Method Article

Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/57451

⸱

April 9th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy równoczesne testy mechaniczne i obrazowanie 3D ściany tętniczej izolowanych, żywych tętnic oporowych człowieka, a także analizy obrazów Fiji i Ilastik w celu ilościowego określenia organizacji przestrzennej elastyny i kolagenu oraz gęstości objętościowej. Omówiono wykorzystanie tych danych w modelach matematycznych mechaniki ścian tętnic.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogenny wkład przebudowy tętnicy opornej jest udokumentowany w nadciśnieniu tętniczym, cukrzycy i zespole metabolicznym. Badania i rozwój mikrostrukturalnie motywowanych modeli matematycznych w celu zrozumienia właściwości mechanicznych tętnic oporowych człowieka w zdrowiu i chorobie mogą pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób choroby i leczenie wpływają na mikrokrążenie u ludzi. Aby opracować te modele matematyczne, konieczne jest rozszyfrowanie związku między właściwościami mechanicznymi i mikroarchitektonicznymi ściany mikronaczyniowej. W niniejszej pracy opisano metodę ex vivo pasywnych badań mechanicznych i jednoczesnego bezznacznikowego trójwymiarowego obrazowania mikroarchitektury elastyny i kolagenu w ścianie tętniczej izolowanych tętnic oporowych człowieka. Protokół obrazowania może być stosowany do tętnic oporowych dowolnego gatunku będącego przedmiotem zainteresowania. Analizy obrazów opisano w celu ilościowego określenia i) wywołanych ciśnieniem zmian w kątach rozgałęzień wewnętrznej blaszki elastycznej i przybyszowej prostoliniowości kolagenu przy użyciu Fidżi oraz ii) gęstości objętościowych kolagenu i elastyny określonych za pomocą oprogramowania Ilastik. Preferencyjnie, aby wszystkie pomiary mechaniczne i obrazowe były wykonywane na żywych, perfuzjonych tętnicach, jednak omówiono alternatywne podejście wykorzystujące standardową wideomikroskopię miografii ciśnieniowej w połączeniu z obrazowaniem po fiksacji naczyń krwionośnych. Ta alternatywna metoda zapewnia użytkownikom różne opcje podejść do analizy. Omówiono włączenie danych mechanicznych i obrazowych do matematycznych modeli mechaniki ściany tętnicy oraz zaproponowano przyszły rozwój i uzupełnienie protokołu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogenny wkład i efekty przebudowy tętnicy opornej są udokumentowane w pierwotnym nadciśnieniu, cukrzycy i zespole metabolicznym1,2,3,4,5. Rozszyfrowanie związku między właściwościami mechanicznymi i mikroarchitektonicznymi ściany mikronaczyniowej jest niezbędne do opracowania modeli matematycznych tego związku. Takie modele przyczynią się do lepszego zrozumienia procesu przebudowy i pomogą w opracowaniu modeli in silico przydatnych do testowania strategii farmakologicznych ukierunkowanych na remodeling ściany tętnicy związany z chorobą.

Wcześniejsze badania koncentrowały się na zrozumieniu, w jaki sposób mikroarchitektura ściany tętnicy odnosi się do mechaniki ściany tętnicy poprzez włączenie środków mechanicznych, a mikroarchitektura macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest prawie wyłącznie wykonywana na dużych, elastycznych tętnicach przewodowych myszy lub świń6,7,8,9,10,11. Obrazowanie mikrostruktur ściany jest zwykle wykonywane przy użyciu nieliniowych technik optycznych, wykorzystujących autofluorescencję elastyny i generowanie drugiej harmonicznej przez kolagen. Umożliwia to obrazowanie czasoprzestrzenne dwóch głównych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, elastyny i kolagenu, bez konieczności barwienia. Obrazowanie ściany tętnicy w pełnej grubości jest wyzwaniem w dużych tętnicach przewodowych ze względu na rozproszenie światła w grubej osłonce. Jednak, aby określić, w jaki sposób mikroarchitektura elementów strukturalnych ściany tętnicy odnosi się do obserwowanych właściwości mechanicznych, podczas badań mechanicznych należy uzyskać informacje trójwymiarowe. W przypadku dużych tętnic, takich jak ludzka aorta, wymaga to montażu dwuosiowego, testów mechanicznych i obrazowania obszarów zainteresowania w 1-2 cm2 kawałkach ściany tętnicy7,9,10,12. Tylko część ściany może być zobrazowana i przetestowana mechanicznie.

