Artykuł metodologiczny

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

DOI:

10.3791/57444

⸱

27 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ośrodkowym układzie nerwowym, receptor podtypu D1-alfa (Drd1α) jest najliczniejszym receptorem dopaminowym (DA), który odgrywa istotną rolę w regulacji wzrostu i rozwoju neuronów. Jednak mechanizmy leżące u podstaw nieprawidłowości receptora Drd1α pośredniczącego w reakcjach behawioralnych i modulującego funkcję pamięci roboczej są nadal niejasne. Korzystając z nowego testu hybrydyzacji RNA in situ, obecne badanie zidentyfikowało ekspresję RNA receptora dopaminy Drd1α i hydroksylazy tyrozyny (TH) z obwodów związanych z DA odpowiednio w obszarze jądra półleżącego (NAc) i regionie istoty czarnej (SNR). Ekspresja Drd1α w NAc wykazuje wzór barwienia "dyskretnej kropki". Zaobserwowano wyraźne różnice płci w ekspresji Drd1α. W przeciwieństwie do tego, TH wykazuje "zgrupowany" wzór barwienia. Jeśli chodzi o ekspresję TH, samice szczurów wykazywały wyższą ekspresję sygnału na komórkę w porównaniu z samcami. Przedstawione tu metody zapewniają nowatorską technikę hybrydyzacji in situ do badania zmian w dysfunkcji układu dopaminowego podczas progresji chorób ośrodkowego układu nerwowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja układu dopaminowego prążkowia jest zaangażowana w postęp objawów klinicznych obserwowanych w wielu chorobach neurokognitywnych. Receptory dopaminy D1 są obecne w korze przedczołowej (PFC) i obszarach prążkowia mózgu i silnie wpływają na procesy poznawcze1, w tym pamięć roboczą, przetwarzanie czasowe i zachowanie lokomotywy2,3,4,5,6,7. Wcześniejsze badania wykazały, że zmiany receptorów dopaminy D1 były związane z postępem zespołu nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD)8, objawy neurokognitywne w schizofrenii9,10 i podatność na stres11. W szczególności w schizofrenii badania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) wykazały, że zdolność wiązania receptorów dopaminy D1 w korze przedczołowej była silnie związana z deficytami poznawczymi i obecnością objawów negatywnych11. Dendrytyczny wzrost neuronów pobudzających w korze przedczołowej, regulowany przez receptor dopaminy D1, zmniejsza podatność na stres. Co więcej, knockdown receptora D1 w neuronach przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) może zwiększyć społeczną porażkę wywołaną stresem unikanie społeczne12.

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w komórce ze świeżo zamrożonymi próbkami tkanek. Obecna technika ma wiele zalet w porównaniu z metodami, które istnieją w obecnej literaturze. Po pierwsze, obecna procedura zachowuje kontekst przestrzenny i morfologiczny tkanki i została przeprowadzona na świeżo zamrożonych próbkach tkanek, dzięki czemu inne procedury wymagające świeżych, nieosadzonych tkanek mogą być łączone z obecnymi metodami. Podobne procedury w tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie pokazały, że rozdzielczość pojedynczej transkrypcji można osiągnąć przy użyciu techniki hybrydyzacji RNA in situ13. Wykrywanie RNA na poziomie pojedynczej transkrypcji zapewnia wyższą czułość na niską ekspresję liczby kopii, a także możliwość porównania ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek, której nie można osiągnąć za pomocą innych metod wykrywania kwasów nukleinowych, takich jak techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Dodatkowo, obecna metoda utrzymuje obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu dzięki wysoce specyficznym sondom RNA, które są hybrydyzowane z pojedynczymi docelowymi transkryptami RNA i sekwencyjnie wiązane kaskadą cząsteczek wzmacniających sygnał w systemie detekcji. Wreszcie, obecna technologia daje możliwość oceny wielu systemów biologicznych za pomocą zastrzeżonych sond specyficznych dla celu, zamiast ograniczać nasze badania tylko do jednej klasy markerów związanych z systemem, takich jak wykrywanie białek metodami immunohistochemicznymi.

