Artykuł metodologiczny

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57463

⸱

21 maja 2018

 , 
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Streszczenie

Inflamasomy są wrodzonymi platformami sygnalizacji immunologicznej, które są niezbędne do skutecznego zwalczania wielu organizmów chorobotwórczych, ale także sprzyjają chorobom zapalnym i autozapalnym. Inflamasomy są aktywowane przez receptory rozpoznawania wzorców cytozolowych, w tym członków rodziny receptorów podobnych do NOD (NLR). Receptory te oligomeryzują się po wykryciu bodźców mikrobiologicznych lub związanych z uszkodzeniem. Późniejsza rekrutacja białka adaptorowego ASC tworzy mikroskopijnie widoczny kompleks inflamasomowy, który aktywuje kaspazę-1 poprzez autoaktywację indukowaną bliskością. Po aktywacji kaspaza-1 rozszczepia pro-IL-1β i pro-IL-18, prowadząc do aktywacji i wydzielania tych cytokin prozapalnych. Kaspaza-1 pośredniczy również w zapalnej postaci śmierci komórki zwanej piroptozą, która charakteryzuje się utratą integralności błony i lizą komórek. Kaspaza-1 rozszczepia gasderminę D, uwalniając N-końcowy fragment, który tworzy pory błony plazmatycznej, prowadząc do lizy osmotycznej.

In vitro, aktywacja kaspazy-1 może być określona poprzez znakowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą sondy aktywności kaspazy-1 FAM-YVAD-FMK i poprzez znakowanie komórek przeciwciałami przeciwko białku adaptorowemu ASC. Technika ta pozwala na identyfikację powstawania inflamasomu i aktywacji kaspazy-1 w poszczególnych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pyroptotyczną śmierć komórek można wykryć, mierząc uwalnianie cytozolowej dehydrogenazy mleczanowej do pożywki. Procedura ta jest prosta, opłacalna i wykonywana na 96-dołkowej płytce, co pozwala na adaptację do badań przesiewowych. W tym manuskrypcie pokazujemy, że aktywacja inflamasomu NLRP3 przez nigerycynę prowadzi do kolokalizacji białka adaptorowego ASC i aktywnej kaspazy-1, co prowadzi do piroptozy.

Wprowadzenie

Zapalenie wywołane przez inflammasomy jest kluczowym elementem obrony przed organizmami chorobotwórczymi1, ale także leży u podstaw etiologii wielu chorób2. Odpowiedź zapalna na szeroki zakres infekcji jest wywoływana przez cytozolowe wykrywanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) lub wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP). Receptory rozpoznawania wzorców (PRR), w tym członkowie rodziny receptorów podobnych do NOD (NLR), oligomeryzują się po wykryciu tych PAMP i DAMP. Powoduje to tworzenie wielobiałkowego kompleksu zwanego inflamasomem, który zawiera PRR, białko adaptorowe podobne do plamki związane z apoptozą, zawierające C-końcową domenę rekrutacji kaspazy (CARD) (ASC) oraz pro-formę kaspazy-13,4. Kompleks ten umożliwia indukowaną bliskością automatyczną aktywację kaspazy-1. Aktywna kaspaza-1 prowadzi następnie do zestawu zdarzeń, które są charakterystyczne dla piroptozy szlaku śmierci komórki stanu zapalnego. Zdarzenia te obejmują: rozszczepienie i uwolnienie cytokin zapalnych IL-1β i IL-18, egzocytozę lizosomów z uwolnieniem zawartości lizosomalnej do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, kondensację jądrową oraz rozszczepienie gasderminy D. Uwolniona N-końcowa domena gasderminy D wstawia się do błony plazmatycznej, tworząc pory, które powodują pęknięcie błony plazmatycznej i uwolnienie treści zapalnej, a także zabierają niszę ochronną dla replikacji patogenu5,6,7.

Tutaj skupiamy się na dobrze zbadanym inflamasomie NLRP3. Aktywacja inflamasomu NLRP3 zachodzi w dwuetapowym procesie8. Pierwszy etap "torowania" następuje poprzez rozpoznanie produktu drobnoustrojowego przez receptory Toll-podobne (TLR). Jest to replikowane w warunkach laboratoryjnych za pomocą LPS do stymulacji TLR4. Ta stymulacja zwiększa poziom NLRP3 i pro-IL-1β poprzez sygnalizację NF-kB. Gruntowanie dodatkowo licencjonuje NLRP3 poprzez mechanizmy nietranskrypcyjne poprzez indukowanie jego deubikwitynacji9,10 oraz fosforylacji lub defosforylacji określonych reszt11,12.

