Eksperymentalna procedura immunofenotypowania mysich ortotopowych homograftów PDAC ma na celu profilowanie immuno-mikrośrodowiska guza. Guzy są wszczepiane ortotopowo za pomocą operacji. Guzy o wielkości 200–600 mm3 pobrano i zdysocjowano w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych, a następnie przeprowadzono analizę FACS pod kątem wielu markerów immunologicznych przy użyciu różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunofenotypowanie homograftu ortotopowego (syngenecznego) mysiego pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki KPC za pomocą cytometrii przepływowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Guzy homograftowe (syngeniczne) są koniem pociągowym dzisiejszych badań przedklinicznych immunoonkologii (I/O). Mikrośrodowisko guza (TME), a w szczególności jego składniki immunologiczne, ma zasadnicze znaczenie dla rokowania i przewidywania wyników leczenia, zwłaszcza immunoterapii. Składniki immunologiczne TME składają się z różnych podzbiorów komórek odpornościowych naciekających nowotwór, które można ocenić za pomocą wielokolorowego FACS. Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów złośliwych, w przypadku których brakuje dobrych opcji leczenia, a zatem pilną i niezaspokojoną potrzebą medyczną. Jednym z ważnych powodów braku reakcji na różne terapie (chemo-, celowane, I/O) jest obfitość TME, składającego się z fibroblastów i leukocytów, które chronią komórki nowotworowe przed tymi terapiami. Uważa się, że ortotopowo wszczepiony PDAC dokładniej wychwytuje TME ludzkiego raka trzustki niż konwencjonalne modele podskórne (SC).
Guzy homograftów (KPC) to przeszczepy spontanicznego PDAC myszy pochodzących od genetycznie zmodyfikowanych myszy KPC (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-C re) (KPC-GEMM). Pierwotna tkanka nowotworowa jest cięta na małe fragmenty (~2mm3) i przeszczepiana podskórnie (SC) biorcom syngenicznym (C57BL/6, 7–9 tygodni). Homografty zostały następnie chirurgicznie ortotopowo przeszczepione do trzustki nowych myszy C57BL/6, wraz z implantacją SC, która osiągnęła objętość guza 300-1000 mm3 w ciągu 17 dni. Tylko guzy o wielkości 400–600mm3 zostały pobrane zgodnie z zatwierdzoną procedurą autopsji i oczyszczone w celu usunięcia sąsiednich tkanek nienowotworowych. Zostały one zdysocjowane zgodnie z protokołem za pomocą dysocjatora tkankowego na zawiesiny jednokomórkowe, a następnie wybarwione wyznaczonymi panelami fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał dla różnych markerów różnych komórek odpornościowych (limfoidalnych, szpikowych i NK, DC). Barwione próbki analizowano przy użyciu wielokolorowego FACS w celu określenia liczby komórek odpornościowych różnych linii, a także ich względnego procentu w obrębie guzów. Profile immunologiczne guzów ortotopowych porównano następnie z profilami immunologicznymi guzów SC. Wstępne dane wykazały znacznie podwyższone naciekające TIL/TAM w guzach nad trzustką oraz wyższą infiltrację komórek B do guzów ortotopowych, a nie SC.
Wprowadzenie
Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) powoduje prawie pół miliona zgonów rocznie na całym świecie, jest jednym z 5 głównych zabójców raka. Istnieje niewiele skutecznych opcji leczenia i nie ma zatwierdzonych immunoterapii; Dlatego pilnie potrzebne są nowe metody leczenia. Nowotwory są coraz częściej uznawane za choroby immunologiczne, w tym PDAC, oprócz chorób genetycznych, jakie są obecnie znane. Czynniki immunologiczne i genetyczne prawdopodobnie decydują o rokowaniu choroby, a także o wynikach leczenia. Guzy unikają nadzoru immunologicznego gospodarza i ostatecznie rozwijają się, powodując śmierć. Wiele z tych procesów immunologicznych zachodzi w mikrośrodowisku guza (TME)1,2,3,4, gdzie różne typy komórek odpornościowych oddziałują z komórkami nowotworowymi, ze sobą nawzajem i z innymi składnikami zrębu guza, bezpośrednio lub pośrednio za pośrednictwem cytokin, które ostatecznie decydują o wyniku choroby. Dlatego charakterystyka składników immunologicznych nowotworu TME, czyli immunofenotypowanie nowotworu, w tym podtypowanie, numeracja i lokalizacja różnych linii komórek odpornościowych, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia odporności przeciwnowotworowej. W przypadku PDAC zaproponowano, że podwyższone makrofagi supresyjne naciekające nowotwór (TAM) i limfocyty B doprowadziły do zapobiegania infiltracji i/lub aktywacji komórek T oraz wysokiego poziomu zwłóknienia5,6.
