Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57443

⸱

30 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Streszczenie

Decidua, znana również jako endometrium w ciąży, jest niezwykle ważną tkanką rozrodczą. Komórki dziesiętne, składające się głównie z liściastych komórek zrębu i komórek odpornościowych, są odpowiedzialne za wydzielanie czynników hormonalnych i zapalnych, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnej implantacji blastocysty, rozwoju łożyska i odgrywają rolę w inicjacji porodu w terminie i wcześniaku. Wiele powikłań ciąży może wynikać z zaburzeń równowagi między różnymi populacjami komórek składającymi się na decidua. Zmiany w proporcji określonych typów komórek dziesiętnych mogą zakłócić te kluczowe procesy i zwiększyć ryzyko wystąpienia poważnych powikłań ciąży, takich jak niepowodzenie implantacji zarodka, wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu, stan przedrzucawkowy i przedwczesny poród. Przedstawiony tutaj protokół demonstruje efektywną kosztowo i czasowo metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk donoszonych. Łącząc trawienie enzymatyczne i delikatne mechaniczne rozerwanie tkanki dziesiętnej, uzyskano wysoką wydajność komórek dziesiętnych praktycznie bez zanieczyszczenia kosmówki. Co ważne, scharakteryzowano izolowane komórki dziesiętne (komórki zrębu (55-60%), leukocyty (35%), komórki nabłonkowe (1%) lub trofoblast (0,01%) i utrzymano wysoką żywotność (80%), co potwierdzono testem wielobarwnej obrazowania metodą cytometrii przepływowej. Protokół ten jest specyficzny dla decidua parietalis i może być dostosowany do łożysk w pierwszym i drugim trymestrze ciąży. Po wyizolowaniu komórki dziesiętne mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań eksperymentalnych mających na celu zrozumienie roli różnych subpopulacji komórek dziesiętnych w powikłaniach ciąży.

Wprowadzenie

Endometrium, jedna z najbardziej aktywnych tkanek dorosłej kobiety, ulega dramatycznej przebudowie każdego cyklu menstruacyjnego w odpowiedzi na stymulację przez hormony jajnikowe, estrogen (E2) i progesteron (P4). Decidua, znana również jako endometrium w ciąży, jest krytycznie ważną tkanką rozrodczą, która powstaje pod koniec fazy poowulacyjnej w wyniku różnicowania napędzanego przez P4 po fazie proliferacyjnej z dominacją E2. Komórki dziesiętne są odpowiedzialne za wydzielanie czynników hormonalnych za pomyślne zagnieżdżenie się blastocysty oraz za rozwój interfejsu maciczno-łożyskowego w celu utrzymania matczynej tolerancji na alloprzeszczep płodu.

Dziesiętna jest wymagana do implantacji i późniejszej przebudowy dziesiętnych tętnic spiralnych. Komórki zrębu endometrium ulegają decydualizacji, pod kontrolą P4 i cAMP, w późnej fazie lutealnej cyklu miesiączkowego1. Proces ten jest inicjowany wokół naczyń krwionośnych i rozprzestrzenia się po całym zrębie, co sugeruje jego rolę w przebudowie naczyń krwionośnych i regulacji transportu leukocytów. Ta transformacja komórkowa charakteryzuje się kolistą morfologią, zwiększonym rozmiarem jądra i ekspansją szorstkiej retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego2. Dziesiętne komórki zrębu są zdolne do wytwarzania czynników parakrynnych wspomagających zagnieżdżanie się blastocyst i charakteryzują się wydzielaniem licznych hormonów (tj. prolaktyny), angiogennych czynników wzrostu, białka wiążącego insulinowy czynnik wzrostu-1 (IGFBP-1), prostaglandyn (PG) E (stymulatora wewnątrzkomórkowego cAMP), cytokin, składników macierzy zewnątrzkomórkowej i składników odżywczych niezbędnych do implantacji i rozwoju łożyska3,4, 5,6.

