Artykuł metodologiczny

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 marca 2018

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwód siatkówki kijanki Xenopus, składający się z komórek zwojowych siatkówki (RGC) w oku, które tworzą synapsy bezpośrednio na neuronach w tektum wzrokowym, jest popularnym modelem do badania, jak obwody neuronowe same się organizują. Możliwość prowadzenia nagrań całych komórek z neuronów tektalnych i rejestrowania reakcji wywołanych przez RGC, zarówno in vivo, jak i przy użyciu preparatu dla całego mózgu, wygenerowała dużą ilość danych o wysokiej rozdzielczości na temat mechanizmów leżących u podstaw normalnego i nieprawidłowego tworzenia i funkcjonowania obwodów. Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić przygotowanie in vivo, oryginalne przygotowanie całego mózgu, a ostatnio opracowane poziome przygotowanie wycinków mózgu w celu uzyskania nagrań klamrowych całych komórek z neuronów tektalnych. Każdy preparat ma unikalne zalety eksperymentalne. Preparat in vivo umożliwia rejestrację bezpośredniej odpowiedzi neuronów tektalnych na bodźce wzrokowe rzutowane na oko. Przygotowanie całego mózgu pozwala na aktywację aksonów RGC w wysoce kontrolowany sposób, a poziome przygotowanie wycinków mózgu umożliwia rejestrację ze wszystkich warstw tectum.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwód siatkówki jest głównym składnikiem układu wzrokowego. Składa się z RGC w oku, które rzutują swoje aksony do tektum wzrokowego, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z postsynaptycznymi neuronami tektalnymi. Obwód siatkówki kijanki Xenopus jest popularnym modelem rozwojowym do badania tworzenia i funkcjonowania obwodów nerwowych. Istnieje wiele atrybutów obwodu siatkówkowego tej kijanki, które czynią z niej potężny model eksperymentalny1,2,3. Jedną z głównych cech, na której skupia się ten artykuł, jest możliwość przeprowadzania nagrań klamer całych komórek z neuronów tektalnych, in vivo lub przy użyciu preparatu całego mózgu. Dzięki sprzętowi do elektrofizjologii wyposażonemu we wzmacniacz, który obsługuje tryby nagrywania cęgów napięcia i prądu, zapisy z użyciem cęgów krosowych całych komórek pozwalają na scharakteryzowanie elektrofizjologii neuronu w wysokiej rozdzielczości. W rezultacie, zapisy klamer całych komórek z neuronów tektalnych na kluczowych etapach tworzenia obwodu siatkówkowego dostarczyły szczegółowego i wszechstronnego zrozumienia rozwoju i plastyczności intrinsic4,5,6,7 i synaptic8,9,10,11 właściwości. Połączenie zapisów neuronów tektalnych z klamrą całej komórki, zdolności do ekspresji genów lub morfolin będących przedmiotem zainteresowania w tych neuronach12, oraz metody oceny zachowania kierowanego wzrokowo za pomocą ustalonego testu unikania wzrokowego13 promuje identyfikację powiązań między cząsteczkami, funkcją obwodu i zachowaniem.

Ważne jest, aby zauważyć, że rodzaj danych o wysokiej rozdzielczości uzyskanych z nagrań z klamrami całych komórek nie jest możliwy przy użyciu nowszych metod obrazowania, takich jak genetyczny wskaźnik wapnia GCaMP6, ponieważ chociaż użycie wskaźników wapnia pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w dużych populacjach neuronów jednocześnie, nie ma bezpośredniego ani oczywistego sposobu, aby uzyskać określone parametry elektryczne poprzez pomiar fluorescencji delta w somatach, I nie ma sposobu, aby napięcie clampować neuron w celu zmierzenia zależności prąd-napięcie. Wyraźnie widać, że te dwa odrębne podejścia, zapisy elektrofizjologiczne i obrazowanie wapnia, mają nienakładające się na siebie mocne strony i generują różne rodzaje danych. W związku z tym najlepsze podejście zależy od konkretnego pytania eksperymentalnego, które jest poruszane.

