Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57448

⸱

26 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, 2Moores Cancer Center, School of Medicine, University of California, San Diego, 3Department of Pathology, School of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Medicine, School of Medicine, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Rakotwórczość to zdolność komórek rakowych do tworzenia masy guza. Szeroko stosowanym podejściem do określenia, czy komórki są rakotwórcze, jest wstrzykiwanie myszom z niedoborem odporności podskórnie komórek rakowych i mierzenie masy guza po tym, jak stanie się on widoczny i wyczuwalny. Iniekcje ortotopowe komórek nowotworowych mają na celu wprowadzenie ksenoprzeszczepu do mikrośrodowiska, które najbardziej przypomina tkankę, z której pochodzi badany guz. Badania nad rakiem mózgu wymagają wewnątrzczaszkowego wstrzyknięcia komórek rakowych, aby umożliwić tworzenie się i analizę guza w unikalnym mikrośrodowisku mózgu. Obrazowanie in vivo ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych natychmiast monitoruje masę guza myszy wszczepionych ortotopowo. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie fluorescencyjnej tomografii molekularnej (FMT) ksenoprzeszczepów guza mózgu. Komórki rakowe są najpierw transdukowane białkami fluorescencyjnymi w bliskiej podczerwieni, a następnie wstrzykiwane do mózgu myszy z obniżoną odpornością. Zwierzęta są następnie skanowane w celu uzyskania ilościowych informacji o masie guza przez dłuższy czas. Wstępne znakowanie komórek pozwala na opłacalną, powtarzalną i wiarygodną ocenę ilościową obciążenia guzem u każdej myszy. Wyeliminowaliśmy konieczność wstrzykiwania substratów obrazowych, a tym samym zmniejszyliśmy stres u zwierząt. Ograniczeniem tego podejścia jest niemożność wykrycia bardzo małych mas; Ma jednak lepszą rozdzielczość dla większych mas niż inne techniki. Może być stosowany do oceny skuteczności leczenia farmakologicznego lub zmian genetycznych linii komórkowych glejaka i próbek pobranych od pacjentów.

Wprowadzenie

Rak jest jedną z głównych przyczyn zgonów związanych z chorobami u ludzi w uprzemysłowionym świecie. Ze względu na niezwykle wysoką liczbę ofiar śmiertelnych pilnie potrzebne są nowe metody leczenia. Glejak wielopostaciowy (GBM) jest niezwykle śmiertelnym typem raka mózgu, składającym się z heterogennych populacji guza mózgu, komórek zrębu i komórek odpornościowych. Według Centralnego Rejestru Nowotworów Mózgu w USA, częstość występowania pierwotnych złośliwych i niezłośliwych guzów mózgu wynosi około 22 przypadków na 100 000. Oczekuje się, że w 2017 roku w USA zostanie zdiagnozowanych około 11 000 nowych przypadków1.

Badania przedkliniczne badają prawdopodobieństwo skuteczności leku, procedury lub leczenia przed testami na ludziach. Jednym z pierwszych etapów badań przedklinicznych jest identyfikacja potencjalnych celów molekularnych do leczenia farmakologicznego przy użyciu komórek nowotworowych wszczepionych do organizmu gospodarza, zdefiniowanych jako modele ludzkiego ksenoprzeszczepu. W tym kontekście, modele ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowego guza mózgu wykorzystujące ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) są szeroko stosowane do badania biologii, progresji, ewolucji i odpowiedzi terapeutycznej guza mózgu, a ostatnio do opracowywania biomarkerów, badań przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej2,3,4.