Dla mniejszych tętnic dowolnego gatunku (np. ludzkie okołosercowe13, pulmonary14 i podskórne15 tętnice, tętnice krezkowe szczura16,17,18,19,20, krezka, mózgowa, udowa i tętnice szyjne21,22,23,24,25,26,27) Obrazowanie całej grubości ścianki jest możliwe i może być połączone z testami mechanicznymi. Pozwala to na jednoczesną rejestrację właściwości mechanicznych i układów konstrukcyjnych w obrębie ściany. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, bezpośrednie modelowanie matematyczne związku między obserwowanymi zmianami w trójwymiarowej strukturze ECM a zmienionymi właściwościami mechanicznymi ściany tętnicy oporowej, zostało według naszej najlepszej wiedzy dopiero niedawno opisane w ludzkich tętnicach oporowych13,15.

W tej pracy opisana jest metoda ex vivo do pasywnych testów mechanicznych i jednoczesnego trójwymiarowego obrazowania mikroarchitektury elastyny i kolagenu w ścianie tętniczej izolowanych tętnic oporowych u ludzi. Protokół obrazowania może być stosowany do tętnic oporowych dowolnego gatunku będącego przedmiotem zainteresowania. Analizy obrazu opisano w celu uzyskania pomiarów wewnętrznych kątów rozgałęzień blaszki elastycznej i przybyszowej prostoliniowości kolagenu13 przy użyciu Fiji28. Gęstości objętościowe kolagenu i elastyny są określane za pomocą oprogramowania Ilastik29 i na koniec omówiono włączenie danych mechanicznych i obrazowych do modeli matematycznych mechaniki ściany tętnicy.

Celem opisania technik obrazowania i analizy obrazów w połączeniu z modelowaniem matematycznym jest dostarczenie badaczom systematycznego podejścia do opisu i zrozumienia obserwowanych zmian wywołanych ciśnieniem w ECM tętnic oporowych. Opisana metoda koncentruje się na ilościowym określeniu zmian ECM w naczyniu podczas zwiększania ciśnienia, poprzez porównanie struktury ECM przy 20, 40 i 100 mmHg. Ciśnienia te zostały wybrane do określenia struktury ściany tętnicy w jej bardziej podatnym (20 mmHg), sztywnym (100 mmHg) i pośrednim (40 mmHg) stanie, odpowiednio. Jednak każdy proces zachodzący w ścianie naczyniowej żywych tętnic, w tym zmiany wywołane przez składniki wazoaktywne, histerezę i przepływ, można określić ilościowo, w zależności od hipotezy badawczej kwestionowanej przez badacza.

Podkreśla się użycie mikroskopii fluorescencyjnej wzbudzenia dwufotonowego (TPEM) w połączeniu z miografem ciśnienia do badania zmian wywołanych ciśnieniem (lub innymi) zmianami w ECM tętnic pod napięciem. Po pierwsze dlatego, że pozwala to na jednoczesne uzyskanie ogólnej trójwymiarowej struktury ściany tętnicy (średnicy i grubości ścianki) wraz z trójwymiarowym pozyskiwaniem wysokiej jakości, szczegółowych obrazów mikroarchitektur kolagenu i elastyny bez użycia znaczników, zgodnie z opisem13 poprzez wykorzystanie autofluorescencji elastyny i sygnału drugiej harmonicznej generacji kolagenu (SHG)30. Po drugie, TPEM pozwala na wykorzystanie niskoenergetycznego światła wzbudzenia w bliskiej podczerwieni, minimalizując fotouszkodzenia tkanki, a tym samym dozwolone jest wielokrotne obrazowanie w dokładnie tej samej pozycji w ścianie naczynia krwionośnego, co pozwala na wielokrotne analizy obserwowanych zmian.

Omówiono użycie alternatywnego podejścia wykorzystującego obrazowanie konfokalne tętnic stałych ciśnieniowo, aby umożliwić użytkownikom bez dostępu do TPEM możliwość korzystania z opisanej metody. Informacje o strukturze ECM i gęstości objętościowej można również uzyskać z dwuwymiarowych analiz tkanek podzielonych szeregowo, np. zgodnie z opisem przez31,32. Jednak ze względu na brak możliwości uzyskania trójwymiarowych informacji strukturalnych w skalach długości tętnicy, a także podczas zmieniających się warunków przy użyciu tej metody, nie zaleca się stosowania tego podejścia do badań ciśnienia i wywołanych leczeniem zmian trójwymiarowych w ECM.

Minimalnym wymogiem dla badacza do zastosowania opisanej tutaj metody jest dostęp do zestawu do kaniulacji i zwiększania ciśnienia w tętnicach w połączeniu z konfokalnym lub dwufotonowym mikroskopem fluorescencyjnym wzbudzenia. Konfiguracja opisana w poniższym protokole to zbudowany na zamówienie miograf ciśnieniowy z przetwornikiem siły podłużnej, zbudowany tak, aby pasował do specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconym wzbudzeniem dwufotonowym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobranie biopsji ludzkiego osierdzia ciemieniowego do wykorzystania w tej pracy zostało wykonane po pisemnej świadomej zgodzie, jak wcześniej opisano33. Badania tkanek ludzkich są zgodne z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej34 i zostały zatwierdzone przez Regionalne Komisje ds. Etyki Badań Zdrowotnych dla Południowej Danii (S-20100044 i S-20140202) oraz Duńską Agencję Ochrony Danych.

