Artykuł metodologiczny

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57447

⸱

12 lipca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 4Center for Lung Biology, University of South Alabama

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano proste metody demonstrowania produkcji cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa.

Streszczenie

Pacjenci, którzy przeżyli zapalenie płuc, mają podwyższone wskaźniki śmiertelności w miesiącach następujących po wypisaniu ze szpitala. Postawiono hipotezę, że zakażenie tkanki płucnej podczas zapalenia płuc powoduje wytwarzanie długożyciowych cytotoksyn, które mogą prowadzić do późniejszej niewydolności narządów końcowych. Opracowaliśmy testy in vitro, aby przetestować hipotezę, że cytotoksyny są wytwarzane podczas infekcji płuc. Jako systemy modelowe wykorzystuje się izolowane komórki śródbłonka płuc szczura i bakterię Pseudomonas aeruginosa, a wytwarzanie cytoksyn po zakażeniu komórek śródbłonka przez bakterie wykazano za pomocą hodowli komórkowej, a następnie bezpośredniej oceny ilościowej przy użyciu testów dehydrogenazy mleczanowej i nowatorskiej metody mikroskopowej wykorzystującej technologię ImageJ. Amyloidowy charakter tych cytotoksyn wykazano za pomocą testów wiązania tioflawiny T oraz przez immunoblotting i immunodepletion przy użyciu przeciwciała antyamyloidowego A11. Dalsze analizy z wykorzystaniem immunoblottingu wykazały, że oligomeryczne tau i Aβ są wytwarzane i uwalniane przez komórki śródbłonka po zakażeniu przez P. aeruginosa. Metody te powinny być łatwe do dostosowania do analiz próbek klinicznych pobranych od ludzi.

Wprowadzenie

Pacjenci, którzy przeżyli zapalenie płuc, mają podwyższone wskaźniki śmiertelności w miesiącach następujących po wypisaniu ze szpitala1,2,3,4,5,6. W większości przypadków śmierć następuje z powodu pewnego rodzaju niewydolności narządów końcowych, w tym zdarzeń nerkowych, płucnych, sercowych lub wątrobowych, a także udaru mózgu5,6. Przyczyna podwyższonej śmiertelności w tej populacji pacjentów nigdy nie została ustalona.

Zapalenie płuc jest klasyfikowane jako nabyte przez społeczność lub szpitalne (szpitalne), a czynniki, które mogą powodować zapalenie płuc to bakterie, wirusy, grzyby i chemikalia. Jedną z głównych przyczyn szpitalnego zapalenia płuc jest bakteria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa jest organizmem Gram-ujemnym, który wykorzystuje system wydzielania typu III do przenoszenia różnych cząsteczek efektorowych, zwanych egzoenzymami, bezpośrednio do cytoplazmy komórek docelowych7,8. Podczas infekcji komórek śródbłonka płuc egzoenzymy atakują różne białka wewnątrzkomórkowe, w tym śródbłonkową formę białka związanego z mikrotubulami tau9,10,11,12, prowadząc do uszkodzenia bariery śródbłonkowej, co skutkuje poważnym obrzękiem płuc, pogorszeniem czynności płuc i często śmiercią.

Jak wspomniano wcześniej, pacjenci, którzy przeżyli początkowe zapalenie płuc, mają podwyższone wskaźniki śmiertelności w ciągu pierwszych 12 miesięcy po wypisaniu ze szpitala. Potencjalnym mechanizmem wyjaśniającym to zjawisko jest to, że podczas początkowej infekcji generowany jest pewien rodzaj długotrwałej toksyny, która prowadzi do złego długoterminowego wyniku. Dwie obserwacje potwierdzają tę możliwość. Po pierwsze, hodowane komórki śródbłonka płucnego, które są początkowo leczone P. aeruginosa, nie rozmnażają się przez okres do tygodnia po zabiciu bakterii przez antybiotyki13. Po drugie, długowieczne priony i czynniki o cechach prionowych zostały wykazane w różnych chorobach ludzi i zwierząt, w szczególności w chorobach związanych z układem nerwowym14,15.