Jedną z najbardziej przystępnych cenowo i nieinwazyjnych metod obrazowania in vivo do monitorowania wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów jest obrazowanie bioluminescencyjne (BLI)5,6,7,8. Jednak niektóre ograniczenia BLI obejmują podawanie i dostępność substratu, stabilność enzymu oraz wygaszanie i rozpraszanie światła podczas akwizycji obrazowania9. W tym miejscu przedstawiamy FMT w podczerwieni jako alternatywną metodę obrazowania do monitorowania przedklinicznych modeli glejaka. W tej metodzie akwizycja sygnału i kwantyfikacja wszczepionych wewnątrzczaszkowo PDX, wyrażających białko fluorescencyjne bliskiej podczerwieni iRFP72010,11 (odtąd określane jako FP720) lub turboFP635 (odtąd określane jako FP635), odbywa się za pomocą systemu obrazowania FMT. Korzystając z technologii FMT, guzy ortotopowe mogą być monitorowane in vivo przed, w trakcie lub po leczeniu, w sposób nieinwazyjny, wolny od substratów i ilościowy do obserwacji przedklinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wykorzystanie eksperymentalnych zwierząt badawczych i czynników zakaźnych, takich jak lentiwirus, do transdukcji komórek rakowych, wymaga uprzedniej zgody instytucjonalnego programu opieki nad zwierzętami oraz instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (UCSD).

1. Znakowanie komórek glejaka za pomocą konstruktu FP635 lub FP720

  1. Wyprodukuj i oczyść lentiwirusa zgodnie z protokołem opisanym przez Tiscornia i wsp.12
  2. Hodowla około 2,0 x 106 komórek z ludzkiej linii komórkowej glejaka z DMEM plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 15-centymetrowym naczyniu; lub hodowla 2,0 x 106 sfer ludzkiego glejaka pochodzącego od pacjenta (GBM-PDX) z DMEM/F12 1:1 z suplementem B27 plus ludzkim rekombinowanym naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF; 20 ng / ml) i FGF (10 ng / ml) w kolbie T75.
  3. Utrzymuj wszystkie komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 100% wilgotności względnej.
  4. Oddziel komórki.
    1. W przypadku komórek glejaka: usuń supernatant z płytek i dodaj 3-5 ml trypsyny 1X do komórek glejaka.
    2. W przypadku kulek GBM: zebrać komórki, pipetując je do probówki o pojemności 15 ml.
      1. Wirować kulki GBM przy 200 x g przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej w temperaturze pokojowej.
      2. Usunąć supernatant i dodać 3-5 ml roztworu do oddzielania komórek.
    3. Inkubować wszystkie komórki w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut.
  5. Ostrożnie rozdzielić komórki, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół (upewnić się, że kulki i komórki glejaka są całkowicie zdysocjowane) i wirować w dół z prędkością 200 x g przez 5 minut.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml pożywki, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Określ żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
  7. Płytka 1,0 x 106 komórek docelowych w 10-centymetrowym naczyniu z 5 ml pożywki przez pipetowanie.
  8. Transdukcja komórek za pomocą lentiwirusa wykazującego ekspresję białek fluorescencyjnych przy wielokrotności infekcji (MOI) 5, jak opisano przez Tiscornia i wsp.12 i inkubować w temperaturze 37 °C.
  9. Po 24 godzinach usunąć pożywkę z transdukowanych komórek, dodać 5 ml świeżej pożywki i inkubować przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37 °C.
  10. Dysocjować zakażone komórki w zawiesinę jednokomórkową, jak opisano w krokach 1.4-1.6. Odwirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 500 μl roztworu sortującego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 1% FBS).
  11. Odpipetować zawiesinę komórek do probówek FACS. Wybarwić komórki 1 μl/ml dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), aby wykluczyć martwe komórki. Kontrole ujemne są wymagane do ustawienia bramek cytometru przepływowego (komórki nietransdukowane i komórki nietransdukowane/barwione DAPI).
  12. Sortuj komórki fluorescencyjnie dodatnie/DAPI-ujemne do roztworu sortującego, jak opisano przez Basu i wsp.13, i zbierz posortowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  13. Odwirowywać posortowane komórki w ilości 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 5 ml pożywki hodowlanej. Posortowane komórki umieścić w 10-centymetrowym naczyniu, pipetując. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 48–72 godziny.
  14. Rozwiń posortowane komórki, dysocjując komórki zgodnie z krokami 1.4-1.6 i posiewając je w wielu szalkach do eksperymentów in vivo.
    UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat przygotowania i oczyszczania sortowania komórek, zobacz Basu i wsp.13

2. Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie komórek glejaka oznaczonych iRFP myszom z niedoborem odporności

UWAGA: Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że sala operacyjna i narzędzia są czyste do zabiegu. Do wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych należy stosować samce lub samice myszy z niedoborem odporności atymiczne nagie (Foxn1nu) w wieku 4-5 tygodni i 17-19 g. Zwierzęta powinny być trzymane w pomieszczeniach przez co najmniej 3 dni po przyjeździe i przed zabiegiem.