Powszechnym podejściem do eksperymentalnego badania immunologicznych TME byłoby użycie zastępczych przedklinicznych modeli zwierzęcych, głównie odpowiednich mysich modeli nowotworów7, szczególnie mysich syngenicznych (homograft) lub genetycznie modyfikowanych mysich modeli mysich (GEMM) nowotworów, na zakładanym podobieństwie myszy i człowieka pod względem nowotworów i odporności8,9. W rzeczywistości rozumie się, że istnieją nieodłączne różnice między tymi dwoma gatunkami10,11.
Przeszczepione nowotwory myszy mają znaczącą przewagę operacyjną nad spontanicznymi nowotworami7, mianowicie zsynchronizowany rozwój guza, w przeciwieństwie do rodzicielskiego spontanicznego rozwoju guza GEMM. Homografty spontanicznych guzów mysich są uważane za guzy pierwotne, które nigdy nie były manipulowane in vitro i odzwierciedlają oryginalną histologię / molekularną guza myszy7, a także możliwe profile immunologiczne. Te mysie homografty są często uważane za "mysią wersję ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX)". W związku z tym prawdopodobnie mają lepszą translatowalność niż konwencjonalne nowotwory myszy pochodzące z syngenicznej linii komórkowej12. W szczególności wiele homograftów pochodzi ze specyficznego genu genu GEMM, w którym zmodyfikowane są specyficzne mechanizmy chorobowe u ludzi, np. onkogenne mutacje powodujące, a zatem homografty te powinny mieć korzystne znaczenie kliniczne. W szczególności KPC GEMM rozwija mysi PDAC w ciągu 15–20 tygodni, który morfologicznie podsumowuje ludzką chorobę z przeważnie dobrze lub umiarkowanie zróżnicowaną architekturą gruczołową i wysoce wzbogaconym zrębem. Model ten podsumowuje również najczęstsze cechy genetyczne ludzkiego PDAC, a mianowicie mutację aktywującą Kras i utratę funkcji P53, które występują odpowiednio u 90% i 75% ludzkiego PDAC5,6.
Miejsca transplantacji również zostały zasugerowane jako odgrywające rolę w przekładalności modelu. Specyficzne środowisko otaczających tkanek, takie jak odpowiednie środowisko ortotopowe, może być niszą dla rozwoju określonych nowotworów, w przeciwieństwie do jednolitych środowisk podskórnych (SC) dla powszechnie przeszczepianych guzów. Szczególnie interesujące byłoby ustalenie i/lub jaka jest różnica między tymi dwoma miejscami przeszczepu pod względem mikrośrodowiska immunologicznego oraz znaczenia dla nowotworów u ludzi, np. w przypadku PDAC.
Jednym z najważniejszych aspektów profilowania immunologicznego, czyli immunofenotypowania, jest określenie infiltrujących nowotwór komórek odpornościowych różnych linii, liczb, względnego procentu w obrębie guzów, jak również ich stanów aktywacji i lokalizacji. Obejmuje to limfoctyesy naciekające nowotwór (TIL, zarówno T, jak i B-), makrofagi naciekające nowotwór (TAM), komórki NK naciekające nowotwór i komórki dendrytyczne rezydujące w nowotworze3,13,14,15,16,17, oraz subkomórkowa lokalizacja niektórych komórek18,19,20, itd. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) lub cytometria przepływowa to technologia wykrywania pojedynczych komórek, która jest powszechnie stosowana do pomiaru określonych parametrów komórki. Wielokolorowa cytometria przepływowa mierzy wiele markerów na pojedynczej komórce3,4,21 i jest najczęściej stosowaną metodą określania liczby i względnego procentu różnych podzbiorów komórek odpornościowych, w tym komórek w obrębie nowotworów.