1. Zbierz tkankę i wyizoluj (ludzką) tętnicę oporową

  1. Próbki tkanek należy pobrać natychmiast po wycięciu podczas zabiegu chirurgicznego. Natychmiast po pobraniu przenieść tkankę do 4 °C buforowanego roztworu soli fizjologicznej (HBS) HEPES i przechowywać ją w HBS.
    UWAGA: Tkanki ludzkie są pobierane wyłącznie po uzyskaniu zgody odpowiednich komisji instytucjonalnych i etycznych oraz po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody pacjenta. Skład HBS w mM: NaCl 144, KCl 4,7, CaCl2 2,5, MgSO4 1,2, KH2PO4 1,2, HEPES 14,9, glukoza 5,5. Dostosuj pH 7,4 za pomocą NaOH i przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 μm.
  2. Pobraną tkankę należy pozostawić na noc w sterylnym HBS w temperaturze 4 °C w celu wypłukania środków znieczulających.
    UWAGA: Wszelki wpływ przechowywania przez noc na integralność i funkcjonalność naczynia powinien być sprawdzony przez indywidualne laboratorium badawcze.
  3. Ostrożnie odizoluj tętnice o wielkości oporu (± średnicy światła 200 μm) za pomocą kleszczy z ostrymi końcówkami i nożyczek do mikropreparacji.
  4. Przechowuj tętnice w temperaturze 4 °C w lodowatym HBS podczas zalewania komory obrazowania/ciśnieniowej.

2. Zamontuj izolowaną tętnicę w miografie ciśnieniowym

  1. Zamontuj szklane kaniule o średnicy końcówki ~80 μm na uchwytach kaniuli. Umieść końcówki około 150 μm nad szklanym dnem komory.
    UWAGA: Kaniule z końcówką wygiętą pod kątem 45° mogą umożliwiać precyzyjne ustawienie naczynia nad szklanym dnem.
  2. Napełnij zarówno rurkę dolotową, jak i wylotową HBS 1% BSA i podłącz do systemu ciśnieniowego.
    UWAGA: BSA jest dołączony w celu zachowania funkcji komórek śródbłonka.
  3. Zamontuj izolowaną tętnicę za pomocą dwóch podwójnych szwów węzłowych na kaniulę.
    UWAGA: Węzły można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać na podwójnej taśmie klejącej, aż będą potrzebne.
  4. Napełnij komorę HBS i umieść dwa podwójne węzły na każdej szklanej kaniuli.
    UWAGA: W przypadku stosowania tętnic o tonacji miogennej, HBS należy zastąpić bezwapniowym HBS uzupełnionym 3 μM EGTA i 3 μM nitroprusydkiem sodu.
  5. Delikatnie przytrzymaj tętnicę na jednym końcu za pomocą dwóch par kleszczyków z ostrą końcówką. Otwórz światło tętnicy i delikatnie wsuń je na kaniulę. Przymocuj do kaniuli za pomocą dwóch węzłów.
  6. Zastosuj nacisk 5 mmHg, aby delikatnie przepłukać światło HBS / 1% BSA.
  7. Kanuluj drugi koniec tętnicy i zabezpiecz go na kaniuli za pomocą dwóch podwójnych węzłów.
  8. Przenieś miograf na stolik mikroskopowy i zwiększ ciśnienie w tętnicy do 5 mmHg (ciśnienie wlotowe = ciśnienie wylotowe), a następnie podgrzewaj do 37 °C przez 30 minut.
  9. Opcjonalnie: Skalibruj przetwornik siły wzdłużnej zgodnie z instrukcjami producenta (1 g = 9,81 mN).
    UWAGA: Niezbędna jest kalibracja przetwornika siły po podgrzaniu, ponieważ jest on wrażliwy na temperaturę.

3. Wykonaj eksperyment: obrazowanie średnicy tętnicy, grubości ścianki oraz mikroarchitektury kolagenu i elastyny za pomocą TPEM