  1. Przygotowanie komórek
    1. Zebrać i zdysocjować fluorescencyjne dodatnie komórki glejaka do zawiesiny jednokomórkowej (kroki 1.4-1.6) i ponownie zawiesić 0,5 lub 1,0 x 106 komórek w 2-5 μl PBS na wstrzyknięcie na zwierzę. Odpipetować zawiesinę komórek do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.
  2. Przygotowanie i podawanie znieczulenia
    1. Przygotować 200 μl roztworu soli fizjologicznej zawierającego ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg) na 20 gramów masy ciała myszy. Zważ zwierzęta i oblicz odpowiednią dawkę znieczulenia.
    2. Zapewnij dootrzewnowe wstrzyknięcie znieczulenia i nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec odwodnieniu. Aby uzyskać więcej informacji na temat tego kroku, zobacz Kathleen i wsp.14 Umieść zwierzę na podkładce termicznej z podgrzaną wodą o temperaturze 37 °C.
    3. Sprawdź, czy zwierzęta są znieczulone, monitorując reakcję na uszczypnięcie palca u nogi (odruch pedałowania), zwykle w ciągu 5-10 minut.
  3. Iniekcja wewnątrzczaszkowa
    1. Załadować strzykawkę Hamiltona o pojemności 5 μl (igła z końcówką) z zawiesiną komórek i zamontować w uchwycie sondy.
    2. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej dla małych zwierząt i przymocuj głowę za pomocą nauszników i adaptera siekaczy, postępując zgodnie ze szczegółami opisanymi przez Cetina i wsp.15
    3. Zdezynfekuj głowę 70% roztworem etanolu i betadyny. Upewnij się, że pole operacyjne jest całkowicie sterylne. Wykonaj środkowe nacięcie małym skalpelem i oddziel skórę i tkanki łączne.
    4. Umieścić strzykawkę Hamiltona na punkcie bregma za pomocą mikromanipulatora.
    5. Przesunąć uchwyt sondy o 1.0 mm przednio-tylny i 2.0 mm w bok od punktu bregma. Zaznacz tę pozycję ołówkiem.
    6. W tym miejscu ostrożnie wykonaj otwór w czaszce za pomocą ręcznego wiertła z mikrosilnikiem, wywierając lekki nacisk w dół, aż naczynia krwionośne staną się widoczne. Nie należy zaburzać pajęczynówki i miąższu mózgu.
    7. Wprowadzić igłę do otworu na zadziory i przesunąć się 3,0 mm poniżej powierzchni zadziorów.
    8. Ustawić objętość (2-5 μl) i natężenie przepływu (1 μl/min) iniekcji za pomocą zmotoryzowanego wtryskiwacza stereotaktycznego lub ręcznie wykonać wstrzyknięcie.
    9. Po wstrzyknięciu należy stopniowo usuwać igłę, wznosząc się o 1,0 mm co 1 minutę i oczyścić miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem.
    10. Zamknij ranę skóry za pomocą zszywek chirurgicznych lub wykonując szwy chirurgiczne (często nazywane szwami) i zobacz Kathleen i wsp.14, aby uzyskać więcej informacji.
  4. Odzyskiwanie zwierząt
    1. Przenieś zwierzę na wodną poduszkę termiczną (37 °C) i monitoruj temperaturę ciała, częstość oddechów i tętno, aż do pełnego wyzdrowienia. Podawaj analgezję zgodnie ze standardowymi protokołami.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat procedury stereotaktycznej, operacji i współrzędnych, zobacz inne raporty5,14,15.

3. Obrazowanie FMT

UWAGA: Zgodnie z celem eksperymentu, komórki glejaka wielopostaciowego oznaczone iRFP mogą być monitorowane in vivo przed, w trakcie lub po leczeniu. W celu obrazowania należy znieczulić zwierzęta za pomocą komory indukcyjnej izofluranu, utrzymać w kasecie obrazowania podczas skanowania i zobrazować w stacji dokującej imagera FMT.