Metody badania potencjalnej produkcji długożyciowych czynników cytotoksycznych podczas infekcji płuc nigdy nie zostały opisane. W tym miejscu przedstawiono szereg prostych testów in vitro, które można wykorzystać do zbadania produkcji i aktywności cytotoksyny po zakażeniu przy użyciu powszechnego czynnika wywołującego zapalenie płuc, P. aeruginosa. Testy te powinny być łatwo przystosowane do badania możliwej indukcji cytotoksyny po zakażeniu przy użyciu innych czynników wywołujących zapalenie płuc, a supernatanty, które są wytwarzane, powinny być również przydatne do badania wpływu cytotoksyn na całe narządy lub zwierzęta. Wreszcie, przedstawione tutaj testy, najprawdopodobniej będą mogły zostać przystosowane do testowania zwierzęcych i ludzkich płynów biologicznych pod kątem produkcji cytotoksyn podczas zapalenia płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Południowej Alabamy i zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi przepisami federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Pierwotne hodowle komórek mikronaczyniowego śródbłonka płuc szczurów (PMVEC) uzyskano z Cell Culture Core Facility w Centrum Biologii Płuc Uniwersytetu Południowej Alabamy. Komórki zostały przygotowane przy użyciu wcześniej opisanych procedur16.

1. Wytwarzanie cytotoksycznych supernatantów

Uwaga: Tutaj używamy dwóch różnych szczepów P. aeruginosa: PA103, który ma nienaruszony system wydzielania typu III zdolny do przenoszenia egzoenzymów ExoU i ExoT do komórek docelowych podczas infekcji, oraz ∆PcrV, który nie ma systemu wydzielania typu III i nie jest zdolny do przenoszenia egzoenzymów do komórek docelowych po inokulacji.