Tutaj opisujemy naszą metodę pozyskiwania nagrań klamr z całych komórek z neuronów tektum wzrokowego kijanki za pomocą preparatu in vivo, preparatu całego mózgu oraz nowszego zmodyfikowanego preparatu całego mózgu, który został opracowany w naszym laboratorium14. W sekcji Reprezentatywne wyniki pokazujemy eksperymentalne zalety każdego preparatu oraz różne rodzaje danych, które można uzyskać. Ograniczenia i mocne strony różnych preparatów, a także wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów znajdują się w sekcji Dyskusja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Wyoming. Wszystkie zabiegi, w tym zapisy elektrofizjologiczne, przeprowadzane są w temperaturze pokojowej, około 23 °C. Wszystkie opisane tutaj metody są zoptymalizowane pod kątem rejestrowania neuronów tektalnych z kijanek między stadium rozwojowym 42 a 49 (etapy według Neiuwkoopa i Faber15).

1. Przygotowanie In Vivo

  1. Znieczul kijankę.
    1. Umieść kijankę na małej szalce Petriego zawierającej roztwór Steinberga z 0,01% MS-222 na około 5 minut.
      UWAGA: MS-222 aka "Tricaine" jest powszechnym środkiem znieczulającym dla ryb i. Kijanki są hodowane w roztworze Steinberga w mM: 0,067 KCl, 0,034 Ca(NO3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.
    2. Upewnij się, że kijanka jest głęboko znieczulona (nie reaguje i nie przestaje pływać) przed przejściem do kroku 2. Upewnij się, że kijanka jest głęboko znieczulona (nie reaguje i nie pływa
      3. ).
  2. Przymocuj znieczuloną kijankę do zanurzonego silikonowego bloku na podłodze naczynia do sekcji/nagrywania.
    1. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej przenieś znieczuloną kijankę do naczynia preparacyjnego/rejestrującego zawierającego zewnętrzny roztwór rejestrujący (115 mM NaCl, 2 mM KCl, 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM glukozy; dostosuj pH do 7,25 za pomocą 10 N NaOH, osmolarność 255 mOsm).
      1. Aby zminimalizować spontaniczne drgania mięśni, dodaj bloker receptora acetylocholiny, tubokurarynę (100 μM) do roztworu zewnętrznego. (Zazwyczaj odbywa się to za pomocą pipety o pojemności 200 μl, aby dodać 100 μl 10 ml bulionu tubocuraryny o pojemności 10 ml do 10 ml roztworu zewnętrznego).
    2. Za pomocą szpilek przeciw owadom przymocuj kijankę, grzbietem do góry, do zanurzonego bloku elastomeru silikonowego (takiego jak Sylgard 184, szczegóły w Tabeli Materiałów), który został przyklejony do podłogi naczynia sekparacyjnego.
      Uwaga: Rozmieszczenie szpilek ma kluczowe znaczenie: umieść je po obu stronach mózgu, wystarczająco ogonowo, aby uniknąć przebicia aferentnych aksonów RGC, które wystają z oka i wchodzą do mózgu tuż przed tektum wzrokowym (Rysunek 1A).
  3. Zafiletuj mózg wzdłuż linii środkowej.
    1. Aby uzyskać wyraźny widok mózgu, usuń skórę pokrywającą mózg, wykonując powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą sterylnej igły 25-G.
    2. Zaokrąglij mózg wzdłuż tej samej osi linii środkowej, wkładając igłę do cewy nerwowej i delikatnie pociągając w górę (grzbietowo), tak aby grzbietowa część rurki została czysto przecięta (odcięta), pozostawiając nienaruszoną płytę podłogową (Rysunek 1B).
      UWAGA: Ważne jest, aby płyta podłogowa cewy nerwowej pozostała nienaruszona, ponieważ aferentne bodźce sensoryczne dostają się do tectum przez płytę podłogową.
  4. Usuń przezroczystą błonę komorową, która pokrywa neurony tektalne.
    1. Przenieś naczynie nagrywające na stanowisko do elektrofizjologii i użyj potłuczonej szklanej końcówki pipety, aby usunąć błonę komorową pokrywającą tektalne ciała komórek neuronów. Złam końcówkę, delikatnie przeciągając ją po delikatnej wycieraczce roboczej.
    2. Wkręć pipetę w uchwyt pipety i opuść ją do osłony optycznej za pomocą mikromanipulatora.
    3. Użyj złamanej pipety, aby oderwać błonę komorową od tectum.
      UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie membrany z całego tectum; Wystarczy małe okienko, które zapewni dostęp do wielu neuronów.
  5. Uzyskaj nagrania z całego zacisku łaty komórkowej.
    UWAGA: Podejście od tego momentu jest podobne do przeprowadzania nagrań całych komórek z wycinków mózgu myszy, jak opisano w Segev i wsp.16(Rysunek 1C).
  6. Rejestruj reakcje neuronów tektalnych na cały błysk światła rzucany na siatkówkę.
    1. Aby rzutować całe pole światła na siatkówkę, umieść światłowód w pobliżu oka kijanki. Na drugim końcu światłowodu znajduje się dioda LED w linii z rezystorem zmiennym, który pozwala na kontrolowanie luminancji światła. Wyzwalaj diodę LED przez wyjście cyfrowe amplifier. W ten sposób można rejestrować rozbłyski całego pola o różnym natężeniu światła (Rysunek 4A).