  1. Wyjąć zwierzę z klatki i umieścić je w komorze indukcyjnej izofluranu. Zamknij komorę i włącz przepływ tlenu i parownik na 3-5%.
  2. Monitoruj zwierzę aż do całkowitego znieczulenia, zwykle w ciągu 1-2 minut. Nieprzytomne zwierzęta nie powinny reagować na bodźce zewnętrzne.
  3. Wyjmij znieczulone zwierzę z komory i umieść je w kasecie obrazowania, umieszczając najpierw adapter głowy, a następnie kładąc zwierzę przodem do dołu. Upewnij się, że głowica znajduje się na środku kasety.
  4. Umieść górną płytę kasety na górze i dokręć pokrętła regulacyjne do 17 mm.
  5. Gdy zwierzę jest już zabezpieczone w kasecie obrazowej, przystąp do obrazowania, wkładając kasetę do wewnętrznej stacji dokującej kamery FMT, gdzie izofluran jest pompowany, aby utrzymać zwierzę w stanie znieczulenia.
  6. Uruchom oprogramowanie imagera i analizatora, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.
  7. W oknie "Eksperymentalne" wybierz "Baza danych" i "Grupa badawcza".
  8. Przejdź do zakładki "Skanuj" i wybierz temat do obrazu, klikając "wybierz temat". Wybierz także kanał laserowy w panelu "Kanał laserowy". W przypadku ogniw oznaczonych FP635 wybierz "kanał laserowy 635 nm", a w przypadku ogniw oznaczonych FP720 wybierz "kanał laserowy 680 nm".
  9. Uzyskaj obraz, klikając opcję "Przechwyć" w oknie "Karta Skanuj". Następnie dostosuj pole skanowania, klikając i przeciągając pole skanowania na przechwyconym obrazie do określonej liczby lokalizacji źródłowych, zwykle w zakresie 20-25 źródeł po stronie ipsilateralnej.
  10. Zaznacz opcję "Dodaj do kolejki rekonstrukcji" i naciśnij "Skanuj" w oknie "Zakładka Skanuj".
  11. Poczekaj na zakończenie skanowania, a następnie wyjmij kasetę z obrazem ze stacji dokującej.
  12. Zdejmij górną płytę kasety i umieść zwierzę z powrotem w klatce.
  13. Powtórzyć kroki 3.1-3.12 dla pozostałych zwierząt.