Uważa się, że drugi sygnał aktywacji NLRP3 obejmuje czynniki mitochondrialne, reaktywne formy tlenu, wypływ potasu i sygnalizację wapnia, chociaż mechanizm jednoczący dla aktywacji NLRP3 pozostaje nieuchwytny8. Aktywowany NLRP3 oligomeryzuje poprzez interakcje między swoimi domenami NACHT i rekrutuje ASC poprzez wiązanie domen pyryny (PYD) 13. W każdej komórce te kompleksy makromolekularne tworzą pojedyncze mikroskopijnie widoczne ognisko. ASC zostało pierwotnie zidentyfikowane jako białko 22 KDa, które tworzy "plamkę" podczas apoptozy ludzkich komórek białaczkowych i nazwane białkowym białaczką związaną z apoptozą zawierającą klasę CARD14. Później ustalono, że ASC rekrutuje pro-kaspazę-1 poprzez interakcję CARD ASC z CARD pro-kaspazy-1, tworząc klasę inflammasome15.

Nie wszystkie NLR-y wymagają obecności ASC do wywołania aktywacji kaspazy-1. W przeciwieństwie do NLRP3, NLRC4 i NLRP1b mają domeny CARD i mogą bezpośrednio rekrutować pro-kaspazę-1 poprzez interakcje CARD-CARD w celu wywołania aktywacji kaspazy-1. W przypadku braku ASC, aktywna kaspaza-1 pozostaje rozproszona w całym cytozolu i nie tworzy pojedynczego ogniska. Ta rozproszona aktywna kaspaza-1 jest wystarczająca do wywołania pyroptotycznej śmierci komórki, ale nie jest w stanie przetworzyć pro-IL-1β13,16.

W tym manuskrypcie omówimy dwa sposoby oceny aktywacji inflamasomu. Pierwszy z nich wykorzystuje sondę aktywności fluorescencyjnej FAM-YVAD-FMK, która wiąże rodzinę proteaz kaspazy-1. Do tej rodziny zalicza się kaspazę-1, ale także kaspazę myszą-11 oraz kaspazę ludzką-4 i kaspazę-5. Wykorzystując makrofagi od myszy z niedoborem kaspazy-1/11 we wszystkich eksperymentach, zajmiemy się specyfiką tej sondy. Metodę tę można połączyć z znakowaniem przeciwciałami składników inflamasomu, które również opiszemy. Wizualizacja mikroskopowa pozwala na identyfikację pojedynczych komórek zawierających aktywną kaspazę-1 i oligomeryzowany ASC. Korzystając z tej metody, naukowcy będą w stanie określić, w którym momencie tworzenia inflamasomu ich manipulacje komórką gospodarza lub badanym organizmem chorobotwórczym mają wpływ. Na przykład, można rozróżnić, czy dana interwencja zapobiega rekrutacji ASC do kompleksu NLRP3, czy też ma na celu późniejszą rekrutację i aktywację kaspazy-117. Badanie wyników aktywacji kaspazy-1, takich jak wydzielanie IL-1β, nie byłoby w stanie rozróżnić tych dwóch możliwości. Ponadto, wydzielanie IL-1β może być zmienione bez zmiany zdolności komórek do aktywacji kaspazy-1 i ulegania pyroptotycznej śmierci komórki16.

Druga metoda mierzy uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) do supernatantu komórki, co następuje podczas lizy makrofagów piroptotycznych po aktywacji kaspazy-1, jak opisano powyżej. Ta druga metoda jest podejściem populacyjnym, ponieważ mierzy się uwalnianie LDH w całym dołku. To proste podejście pozwala na szybką analizę (30 minut czasu inkubacji) próbek w celu określenia, czy śmierć komórki za pośrednictwem kaspazy 1 i może być przeprowadzona w formacie 96-dołkowej płytki.