Populacja komórek dziesiętnych nie składa się wyłącznie z dziesiętnych komórek zrębu, ale zawiera również duże, specyficzne dla ciąży populacje leukocytów dziesiętnych. Dziesiątkowanie obejmuje przemijający miejscowy obrzęk i napływ komórek NK (Natural Killer), limfocytów T, komórek dendrytycznych i makrofagów. Największą subpopulacją leukocytów są komórki NK macicy, stanowiące około 50-70% wszystkich leukocytów matczynych naciekających decidua, które są źródłem cytokin i czynników angiogennych, które mogą pomóc w procesie decydualizacji i wzroście liczby w czasie ciąży7. Makrofagi, będące drugą co do wielkości subpopulacją komórek odpornościowych, znajdują się wokół miejsca implantacji i zwiększają się w czasie ciąży8. Są źródłem cytokin i czynników wzrostu, takich jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii (CSF-1)9, czynnik martwicy nowotworu α (TNFα)10 i prostaglandyna (PG) E11.

Przez cały okres ciąży i przed porodem, decidua jest głównym źródłem cytokin i chemokin odpowiedzialnych za aktywację obwodowych leukocytów matki i późniejszą migrację do tkanek macicy w celu zainicjowania porodu. Badania na zwierzętach wykazały, że liczne cytokin prozapalnych są regulowane w górę w decidua myszy podczas porodu, takich jak TNF-a, IL-6, IL-12 i IL-1b12. W ludzkim decidua cytokiny prozapalne IL-1b, IL-6 i IL-8 (główny chemoatraktant neutrofili) wykazują wyższą ekspresję podczas porodu w porównaniu do nieuprawiania porodu13. Te wydzielane cytokiny powodują aktywację i napływ leukocytów do tkanek dziesiętnych14; Wzrost liczby dziesiętnych makrofagów i nacieków neutrofili zarówno u człowieka, jak i szczura obserwuje się podczas porodu, przy czym naciek dziesiętny poprzedzający mięśniówkę macicy jest 4-krotnie większy, co wskazuje na kaskadę aktywacji między tymi dwiema sąsiadującymi tkankami macicy15. Te naciekające leukocyty wytwarzają PG zdolne do aktywacji synchronicznych skurczów mięśniówki macicy < sup class="xref">16, metaloproteinaz macierzy (MMP) w celu zainicjowania pęknięcia błony 17,18, a także cytokin prozapalnych w celu wzmocnienia procesu aktywacji macicy ("burza cytokinowa").

Ze względu na wiele ważnych funkcji komórek dziesiętnych, takich jak odgrywanie kluczowej roli w procesie implantacji, utrzymywanie tolerancji matki i płodu we wczesnej ciąży oraz udział w aktywacji porodu w terminie, podczas ciąży mogą powstać różne patologie. Na przykład: (1) niepłodność spowodowana nawracającym niepowodzeniem implantacji i nawracającą utratą ciąży może wynikać z niepowodzenia dojrzewania dziesiętnego; (2) wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu (IUGR) i stan przedrzucawkowy spowodowane nieprawidłowym rozwojem i dysfunkcją decidua/łożyska lub upośledzoną transformacją naczyniową w połączeniu dziesiętno-mięśniowym; a także (3) przedwczesny poród, który może wynikać z przedwczesnej aktywacji dziesiętnej.