Ten raport opisuje procedury profilowania komórek odpornościowych naciekających nowotwór: 1) Implantacja ortotopowych homograftów guza myszy PDAC, wraz z implantacją SC; 2) pobieranie tkanki nowotworowej i przygotowanie pojedynczych komórek poprzez dysocjację guza; 3) analiza cytometrii przepływowej wszystkich komórek pochodzących z nowotworów jako punkt odniesienia; 4) Porównanie profili wyjściowych obu podejść do transplantacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły i poprawki lub procedury związane z opieką i użytkowaniem zwierząt zostaną przejrzane i zatwierdzone przez Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) przed przeprowadzeniem badań. Opieka nad zwierzętami i ich wykorzystywanie będą zazwyczaj prowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care), jak podano w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, National Research Council (2011). Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach będą odbywać się w sterylnych warunkach w obiektach SPF (wolnych od określonych patogenów) i będą prowadzone w ścisłej zgodności z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych różnych instytucji rządowych (np. Narodowych Instytutów Zdrowia). Protokół będzie musiał zostać zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach w instytucji placówki (np. instytucjonalnym Komitecie IACUC).
1. Przygotowanie do przeszczepu guza
- Pomieszczenia dla zwierząt
- Zdobądź generyczne myszy C57BL/6 od komercyjnego dostawcy hodowlanego.
- Myszy domowe (5) w indywidualnych wentylowanych klatkach w następujących warunkach: Temperatura: 20–26 °C; wilgotność 30–70%; cykl oświetlenia: 12 godzin światła i 12 godzin ciemności.
- Używaj ściółki z kolb kukurydzy, która jest zmieniana co tydzień.
- W przypadku diety należy zapewnić sterylizowany promieniowaniem suchy granulat żywności przez cały okres badania.
- Jeśli chodzi o wodę, zapewnij zwierzętom swobodny dostęp do sterylnej wody pitnej.
- Przygotowanie fragmentu guza dawcy
- Zacznij od monitorowania masy ciała (BW), poprzez ważenie za pomocą wagi, oraz objętości guza (TV), poprzez pomiar suwmiarkowy, myszy dawców z nowotworem.
- Gdy telewizja osiągnie 500–1200 mm3, poddaj zwierzę eutanazji w kapturze chroniącym przed zagrożeniem biologicznym zgodnie z protokołem.
- Wysterylizuj skórę wokół guza za pomocą wacików jodoforowych.
- Chirurgicznie usunąć guz (szczegóły opisane w sekcji 3: Sekcja zwłok i pobieranie guza) i umieścić guz na szalce Petriego zawierającej 20 ml PBS (przed eutanazją zwierząt należy wstępnie schłodzić pożywkę lub bufor do 4 °C).
- Jeśli krew jest zanieczyszczająca, przenieś guz na inną szalkę Petriego i umyj guz PBS.
- Przeciąć guz na pół, usuwając dodatkową skórę, naczynia, zwapnienia i/lub martwicę.
- Wybierz tylko nienaruszone fragmenty guza i umieść je w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 20 ml PBS, a następnie przetransportuj probówkę do oddzielnego pomieszczenia dla zwierząt w celu badań farmakologicznych.
2. Wszczepienie ortotopowe i podskórne (SC)
- Szczepienie SC
- Pokrój guzy na kawałki o średnicy 2 mm za pomocą skalpela, wkładając 1 kawałek do każdego trokaru, w celu implantacji SC lub późniejszej implantacji ortotopowej (patrz poniżej).
- Znieczulić zwierzę biorcy 5% izofluranem, który jest utrzymywany przez stożek nosowy w poziomie 1%. Zwierzę zacznie się relaksować, tracąc odruch prostowania i ostatecznie stanie się nieruchome. Na tej głębokości znieczulenia mogą być łatwo obudzone przez bolesne bodźce; Pozwól, aby znieczulenie się pogłębiło, aż takie reakcje na ból znikną.