Te metody są komplementarne, każda z innymi zaletami i obie łatwo poddają się modyfikacjom. Na przykład leczenie makrofagami ukierunkowanymi związkami o małej masie cząsteczkowej przed stymulacją inflamasomu można zastosować do zbadania roli, jaką niektóre białka mogą odgrywać w kontrolowaniu odpowiedzi zapalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego.

1. Pobieranie szpiku kostnego

  1. W asepcie usuń kość udową i piszczel myszy i oczyść kości za pomocą sterylnych narzędzi. Umieść oczyszczone kości w Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 50 mg/ml siarczanu gentamycyny + 10 000 U/ml penicyliny/streptomycyny + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, DMEM-10 kompletne) i inkubuj probówkę na lodzie przez 15 minut.
  2. Usuń proksymalne i dystalne przeguby kulowe za pomocą nożyczek. Wprowadzić igłę o sile 25 g dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej pożywką do zagłębienia kości. Wypłukać szpik kostny za pomocą DMEM-10 complete. Ponownie zawiesić wszelkie grudki, delikatnie pipetując pożywkę w górę i w dół.
  3. Odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. W tym momencie albo zamroź komórki za pomocą 90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), albo umieść komórki na 15-centymetrowej szalce Petriego, aby rozróżnić makrofagi przy użyciu pożywki kondycjonowanej L929 (krok 2.1).

2. Różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

  1. Używając wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej (21 ml kompletnej pożywki DMEM-10 i 9 ml pożywki kondycjonowanej komórkami L929, jak opisano przez Swansona i wsp.18), umieść komórki szpiku kostnego na 15-centymetrowej szalce Petriego bez hodowli tkankowej (1,2-1,5 x 107 komórek). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni. Dodać dodatkowe 30 ml pożywki różnicującej do płytki w dniu 3 lub 4,
    UWAGA: Ważne jest, aby nie używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych, ponieważ makrofagi będą trudne do oderwania i pobrania.
  2. Aby zebrać makrofagi, przemyj płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodaj 20 ml zimnego PBS + 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać komórki, pipetując PBS + EDTA na komórki i przemyć płytkę 10 ml PBS. Połącz oba mycia w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej + 5 mM HEPES + 0,2 mg / ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 5% FBS (DMEM-5) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub licznika Coredler. Utrzymuj komórki na lodzie podczas liczenia.
  4. Wysiewaj makrofagi na płytkach pokrytych kulturą tkankową w ilości 2 x 105 komórek/ml. Do eksperymentów mikroskopowych wysiewa się 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach. W przypadku testów uwalniania LDH wysiewaj 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce. W przypadku testu LDH należy wysiać 9 dołków (3 dołki niepoddane obróbce, 3 dołki ze 100% kontrolą lizy i 3 dołki dla bodźca eksperymentalnego).
  5. Wirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut przy 300 x g, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w basenie.
  6. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przed rozpoczęciem procesu zalewania.

3. Gruntowanie

  1. Zastąp pożywkę świeżą pożywką (DMEM-5) zawierającą 100 ng/ml LPS (500 μl dla płytki 24-dołkowej lub 50 μl dla płytki 96-dołkowej).
    UWAGA: Istnieje wiele różnic strukturalnych w LPS, które wpływają na zdolność do stymulowania gruntowania za pośrednictwem TLR419. LPS firmy Salmonella minnesota R595 (Re) jest dostępny u wielu dostawców i jest zalecany.
  2. Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