  1. Szybko zeskanuj tętnicę kaniulowaną pod ciśnieniem do 5 mmHg za pomocą obiektywu 20X (apertura numeryczna (NA) ≥ 0,8) i światła wzbudzającego o niskiej mocy, aby ocenić średnicę naczynia i grubość ścianki przy 5 mmHg.
    UWAGA: W przypadku mikroskopów odwróconych należy użyć obiektywu do zanurzenia w wodzie; W przypadku mikroskopów pionowych należy użyć obiektywu do zanurzania w wodzie. Jeśli obiektyw nie jest wyposażony w kołnierz korekcyjny do korekty grubości szkiełka nakrywkowego, upewnij się, że używany szkiełko nakrywkowe jest dopasowany do używanego obiektywu. Ustawienia i opisy oprogramowania mogą się różnić w zależności od używanego interfejsu fazowego i mikroskopu oraz oprogramowania.
    1. Ustaw ścieżkę optyczną.
      1. Aktywuj laser dwufotonowy Mai Tai i ustaw go na światło wzbudzające 820 nm.
        UWAGA: Unikaj ekspozycji na widzialne i niewidzialne światło laserowe.
      2. Zbieraj emisję jednocześnie w dwóch kanałach. Podziel światło emisyjne między fotopowielacze za pomocą długoprzepustowego zwierciadła dichroicznego 460 nm i zbierz emisję za pomocą filtrów pasmowoprzepustowych o szerokości 30-60 nm wyśrodkowanych odpowiednio na 520 nm (elastyna) i 410 nm (kolagen).
    2. Umożliwia ciągłe skanowanie z czasem przebywania lasera 10 μs na piksel i 512 × 512 pikselami, co zapewnia 100% pole widzenia.
    3. Ręcznie przeskanuj tętnicę, aby określić głębokość, na której obserwuje się maksymalną średnicę.
    4. Wybierz prostokątny wycinek zakrywający najszerszą średnicę tętnicy i zeskanuj pojedynczą klatkę o rozmiarze piksela ≤ 300 nm/piksel (Rysunek 2C). Używaj jak najmniejszej mocy światła wzbudzającego i czasu przebywania pikseli, aby uniknąć fotouszkodzenia tętnicy pod napięciem.
      UWAGA: Zaleca się uzyskanie obrazu prostokątnego, np. 100 × 1024 pikseli, a nie obrazu kwadratowego w tej pozycji, aby zaoszczędzić czas i ograniczyć ekspozycję na fotony tkankowe (Rysunek 2C).
    5. Zapisz obraz do późniejszych analiz.
  2. Określ średnicę światła i grubość ściany przy maksymalnej średnicy tętnicy.
    1. Załaduj obraz w języku Fidżi.
    2. Ustaw skalę, klikając Menu główne | Analizowanie | Ustaw Skala i wprowadź μm/piksel i proporcje pikseli (zdecydowanie zaleca się zachowanie proporcji pikseli 1:1).
    3. Wybierz narzędzie Linia Fidżi i narysuj linię między dwiema wewnętrznymi elastycznymi blaszkami po każdej stronie światła tętnicy, a następnie kliknij ctrl + M. Fidżi podaje długość jako domyślną w tabeli wyników.
    4. Podobnie narysuj więcej linii, aby zmierzyć grubość każdej ściany i kliknij ctrl + M, aby zmierzyć następujący znacznik.
    5. Zapisz pomiary.
  3. Obraz mikroarchitektury kolagenu i elastyny przy 5 mmHg, skanując całą grubość ściany tętnicy, uzyskując stosy obrazów 3D o dobrej jakości dla 1-3 obszarów zainteresowania wzdłuż długości tętnicy.
    1. Uzyskaj stosy obrazów na całej ścianie tętnicy za pomocą obiektywu 60X, NA ≥ 1, zoptymalizowanych rozmiarów pikseli i odstępów z.
      1. Oblicz optymalne warunki obrazowania (rozmiary pikseli i odstępy między krokami z) zgodnie ze ścieżką optyczną, medium immersyjnym i współczynnikami załamania światła próbki za pomocą kalkulatora Nyquista do obrazowania objętościowego (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        UWAGA: Proszę zwrócić uwagę na różnicę między optymalnym rozmiarem pikseli a odstępami Z w porównaniu z poradami zawartymi w sekcji 3.4. powyżej na temat stosowania maksymalnego rozmiaru w pikselach.
    2. Stosować te same ustawienia wzbudzenia i emisji, co powyżej (ppkt 3.1.1.).
    3. Szybko zeskanuj ścianę naczynia, jak opisano powyżej, aby określić grubość stosu z.
    4. Z-stack definiuje głębokość początkową i końcową z-stack, odstępy z-step i gęstość pikseli (obliczone w 3.3.1.1.) i wykonaj skanowanie z-. Zapisz każdy kanał osobno.
      UWAGA: Obrazy powinny być na tyle małe, np. 30 x 30 μm lub 50 × 50 μm w zależności od wielkości naczynia, aby uniknąć wpływu krzywizny w późniejszych analizach obrazu.
  4. Określ średnicę tętnicy, grubość ścianki oraz mikroarchitekturę elastyny i kolagenu przy pozostałych ciśnieniach protokołu.
    1. Powtórzyć 3,1-3,2 przy ciśnieniu 10 i 20 mmHg, powtórzyć 3,3 przy ciśnieniu 20 mmHg.
    2. Powtórzyć 3.1 i 3.2 pod ciśnieniem 40 mmHg.
    3. Powtórzyć 3,1-3,2 przy ciśnieniu 60, 80 i 100 mmHg i powtórzyć 3,3 przy 100 mmHg.
      UWAGA: Ppkt 3.1-3.3 można powtórzyć dla wszystkich ciśnień i kombinacji ciśnień (np. seria/kombinacja rosnących i malejących ciśnień), w zależności od hipotezy, która ma być badana. Eozyna w stężeniu 0,3 - 1 μM może być dodawana w celu wzmocnienia autofluorescencji elastyny w przypadku fotowybielania. Fotowybielania można uniknąć, stosując światło wzbudzające o jak najmniejszej mocy.
    4. Wymienić bufor w komorze miografu na świeży HBS o temperaturze 37 °C po każdym kroku ciśnienia. Pozwól tętnicy przystosować się przez 5 minut przed obrazowaniem po każdej zmianie ciśnienia.
  5. Przechowuj stosy kanałów oddzielnie do analiz obrazów.
  6. Przetestuj żywotność tętnicy.
    1. Zastosować 10 μM U46619 w komorze miografu, a następnie dodać 10 μM bradykininy, gdy zaobserwuje się stabilne zwężenie.
    2. Zapisać średnicę i grubość ścianki, jak opisano powyżej w sekcji 3.1 po zastosowaniu każdego ze związków.
    3. Dodać 3 μM nitroprusydku sodu, gdy tętnica nie jest w pełni rozszerzona po dodaniu bradykininy i zapisz średnicę i grubość ścianki.
      UWAGA: W zależności od właściwości farmakologicznych badanej tętnicy (łożysko naczyniowe i gatunki) można stosować inne związki zwężające naczynia krwionośne i (zależne od śródbłonka) rozszerzające naczynia krwionośne.
  7. Opcjonalnie: Zamocuj tętnicę pod ciśnieniem lub kontynuuj obrazowanie kolagenu i elastyny w celu uzyskania gęstości objętości (krok 7).
    1. Dodać 4% formaldehydu do 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Umyj nieruchomą tętnicę trzy razy w 1x PBS i delikatnie zsuń tętnicę z kaniul, dotykając tylko części tętnicy poza węzłami. Nie usuwaj węzłów, używaj ich do przytrzymywania tętnicy podczas przenoszenia do rurki do przechowywania.
    3. Przechowywać w 1x PBS / 0,05% azydek sodu w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania w celu określenia gęstości objętości elastyny i kolagenu lub w innych celach.
      UWAGA: Stałe tętnice można przechowywać przez co najmniej 3 miesiące w 1x PBS / 0,05% azydku sodu w temperaturze 4 °C.