- Po znieczuleniu unieruchomij myszy na tablicy eksperymentalnej w odpowiedniej pozycji bocznej. Wysterylizuj mysz za pomocą wacików jodoforowych, szczególnie obszarów otaczających guzy.
- Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry o długości od 0,5 do 1,0 cm na lewym boku, tuż przy czaszce do biodra.
- Tunel pod skórą w kierunku kończyny przedniej, dwa do trzech centymetrów, za pomocą kleszczy.
- W asepcie przenieś jedną kostkę guza z pożywki i umieść ją głęboko w tunelu podskórnym.
- Wizualnie potwierdź, że guz znajduje się głęboko w tunelu (a nie w nacięciu skóry).
- Zamknij ranę klipsami do ran.
- Monitorować zwierzęta po zaszczepieniu, aż odzyskają wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Zwierzęta należy przywrócić do klatki dopiero po ich pełnym wyzdrowieniu ze znieczulenia. Wypełnij Dziennik Anestezjologii i rozpocznij Kartę Zdrowia Zwierząt. Ważenie zwierząt biorców codziennie przez trzy dni
- W przypadku standardowej procedury należy zaszczepić 5-10 myszy na grupę w celu monitorowania wzrostu guza.
- Ortotopowa implantacja trzustki
- Znieczulenie i analgezja
- Użyj 2 ml ketaminy do wstrzykiwań i 0,42 ml ksylazyny do wstrzykiwań (20 mg/ml) zmieszanych z 5,91 sterylną wodą do wstrzykiwań lub solą fizjologiczną w objętości dawki 0,06–0,1 ml/20-25 g masy ciała.
UWAGA: Zgodnie z dobrostanem zwierząt analgezja jest konieczna zarówno przed, jak i po operacji. 0,05–0,1 mg buprenorfiny/kg, SC. Pierwsza dawka jest podawana przed operacją, a następnie dozowana 3 razy co 4 godziny po operacji w sposób ciągły.
- Użyj 2 ml ketaminy do wstrzykiwań i 0,42 ml ksylazyny do wstrzykiwań (20 mg/ml) zmieszanych z 5,91 sterylną wodą do wstrzykiwań lub solą fizjologiczną w objętości dawki 0,06–0,1 ml/20-25 g masy ciała.
- Operacja chirurgiczna w celu implantacji ortotopowej
- Znieczulić myszy przez wstrzyknięcie domięśniowe (IM) zgodnie z krokiem 2.2.1.
- Po całkowitym znieczuleniu zwierząt zamocuj myszy na tablicy doświadczalnej w odpowiedniej pozycji bocznej.
- Utrzymuj myszy we właściwej pozycji bocznej. Zdezynfekuj skórę wokół śledziony jodem, a następnie odjoduj 75% alkoholem etylowym.
- Znajdź środkowy punkt śledziony i wykonaj 1 cm pionowe nacięcie na brzuchu, aby odsłonić śledzionę.
- Delikatnie wyciągnij część tkanki trzustki pod śledzioną za pomocą pęsety z płaską końcówką i zszyj fragment guza homoprzeszczepu myszy z myszy nasiennej na trzustce myszy biorcy za pomocą wchłanialnego szwu chirurgicznego 9-0.
- Zamknij brzuch jedwabnym szwem 6-0 podwójnym szwem. Osiągnij homeostazę przez kompresję.
- Po zakończeniu implantacji guza, jeśli nie wystąpi krwawienie ani wyciek tkanki nowotworowej, należy trzymać zwierzęta w ciepłej klatce.
- Monitorować zwierzę do momentu, gdy odzyska przytomność wystarczającą do utrzymania pozycji leżącej mostka; po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia należy je umieścić w pomieszczeniu dla zwierząt. Monitoruj myszy z guzem, badając palpacyjnie brzuch w pobliżu śledziony i wybierz myszy z guzami ortotopowymi.