4. Aktywacja inflamasomu NLRP3 za pomocą nigerycyny i znakowanie za pomocą FAM-YVAD-FMK

  1. Usuń pożywkę i zastąp ją 290 μl DMEM-5 zawierającego 5 μM nigerycyny i 5 mM glicyny. Glicyna jest dodawana w celu zmniejszenia ilości lizy komórek, która zachodzi podczas aktywacji kaspazy-15. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Używaj zarówno makrofagów typu dzikiego, jak i makrofagów z niedoborem kaspazy-1, aby upewnić się, że obserwowane oznakowanie jest specyficzne dla kaspazy-1.
  2. W ciągu ostatnich 45 minut dodaj 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK, przygotowanego zgodnie z zaleceniami producenta.
  3. Po 60 minutach usuń pożywkę i umyj komórki trzy razy po 5 minut każdy 1 ml zimnego PBS.
  4. Do każdej studzienki dodać 250 μl 2% paraformaldehydu i inkubować na lodzie pokrytym folią aluminiową przez 30 minut.
  5. W ciągu ostatnich 5 minut dodaj 4 μl 0,2 mM barwienia kwasem nukleinowym dalekiej czerwieni, aby oznaczyć jądra. 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) lub inne barwniki mogą być również używane do znakowania DNA.
  6. Umyj komórki trzykrotnie 1 ml zimnego PBS i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 7 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Poczekaj, aż podłoże montażowe stwardnieje przez noc, a następnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą lakieru do paznokci.
  7. Zobrazuj makrofagi za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ex/Em dla FAM-YVAD-FMK to 492/520nm i 642/661 dla barwienia kwasami nukleinowymi dalekiej czerwieni fluorescencyjnej. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w taki sposób, aby nieleczone komórki nie wykazywały żadnych zabarwień tła w kanale 488. W przeciwnym razie zostanie wykryte barwienie w tle FAM-YVAD-FMK, a nie rzeczywista aktywna kaspaza-1.
    UWAGA: Konfiguracja mikroskopu jest opisana w rozdziale 6.

5. Barwienie przeciwciał

UWAGA: Aby oznaczyć komórki przeciwciałami do wykrywania ASC, wysiewamy, zaszczepiamy i wystawiamy komórki na działanie nigerycyny identycznie jak w poprzedniej sekcji. Późniejsze przetwarzanie odbywa się w następujący sposób:

  1. Umyj komórki trzy razy przez 5 minut każde 1 ml zimnego PBS. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego i przepuszczalnego. Inkubować komórki na lodzie i przykrywać przez 30 minut.
  2. Przemyj makrofagi trzy razy przez 5 minut każdy 1 ml buforu do mycia.
  3. Dodać 250 μl pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko ASC rozcieńczonego w stosunku 1:500 do buforu do przemywania i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Dołącz jedno szkiełko nakrywkowe, które nie otrzyma żadnego przeciwciała pierwszorzędowego, ale otrzyma tylko przeciwciało wtórne. Szkiełko nakrywkowe będzie używane podczas ustawiania mikroskopu w celu ustawienia prawidłowego przesunięcia.
  4. Przemyć komórki trzy razy przez 5 minut każda, za pomocą 1 ml buforu do płukania.
  5. Dodać 250 μl przeciwciała drugorzędowego (barwnik fluorescencyjny, sprzężony z kozią anty-myszą) rozcieńczonego w stosunku 1:500 w buforze do przemywania i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Dodać 4 μl 0,2 mM barwienia kwasem nukleinowym dalekiej czerwieni fluorescencyjnej przez ostatnie 5 minut tej inkubacji, aby znakować jądra.
  6. Przemyj komórki 3x 1 ml buforu do płukania na zimno i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 7 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Poczekaj, aż podłoże montażowe stwardnieje przez noc, zanim uszczelnisz szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.
  7. Obrazowanie makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ex/Em dla przeciwciała drugorzędowego wynosi 555/580 nm i 642/661 dla barwienia kwasem nukleinowym o dalekiej czerwieni fluorescencyjnej (jak opisano poniżej).
    UWAGA: Znakowanie za pomocą FAM-YVAD-FMK i znakowanie przeciwciałami można połączyć w celu wykazania kolokalizacji aktywnej kaspazy-1 i ASC. W tym celu należy postępować zgodnie z warunkami znakowania FAM-YVAD-FMK, a następnie przejść na protokół znakowania przeciwciał w celu dalszego przetwarzania.

6. Obrazowanie znakowanych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Poplamione komórki można oglądać po pozostawieniu szkiełek nakrywkowych do utwardzenia przez noc i przyklejeniu ich do szkiełka mikroskopowego lakierem do paznokci. Tutaj opisano obrazowanie przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Komórki można również oglądać za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej.