W naszym badaniu użyliśmy tej nowej hybrydyzacji RNA in situ do oceny ekspresji receptora Drd1α w jądrze półleżącym (NAc) i ekspresji hydroksylazy tyrozynowej (TH) w istocie czarnej (SNR) zarówno samca, jak i samicy szczurów F344/N. Innowacyjna hybrydyzacja RNA in situ umożliwiła nam zbadanie mechanizmów wpływających zarówno na wychwyt DA, jak i uwalnianie DA, poprawiając naszą wiedzę na temat złożoności układu DA prążkowia. Tutaj opisujemy procedurę dla świeżo mrożonych wycinków mózgu i podajemy metody analizy danych dla różnych wzorców barwienia: "dyskretna kropka" lub "klastry".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) na Uniwersytecie Południowej Karoliny (numer federalny: A3049-01).

1. Przygotowanie świeżo zamrożonych sekcji mózgu

  1. Użyj szczepu szczurów F344/N: trzy szczury każdej płci, w wieku 13 miesięcy, masa ciała około 320 g.
  2. Dostosować stężenie sewofluranu do 5% (przedawkowanie sewofluranu). Ekspozycję na sewofluran należy kontynuować po zatrzymaniu oddechu na dodatkową minutę.
  3. Odetnij głowę szczurowi i usuń mózg.
  4. Zanurz mózg szczura w ciekłym azocie na 15 s w ciągu 5 minut od pobrania tkanek.
  5. Wyrównać temperaturę mózgu do -20 °C w kriosacie przez 1 godzinę.
  6. Wyciąć odcinki 30 μm i przenieść na szkiełka (patrz tabela materiałów).
  7. Wybierz sekcje z obszaru jądra półleżącego, około 2,76 mm do 2,28 mm przed Bregma14.
  8. Nieprzerwanie przecinaj mózg szczura od opuszki węchowej przez obszar jądra półleżącego zgodnie ze stereotaktyczną strukturą mózgu szczura.
  9. Zamontuj próbki na szkiełkach. Przechowywać sekcje w temperaturze -20 °C przez 10 minut do wyschnięcia.
  10. Preparaty należy natychmiast zanurzyć we wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  11. Umieść szkiełka w rosnącym gradiencie etanolu w temperaturze pokojowej (RT): 50% EtOH przez 5 min; 70% EtOH przez 5 min; i 100% EtOH przez 5 min.
  12. Powtórz ze świeżym 100% EtOH.
  13. Umieść szkiełka na chłonnym papierze i wysusz na powietrzu.
  14. Narysuj barierę wokół każdej sekcji za pomocą pisaka barierowego (patrz Tabela materiałów). Pozostaw barierę do całkowitego wyschnięcia na 1 minutę.

2. Wstępne leczenie wycinków mózgu

  1. Włącz piekarnik i ustaw temperaturę na 40 °C.
  2. Dodać 3 krople (90 μl) odczynnika Pretreatment 4 (patrz tabela materiałów) na każdą sekcję mózgu (po jednej sekcji na szkiełku).
  3. Inkubować sekcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zanurz szkiełka w 1x PBS na 1 minutę przy RT. Powtórz ze świeżymi 1x PBS.
    UWAGA: Slajdy nie powinny pozostawać w 1x PBS dłużej niż 15 minut.