4. Obliczanie zależności naprężenie-odkształcenie i wewnętrzna sztywność ściany

  1. Postępuj zgodnie ze wzorami i krokami obliczeniowymi do obliczania naprężeń, odkształceń i sztywności ścian zgodnie z opisem Bloksgaard, M. i wsp.13 i odnośniki w niniejszym dokumencie.

5. Analiza obrazu - (wewnętrzna blaszka sprężysta) Kąty rozgałęzień IEL

  1. Otwórz stos obrazów w Fidżi. Przejdź do plik | otwórz obraz, aby wybrać stos obrazów.
    UWAGA: Projekcje maksymalnej intensywności 2-7 kolejnych przekrojów z pokrywających IEL (grubość 1-2 μm) są używane do określania kątów rozgałęziania włókien elastynowych IEL za pomocą narzędzia kąta w Fiji28,35. Patrz Rysunek 4A dla ilustracji.
  2. Przejdź do Obraz | stosy | z projektem..., aby wybrać obrazy i "Projekcja maksymalnej intensywności".
  3. Zapisz projekcję maksymalnej intensywności w formacie TIFF.
  4. Wybierz jak najwięcej punktów rozgałęzień włókien IEL za pomocą "narzędzia kąta" i systematycznie pracuj nad obrazami. Kliknij ctrl + M, aby zmierzyć każdy kąt.
  5. Zapisz arkusz wyników Fidżi.