2. Przygotowanie całego mózgu

  1. Wykonaj kroki od 1.1 do 1.3.
    Uwaga: Nie ma potrzeby stosowania tubokuraryny w roztworze zewnętrznym do tego preparatu.
  2. Odizoluj mózg.
    1. Użyj igły 25-G, aby przeciąć tyłomózgowie (Rysunek 2A).
    2. Aby odizolować cały mózg od kijanki, delikatnie przeciągnij igłę pod mózgiem, w kierunku ogonowo-rostralnym, aby przeciąć całą boczną i brzuszną tkankę łączną oraz włókna nerwowe.
  3. Przymocuj mózg do bloku elastomeru silikonowego.
    1. Po całkowitym uwolnieniu przymocuj mózg do bloku elastomeru krzemowego, umieszczając jedną szpilkę przez jedną z opuszki węchowych, a drugą szpilkę przez tyłomózgowie (Rysunek 2B). Jest to optymalna konfiguracja do nagrywania z neuronów tektalnych.
  4. Przenieś naczynie zawierające przypięty preparat całego mózgu z lunety prosektoryjnej do stanowiska do elektrofizjologii. Usunąć błonę komorową za pomocą pipety z potłuczonego szkła, jak opisano w kroku 1.4.
  5. Umieść bipolarną elektrodę stymulującą na skrzyżowaniu wzrokowym (gdzie akson przechodzi od każdego oka krzyżującego się w śródmózgowiu), aby bezpośrednio aktywować aksony RGC.
    1. Umieść bipolarną elektrodę stymulującą rostral i prawie przylegającą do dużej środkowej komory. Skrzyżowanie wzrokowe znajduje się bezpośrednio rostralnie do dużej środkowej komory (Ryc. 2B).
      1. Delikatnie opuść elektrodę stymulującą w dół na skrzyżowanie optyczne, tak aby w tkance powstało małe wgniecenie. Elektroda bipolarna napędzana jest stymulatorem impulsów, który pozwala na precyzyjną kontrolę siły stymulacji.
  6. Wykonaj zapis całego zacisku łaty komórkowej (Rysunek 2C) zgodnie z opisem Segev i wsp.16