3. Test multipleksowy fluorescencyjny RNA in situ

  1. Podgrzewać sondę docelową przez 10 minut w temperaturze 40 °C w łaźni wodnej, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
  2. Umieść odczynnik RNA (np. Amp 1-4 FL) w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń nadmiar płynu z szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).
  4. Dodać 3 krople (90 μl) sondy Drd1α (C1) na wycinek próbki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 40 °C.
  5. Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do płukania.
  6. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).
  7. Dodać 3 krople (90 μl) Amp 1-FL na wycinek próbki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
  8. Zanurz szkiełka w 1 buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym buforem 1wash.
  9. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).
  10. Dodać 3 krople (90 μl) Amp 2-FL na wycinek próbki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
  11. Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do płukania.
  12. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).
  13. Dodać 3 krople (90 μl) Amp 3-FL na próbkę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
  14. Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do mycia.
  15. Usuń nadmiar płynu ze szkiełek za pomocą chłonnego papieru i umieść z powrotem na stojaku na szkiełka (patrz Tabela materiałów).
  16. Dodaj 3 krople (90 μl) Amp 4-FL-Alt A na wycinek próbki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
  17. Zanurz szkiełka w 1x buforze do płukania na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ze świeżym 1x buforem do płukania.
  18. Usuń nadmiar płynu z szkiełek i natychmiast umieść 2 krople odczynnika montażowego (patrz Tabela materiałów) na każdą sekcję.
  19. Umieścić szkiełko nakrywkowe o grubości 22 mm i średnicy 22 mm (patrz Tabela materiałów) na każdym fragmencie mózgu.
  20. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C do czasu wyschnięcia.
  21. Włącz mikroskop konfokalny i przełącz się na obiektyw 60X.
  22. Uzyskaj obrazy stosu Z za pomocą mikroskopu konfokalnego. Zobacz film dodatkowy, aby zapoznać się ze szczegółową procedurą obrazowania konfokalnego.
  23. Uzyskaj obrazy komórek znakowanych Drd1α w regionie jądra półleżącego (wzbudzenie: 488 nm; Emisja: 515/30 nm).
    UWAGA: Nie pozwól, aby sekcje mózgu wyschły między etapami inkubacji.

4. Analiza danych

  1. Półilościowo przeanalizuj wzór barwienia: "dyskretne kropki".
    1. Aby zidentyfikować pojedynczą komórkę na obrazie, wykonaj barwienie DAPI jako marker jądrowy. Jednak nadal trudno jest analizować niektóre części tkanki mózgowej, ponieważ ma ona wiele typów komórek o nieregularnym kształcie jąder i / lub komórek. Tutaj dwóch doświadczonych badaczy osobno przypisuje każdą komórkę z obrazów, aby zdefiniować region komórki.
    2. Wizualnie oceń każdą komórkę w reprezentatywnych obrazach konfokalnych na podstawie liczby punktów na komórkę, korzystając z określonych kryteriów (Rysunek 1B).
    3. Określ całkowitą liczbę komórek w każdej kategorii i podziel przez całkowitą liczbę komórek x100, aby utworzyć względne wykresy częstości, które wyświetlają procentową częstość komórek w każdej kategorii dla wszystkich sekcji tkanek (Rysunek 2A) oraz osobno dla mężczyzn i kobiet (Rysunek 2E).
    4. Podziel sumę komórek we wszystkich poprzednich kategoriach przez całkowitą liczbę komórek x100, aby określić skumulowaną częstość komórek dla wszystkich odcinków tkanki (Rysunek 2B) oraz osobno dla mężczyzn i kobiet ( Rysunek 2F).
  2. Przeanalizuj statystycznie wzór barwienia "dyskretne kropki" (opcjonalnie).
    1. Zbadaj liczbę kropek na komórkę, aby uzyskać zmienną jakościową, która ma charakter porządkowy (tj. liczbę komórek, które mieszczą się w każdej kategorii rangi od najniższego wyrażenia komórki (1) do najwyższej ekspresji komórki (9)) w celu dalszych analiz statystycznych.
    2. Po zapoznaniu się ze statystykami opisowymi zastosuj trzy główne podejścia: statystykę Mantela-Haenszela, test U Manna-Whitneya i test Kruskala-Wallisa. Chociaż dokładne podejście statystyczne będzie zależało od projektu eksperymentu i interesującego nas pytania badawczego, statystyczne drzewo decyzyjne (Rysunek 4) może pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących podejścia analitycznego.
  3. Określ ilościowo intensywność sygnału w obszarze zainteresowania (ROI) dla wzoru barwienia: "klastry".
    1. Oblicz intensywność sygnału każdego obrazu, korzystając z następującego równania:
      Intensywność sygnału = Całkowita intensywność obrazu ROI - (Średnia intensywność tła × Całkowita powierzchnia obrazu)
    2. Policz całkowitą liczbę komórek na obrazie ROI, aby obliczyć przybliżone wyrażenie sygnału na komórkę. Różnice grupowe w intensywności sygnału/obrazie, a także liczbie komórek/obrazu mogą być interesujące w celu rozważenia mechanizmów, które mogą przyczyniać się do różnic grupowych obserwowanych w ekspresji sygnału/komórce (Rysunek 3B-3D).
  4. Przeanalizuj statystycznie wzór barwienia "klastrów" (opcjonalnie).
    1. Zbadaj wyrażenie/komórkę sygnału, aby zapewnić zmienną ciągłą do dalszej analizy statystycznej. Zastosuj dwa podejścia, w tym test t dla niezależnej próby i analizę wariancji (ANOVA), w oparciu o liczbę czynników międzyobiektowych uwzględnionych w projekcie. Statystyczne drzewo decyzyjne (Rysunek 4) może pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących najbardziej odpowiedniego podejścia statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne badanie zaobserwowało "dyskretne kropki" wzorca barwienia ekspresji RNA w receptorach dopaminowych D1-alfa (Drd1α) NAc u szczurów F344/N (Rysunek 1A). Poszczególne sygnały fluorescencyjne były łatwe do zidentyfikowania i mogą być postrzegane jako pojedyncze "kropki", z których każda reprezentuje pojedynczy transkrypt RNA w komórce. W przypadku obrazów z NAc, które pokazują wzór barwienia "dyskretne kropki", oceniliśmy dynamiczny zakres ekspresji za pomocą analiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę hybrydyzacji in situ dla świeżo mrożonych wycinków mózgu w celu oceny ekspresji receptora Drd1α w jądrze półleżącym (NAc) i ekspresji hydroksylazy tyrozynowej (TH) w regionie istoty czarnej (SNR). Udostępniamy również metody analizy danych dla różnych wzorów barwienia: "dyskretna kropka" lub "klastry".