6. Analiza obrazu - Falistość kolagenu przybyszowego

  1. Otwórz stos obrazów w Fidżi. Przejdź do plik | otwórz obraz, aby wybrać stos obrazów.
    UWAGA: Projekcje maksymalnej intensywności 2-7 kolejnych sekcji Z pokrywających kolagen tuż poza zewnętrzną elastyczną blaszką (EEL, grubość 1-4 μm) są używane do określania falistości kolagenu za pomocą wtyczki Fiji NeuronJ36, zgodnie z opisem Rezakhaniha, R. i wsp. 37(Rysunek 4B).
  2. Ustaw skalę. Przejdź do sekcji Analiza | ustaw skalę, aby wprowadzić wymiary w pikselach.
  3. Przejdź do Obraz | stosy | z projektem..., aby wybrać obrazy do pracy i "Projekcja maksymalnej intensywności".
  4. Zmień Typ obrazu na 8 bitt TIFF, klikając Obraz | type | 8 bitt i zapisz projekcję maksymalnej intensywności jako TIFF.
  5. Zmierz prostoliniowość włókien kolagenowych za pomocą wtyczki Fiji Neuron J.
    1. Otwórz wtyczkę NeuronJ, klikając Fidżi | Wtyczki | Neuron J.
    2. Otwórz 8-bitowy plik TIFF w NeuronJ, klikając Załaduj obraz | Wybierz pozycję Plik.
    3. Kliknij dodaj śledzenie i wybierz włókna do analizy, klikając początek i koniec każdego włókna.
    4. Kliknij opcję Zmierz obrysy, a następnie wybierz opcję Wyświetl obrys (Lf) i pomiary wierzchołków w oknie dialogowym.
  6. Oblicz L0/Lf w Excelu (lub podobnym) i zapisz wyniki.
    1. Skopiuj i wklej dane wyjściowe i wierzchołki Fiji Neuron J do programu Excel (lub podobnego) i oblicz L0 przy użyciu twierdzenia Pitagorasa na podstawie pomiarów wierzchołków. Pierwszy i ostatni punkt na linii wskazują położenie końców przeciwprostokątnej w układzie współrzędnych 2D.
      UWAGA: L0/Lf [wiązka włókien kolagenowych długość od końca do końca za pomocą linii prostej (L0) / pełnej długości (Lf)] bliska 1 wskazuje na prawie proste włókno kolagenowe.

7. Obrazowanie gęstości objętości kolagenu i elastyny

  1. Przemyj (utrwaloną) tętnicę 1x w PBS i wybarwiaj ją przez 15 minut w 1 μM eozynie w 1x PBS w ciemności. W przypadku tętnic stałych wykonaj ten krok w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Eozyna wzmacnia fluorescencję elastyny. Eozyna zabarwi inne struktury, takie jak kolagen i cytoplazma komórkowa, jeśli próbka zostanie pozostawiona w roztworze barwiącym przez dłuższy czas. Jeśli barwienie innych struktur jest zbyt intensywne, zmniejsz stężenie eozyny do 0,3 μM lub powtórz mycie.
  2. Umyj tętnicę 3x w 1x PBS
    1. W przypadku tętnic stałych: zamontuj tętnicę do obrazowania.
      Uwaga: Obrazowanie naczyń bez ciśnienia nie pozwala na uzyskanie żadnych geometrycznych informacji ilościowych. Gdy wymagane są ilości bezwzględne, należy je zawsze uzyskiwać na żywych, ciśnieniowych tętnicach. Za pomocą tej metody można uzyskać proporcje objętości na tętnicach bezciśnieniowych.
      1. Umieść dwa kawałki podwójnej taśmy klejącej w odległości 1-1,5 cm od siebie na szklanym obiekcie. Podwójna taśma klejąca ma grubość około 100 μm. Nałóż jedną lub więcej warstw taśmy, aby dopasować ją do średnicy tętnicy, która ma być zamontowana.
      2. Umieść 10-20 μl PBS na szkle pośrodku kwadratu i umieść tętnicę w kropli PBS.
        UWAGA: Spadek powinien być jak najmniejszy i płaski, aby uniknąć wypchnięcia tętnicy z pozycji podczas montażu szkiełka nakrywkowego.
      3. Umieść szkiełko nakrywkowe i dociśnij do podwójnej taśmy klejącej.
      4. Napełnij zbiornik między szkiełkiem nakrywkowym a szkłem przedmiotowym 1x PBS. Napełniaj go co godzinę, aby uniknąć wysuszenia próbki.
  3. Uzyskaj stosy obrazów dla gęstości objętości kolagenu i elastyny za pomocą obiektywu 20X z NA > 1, aby pokryć jak największą część ściany tętnicy, zachowując jednocześnie dobrą rozdzielczość optyczną (Rysunek 2D, 2G i 2H).
    UWAGA: Użyj obiektywu do zanurzenia w wodzie do obrazowania stałych tętnic pod szkiełkiem nakrywkowym, a do obrazowania ważnych tętnic użyj obiektywu do zanurzania w wodzie. Jeśli obiektyw nie jest wyposażony w kołnierz korekcyjny do korekty grubości szkiełka nakrywkowego, upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest dopasowane do obiektywu. Najlepiej używać optymalnych rozmiarów pikseli i odstępów Z. Oblicz je za pomocą kalkulatora Nyquista (krok 3.3.1.1.). Alternatywnie należy użyć minimalnego rozmiaru piksela 300 nm i odstępu z wynoszącego 1 μm. Zaleca się uzyskanie trzech obrazów wzdłuż długości tętnicy, aby umożliwić użytkownikowi określenie zmienności wewnątrz testu.
  4. Zobrazuj elastynę za pomocą światła wzbudzającego 820 nm i zbierz emisję za pomocą filtra pasmowoprzepustowego o szerokości 30-60 nm wyśrodkowanego na 520 nm.
  5. Zobrazuj kolagen za pomocą światła wzbudzającego 990 nm, aby uniknąć wzbudzenia elastyny i innych białek autofluorescencyjnych oraz zbieraj emisję za pomocą filtra pasmowoprzepustowego o szerokości 10-30 nm wyśrodkowanego na 495 nm.
  6. Zapisywanie stosów obrazów z każdego kanału osobno jako plików TIFF