  1. Umieść szkiełko z nieleczonymi komórkami kontrolnymi na stoliku mikroskopu i skoncentruj mikroskop na komórkach.
  2. Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu (LUT), dostosuj przesunięcie tak, aby w nieleczonych komórkach nie było dodatniego barwienia FAM-YVAD-FMK. Proces ten można również przeprowadzić przy użyciu makrofagów z niedoborem kaspazy-1.
    UWAGA: Przesunięcie musi być dostosowane dla każdego kanału użytego w eksperymencie, ale ustawienie prawidłowego przesunięcia jest najbardziej krytyczne dla kanału FAM-YVAD-FMK i kanałów przeciwciał fluorescencyjnych. Przesunięcie kanału DNA jest mniej krytyczne. Po ustawieniu przesunięcia nie dostosowuj tego ustawienia do końca eksperymentu.
  3. Przesunąć szkiełko na próbkę potraktowaną nigerycyną. Znajdź pole, które zawiera zarówno komórki, które są dodatnie, jak i ujemne dla barwienia FAM-YVAD-FMK. Dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału FAM-YVAD-FMK do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego. Zwykle będzie to płaszczyzna, w której obrazowany jest środek ogniska inflamasomu.
  4. Dostosuj wzmocnienie tak, aby ogniska były widoczne w komórkach, które mają skondensowane jądra. Po ustawieniu zarówno wzmocnienia, jak i przesunięcia, pozostaw te ustawienia do końca sesji obrazowania.
    UWAGA: Jednym z łatwych sposobów określenia, czy komórka jest piroptotyczna, jest przyjrzenie się morfologii jądrowej. Komórki z aktywną kaspazą-1 mają zaokrąglone i skondensowane jądra, podczas gdy jąderka są widoczne w komórkach bez aktywacji kaspazy-1, a morfologia jądra jest podobna do morfologii komórek nieleczonych.
  5. Zbierz obrazy 5 losowo wybranych pól w 100-krotnym powiększeniu całkowitym. Zwykle daje to około 40 komórek na obraz. Powtórz ten proces dla każdej próbki.
  6. Policz liczbę komórek na każdym obrazie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następnie policz liczbę komórek, które mają dodatnie barwienie FAM-YVAD-FMK. Reprezentują poziom aktywacji kaspazy-1 jako procent komórek dodatnich FAM-YVAD-FMK.

7. Test uwalniania LDH

UWAGA: Do testu uwalniania LDH, zasiewaj i zagruntuj komórki zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, z wyjątkiem użycia płytki 96-dołkowej. Nie usuwaj podłoża po zagruntowaniu.

  1. Dodać 50 μl DMEM-5 zawierającego 10 μM nigerycyny do dołków doświadczalnych i 50 μL DMEM-5 do dołków do spontanicznej i 100% kontrolnej lizy. Nie dodawaj glicyny w tym eksperymencie, ponieważ celem jest pomiar lizy komórek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Po 30 minutach dodać 10 μl 10-krotnego buforu do lizy do 100% dołków kontrolnych lizy i dodać 10 μl DMEM-5 do pozostałych studzienek. Podczas tej inkubacji wyjmij 1 fiolkę mieszanki substratów (1,5 ml liofilizowanego substratu) i 1 podwielokrotność buforu do oznaczania (~12 ml) z zamrażarki i pozwól im rozmrozić się przed światłem do temperatury pokojowej.
    UWAGA: Mieszanka substratów zawiera sól tetrazolową (fiolet jodonitro-tetrazoliowy), która jest przekształcana w czerwony produkt formazanu.
  3. Po 60 minutach całkowitej inkubacji odwirować płytkę przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 10 °C. Przenieść 50 μl supernatantu na przezroczystą płytkę z płaskim dnem. W tym czasie dodać 12 ml buforu do testu do fiolki z mieszanką substratów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed użyciem.
  4. Dodaj 50 μl substratu do każdej studzienki i inkubuj przez 30 minut w ciemności. Uwzględnij dołki tylko w pożywkach dla wartości pustych. Sprawdź tabliczkę po 15 minutach, aby upewnić się, że sygnał nie przekroczy granicy wykrywalności czytnika tabliczek.
  5. Po 30 minutach dodać 50 μl roztworu zatrzymującego (1 M kwas octowy) i zmierzyć OD490 za pomocą czytnika płytek.
  6. Oblicz procent lizy komórek, korzystając z następującego wzoru:
    % Cytotoksyczność = ((Eksperymentalny - Spontaniczny)/(Maksymalny - Spontaniczny))×100
    Eksperymentalny: komórki traktowane nigerycyną; spontaniczne: nieleczone komórki; Maksimum: Komórki wystawione na działanie buforu do lizy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby wykryć aktywację kaspazy-1 po ekspozycji na nigerycynę, komórki przetworzono zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Zastosowaliśmy jednoczesne znakowanie FAM-YVAD-FMK oraz przeciwciałem przeciwko ASC, aby wykazać, że ASC i aktywna kaspaza-1 kolokalizują po aktywacji inflamasomu zależnej od NLRP3. Rysunek 1A pokazuje, że w makrofagach typu dzikiego poddanych działaniu 5 μM nigerycyny dochodzi do tworzenia się ognisk ASC w regionie perinuklearnym. Ogniska te ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym manuskrypcie przedstawiliśmy dwie techniki badania aktywacji inflamasomu i konsekwencji aktywacji kaspazy-1 po stymulacji NLRP3 w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Pierwsza technika pozwala badaczowi określić poziom aktywacji kaspazy-1 na bazie komórkowej za pomocą fluorescencyjnego reportera FAM-YVAD-FMK. Ten reporter jest wysoce specyficzny dla wiązania enzymów z rodziny kaspazy-1, co widać po braku barwienia w makrofagach z niedoborem kaspazy-1/11. Swoistość wykazali również LaRock i wsp