Uwzględniono kluczowe etapy udanego testu hybrydyzacji multipleksowego fluorescencyjnego RNA in situ . Po odcięciu głowy szczurowi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne prace były wspierane przez granty National Institutes of Health (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 i NS100624. Częściowe finansowanie pochodziło z grantu szkoleniowego NIH T32 w zakresie nauk biomedyczno-behawioralnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System HybEZ OvenZaawansowana diagnostyka komórek 310010
Sonda RNAscope - Zaawansowana diagnostyka komórkowa Rn-DRD1a 317031Kanał koloru 1, zielona
sonda RNAscope - Zaawansowana diagnostyka komórek Rn-Th-C2 314651-C2Kanał koloru 2, pomarańczowy
zestaw odczynników fluorescencyjnych RNAscopeZaawansowane diagnostyki komórek 320850
ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowyVector LaboratoryH-4000
Prowadnice SuperFrost PlusFisher Scientific12-550-154% 
4% paraformaldehydSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek pionowy stojak na 24 prowadnice FisherScientificNC9837976
Naczynie do barwienia Tissue-TekFisher ScientificNC0731403
Precyzyjne wanny ogólnego przeznaczeniaThermoFisher ScientificTSGP28
Obróbka wstępna 4Zaawansowana diagnostyka komórkowa 320850części zestawów
Odczynnik zapobiegający blaknięciu ProLong GoldLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLZaawansowana diagnostyka komórek 320850części zestawów
Amp 2-FLZaawansowana diagnostyka komórek 320850części zestawów
Amp 3-FLZaawansowana diagnostyka komórek 320850części zestawów
Amp 4-FL-Alt A Zaawansowana diagnostykakomórek 320850części zestawów
Pakiet oprogramowania EZ-C1Nikon Instrumentswersja 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,wersja 9.4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hybrydyzacja in situ RNAmikroskopia konfokalnar nice mi dzy p ciamihydroksylaza tyrozynowao rodkowy uk ad nerwowyobrazowanie fluorescencyjneanaliza stosu Ztest U Manna Whitneya

Powiązane artykuły