8. Analiza obrazu do ekstrakcji gęstości objętości elastyny i kolagenu za pomocą Ilastik

  1. Konwertuj stosy obrazów TIFF na HDF5 za pomocą Fiji28,35, klikając Wybierz plik | Zapisz jako... HDF5.
  2. Utwórz dwa foldery plików danych na dysku twardym komputera, jeden odpowiednio dla elastyny, drugi dla stosów obrazów kolagenu. Skopiuj odpowiednie stosy obrazów do odpowiedniego folderu.
  3. Utwórz dwa nowe projekty Ilastik w oprogramowaniu Ilastik, jeden odpowiednio elastyny, drugi kolagenu.
    1. Otwórz Ilastik | Utwórz nowy projekt | Klasyfikacja pikseli | Nowy projekt | Dodaj dane i wybierz folder obrazów utworzony w kroku 8.2.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora Ilastik.
  4. Zaimportuj jeden stos obrazów 3D, aby wytrenować oprogramowanie.
    1. Wybierz aplet Dane wejściowe | główny obszar roboczy | Zakładka Dane surowe | Dodaj nowy ... | Dodaj oddzielne obrazy i wybierz żądane dane obrazu
  5. Wybierz odpowiednie funkcje w oprogramowaniu.
    1. Otwórz aplet wyboru funkcji | Wybierz Cechę, która otwiera nowe okno dialogowe. Zobacz Rysunek 5A, aby uzyskać szczegółowe informacje.
  6. Dodaj co najmniej dwie etykiety za pomocą przycisku Dodaj etykietę w aplecie Trenowanie.
    UWAGA: Każda etykieta będzie odpowiadać typowi obiektu, który musi zostać oddzielony. W tej pracy użyto trzech etykiet dla elastyny: samej elastyny, jasnych punktów (do wykluczenia) i tła (do wykluczenia).
  7. Narysuj etykiety na wierzchu stosu obrazów RAW za pomocą narzędzia adnotacji stylizowanego pędzlem malarskim.
    1. Wybierz odpowiednią etykietę: kliknij narzędzie Pędzel i zacznij rysować.
  8. Monituj Ilastik o przeanalizowanie stosu obrazów i wyszukanie podobnych funkcji, klikając opcję Włącz aktualizację na żywo.
  9. Sprawdź dokładnie mapę predykcji (Rysunek 5D).
    UWAGA: Proces od surowego obrazu do kompletnej mapy predykcyjnej jest pokazany w Rysunek 5. Ilastik wykorzystuje mapę predykcji do segmentacji stosu obrazów, według której etykieta jest bardziej prawdopodobna do powiązania piksela (Rysunek 5D).
  10. Zastosuj próg.
    1. Wybierz aplet Thresholding, wybierz odpowiednią metodę, wprowadź etykietę, parametry filtru smooth, threshold i size, a na koniec kliknij Apply.
      UWAGA: Spowoduje to posegregowanie podobnie oznaczonych części obrazu na odrębne obiekty. Silnie połączone tkanki, takie jak elastyna i kolagen, nie muszą być segregowane, dlatego stosuje się próg 0,4 (wartość domyślna to 0,5). Rysunek 5E i 5F ilustrują wynik zastosowania progu.
  11. Powtarzaj trening Ilastik, aż wynik będzie zadowalający (w odpowiednich analizach rozpoznawane są tylko elastyna lub kolagen).
    1. Podczas tego procesu często przełączaj się między apletami trenowania i segmentacji (a czasami także progowania). Przykład efektu ponownego trenowania Ilastik pokazano w Rysunek 6.
  12. Analiza wsadowa podobnych danych obrazu: wybierz wybór danych wejściowych predykcji wsadowej i dodaj odpowiednie pliki.
    UWAGA: Dane wyjściowe Ilastik to zbiór pseudo-1-bitowych stosów obrazów 3D (masek obrazu), gdzie 0 (zero) oznacza brak elastyny (lub kolagenu), a 1 (jeden) oznacza obecność tego elementu (rzeczywista głębia bitowa to 8 bitów).
  13. Sprawdź wyniki dla każdego stosu obrazów, porównując wizualnie maski obrazów i pliki obrazów RAW.
  14. Zoptymalizuj maskę Ilastik (kroki 8.4-8.9) i ponownie przeanalizuj wszystkie stosy obrazów z niezadowalającymi wynikami.
  15. Obliczanie gęstości objętości elastyny i kolagenu z masek obrazowych Ilastik za pomocą MATLAB
    1. Otwórz program MATLAB.
    2. Wybierz folder z maskami obrazu ilastik w oknie "bieżący folder" w MATLAB.
    3. Skopiuj skrypt MATLAB z pliku uzupełniającego 1 do edytora MATLAB i zapisz kod jako volumeCalculator.m w folderze MATLAB na dysku twardym komputera.
    4. Wprowadź rozmiary i wysokość pikseli w wierszach skryptu
      pixelSize = 0,1230000*0,1230000; %mikron*mikron
      pixelHeight = 0,9; % mikronów
    5. Zapisz skrypt.
    6. Przejdź do okna poleceń MATLAB i wpisz "volumeCalculator('ścieżka do danych')", aby załadować skrypt.
    7. Kliknij Enter. Każda maska obrazu jest teraz sumowana i mnożona przez (znaną) objętość piksela/woksela (fizyczne wymiary piksela pomnożone przez rozdzielczość osi z). Dane wyjściowe z MATLAB to całkowita objętość elastyny i kolagenu w każdym stosie obrazów.