3. Poziome przygotowanie wycinka mózgu

  1. Wykonaj kroki od 2.1 do 2.3.
  2. Użyj żyletki, aby wyciąć najbardziej boczną czwartą część (która in vivo odpowiada najbardziej grzbietowej ćwiartce) z jednej strony jednego tektum optycznego. To cięcie jest wykonane równolegle do płaszczyzny rostralno-ogonowej, jak pokazano na Rysunek 3A.
  3. Ponownie przypnij mózg do boku elastomeru silikonowego przekrojoną stroną skierowaną do góry (tak, aby somata i neuropil były bezpośrednio dostępne do nagrywania) i powierzchni komorowej mózgu skierowanej od bloku elastomeru silikonowego (Rysunek 3B) (tak, aby można było umieścić elektrodę bipolarną na skrzyżowaniu wzrokowym).
  4. Wykonaj zapis całego zacisku łaty komórkowej lub lokalnego potencjału pola (Rysunek 3C) zgodnie z opisem Segev i wsp.16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zarejestrować reakcje wywołane światłem, na siatkówkę rzutowany jest cały błysk światła, podczas gdy wynikowa odpowiedź jest rejestrowana z indywidualnych neuronów tektalnych (Rysunek 4A). Ten konkretny protokół jest przeznaczony do pomiaru zarówno odpowiedzi neuronu na włączenie światła ("odpowiedź On"), jak i wyłączenia 15 s później, aby zmierzyć "Odpowiedź Off". Neurony tektalne zazwyczaj wykazują silne reakcje włączania i wyłączania (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody opisane w tej pracy są zoptymalizowane pod kątem rejestrowania neuronów tektalnych z kijanek między stadium rozwojowym 42 a 49 (według Neiuwkoopa i Fabera15). Na etapie 42 kijanki są wystarczająco duże i wystarczająco rozwinięte, aby szpilki owadów można było umieścić po obu stronach mózgu w celu nagrań in vivo i przeprowadzenia całej sekcji mózgu. Na wcześniejszych etapach, gdy kijanki są zasadniczo dwuwymiarowe (tj. płaskie), opisane tutaj podejścia nie są opty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez grant NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Mikroskop preparacyjny
MS-222 "Tricane"FinquelARF5Gznieczulenie ogólne
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS271-3Służy do przygotowania roztworu Stienberga i roztworu zewnętrznego
Chlorek potasu (KCl)Fisher ScientificP217-500Służy do przygotowania roztworu Stienberga i roztworu zewnętrznego
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGSłuży do przygotowania roztworu Stienberga i roztworu zewnętrznego
Tetrahyran azotanu wapnia (Ca(NO3)• 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GSłuży do przygotowania roztworu Stienberga   
Siarczan magnezu (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Służy do przygotowania roztworu Steinberga
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GSłuży do przygotowania zewnętrznego roztworu rejestrującego
Chlorek magnezu (MgCl2)J.T. Baker2444-01Służy do przygotowania zewnętrznego roztworu do nagrywania
D-glukoza bezwodnaMallinckrodt Chemicals6066-04Służy do przygotowania zewnętrznego roztworu rejestrującego
Chlorowodorek tubokuraryny pentahydratSigmaT2379Nikotynowy antagonista receptora acetylocholiny
Szpilki do owadów FineScience Tools26002-10Szpilki ze stali nierdzewnej o średnicy 0,1 mm
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning761028Zestaw wstępnie zważonych monomerów i utwardzaczy
Sterylna polistyrenowa szalka Petriego - 60x15mmFisher ScientificAS4052Małe szalki Petriego
Igła PrecisionGlide 25Gx5/8 (.0,5mm X 16mm)BD305122Igły do strzykawek
1mL Strzykawka tuberkulinowa z końcówką ślizgową BD309659Jednorazowe, sterylne strzykawki
Szkło do pipet borokrzemianowychSutter InstrumentBF150-86-10HPWyciągnięte do żądanych specyfikacji za pomocą maszyny do ciągnięcia pipet
Ściągacz do mikropipet płonących/brązowych SutterInstrumentsP-97Produkuje mikropipety do zapisu elektrofizjologii
Chusteczki KimwipesKimtech Kimberly-Clark34120Delicate Zadaniowe niestrzępiące się wycieraczki
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BUrządzenia molekularne1-CV-7BCęgi prądowe i zaciski napięciowe Headstage
MP-285 Manipulator z napędem z kontroleremSutter InstrumentMP-285/TSterowanie do headstage na stanowisku elektrofizjologicznym
Dioda LED sprzężona światłowodem (zielona)ThorlabsM530F2światłowodowy w połączeniu z zieloną diodą LED
Klasterowa elektroda bipolarna (25µ średnica m)FHC30207Bipolarna elektroda stymulująca
ISO-Flex StymulatorA.M.P.I. (Izrael) Skontaktuj się z producentemElastyczny izolator bodźców
Axon Instruments 700B Multipatch AmplifierMolecular Devices2500-0157Wzmacniacz do nagrywania cęgów napięciowych i prądowych 
Digidata 1322A digitizerMolecular Devices2500-135System akwizycji danych do rejestracji elektrofizjologii
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Mikroskop do elektrofizjologii
Stół laboratoryjny Micro-GTMC63-533Stół powietrzny do mikroskopu elektrofizjologicznego
Komputer stacjonarny Inspiron 620 z 64-bitowym systemem Windows 7 KomputerDellD06D001z oprogramowaniem do elektrofizjologii
Kamera CCD c2400Hamamatsu70826-5Kamera ze sprzężeniem ładunkowym do obrazowania elektrofizjologii
Żyletki ze stali nierdzewnej na godzinie 7 O'Clock Super PlatinumGilletteCMM01049Ostrza do golenia ze stali nierdzewnej pokrytej platyną
Pipety transferoweFisher Scientific13-711-7MJednorazowe pipety transferowe z polietylenu
stołowym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie in vivoprzygotowanie ca ego m zgupoziomy skrawki m zgurejestracje z obr bu wzg rza optycznegoaktywacja kom rek zwojowych siatk wkibipolarna elektroda stymuluj cablok z elastomeru silikonowegozewn trzny roztw r rejestracyjny

Powiązane artykuły