wytwarzają wystarczające ilości wysokiej jakości cDNA. W ten sposób można badać globalne zmiany w profilach ekspresji genów izolowanych komórek.

Podsumowując, protokół ten zapewnia solidną metodę izolowania i badania różnych typów komórek OUN z mózgów larw danio pręgowanego. Można to zastosować w celu głębszego zrozumienia tych komórek podczas rozwoju, a także do zbadania ich roli w chorobie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Claire Davis i dr Veronique Miron (The Queen's Medical Research Institute, Edynburg, Wielka Brytania) za wstępną pomoc i dyskusję na temat eksperymentalnego podejścia i urządzenia do cytometrii przepływowej i sortowania komórek QMRI. Praca ta została wsparta nagrodą Cancer Research UK Career Establishment Award dla dr Dirka Siegera.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-fenylo 2-tiomocznik (PTU)SigmaP7629
HepesGibco15630-056
D-GlucoseSigmaG8644-100ML
HBSS 1XGibco14170-088
PercollGE Healthcare17-0891-02
HBSS 10XGibco14180-046
DPBS 1XGibco14190-094
Tricaine (MS222)SigmaA5040
Sterilin standardowe szalki Petriego 90 mmThermoFisher101VIRR
Mikronożyczki chirurgiczneFine Science Tools15000-00
3 mL Plastikowa pipeta PasteuraSLSPIP4206
Homogenizator szklanyWheaton357538
Sterilin standard 55mm szalki PetriegoThermoFisherP55V
PercollGE Healthcare17-0891-02
40 µ m Sitko do komórekFalcon352340
50 ml polipropylenowa rurka stożkowaFalcon352070
WirówkaEppendorf5804 R
10 mL StrzykawkaBD302188
Igła 23G x 1''BD300800
Normalna surowica kozia (NGS)Sygnalizacja komórkowa5425S
35 μ m Nasadka sitowa do komórekProbówki BD352235
FACSBD352063
Low Endotoksyny, bez azydków (LEAF)Biolegend101321
Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Life TechnologiesA11008
Anti-4C4Dzięki uprzejmości Catheriny Becker (University of Edinburgh)
Sortownik FACS FACSAria IIBDQMRI, FACS zakład
RNeasy Plus Micro KitQIAGEN74034
β-merkaptoetanolGibco  31350-010
QIAshredderQIAGEN79654
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725271
SuperScript III System syntezy pierwszej niciInvitrogen18080-051
LightCycler 96 System PCR w czasie rzeczywistym 
Ovation RNA-Seq System V2NuGEN7102-32
Odczynniki Agilent RNA 6000 PicoAgilent5067-1513
2100 BioanalizatorAgilent
RNaseZapAmbionAM9780
Roche

Bibliografia

  1. Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
  2. Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
  3. Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
  4. Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
  5. Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
  6. Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
  7. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  8. Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  9. Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
  10. Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
  11. Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
  12. Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
  13. Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
  14. Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  15. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  16. Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja m zgu rybki zebrafishizolacja neuron wizolacja makrofag wizolacja mikroglejusortowanie FACShomogenizacja mechanicznaprotok immunobarwieniafiltracja przez sitko kom rkowewirowanie w gradiencie g sto ci
Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.