  1. Nanieś bakterie na płytki agarowe Vogel-Bonner (VB)17 i rozwijaj się przez noc w temperaturze 37 °C.
    1. Aby przygotować płytki, przygotuj następujący roztwór podstawowy (sole Vogela-Bonnera; 10x bulion): odmierz 2 gMgSO4, 20 g kwasu cytrynowego (wolnego kwasu), 100 gK2PO4 i 35 g NaH2PO4. Dodać ddH2O do 1 L i sterylizować w autoklawie przez 15 minut z powolnym wydechem.
    2. Umieścić 7,5 g agaru w 450 ml ddH2O i autoklaw jak powyżej.
    3. Po sterylizacji w autoklawie umieścić oba roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C do ostygnięcia.
    4. Dodaj 50 ml 10x roztworu soli podstawowej VB do agaru.
    5. Dodać karbenicylinę do 400 μg/ml (dla stosowanych szczepów P. aeruginosa) i dobrze wymieszać, obracając kolbą.
    6. Umieścić 5 ml roztworu agaru VB w indywidualnych sterylnych szalkach hodowlanych, pozostawić agar do zestalenia się, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia wysiewu bakterii.
    7. W dniu wysiewu bakterii należy podgrzać płytkę do temperatury 37 °C, a następnie rozprowadzić bakterie na szalce za pomocą sterylnej pętli. Umieścić płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  2. Sprawdzić czystość PMVEC poprzez barwienie dodatnie lektyną Griffonia simplicifolia i barwienie ujemne fluorescencyjną lektyną Helix pomatia (marker komórek śródbłonka tętnic). Podwielokrotne komórki i zamrozić w ciekłym azocie.
  3. Do eksperymentów utrzymuj komórki w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 . Użyj komórek w przejściach od 5 do 15.
    1. W celu wytworzenia cytotoksycznych supernatantów, umieść 2 x 106 komórek na pojedynczych szalkach o długości 150 cm i hoduj przez 3 - 4 dni, aż do osiągnięcia konfluencji. Użyj dwóch płytek na eksperyment (patrz poniżej).
    2. Do analizy cytotoksycznych supernatantów należy umieścić 1 x 105 komórek w pojedynczych dołkach 6-dołkowej płytki i rosnąć przez cztery dni, aż do osiągnięcia konfluencji.
  4. Aby wytworzyć supernatant, umyj jedną z dwóch 150 cm naczyń PMVEC z kroku 1.3.1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, poddaj ją trypsynizacji, a następnie policz komórki (używamy automatycznego licznika komórek i postępujemy zgodnie z protokołem producenta; patrz Tabela materiałów). Umyj drugie naczynie PMVEC zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS), a następnie zainfekuj dowolnym szczepem P. aeruginosa przy wielokrotności infekcji (MOI) 20:1. Osiąga się to w następujący sposób:
    1. Dla P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 jtk/ml. Aby przygotować to rozcieńczenie, dodaj 1 ml HBSS do jednorazowej kuwety o pojemności 1 ml. Zeskrobać wystarczającą ilość bakterii z płytki, która została przygotowana w kroku 1.1, aż do osiągnięcia OD540 wynoszącego 0,25 podczas pomiaru za pomocą spektrofotometru. Następnym krokiem będzie obliczenie, ile bakterii będzie potrzebnych.
    2. Po ustaleniu liczby PMVEC w szalce hodowlanej (krok 1.4 powyżej), należy określić odpowiednią liczbę bakterii, które należy dodać do drugiej, nietrypsynizowanej szalki hodowlanej zawierającej PMVEC. Na przykład, jeśli ustalono, że naczynie hodowlane PMVEC zawiera 1,3 x 107 komórek, należy przygotować 1,3 x 107 komórek x 20 bakterii/komórkę x 1 ml / 2 x 108 CFU = 1,3 ml bakterii.
    3. Rozcieńczyć 1,3 ml bakterii w HBSS do końcowej objętości 20 ml, tak aby cała powierzchnia naczynia o długości 150 cm mogła być pokryta płynem, a następnie dodać rozcieńczone bakterie do płytki PMVEC.
    4. Inkubować PMVEC zaszczepione bakteriami w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 4 - 5 godzin, aż będzie można zobaczyć przerwy tworzące się w monowarstwie komórki, gdy płytka jest obserwowana pod mikroskopem (patrz rysunek 1 w celu uzyskania prawidłowego poziomu tworzenia luki).
    5. Zebrać supernatant, a następnie odwirować przez 10 minut przy 2 000 x g w wirówce stołowej w celu usunięcia resztek komórkowych.
      Uwaga: Na tym etapie można użyć dowolnej wirówki stołowej zdolnej do wytworzenia siły g wystarczającej do osadzania niezlizanych komórek i dużych fragmentów komórek.
    6. Wlej supernatant do strzykawki z filtrem 0,2 μm przymocowanym do jej końca, a następnie przepuść supernatant przez filtr w celu usunięcia bakterii.
    7. Użyć podwielokrotności sterylnego supernatantu do zbadania cytotoksyczności (patrz 2.1) i zamrozić resztę supernatantu w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Analiza cytotoksycznych supernatantów