- Znieczulenie i analgezja
- Monitorowanie stanu zdrowia myszy z nowotworem
- Codziennie sprawdzaj spożycie wody i żywności.
- Zbadaj wygląd myszy pod kątem niezadbanej sierści, grudek, cienkiej skóry, nieprawidłowego oddechu lub wodobrzusza.
- Zbadaj palpacyjnie brzuch, aby sprawdzić, czy nie ma spontanicznych guzów na wątrobie lub śledzionie.
- Waż myszy co tydzień za pomocą wagi.
- Jeśli zaobserwuje się którykolwiek z następujących objawów klinicznych, myszy są poświęcane w celu pobrania próbki i przeprowadzenia sekcji zwłok: utrata masy ciała >20%; upośledzenie ruchomości (niezdolność do jedzenia lub picia); niezdolność do normalnego poruszania się z powodu znacznego wodobrzusza i powiększonego brzucha; wysiłek w oddychaniu.
3. Sekcja zwłok i żniwa nowotworów
- Sprawdź wzrokowo i palpacyjnie pod kątem obecności wyczuwalnych palpacyjnie guzów przed zakończeniem.
- Aby zakończyć terminację, najpierw poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem, otwórz brzuch i wizualnie zbadaj trzustkę pod kątem guzów.
- Odetnij guz za pomocą operacji po śmierci i dodaj go do zimnego PBS. Umieść wszystkie zwierzęta w czystej, nienaładowanej, półprzezroczystej komorze eutanazyjnej ze specjalną pokrywą z portem do dostarczania dwutlenku węgla, który ma być użyty.
- Odprowadzać gaz do komory z natężeniem przepływu, które powoduje szybką utratę przytomności przy minimalnym stresie zwierzęcia. Optymalne natężenie przepływu dla CO2 powinno wynosić około 2–2,5 l/min.
- Obserwuj wzrokowo każde zwierzę podczas procedury eutanazji, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta otrzymują odpowiednie stężenie gazu i nie odzyskują przytomności podczas procedury eutanazji.
- Utrzymuj przepływ gazu przez co najmniej 1 minutę po pozornej śmierci klinicznej, aby zminimalizować możliwość wyzdrowienia zwierzęcia (jeśli ma bezdech, ale nie jest martwe).
- Usuń sąsiednie tkanki nienowotworowe. Oczyszczony guz można szybko sfotografować.
Umieść tkanki nowotworowe w RPMI-1640 i trzymaj na lodzie przed dysocjacją.
UWAGA: Tusze zwierzęce są pakowane w worki i przechowywane w odpowiedniej zamrażarce w oczekiwaniu na wyjęcie.
4. Dysocjacja tkanki nowotworowej i przygotowanie pojedynczych komórek
- Przygotowanie odczynnika
UWAGA: Zestaw do dysocjacji guza zawiera 2 fiolki enzymu D (liofilizowany proszek), 1 fiolkę enzymu R (liofilizowany proszek), 1 fiolkę enzymu A (liofilizowany proszek) i 1 ml buforu A.- Przygotować enzym D, rozpuszczając liofilizowany proszek w każdej fiolce w 3 ml RPMI-1640. Przygotować porcje o odpowiedniej objętości, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
- Przygotuj enzym R, rozpuszczając liofilizowany proszek w fiolce w 2,7 ml RPMI 1640. Przygotować porcje o odpowiedniej objętości, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
- Przygotować enzym A, rozpuszczając liofilizowany proszek w fiolce z 1 ml buforu A dostarczonego z zestawem. Nie wirować. Przygotować podwielokrotności o odpowiedniej objętości, aby uniknąć powtarzających się cykli swobodnego rozmrażania.
- Przygotuj mieszankę enzymów, dodając 2,35 ml RPMI-1640, 100 μl enzymu D, 50 μl enzymu R i 12,5 μl enzymu A do każdej probówki C gentleMACS.
- Dysocjacja guza
- Dla każdego guza należy przygotować jedną rurkę C z mieszanką do trawienia guza, należy zapoznać się z sekcją 4.1 dotyczącą rozcieńczania i przygotowania buforu trawiennego.
