Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Inflamasomy są wrodzonymi platformami sygnalizacji immunologicznej, które są niezbędne do skutecznego zwalczania wielu organizmów chorobotwórczych, ale także sprzyjają chorobom zapalnym i autozapalnym. Inflamasomy są aktywowane przez receptory rozpoznawania wzorców cytozolowych, w tym członków rodziny receptorów podobnych do NOD (NLR). Receptory te oligomeryzują się po wykryciu bodźców mikrobiologicznych lub związanych z uszkodzeniem. Późniejsza rekrutacja białka adaptorowego ASC tworzy mikroskopijnie widoczny kompleks inflamasomowy, który aktywuje kaspazę-1 poprzez autoaktywację indukowaną bliskością. Po aktywacji kaspaza-1 rozszczepia pro-IL-1β i pro-IL-18, prowadząc do aktywacji i wydzielania tych cytokin prozapalnych. Kaspaza-1 pośredniczy również w zapalnej postaci śmierci komórki zwanej piroptozą, która charakteryzuje się utratą integralności błony i lizą komórek. Kaspaza-1 rozszczepia gasderminę D, uwalniając N-końcowy fragment, który tworzy pory błony plazmatycznej, prowadząc do lizy osmotycznej.
In vitro, aktywacja kaspazy-1 może być określona poprzez znakowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą sondy aktywności kaspazy-1 FAM-YVAD-FMK i poprzez znakowanie komórek przeciwciałami przeciwko białku adaptorowemu ASC. Technika ta pozwala na identyfikację powstawania inflamasomu i aktywacji kaspazy-1 w poszczególnych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pyroptotyczną śmierć komórek można wykryć, mierząc uwalnianie cytozolowej dehydrogenazy mleczanowej do pożywki. Procedura ta jest prosta, opłacalna i wykonywana na 96-dołkowej płytce, co pozwala na adaptację do badań przesiewowych. W tym manuskrypcie pokazujemy, że aktywacja inflamasomu NLRP3 przez nigerycynę prowadzi do kolokalizacji białka adaptorowego ASC i aktywnej kaspazy-1, co prowadzi do piroptozy.
Wprowadzenie
Zapalenie wywołane przez inflammasomy jest kluczowym elementem obrony przed organizmami chorobotwórczymi1, ale także leży u podstaw etiologii wielu chorób2. Odpowiedź zapalna na szeroki zakres infekcji jest wywoływana przez cytozolowe wykrywanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) lub wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP). Receptory rozpoznawania wzorców (PRR), w tym członkowie rodziny receptorów podobnych do NOD (NLR), oligomeryzują się po wykryciu tych PAMP i DAMP. Powoduje to tworzenie wielobiałkowego kompleksu zwanego inflamasomem, który zawiera PRR, białko adaptorowe podobne do plam....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego.
1. Pobieranie szpiku kostnego
- W asepcie usuń kość udową i piszczel myszy i oczyść kości za pomocą sterylnych narzędzi. Umieść oczyszczone kości w Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 50 mg/ml siarczanu gentamycyny + 10 000 U/ml penicyliny/streptomycyny + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, DMEM-10 kompletne) i inkubuj probówkę na lodzie przez 15 minut.
- Usuń proksymalne i dystalne przegu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby wykryć aktywację kaspazy-1 po ekspozycji na nigerycynę, komórki przetwarzano zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Połączyliśmy znakowanie FAM-YVAD-FMK oraz przeciwciałem przeciw ASC, aby wykazać, że ASC i aktywna kaspaza-1 kolokalizują po aktywacji inflamasomu zależnej od NLRP3. Rysunek 1A pokazuje, że w makrofagach typu dzikiego eksponowanych na 5 μM nigerycyny dochodzi do tworzenia się ogniska ASC w regionie okojądrowym. Ogniska te zawierają również akt.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie przedstawiliśmy dwie techniki badania aktywacji inflamasomu i konsekwencji aktywacji kaspazy-1 po stymulacji NLRP3 w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Pierwsza technika pozwala badaczowi określić poziom aktywacji kaspazy-1 na bazie komórkowej za pomocą fluorescencyjnego reportera FAM-YVAD-FMK. Ten reporter jest wysoce specyficzny dla wiązania enzymów z rodziny kaspazy-1, co widać po braku barwienia w makrofagach z niedoborem kaspazy-1/11. Swoistość wykazali również LaRock i wsp
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów
Podziękowania
Wszystkie mikroskopy zostały wykonane w Centrum Mikroskopii W. M. Keck przy wsparciu Nathaniela Petersa i przy wsparciu nagrody NIH S10OD016240. S.L.F. jest wspierane przez NIH K08AI119142 i R21AI130281. Dziękujemy dr Richardowi Flavellowi i dr Bradowi Cooksonowi za myszy z niedoborem kaspazy-1/11 oraz dr Bradowi Cooksonowi za udostępnienie urządzeń i sprzętu laboratoryjnego.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | Do hodowli komórek L929 |
| Klon NCRC 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Zestaw do utrwalania/permeabilizacji | BD Biosciences | 554714 | Zawiera roztwór do utrwalania i przepuszczalności oraz bufor do mycia. Zastrzeżone preparaty. Zawiera 4,2% formaldehydu |
| Glicyna | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Test cytotoksyczności nieradioaktywnej | Fisher Scientific | PR-G1780 | zawiera mieszaninę substratów i bufor do oznaczania; Zastrzeżone preparaty. Roztwór zatrzymujący to 1 M Kwas octowy |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, bez wapnia, bez magnezu | Invitrogen | 14190144 | |
| Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowany, pochodzący z USA | Invitrogen | 26140079 | Heat inaktywowany w temperaturze 55° C przez 50 min |
| Gentamycyna | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Medium montażowe | Invitrogen | p36934 | Zastrzeżona formuła. Utwardzanie medium montażowego. Utwardza się do wskaźnika oporności 1,46 |
| Kozia ALEXA555 przeciw mysim | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Jodek | Invitrogen | T3605 | dalekoczerwony fluorescencyjny barwienie kwasem nukleinowym |
| Mysz C57BL/6J | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| kaspaza-1/11-/- mysz | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Mikroskop konfokalny Leica SP8X | Leica | ||
| Ultrapure LPS od Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anty-ASC klon 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-merkaptoetanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 | czytnik płytek Urządzenia molekularne | 5000414 |
Bibliografia
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