  1. Test cytotoksyczności
    1. Hoduj PMVEC w 6-dołkowych naczyniach aż do konfluencji. Umyj studzienki raz HBSS, a następnie dodaj 1,5 ml supernatantu wysterylizowanego filtrem (zebranego z komórek zaszczepionych PA103 lub ∆PcrV) do poszczególnych studzienek. Dodaj sterylny HBSS do innego dołka jako kontrolę ujemną.
    2. Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 na 21 - 24 godziny, a następnie obserwować pod kątem zabijania komórek/cytotoksyczności (patrz następny krok). Do dalszych eksperymentów należy używać supernatantów, które wykazują cytotoksyczność, i odrzucać te, które nie wykazują zabijania komórek.
    3. Kwantyfikacja zabijania komórek
      1. Zmierz uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) z martwych komórek przy użyciu dostępnych na rynku zestawów testowych LDH i procedur zalecanych przez producenta.
      2. Alternatywnie, określ ilościowo zabijanie komórek pod mikroskopem za pomocą oprogramowania ImageJ. W tym celu należy zarejestrować obrazy mikroskopowe i obszary szalki hodowlanej zawierające nienaruszone komórki, a następnie określić ilościowo regiony pozbawione komórek (wskazujące na śmierć komórki w monowarstwie) za pomocą niestandardowego makra ImageJ (National Institutes of Health) (patrz Dodatkowy plik kodowania). W razie potrzeby wykonaj kroki makr ręcznie w następujący sposób:
        1. Wprowadź obrazy (w formacie RGB lub Tiff) do makro i dostosuj kontrast do 15% nasyconych pikseli. Zduplikuj obrazy o dostosowanym kontraście i wykonaj polecenie "odejmij tło", aby uzyskać obraz o wysokim kontraście zarówno komórki, jak i obszaru przerwy w polu widzenia.
        2. Odejmij ten obraz od oryginalnego obrazu i połącz wynikowy obraz z oryginalnym obrazem za pomocą funkcji "AND" kalkulatora obrazów. Przekonwertuj wynikowy obraz na czarną (przerwy) i białą (komórki) maskę z funkcją progu (minimum 0, maksimum 5) i użyj funkcji "erozji binarnej", aby usunąć szum z obrazu.
        3. Zmierz stosunek czarnych do białych pikseli w wynikowym obrazie za pomocą pomiaru "ułamka powierzchniowego". Wykreśl i wyraź obszary ułamkowe dla każdego punktu czasowego leczenia jako procent maksymalnej powierzchni przerwy.
        4. Oblicz średnie i porównaj przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z testem post hoc Tukeya, gdzie wartości p są mniejsze niż 0,05 uważane za istotne.
    4. Użyj analizy immunoblot, aby ustalić obecność amyloidu, oligomerycznego tau i Aβ w supernatantach hodowli. Analizę immunoblot należy przeprowadzić przy użyciu standardowych procedur10,11,12, z wyjątkiem co najmniej 10-krotnego zagęszczenia supernatantów hodowlanych przed elektroforezą.
      1. Aby zagęścić supernatant, należy umieścić 1 - 2 ml supernatantu w jednostce filtrującej wirówki, której membrana ma odciętą masę cząsteczkową 10 kDa. Następnie umieść jednostkę filtrującą w wirówce stołowej i odwiruj przy 2 000 x g, aż do osiągnięcia wymaganego stopnia stężenia (zwykle 45 - 60 min).
      2. Określić ilość białka w skoncentrowanym supernatant11 i załadować równe ilości próbek do poszczególnych dołków żelu.
      3. Uruchom żele, przenieś białka do nitrocelulozy, a następnie zbadaj blot przeciwciałem anty-amyloidowym A11, antyoligomerycznym przeciwciałem tau T22 lub przeciwciałem anty-Aβ MOAB2, a następnie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi. Rozwiń bloty przy użyciu standardowych procedur chemiluminescencyjnych.
    5. Aby wykonać test tioflawiny T, użyj fluorescencji tioflawiny T (ThT) do ilościowego określenia amyloidów w supernatantach. Do tych pomiarów należy używać supernatantów sterylizowanych filtrem.
      1. Przygotować roztwór podstawowy (50x) tioflawiny T, zawieszając 8 mg tioflawiny T (ThT) w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po wymieszaniu przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia cząstek stałych.
      2. W przypadku pomiarów dodaj 20 μl materiału ThT do 1 ml PBS w kuwecie spektrofotometru o pojemności 1 ml. Umieścić rozcieńczoną próbkę w spektrofluorymetrze.
      3. Zmierzyć podstawową emisję fluorescencji za pomocą wzbudzenia 425 nm i skanować emisję fluorescencji w zakresie 450-575 nm w krokach co 2 nm.
      4. Wykonaj skan poklatkowy przy użyciu wzbudzenia 425 nm i emisji 482 nm, z danymi zbieranymi co 0,2 s przez 60 s.
      5. Początkowe 20 s skanu poklatkowego mierzy fluorescencję w ślepej kuwecie. Po 20 s przerwij skanowanie i dodaj 10 μl supernatantu wysterylizowanego przez filtr do kuwety. Wymieszaj kuwetę przez odwrócenie, a następnie umieść z powrotem w spektrofluorymetrze.
      6. Wznów skanowanie na podstawie czasu, uzyskując ostatnie 40 s danych.
      7. Po zakończeniu skanowania poklatkowego należy wykonać końcowe skanowanie widma emisji fluorescencji przy użyciu identycznych ustawień, jak opisano w ppkt 2.1.5.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowano prosty test in vitro w celu oznaczenia obecności cytotoksyn w nadsączach z komórek zainfekowanych bakterią P. aeruginosa. W zasadzie po 4 h od dodania bakterii pobiera się pożywkę hodowlaną z zainfekowanych komórek, bakterie usuwa się poprzez sterylizację nadsączu hodowlanego za pomocą filtra, a następnie sterylny nadsącz dodaje się do nowej populacji komórek. Komórki obserwuje się po 21–24 h od dodania nadsączu, a następnie kwantyfikuje obumieranie komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiono proste metody in vitro , które pozwalają wykazać wytwarzanie cytotoksycznych amyloidów podczas zakażenia organizmem wywołującym zapalenie płuc. Metody te obejmują test cytotoksyczności hodowli komórkowej, immunoblotting, ocenę ilościową zabijania komórek przy użyciu nowatorskiej metody mikroskopowej oraz wiązanie ThT. Analizy czynników cytotoksycznych wykazały, że mają one charakter amyloidowy (ryc. 2 i ryc. 4) i wykazują ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak do zgłoszenia.