- Użyj 3 ml buforu do wytrawiania dla fragmentów guza <0,8 g i upewnij się, że guz jest w pełni strawiony.
- Etykieta z kodem badania, guzem, identyfikatorem myszy, grupą leczoną i masą guza.
- Zbierz guz od myszy, umyj guz w zimnym PBS i oczyść tkankę przyczepioną do guza (taką jak naczynia krwionośne, tłuszcz, powięź itp.).
- Umieść guz w pożywce trawiącej w jednym dołku sterylnej 6-dołkowej płytki.
- Przytrzymaj guz na miejscu za pomocą sterylnej pęsety/kleszczy i pokrój skalpelem. Pokrój guz na tyle dobrze, aby rozbić się na mniejsze kawałki (~1 mm3).
- Umieść kawałki guza z powrotem w C-probówce i użyj pozostałego buforu do wytrawiania, aby umyć płytkę, a następnie przenieś płyn do C-probówki, która jest umieszczona na lodzie aż do trawienia.
- Włączyć dysocjator z grzejnikami.
- Umieść rurki C dysocjacji guza do góry nogami w tulejach wolnych pozycji i dostosuj stan pozycji rurki od Swobodnej do Wybranej. Wybierz program rozdzielający (37_c_m_TDK_1), a następnie wybierz żądany folder, w którym wyświetlana jest lista programów.
- Po zakończeniu programu zdjąć rurki C z dysocjatora i krótko odwirować (300 x g, 4 °C) w celu osadzenia próbki.
- Ponownie zawiesić próbki i umieścić w sitku do komórek nad probówką o pojemności 50 ml. Przemyć komórki przez sitko komórkowe z 10 ml buforu do przemywania w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
- Odwirować probówki o sile 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu do przemywania wodą, policzyć żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i/lub licznika komórek i dostosować stężenie komórek do 1 x 10,6 komórek na probówkę lub na próbkę. Dołącz odpowiednie przeciwciała kontrolne izotypu, aby upewnić się, że barwienie jest specyficzne
5. Projektowanie panelu immunologicznego i pozyskiwanie danych przepływu
- Projektowanie paneli
- Patrz tabela 1.
- Barwienie immunologiczne
- Komórki próbki Fc-Block: ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego z 1 μg/ml Fc-Block, a następnie inkubować na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
- Wybarwić komórki za pomocą pożądanych paneli przeciwciało/fluorescencyjnych (np. Panel limfocytów T, panel makrofagów itp.): Dodać mieszaninę przeciwciał rozcieńczoną w buforze blokującym Fc do każdej próbki, barwić przez co najmniej 30 minut na lodzie w ciemności.
- Dodać 1 ml lodowatego PBS do każdej probówki i delikatnie ponownie zawiesić komórki, a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Wyrzucić powstały supernatant.
- Powtórz tę czynność, aby dwukrotnie umyć komórki.
- W razie potrzeby wybarwić markery wewnątrzkomórkowe, wykonując kroki 6-10, w przeciwnym razie przejdź do kroku 10.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą wiru pulsacyjnego i dodać 200 μl przygotowanego roztworu roboczego do utrwalania/przepuszczalności dla każdej próbki. Ponownie wykonać wir pulsacyjny, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez noc (preferowane) lub 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Odwiruj komórki i usuń supernatant.
- Przemyć dwukrotnie, dodając 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego (sporządzonego z 10x buforu permeabilizacyjnego, rozcieńczonego destylowanymH2O), a następnie odwirować i zdekantować supernatant.
- Dodaj wewnątrzkomórkowe przeciwciało markerowe do 1x buforu permeabilizacyjnego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
- Umyj komórki dwukrotnie 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować i zdekantować supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w 150 μl buforu barwiącego i przeanalizować na cytometrze. Ze względu na procedurę utrwalania i przepuszczalności, rozkład FSC (rozproszenie światła do przodu)/SSC (rozpraszanie światła bocznego) populacji komórek będzie inny niż w przypadku żywych komórek. W związku z tym bramka i napięcia będą musiały zostać zmodyfikowane.