4. Analiza obrazu

  1. W oprogramowaniu imagera i analizatora wybierz okno "Karta Analiza".
  2. Załaduj zbiór danych i temat do analizy, klikając przycisk "+" w panelu "Wybór zestawu danych" w oknie "Karta Analiza".
  3. Po załadowaniu obrazu w oknie "Zakładka Analiza" należy przeprowadzić analizę obszaru zainteresowania (ROI), wybierając ikonę elipsoidy, znajdującą się w lewym górnym rogu okna "Zakładka Analiza".
  4. Dostosuj próg do zera w panelu "dane statystyczne", klikając prawym przyciskiem myszy kolumnę "próg" w oknie "zakładka Analiza".
  5. Całkowita wartość w panelu "Dane statystyczne" reprezentuje sygnał z komórek glejaka znakowanego fluorescencyjnie wszczepionych do mózgu myszy.
  6. Powtórzyć kroki 4.2-4.4 dla pozostałych zwierząt. Załaduj lub usuń nowy temat, klikając odpowiednio przycisk "+" lub "−" w panelu "Wybór zestawu danych" w oknie "Karta Analiza".
    UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat obrazowania FMT i działania oprogramowania, zobacz20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki glejaka wielopostaciowego U87EGFRvIII (komórki U87 nadmiernie eksponujące wariant III receptora EGF) hodowano zgodnie z krokiem 1.2. Lentiwirusy produkowano i oczyszczano zgodnie z krokiem 1.1. Stężenie wirusa określono za pomocą analizy p24 ELISA. Komórki transdukowano lentiwirusami niosącymi białka fluorescencyjne z zakresu podczerwieni zgodnie z krokiem 1.8. Plazmid kodujący FP72010,1 został udostępniony przez dr. V.V. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ksenoprzeszczepy nowotworowe są szeroko stosowane w badaniach nad rakiem i opracowano szereg dobrze znanych technik obrazowania: BLI; rezonans magnetyczny (MRI); pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa (CT); FMT. Każde z tych podejść ma swoje wady i zalety, ale ostatecznie uzupełniają się nawzajem pod względem rodzaju dostarczanych informacji. Jedną z najczęściej stosowanych technologii obrazowania in vivo jest BLI 5,6,7,8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Frederickowi Langowi, MD Anderson Cancer Center za neurosfery GBM-PDX. Praca ta była wspierana przez Defeat GBM Research Collaborative, spółkę zależną National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), Fundację Jamesa S. McDonnella (Frank Furnari); Jorge Benitez otrzymał nagrodę od Amerykańskiego Towarzystwa Nowotworów Mózgu (ABTA); Ciro Zanca był częściowo wspierany przez amerykańsko-włoską fundację na rzecz walki z rakiem. Frank Furnari otrzymuje wynagrodzenie i dodatkowe wsparcie od Ludwig Institute for Cancer Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/Wysoki poziom glukozy HyClone/GESH30022.1
DMEM/F12 1:1 Gibco11320-082
FBSHyClone/GESH30071.03
AccutaseInnowacyjne technologie komórkoweAT-104
TrypsinHyClone/GESH30236.01
B27 suplementGibco17504044
ludzka rekombinowana EGF Stemcell Technologies2633
rekombinowany ludzki FGFStemcell Technologies2634
DPBSCorning21-031-00
Probówki FACSFalcon352235
DAPIThermoFisher Scientific62248
BlasticidinThermoFisher ScientificA1113903
p24 ELISA Clontech632200
XylazineAkornNDC 59399-110-20
KetamineZoetisNADA 043-403Substancja kontrolowana
MaśćDechronNDC 17033-211-38
Szew wchłanialnyCpMedicalVQ392
Strzykawka 5 ulHamilton26200-UNumer katalogowy sprzedawany przez Sigma-Aldrich
Cell SorterSonySH8007
Mysz stereotaktyczna ramka Stoelting51730
Zmotoryzowany wtryskiwacz stereotaktycznyStoelting53311
Wiertarka ręczna z mikrosilnikiemForedomK1070
Podkładka do podgrzewania myszy Ken Scientific CorporationTP-22G
 Oprogramowanie do obrazowania PerkinElmerFMT 2500 XL
TrueQuant Perkin Elmer 
Ultrawirówka Optima L-80 XPBeckman Coulter392049
Naczynia do hodowli tkankowych 100 mmOlympus Plastics25-202
Naczynia do hodowli tkankowych 150 mmOlympus Plastics25-203
Kolby do hodowli tkankowych T75Corning430720U
50 ml probówki stożkoweCorning430290
Probówki stożkowe 15 mlOlympus Plastics28-101
Wirówka Avanti J-20Beckman CoulterJ320XP-IM-5
Probówka, polipropylen, cienkościenna, 5.0 ml326819Beckman Coulter
, cienkościenna, polipropylenowa, 38,5 mL, 25 x 89 mmBeckman Coulter326823
Atymiczne nagie myszyCharles River LaboratoriesKod szczepu  490 (Homozygota)Wymagana uprzednia zgoda Instytucjonalnego Programu Opieki nad Zwierzętami oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego.     
System tomografii fluorescencyjnej 7005319 Probówka

Bibliografia

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
  2. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  3. Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
  4. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  5. Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).
  6. Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
  7. Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
  8. Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
  9. Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
  10. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
  11. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
  12. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
  13. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).
  14. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
  15. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
  16. Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223(2017).
  17. Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994(2016).
  18. Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
  19. Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
  20. Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
  21. Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
  22. Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
  23. Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

transdukcja komóreksortowanie cytometrycznewstrzykiwanie doczaszkowemonitorowanie guzabiałka bliskiej podczerwienimyszy immunodeficyjnebadanie skuteczności leków
Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.