W świetle tych poważnych zaburzeń, w połączeniu z etycznymi i praktycznymi ograniczeniami badań in vivo na ludziach, ustalenie pierwotnych ludzkich linii komórek dziesiętnych jest niezbędne do analizy in vitro w celu lepszego zrozumienia i poprawy klinicznego zarządzania powikłaniami ciąży. W związku z tym celem naszych badań było opracowanie protokołu, który pozwala na izolację ludzkich pierwotnych komórek liściastych o wysokiej wydajności i żywotności komórek, pobranych z błon płodowych łożysk donoszonych. Obecny protokół jasno opisuje efektywną czasowo i kosztowo metodę izolowania określonych podtypów komórek dziesiętnych, które mogą być wykorzystywane do różnych analiz in vitro. Charakterystyka liczebności i fenotypu subpopulacji dziesiętnych w terminie i porównanie z pierwszym lub drugim trymestrem ciąży ma kluczowe znaczenie dla określenia ich ról w czasie ciąży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Łożek pobrano od zdrowych kobiet w pełnym terminie ciąży, niebędących w fazie akcji porodowej, poddawanych planowemu cięciu cesarskiemu. Pobieranie, przetwarzanie i utylizacja próbek ludzkich odbywają się zgodnie z wytycznymi komisji etycznej Mount Sinai Hospital. Od każdej pacjentki uzyskano pisemną zgodę. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań w Mount Sinai Hospital.

1. Przygotowania

UWAGA: Wszystkie etapy muszą być przeprowadzane w dygestorium, a cały sprzęt chirurgiczny musi zostać wysterylizowany w autoklawie przed umieszczeniem w dygestorium. Wszystkie pozostałe materiały (butelki, probówki 50 mL itp.) muszą być wysterylizowane 70% roztworem etanolu. Podczas pracy z odpadami biologicznymi należy przez cały czas używać środków ochrony osobistej (fartucha laboratoryjnego, rękawiczek, związanych długich włosów itp.).

  1. Roztwór do trawienia enzymatycznego (Roztwór końcowy: 200 mL)
    1. Odmierz pipetą 180 mL HBSS-/- do zlewki o pojemności 500 mL, dodaj sterylny magnes mieszający i ustaw na mieszadle w temperaturze pokojowej.
    2. Odważ i dodaj powoli oraz sekwencyjnie do roztworu HBSS-/- następujące składniki: 20 mL FBS, 400 mg kolagenazy 2 ([stężenie końcowe] = 2 mg/mL), 20 mg inhibitora trypsyny z soi ([stężenie końcowe] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNazy 1 ([stężenie końcowe] = 0,15 mg/mL) oraz 200 mg BSA ([stężenie końcowe] = 1 mg/mL).
    3. Ustaw mieszanie na średnią prędkość i pozostaw mieszaninę do mieszania przez 10-20 min (podczas mieszania przykryć folią aluminiową lub folią parafinową).
    4. Przelej wymieszany roztwór do szklanej butelki o pojemności 250 mL za pomocą plastikowego lejka i umieść w dygestorium.
    5. Przefiltruj roztwór przez jednostkę filtracyjną z plastikową górną częścią (filtr membranowy 0,22 μm, 500 mL), rozlej po 20 mL do probówek o pojemności 50 mL (łącznie 10 probówek) i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Pożywka RPMI 1640 (2% roztwór do płukania i 10% kompletna pożywka wzrostowa)
    1. Połącz RPMI 1640 i FBS w szklanej butelce w dygestorium.
    2. W przypadku roztworu 2% FBS połącz 490 mL RPMI 1640 i 10 mL FBS.
    3. W przypadku roztworu 10% FBS połącz 450 mL RPMI 1640 i 50 mL FBS.
    4. Odmierz pipetą 500 μL normocyny do szklanej butelki o pojemności 500 mL z poprzedniego kroku zawierającej pożywkę RPMI i FBS (stok 50 mg/mL, stężenie robocze 0,05 mg/mL).
    5. Przefiltruj pożywkę przez filtr membranowy 0,22 μm i przechowuj w szklanej butelce o pojemności 500 mL w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Na 30 min przed rozpoczęciem eksperymentu umieść 20 mL zamrożonego roztworu do trawienia enzymatycznego w łaźni z kuleczkami w temperaturze 37 °C, umieść pożywki RPMI 1640 z 2% FBS i 10% FBS w łaźni z kuleczkami w temperaturze 37 °C, włącz kołyszącą łaźnię wodną i ustaw ją na 37 °C, 2 g, a wirówkę z kontrolą temperatury ustaw na 4 °C.