- Kontrole FMO (fluorescencja minus jedna kontrola)
UWAGA: Wielokolorowa analiza przepływu jest szczególnie ważna w przypadku analizy komórek odpornościowych naciekających nowotwór. W związku z tym istnieje potrzeba znalezienia sposobu na identyfikację i bramkę komórek w kontekście rozprzestrzeniania się danych ze względu na wiele fluorochromów w danym panelu. Kontrola FMO (Fluorescence Minus One) jest ważnym podejściem do tego celu.- W tym celu należy włączyć dodatkowe myszy do każdej grupy do kontroli FMO (co najmniej 2 na Rx) i przetwarzać indywidualnie dla każdej tkanki. Po dysocjacji tkanki basenowe. Na przykład w badaniu z 4 grupami Rx 8 dodatkowych guzów powinno być przetwarzanych indywidualnie, a następnie łączonych w jedną próbkę dla FMO.
- Konfiguracja przyrządu przepływu
- Wykonaj koraliki kompensacyjne podczas rozgrzewania się maszyny (co najmniej 20 min).
- Użyj koralików CS&T, aby sprawdzić wydajność.
- Ustawienia napięcia i kompensacji: użyj koralików UltraComp, przed użyciem dokładnie wymieszaj koraliki Comp.
- Oznaczyć oddzielną probówkę z próbką o wymiarach 12 x 75 mm2 dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem.
- Do każdej probówki dodać 100 μl buforu barwiącego. Dodaj 1 pełną kroplę (około 60 μl) kulek do każdej probówki.
- Dodać przeciwciała i przeprowadzić procedurę barwienia dokładnie tak, jak proces pobierania próbki opisany w sekcji 4.
- Dodaj po 0,5 ml buforu barwiącego, aby całkowicie ponownie zawiesić granulki kulek przez wir.
- Ustaw napięcie PMT cytometru przepływowego na tkankę docelową dla danego eksperymentu.
- Przepuść przez cytometr przepływowy w celu uzyskania danych, bramkując populację kulek singletowych na odczyty FSC i SSC.
- Ustaw natężenie przepływu wokół 200–300 zdarzeń/s.
- Ustaw odpowiednią kompensację dla danego przeciwciała sprzężonego z fluoresceiną [FITC], użyj wykresu punktowego FL1 vs. FL2.
- Umieść bramkę kwadrantową tak, aby koraliki ujemne znajdowały się w lewym dolnym kwadrancie, a koraliki dodatnie w prawym górnym lub dolnym kwadrancie. Dostosuj wartości kompensacji, aż mediana intensywności fluorescencji (MFI) dla każdej populacji (jak pokazano w oknie statystyk kwadrantu) będzie w przybliżeniu równa (tj. dla FL2-%FL1 FL2 MFI obu koralików powinna być podobna).
- Powtórzyć kroki 5.4.11 i 5.4.12 dla wszystkich probówek.
- Przystąp do pobierania rzeczywistych poplamionych próbek. Uruchom kreatora wynagrodzeń i zapisz ustawienia w formacie "data, eksperymentuj ze swoimi inicjałami".