  16. Zapisz wyniki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specjalnie zbudowany miograf ciśnienia do obrazowania używany w tej pracy jest pokazany w Rysunek 1. Szczególną uwagę przy projektowaniu miografu zwrócono na i) komorę o małej objętości (2 ml) oraz ii) możliwość umieszczenia kaniul blisko i równolegle do szklanego dna (Ryc. 1B). Na dnie komory mieści się szklane szkiełko nakrywane 50 × 24 mm #1,5 (wymienne). Regulator ciśnienia został zbudowany ze standardowej szklanej butelki o pojemności...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta stanowi naszą sugestię dotyczącą znormalizowanego, połączonego podejścia do obrazowania i miografii ciśnieniowej, cennego dla jednoczesnej oceny właściwości mechanicznych tętnic oporowych i związanych z ciśnieniem zmian w strukturze ściany tętnicy w zakresie ciśnienia od 0 do 100 mmHg. Przedstawione podejście zostało opracowane przy użyciu specjalnie skonstruowanego sprzętu, jednak można użyć dowolnego miografu ciśnieniowego, który pasuje do mikroskopu fluorescencyjnego wzbudzenia dwufotonowego, gdy konstrukcja ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Duńskiemu Centrum Obrazowania Biomedycznego na Wydziale Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Południowej Danii za korzystanie z laboratoriów i mikroskopów. Kristoffer Rosenstand i Ulla Melchior są znani z doskonałej pomocy technicznej w zakresie miografii ciśnieniowej i obrazowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Narzędzia Fine Science15401-12
Narzędzia Fine Science11251-23
NikonSMZ800N
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.761028do celów preparacyjnych
Vitrex Medical A/S, Herlev, Dania1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, Wielka Brytania
EthiconEthilon 11-0
ZbudowanyDK numer patentu 201200167, Uniwersytet Południowej Danii, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.B3259
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.A7030
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.C5670
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.G7021
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Dania1.00496.9010Buforowany fosforanem (pH 6,9) 4% roztwór formaldehydu 
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.H3784
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.P9666
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.P5655
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.M2643
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.S2002
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.S5886
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.S5761
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.PHR1423
  Sigma-Aldrich, Brø ndby, Dania.Z370525
  Tocris Bioscience, Bristol, Wielka Brytania538944
NikonCustom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, DaniaH7422P-40
Akcje AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Niemcy).ChromaET 460 nm długoprzepustowy dichroiczny
AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Niemcy).Filtr Semrock FF01-520/35-25 BrightLine
AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Niemcy).Chroma ET402/15X 
Grubość szkiełka nakrywkowego Scotch TM powinna pasować do używanego obiektywu pod mikroskopem (#1 lub #1.5), alternatywnie ustaw kołnierz regulacyjny tak, aby pasował do szkiełka
na zamówienie nakrywkowego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001(2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108(2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022(2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285(2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058(2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998(2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760(2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111(2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Collagen Elastin MicroarchitectureResistance Artery MechanicsLabel free Fluorescence MicroscopyTwo photon Excitation ImagingElastin AutofluorescenceCollagen Second Harmonic GenerationFiji Image AnalysisIlastik Software AnalysisPressure induced Vascular ChangesExtracellular Matrix Quantification

Related Articles