2. Pobieranie tkanki decydualnej z błon płodowych w terminie porodu

  1. Umieścić butelki z HBSS+/+, HBSS-/- oraz pięć probówek 50 mL w statywie pod dygestorium. Do jednej probówki pipetować 25 mL HBSS+/+.
  2. Używając dłoni w rękawiczkach, wyjąć łożysko dojrzałe z pojemnika użytego do jego transportu z bloku operacyjnego. Położyć łożysko na podkładzie chłonnym (stroną maciczną do góry) i rozłożyć błony płodowe za pomocą nożyczek i pęsety.
    1. Rozłożyć na dygestorium kilka nakładających się na siebie podkładów chłonnych.
    2. Użyć osobnego podkładu, aby obrócić łożysko tak, aby strona maciczna była skierowana do góry.
    3. Zlokalizować miejsce pęknięcia błon i wykonać nacięcia, aby umożliwić rozłożenie błony i jej płaskie ułożenie na powierzchni dygestorium.
      UWAGA: Po odciągnięciu błony od łożyska, decidua będzie skierowana stroną górną, spoczywając na warstwie chorionu, z warstwą amnionu z tyłu.
  3. Używając plastikowej skrobaczki do komórek, ostrożnie zeskrobać tkankę deciduy z chorionu i umieścić ją w probówce 50 mL zawierającej 25 mL HBSS+/+.
  4. Szkrobać błonę z umiarkowanym naciskiem. Nie należy stosować zbyt silnego nacisku, ponieważ może to doprowadzić do zanieczyszczenia chorionem. Należy zebrać również małe skrzepy krwi, ponieważ zawierają one komórki deciduy.
    Uwaga: Po pobraniu deciduy, łożysko należy zapakować do plastikowego pojemnika na odpady biologiczne i zamrozić w zamrażarce -20 °C przed odpowiednią utylizacją (zgodnie z zasadami instytucjonalnymi). Zakrwawione podkłady chłonne należy zawinąć w szczelny worek plastikowy i wyrzucić do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.