6. Analiza i prezentacja danych przepływu
- Analizuj dane według Flowjo i/lub Kaluza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ortotopowa implantacja PDAC doprowadziła do szybkiego wzrostu guza, podobnie jak w przypadku implantacji SC. Po zaimplantowaniu fragmentów guza dawcy myszom biorcom, zarówno podskórnie, jak i ortotopowo, zgodnie z protokołami opisanymi w krokach 2.1 i 2.2, zaimplantowane homogeny KPC wykazały podobnie szybki wzrost, co przedstawiono na Ryc. 1A. Homogeny KPC pobrane w różnych punktach czasowych przedstawiono na Ryc. 1B, a reprezen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż badania z wykorzystaniem guzów SC są łatwiej przeprowadzane, ortotopowo wszczepione modele guzów mogą być potencjalnie bardziej istotne dla przedklinicznych badań farmakologicznych (w szczególności badań I/O), aby zapewnić lepszą translację. Niniejszy raport ma na celu pomóc zainteresowanym czytelnikom/odbiorcom w bezpośredniej wizualizacji procedur technicznych, które można wykorzystać w ich odpowiednich badaniach. Nasze protokoły pokazują, że ortotopowa implantacja PDAC może skutkować efektywnym wzrostem guza, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy są obecnie pełnoetatowymi pracownikami Crown Bioscience, Inc.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr Jody Barbeau - za krytyczne przeczytanie i redakcję rękopisu, a także podziękować Ralphowi Manuelowi za zaprojektowanie dzieł sztuki. Autorzy chcieliby również podziękować zespołowi Crown Bioscience Oncology Immuno-Oncology Biomarker i zespołowi Oncology In Vivo za ich wielki wysiłek techniczny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aparat anestezjologiczny | SAS3119 | \ | |
| Trokar 20 | \ | \ | 2 mm |
| szalka Petriego | \ | \ | 20 mm |
| 100x antybiotyk i środek przeciwgrzybiczy | \ | \ | |
| Wymazy jodoforowe | \ | \Codzienny | zakup w aptece |
| Waciki nasączone alkoholem | \ | \Codzienny | zakup |
| w apteceCiekły azot | Powietrze chemiczne | \ | \Kaptur |
| bezpieczeństwa biologicznego | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | \ |
| FACS maszyna LSRFortessa X-20 | BD LSR Fortessa | \ | |
| przeciwciała | BD\ | \ | |
| Trevigen MD lub BD Matrigel Podstawna membrana Matrix Wysokie stężenie | BD | 354248 | \ |
| FACS | BD | 554656 | Bufor do mielenia |
| mięsa Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | \ |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | \ |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70 µ m |
| rutynowa probówka do krwi | BD-Vacutainer | 365974 | 2 ml |
| Kaluza | Beckman | vs 1,5 | |
| 6-dołkowe płytki | Corning | 3516 | \ |
| Foxp3 Fix/Perm | kit ebioscience | 00-5523-00 | \ |
| UltraComp | eBeads ebioscience | 01-2222-42 | \ |
| Wirówka | eppendorf | 5810R,5920R | \ |
| Oprogramowanie FlowJo | FlowJo LLC | \ | vs 10.0 |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50 mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | \ |
| Jednorazowe, sterylne skalpele | Jin zhong | J12100 | 11# |
| rękojeść noża | Jin zhong | J11010 | \ |
| nożyczki do oczu i pęsety | Jin zhong | Y00030 | Nożyczki do oczu Nożyczki do oczu 10 cm |
| pęseta | Jin zhong | JD1060 | Pęseta do oczu 10 cm z zębami |
| Przenośny zbiornik ciekłego azotu | Jinfeng | YDS-175-216 | \ |
| Waga elektroniczna | Metter Toledo | AL204 | 0-100 g |
| Rurki C Miltenyi | Miltenyi | 130-096-334 | \ |
| Miltenyi Delikatny MACS z blokami grzejnymi | Miltenyi | 120-018-306 | \ |
| Zestaw do dysocjacji guzów | Miltenyi | 130-096-730 | \ |
| Licznik komórek | Nexcelom | Cellometer | Celometr Auto T4 |
| rurka do kriokonserwacji | Nunc | 375418 | 1,8 mL |
| Cultrex o wysokim stężeniu białka (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | \ |
| strzykawki | Szanghaj MIWA medical industry | \ | 1-5 mL |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance i obsługujący USB | OHAUS | SE601F | Balance i obsługujący USB |
| Studylog-Data linia suwmiarek z noniuszem | Sylvac | 926.6721 | Linia danych suwmiarki z noniuszem |
| Suwmiarka | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Probówki wirówkowe sterylizowane | Thermo | 339653 | 50 ml |
| Probówki wirówkowe sterylizowane | Thermo | 339651 | 15 ml |
| Wiadro na lód | Thermo | KLCS-288 | 4 ° C |
| Wiaderko | do lodu Thermo | PLF-276-20 | ° C |
| Wiadro na lód | Thermo | DW-862626-80 | ° C |
| RNAlater | Thermo | am7021 | \ |
Bibliografia
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316(2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