Podziękowania

To badanie zostało częściowo sfinansowane z grantów NIH HL66299 dla TS, RB i SL, HL60024 dla TS, a HL136869 dla MF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Królicze przeciwciało anty beta amyloidThermo71-5800
A11 Przeciwciało oligomerowe amyloiduStressMarqSPC-506D
T22 przeciwciało anty-tau oligomeroweEMD MilliporeABN454
Tioflawina TSigma AldrichT3516
HBSSGibco14025-092
PBSGibco10010-023
Filtry strzykawkowe 0,22 mikronaMilliporeSLGP033RS
DMEMGibco11965-092
HRP Goat antirabbit IgGAbcamab6721-1
Szczepy PA103 i Δ PcrVTe szczepy P. aeruginosa uzyskano od Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectinSigma AldrichL9381
TRITC Helix pomatia lectinSigma AldrichL1261
AgarFisherBP1423-500
0,22 mikrona nitrocelulozaBioRad162-0112
Kolagenaza typu 2WorthingtonLS004176
Płodowa surowica bydlęcaHyklonSH30898.03IH
PenStrepGibco15070063
Karbenicylina Sól disodowaSigma C1389
Koncentratory mikrocetrifugacji - 10 000 MW odcięcieMiliporeUFC801008
Fosforan potasu dwuzasadowySigma 795496-500G
Fosforan magnezu siedmiowodnyMP BiomedicalsMP021914221
Kwas cytrynowyG Biosciences50-103-5801
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnySigmaS9506-500G
Countess Automatyczny licznik komórekInvitrogenC10277

Bibliografia

  1. Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
  2. Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
  3. Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
  4. Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
  5. Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
  6. Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
  7. Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
  8. Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
  9. Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
  10. Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343(2013).
  11. Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
  12. Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
  13. Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
  14. Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
  15. Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
  16. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
  17. Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczanie aktywno ci dehydrogenazy mleczanowejwi zanie tioflawiny Tanaliza w programie ImageJimmunoblottingprzeciwcia o anty amyloidowe A11oligomery taubeta amyloid

Powiązane artykuły