Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glejak wielopostaciowy (GBM), najczęstszy i najbardziej agresywny pierwotny rak mózgu, prowadzi do 12-15 miesięcy. Krótka oczekiwana długość życia wynika częściowo z niezdolności obecnego leczenia, składającego się z chirurgicznej resekcji, a następnie radioterapii i chemioterapii, w celu wyeliminowania inwazyjnych ognisk nowotworowych. Leczenie tych ognisk może być ulepszone dzięki rakobójczym ludzkim mezenchymalnym komórkom macierzystym (MSC). MSCs wykazują silny tropizm nowotworowy i mogą być modyfikowane do ekspresji białek terapeutycznych, które zabijają komórki nowotworowe. Postępy w modelach przedklinicznych wskazują, że resekcja chirurgiczna powoduje przedwczesną utratę MSC i zmniejsza skuteczność terapeutyczną. Skuteczność zabiegu MSC można poprawić, wysiewając MSCs na biodegradowalnym rusztowaniu z poli(kwasu mlekowego) (PLA). Dostarczenie MSC do jamy resekcji chirurgicznej na rusztowaniu PLA przywraca retencję komórek, trwałość i zabijanie guza. Aby zbadać wpływ implantacji PLA zasianego przez MSC na GBM, potrzebny jest dokładny model przedkliniczny. W tym miejscu przedstawiamy przedkliniczny protokół chirurgiczny do sterowanej obrazem resekcji guza GBM u myszy z niedoborem odporności, a następnie implantacji rusztowania z nasionami MSC. MSCs są modyfikowane przy użyciu konstruktów lentiwirusowych w celu konstytutywnej ekspresji i wydzielania terapeutycznego liganda indukującego apoptozę związanego z TNFα (TRAIL), a także białka zielonej fluorescencji (GFP), aby umożliwić śledzenie fluorescencyjne. Podobnie, komórki nowotworowe U87 są zaprojektowane do ekspresji lucyferazy mCherry i świetlika, zapewniając podwójne śledzenie fluorescencyjne / luminescencyjne. Chociaż protokół ten jest obecnie stosowany do badania dostarczania leków za pośrednictwem komórek macierzystych, może zostać zmodyfikowany w celu zbadania wpływu resekcji chirurgicznej na inne interwencje GBM.
Wprowadzenie
Glioblastoma (GBM) jest najczęstszym pierwotnym nowotworem mózgu u dorosłych, charakteryzującym się bardzo niską medianą przeżycia wynoszącą zaledwie 12-15 miesięcy1,2,3,4,5. Przeżywalność nie uległa znaczącej poprawie od 2005 roku, kiedy wprowadzono obecny standard kliniczny polegający na maksymalnej resekcji chirurgicznej, po której następowało naświetlanie oraz towarzysząca i uzupełniająca chemioterapia temozolomidem6,7. Choć leczenie to zapewnia....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill.
UWAGA: Ta procedura jest wykonywana na myszach z otwartą kraniotomią, jako zmodyfikowana wersja protokołu przez Mostany i Portera-Cailliau19, w którym tkanka kostna, która jest usuwana chirurgicznie, jest odrzucana, pozostawiając mózg dostępny do ustalenia i ewentualnej resekcji guzów GBM. Po kraniotomii guzy są ustalane za pomocą implantacji stereotaktycznej, jak opisano w Ozawa i James20. Wszczepiamy 1 x 105
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórki nowotworowe U87 zostały zmodyfikowane w celu ekspresji mCherry oraz lucyferazy świetlika (U87 mCh-Fl) przed wstrzyknięciem, aby umożliwić resekcję pod kontrolą obrazowania oraz śledzenie bioluminescencyjne (Rysunek 2A-C). Komórki macierzyste zostały w podobny sposób zmodyfikowane za pomocą diagnostycznej GFP-Rluc (MSC-GFP) lub terapeutycznej GFP-TRAIL (MSC-TRAIL), a następnie wysiane na rusztowania z PLA w celu potwierdzenia ich przyc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Operacja może być zazwyczaj zakończona w ciągu 30 minut na mysz, biorąc pod uwagę, że następujące punkty są brane pod uwagę, aby zmaksymalizować precyzję i uniknąć czasochłonnych pułapek. Po pierwsze, upewnij się, że mysz jest prawidłowo umieszczona w instrumencie stereotaktycznym przed rozpoczęciem procedury. Niepożądane ruchy głowy ograniczą dokładność chirurgiczną kraniotomii, lokalizację implantacji guza i stopień resekcji guza. Przed resekcją należy całkowicie usunąć część opony twardej pokrywającą guz. Twarda, włók.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doktorzy Sheets, Bagó i Hingtgen mają udziały w firmie Falcon Therapeutics, która uzyskała licencję na aspekty technologii komórek macierzystych i rusztowań od UNC Chapel Hill.
Podziękowania
Autorzy doceniają wkład redakcyjny dr Kathryn Pietrosimone. Rusztowania PLA zostały wyprodukowane przez laboratorium dr Elizabeth Loboa na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej. Prace te były wspierane przez Uniwersytecki Fundusz Badań nad Rakiem UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center oraz UNC Translational and Clinical Sciences Institute (KL2TR001109, UL1TR001111).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tylko dla myszy instrument stereotaktyczny | Stoelting | 51730 | Utrzymuje stabilną pozycję głowy podczas operacji |
| Mikroskop stereoskopowy fluorescencyjny | Leica | M165 FC | Umożliwia obrazowanie guza w czasie rzeczywistym podczas resekcji |
| Zmotoryzowany zintegrowany system wtryskiwacza stereotaktycznego (ISI) | Stoelting | 53315 | Umożliwia precyzyjną objętość i szybkość wstrzykiwania komórek nowotworowych |
| Klej tkankowy Vetbond | 3M | 1469 | Klej sugiczny do zamykania ran skóry |
| Sztuczne łzy | Akorn | 664268 | Zapobiega wysuszaniu oczu podczas operacji |
| Alkohol Webcol przygotowuje | Covidien | 6818 | Sterylizuj miejsce nacięcia |
| Peeling chirurgiczny Betadine | Purdue Fredick Company | 6761815117 | Sterylizuj miejsce nacięcia |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką | Fisherbrand | 23-400-115 | Narzędzie chirurgiczne |
| System aspiracyjny E-vac | Argos | EV310 | Pompa próżniowa używana do resekcji guza |
| Fibrynogen i trombina ekstrahowane z otrzymanego TISSEEL | Baxter | Aby tymczasowo zabezpieczyć rusztowanie w jamie resekcyjnej | |
| IVIS Kinetyczny system obrazowania optycznego in vivo | Suwmiarka Nauki przyrodnicze | Obrazowanie bioluminescencyjne | |
| Sól potasowa D-Lucyferyna | PerkinElmer | 122799 | Środek do obrazowania in vivo |
Bibliografia
- Adamson, C., et al. Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going. Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).
- Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E. Advances in Brain Tumor ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