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów

Podziękowania

Wszystkie mikroskopy zostały wykonane w Centrum Mikroskopii W. M. Keck przy wsparciu Nathaniela Petersa i przy wsparciu nagrody NIH S10OD016240. S.L.F. jest wspierane przez NIH K08AI119142 i R21AI130281. Dziękujemy dr Richardowi Flavellowi i dr Bradowi Cooksonowi za myszy z niedoborem kaspazy-1/11 oraz dr Bradowi Cooksonowi za udostępnienie urządzeń i sprzętu laboratoryjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
E-MEMATCC30-2003Do hodowli komórek L929
Klon NCRC 929 (L929)ATCCCCL-1
Zestaw do utrwalania/permeabilizacjiBD Biosciences554714Zawiera roztwór do utrwalania i przepuszczalności oraz bufor do mycia. Zastrzeżone preparaty. Zawiera 4,2% formaldehydu
GlicynaBiorad161-0718
Cytotox96 Test cytotoksyczności nieradioaktywnejFisher ScientificPR-G1780zawiera mieszaninę substratów i bufor do oznaczania; Zastrzeżone preparaty. Roztwór zatrzymujący to 1 M Kwas octowy
FAM-YVAD-FMKImmunocytochemistry Technologies98
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminyInvitrogen11960044
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejInvitrogen31053028
Dulbecco's PBS, bez wapnia, bez magnezuInvitrogen14190144
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowany, pochodzący z USAInvitrogen26140079Heat inaktywowany w temperaturze 55° C przez 50 min
GentamycynaInvitrogen15750060
ProLong Gold Medium montażoweInvitrogenp36934Zastrzeżona formuła. Utwardzanie medium montażowego. Utwardza się do wskaźnika oporności 1,46
Kozia ALEXA555 przeciw mysimInvitrogenA-21422
HEPES (Ultra Pure)Invitrogen11344041
L-GlutaminaInvitrogen21051024
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140122
TO-PRO-3 JodekInvitrogenT3605dalekoczerwony fluorescencyjny barwienie kwasem nukleinowym
Mysz C57BL/6JJackson Laboratoy000664
kaspaza-1/11-/- myszJackson Laboratory016621
Mikroskop konfokalny Leica SP8XLeica
Ultrapure LPS od Salmonella minnesota R595 (Re)List Biologicals434
anty-ASC klon 2EI-7Millipore-Sigma04-417
beta-merkaptoetanolMillipore-SigmaM6250-10ML
DMSOMillipore-SigmaD2650-5X10ML
EDTAMillipore-SigmaE5391
Spectramax M3czytnik płytek Urządzenia molekularne5000414

Bibliografia

  1. Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
  2. Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
  3. Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
  4. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  5. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  6. Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
  7. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  8. Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
  9. Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
  10. Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
  11. Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
  12. Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
  13. Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
  14. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  15. Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
  16. Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
  17. LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
  18. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
  19. Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
  20. Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
  21. Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
  22. DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
  23. Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
  24. Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywacja kazpazy 1tworzenie ognisk ASCtest uwalniania LDHmikroskopia fluorescencyjnastymulacja nigerycynsonda FAM YVAD FMKrozszczepienie gasderminy D

Powiązane artykuły