3. Płukanie i trawienie enzymatyczne tkanki decydualnej

  1. Przemyj zebrane tkanki, delikatnie potrząsając ręcznie probówką 50 mL i przepuszczając zawartość przez metalowe sito o oczkach 250 μm (250 μm, rozmiar 60 mesh) umieszczone nad sterylnym pojemnikiem na próbki (na mocz).
  2. Powtórz płukanie dwukrotnie za pomocą HBSS+/+ oraz dwukrotnie za pomocą HBSS-/-, używając nowych probówek do każdego płukania. (końcowe płukanie HBSS-/- umożliwia usunięcie wapnia i magnezu obecnych w HBSS+/+, które w przeciwnym razie zakłócałyby następujący proces trawienia enzymatycznego).
    UWAGA: Podczas etapów płukania zanieczyszczenie tkanką błony kosmicznej będzie widoczne, ponieważ tkanka decydualna ma jasnoróżowy kolor i strukturę amorficzną, podczas gdy błona kosmiczna jest biała, gęsta i włóknista. W związku z tym zanieczyszczenia błoną kosmiczną można łatwo usunąć pęsetą.
  3. Opcjonalnie, jeśli tkanka decydualna jest gruba, przenieś ją do sterylnej szalki Petriego o średnicy 10 cm i przystąp do posiekania tkanki w szalce za pomocą dwóch przeciwstawnych skalpeli.
  4. Umieść przemyte tkanki w sterylnej probówce 50 mL zawierającej 100 mg tkanki/mL roztworu do trawienia enzymatycznego (patrz: Preparaty).
    1. Jako punkt odniesienia upewnij się, że poziom tkanki decydualnej sięga oznaczenia 5-10 mL na probówce 50 mL.
    2. Użyj około 20 mL roztworu do trawienia enzymatycznego (przygotowanego w kroku 1.1), aby strawić całą decyduę zebraną z pełnej błony płodowej w terminie.
  5. Uszczelnij korek probówki folią parafinową (szczelnie zamknij probówkę i owiń folią parafinową korek oraz górną część probówki) pod dygestorium i inkubuj tkankę decydualną w temperaturze 37 °C przez 20 min w wytrząsającej kąpieli wodnej (145 rpm, 2 g).
  6. Po inkubacji usuń folię parafinową, zdezynfekuj powierzchnię probówki z strawioną tkanką 70% etanolem i przenieś ją pod wyciąg. Krótko potrząśnij probówką ręcznie.
  7. Zbierz zawiesinę komórkową przez metalowe sito (250 μm, rozmiar 60 mesh) do nowego sterylnego pojemnika na próbki. Rozcieńcz równą objętością (20 mL) pożywki RPMI + 10% FBS zawierającej 0,1% normocyny, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przejdź bezpośrednio do etapu centryfugacji 4.1.
  8. W razie potrzeby umieść pozostałą niestrawioną tkankę z powrotem w nowej probówce 50 mL z 20 mL świeżego roztworu do trawienia enzymatycznego i powtórz trawienie (20 min, 37 °C, wytrząsająca kąpiel wodna).
  9. Jeśli drugie trawienie jest konieczne, umieść pierwszą probówkę z zawiesiną komórkową na lodzie (przykryj folią parafinową, aby zachować sterylność). Powtórz kroki 3.5-3.6 i połącz obie zawiesiny komórkowe.

4. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek

  1. Odwirować zawiesinę komórkową (420 g, 4 °C, 11 min).
  2. Usunąć nadsącz i zawiesić komórki ponownie w 40 mL pożywki RPMI + 2% FBS zawierającej 0,1% normocyny („bufor piorący”).
    UWAGA: Osad komórkowy będzie luźny i galaretowaty z powodu zanieczyszczenia erytrocytami; nadsącz należy aspirować ostrożnie. Może być konieczne usunięcie górnej fazy za pomocą pipety manualnej.
  3. Powtórzyć wirowanie przy 420 g w temperaturze 4 °C przez 11 min.
  4. Ostrożnie usunąć nadsącz (zgodnie z uwagą do kroku 4.2) i zawiesić osad komórkowy ponownie w 5 mL buforu piorącego, a następnie dodać do tej samej probówki 35 mL buforu do lizy erytrocytów.
    UWAGA: Jeśli osad jest duży lub silnie zanieczyszczony krwią, można go rozdzielić do dwóch probówek na etap lizy erytrocytów, dodając 10 mL buforu piorącego i dzieląc zawiesinę równo pomiędzy dwie probówki, a następnie dodając do każdej z nich 35 mL buforu do lizy erytrocytów.
  5. Inkubować na lodzie przez 20 min. Krótko wymieszać zawartość probówki(wek) w vorteksie na początku i na końcu inkubacji w celu lizy erytrocytów.
  6. Odwirować przy 420 g przez 11 min w temperaturze 4 °C.
  7. Ostrożnie usunąć nadsącz i zawiesić osad ponownie w 40 mL buforu piorącego.
  8. Przepuścić komórki przez filtr nylonowy 70 μm w celu usunięcia agregatów komórkowych.
  9. Odwirować przy 420 g przez 11 min w temperaturze 4 °C.
  10. Usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy ponownie w 10 mL pożywki kompletnej (RPMI 10% + FBS zawierającej 0,1% normocyny).
  11. Policzyć komórki przy użyciu hemocytometru i metody wykluczania barwnika trypan blue, zgodnie z poniższym opisem:
    1. W komorze z laminarem ostrożnie pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół 3 razy w celu dokładnego wymieszania przed połączeniem z trypan blue. W probówce 1,5 mL przygotować zawiesinę komórkową rozcieńczoną 1:2 (połączyć 20 μL roztworu trypan blue i 20 μL zawiesiny komórek błony śluzowej macicy). Ostrożnie wymieszać roztwór trypan blue z komórkami, pipetując w górę i w dół kilka razy (roztwór ten nie jest sterylny).
    2. Umieścić hemocytometr na stoliku mikroskopu z nałożonym szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Hemocytometr to szkiełko mikroskopowe z naniesioną siatką tworzącą dziewięć dużych kwadratów oddzielonych potrójnymi liniami. Każdy duży kwadrat ma powierzchnię 1 mm2, a głębokość komory wynosi 0,1 mm. Zatem objętość cieczy, która może wypełnić każdy duży kwadrat, to 1 mm*1 mm*0,1 mm = 0,1 mm3 = 10-4 mL.
    3. Powoli dodać 10 μL mieszaniny trypan blue i komórek do szczeliny hemocytometru, pozwalając siłom kapilarnym rozprzestrzenić mieszaninę komórkową na całe szkiełko (zatrzymać przed całkowitym wypełnieniem wgłębienia).
    4. Obejrzeć komórki pod mikroskopem (powiększenie 10X) i policzyć wszystkie białe/zielone komórki, które wykluczają trypan blue (są to komórki żywe), w czterech dużych zewnętrznych kwadratach hemocytometru. Podczas liczenia komórek dotykających linii, liczyć tylko te, które dotykają prawej i górnej linii, pomijając te dotykające lewej i dolnej linii. Nie liczyć komórek ciemnoniebieskich; niebieski kolor wskazuje, że komórka jest martwa, ponieważ barwnik trypan blue może łatwo przenikać przez błonę plazmatyczną do cytoplazmy.
    5. Aby obliczyć liczbę żywych komórek w 1 mL zawiesiny komórkowej (X):
      Wzór na liczenie komórek, X = (całkowita liczba komórek/4) × 2 × 10 000; równanie matematyczne.
      2 = czynnik rozcieńczenia
      10 000 = współczynnik konwersji (1 mL = 1 cm3 = 10 000*0,1 mm3)
  12. Rozcieńczyć komórki błony śluzowej macicy do pożądanego stężenia końcowego w pożywce RPMI + 10% FBS (pożywka wzrostowa).
    UWAGA: W przypadku wysiewu do hodowli tkankowej, nanieść do plastikowej płytki 6-dołkowej 2*106 komórek/dołek, do plastikowej płytki 10-cm 10*106 komórek lub na szkiełko nakrywkowe 75 000 komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zweryfikować wydajność i żywotność wyizolowanych komórek, poddano je charakterystyce za pomocą dwóch metod: cytometrii przepływowej oraz immunocytochemii (ICC). Analizie poddano 4 populacje komórek; komórki zrębu w stanie decydualizacji wykryto za pomocą przeciwciała przeciwko wimentyną, markeru pan-leukocytowego CD45 użyto do identyfikacji komórek odpornościowych błony podstawnej, cytokeratyny użyto do wykrycia komórek nabłonkowych/śródbłonkowych, a na koniec cytokeratyny 7 użyto do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół demonstruje efektywną kosztowo i czasowo metodę izolowania pierwotnych komórek liściastych pobranych z błon płodowych całych ludzkich łożysk donoszonych, która jest wysoce dostępna i prosta. Powodzenie tego protokołu zależy od dwóch krytycznych czynników: (1) skuteczności zeskrobywania dziesiętnych z warstwy kosmówkowej błon płodowych oraz (2) staranności, z jaką komórki dziesiętne są traktowane przez cały protokół. Ważne jest, aby zanieczyszczenie tkanki kosmówki było kontrolowane poprzez zapewnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować darczyńcom, RCWIH BioBank oraz Mount Sinai Hospital/UHN Department of Obstetrics and Gynaecology za próbki ludzkie użyte w tym badaniu. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lye, a w szczególności dr Caroline Dunk za pomoc w opracowaniu metody. Praca ta jest wspierana przez Burroughs Welcome Fund (grant #1013759).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hank' s zbilansowany roztwór soli z wapniem i magnezemPrzygotowany w zakładzie (LTRI)
Hank' s zbilansowany roztwór soli bez wapnia i magnezuPrzygotowany w placówce (LTRI)
Wkładki na pieluchySigma-AldrichD9542
Duże nożyczki chirurgiczneAL Medical2018-12-20.
Duże kleszcze chirurgiczneFine Science Tools11000-18
Plastikowy jednorazowy skrobak do komórek (25 cm)Sarstedt83.183
250 mm (rozmiar 60 oczek) sito metaloweSigma-AldrichS1020-5EA
Jednorazowy skalpel z plastikową rączką (#21)Fisher Scientific08-927-5D
Sterylna plastikowa szalka Petriego (średnica 10 cm)Sarstedt82.1473.001
Sterylny pojemnik na próbki (kubek na mocz, 4.5 uncji)VWR25384-146
Filtr nylonowy (70 mm)VWR/Corning21008-952
Bufor do lizy erytrocytówQiagen79217
Błękit trypanowy, roztwór 0,4%Lonza17-942E
ParafilmFisher Scientific13-374-10
HemocytometrReichert1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pożywka hodowlanaInvitrogen11835-055
Płodowa surowica bydlęcaŻubr080-150
Normocin (50mg/ mL)Invivogenant-nr-1
Plastikowa górna jednostka filtracyjna (membrana 0,22 mm, 500 mL)MiliporeSCGPT05RE
Kolagenaza 2, liofilizowany proszekSigma-AldrichC6885
Inhibitor trypsyny sojowej, proszekSigma-AldrichT9003-250mg
DNaza w proszkuRoche10104159001
Albumina surowicy bydlęcej (proszek BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem - Leica DMI 6000BLeica
Obrazowanie Cytometr przepływowy - Strumień obrazu MK2Oprogramowanie Amnis
IDEAMillipore Sigma
Przeciwciało wimentyny sprzężone z APCR& Systemy DIC2105A
Przeciwciało CD45 sprzężone z APC H7BD641399
Przeciwciało cytokeratynowe sprzężone z FITCMAC Miltenyi Biotec130-080-101
Przeciwciało cytokeratyny 7 skoniugowane PerCPNovusNBP2-47941PCP
eFluor450 Utrwalany barwnik żywotnościThermo Fisher Scientific65-0863-14
Przeciwciało pierwszorzędowe VimentinSanta Cruzsc-7558
CD45 przeciwciało pierwszorzędoweDakoM0701
Przeciwciało pierwszorzędowe cytokeratynyDakoM0821
Przeciwciało pierwszorzędowe cytokeratyny 7DakoM7018
Mysz IgGSanta Cruzsc-2025
Koza IgGSanta Cruzsc-2028
Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 546InvitrogenA10036
Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 594Fisher ScientificA-11058
DAPISigma-AldrichD9542

Bibliografia

  1. Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
  2. Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidualization and relevance to menstruation. , Cambridge University press. 187-212 (1990).
  3. Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
  4. Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
  5. Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
  6. Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
  7. Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
  8. Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
  9. Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
  10. Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
  11. Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
  12. Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
  13. Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
  14. Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
  15. Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39(2011).
  16. Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
  17. Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
  18. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
  19. Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
  20. Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
  21. Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
  22. Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
  23. De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
  24. Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja kom rek b ony podstawnejtkanka b on p odowychprotok trawienia enzymatycznegoanaliza cytometrycznatest ywotno ci kom rekcharakterystyka kom rek zr buimmunologiczne markery kom rkowewalidacja za pomoc mikroskopii konfokalnejetapy przemywania przez wirowanie
Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.