Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Obwód siatkówki jest głównym składnikiem układu wzrokowego. Składa się z RGC w oku, które rzutują swoje aksony do tektum wzrokowego, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z postsynaptycznymi neuronami tektalnymi. Obwód siatkówki kijanki Xenopus jest popularnym modelem rozwojowym do badania tworzenia i funkcjonowania obwodów nerwowych. Istnieje wiele atrybutów obwodu siatkówkowego tej kijanki, które czynią z niej potężny model eksperymentalny^1,2,3. Jedną z głównych cech, na której skupia się ten artykuł, jest możliwość przeprowadzania nagrań klamer całych komórek z neuronów tektalnych, in vivo lub przy użyciu preparatu całego mózgu. Dzięki sprzętowi do elektrofizjologii wyposażonemu we wzmacniacz, który obsługuje tryby nagrywania cęgów napięcia i prądu, zapisy z użyciem cęgów krosowych całych komórek pozwalają na scharakteryzowanie elektrofizjologii neuronu w wysokiej rozdzielczości. W rezultacie, zapisy klamer całych komórek z neuronów tektalnych na kluczowych etapach tworzenia obwodu siatkówkowego dostarczyły szczegółowego i wszechstronnego zrozumienia rozwoju i plastyczności intrinsic^4,5^,6,7 i synaptic^8,9,10,11 właściwości. Połączenie zapisów neuronów tektalnych z klamrą całej komórki, zdolności do ekspresji genów lub morfolin będących przedmiotem zainteresowania w tych neuronach¹², oraz metody oceny zachowania kierowanego wzrokowo za pomocą ustalonego testu unikania wzrokowego¹³ promuje identyfikację powiązań między cząsteczkami, funkcją obwodu i zachowaniem.

Ważne jest, aby zauważyć, że rodzaj danych o wysokiej rozdzielczości uzyskanych z nagrań z klamrami całych komórek nie jest możliwy przy użyciu nowszych metod obrazowania, takich jak genetyczny wskaźnik wapnia GCaMP6, ponieważ chociaż użycie wskaźników wapnia pozwala na obrazowanie dynamiki wapnia w dużych populacjach neuronów jednocześnie, nie ma bezpośredniego ani oczywistego sposobu, aby uzyskać określone parametry elektryczne poprzez pomiar fluorescencji delta w somatach, I nie ma sposobu, aby napięcie clampować neuron w celu zmierzenia zależności prąd-napięcie. Wyraźnie widać, że te dwa odrębne podejścia, zapisy elektrofizjologiczne i obrazowanie wapnia, mają nienakładające się na siebie mocne strony i generują różne rodzaje danych. W związku z tym najlepsze podejście zależy od konkretnego pytania eksperymentalnego, które jest poruszane.

Tutaj opisujemy naszą metodę pozyskiwania nagrań klamr z całych komórek z neuronów tektum wzrokowego kijanki za pomocą preparatu in vivo, preparatu całego mózgu oraz nowszego zmodyfikowanego preparatu całego mózgu, który został opracowany w naszym laboratorium14. W sekcji Reprezentatywne wyniki pokazujemy eksperymentalne zalety każdego preparatu oraz różne rodzaje danych, które można uzyskać. Ograniczenia i mocne strony różnych preparatów, a także wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów znajdują się w sekcji Dyskusja.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Wyoming. Wszystkie zabiegi, w tym zapisy elektrofizjologiczne, przeprowadzane są w temperaturze pokojowej, około 23 °C. Wszystkie opisane tutaj metody są zoptymalizowane pod kątem rejestrowania neuronów tektalnych z kijanek między stadium rozwojowym 42 a 49 (etapy według Neiuwkoopa i Faber¹⁵).

1. Przygotowanie In Vivo

1. Znieczul kijankę.
   1. Umieść kijankę na małej szalce Petriego zawierającej roztwór Steinberga z 0,01% MS-222 na około 5 minut.
      UWAGA: MS-222 aka "Tricaine" jest powszechnym środkiem znieczulającym dla ryb i. Kijanki są hodowane w roztworze Steinberga w mM: 0,067 KCl, 0,034 Ca(NO₃)₂•4H₂O, 0,083 MgSO4•_7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.
   2. Upewnij się, że kijanka jest głęboko znieczulona (nie reaguje i nie przestaje pływać) przed przejściem do kroku 2. Upewnij się, że kijanka jest głęboko znieczulona (nie reaguje i nie pływa
   ).
2. Przymocuj znieczuloną kijankę do zanurzonego silikonowego bloku na podłodze naczynia do sekcji/nagrywania.
   1. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej przenieś znieczuloną kijankę do naczynia preparacyjnego/rejestrującego zawierającego zewnętrzny roztwór rejestrujący (115 mM NaCl, 2 mM KCl, 3 mM CaCl₂, 3 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, 1 mM glukozy; dostosuj pH do 7,25 za pomocą 10 N NaOH, osmolarność 255 mOsm).
      1. Aby zminimalizować spontaniczne drgania mięśni, dodaj bloker receptora acetylocholiny, tubokurarynę (100 μM) do roztworu zewnętrznego. (Zazwyczaj odbywa się to za pomocą pipety o pojemności 200 μl, aby dodać 100 μl 10 ml bulionu tubocuraryny o pojemności 10 ml do 10 ml roztworu zewnętrznego).
   2. Za pomocą szpilek przeciw owadom przymocuj kijankę, grzbietem do góry, do zanurzonego bloku elastomeru silikonowego (takiego jak Sylgard 184, szczegóły w Tabeli Materiałów), który został przyklejony do podłogi naczynia sekparacyjnego.
      Uwaga: Rozmieszczenie szpilek ma kluczowe znaczenie: umieść je po obu stronach mózgu, wystarczająco ogonowo, aby uniknąć przebicia aferentnych aksonów RGC, które wystają z oka i wchodzą do mózgu tuż przed tektum wzrokowym (Rysunek 1A).
3. Zafiletuj mózg wzdłuż linii środkowej.
   1. Aby uzyskać wyraźny widok mózgu, usuń skórę pokrywającą mózg, wykonując powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej za pomocą sterylnej igły 25-G.
   2. Zaokrąglij mózg wzdłuż tej samej osi linii środkowej, wkładając igłę do cewy nerwowej i delikatnie pociągając w górę (grzbietowo), tak aby grzbietowa część rurki została czysto przecięta (odcięta), pozostawiając nienaruszoną płytę podłogową (Rysunek 1B).
      UWAGA: Ważne jest, aby płyta podłogowa cewy nerwowej pozostała nienaruszona, ponieważ aferentne bodźce sensoryczne dostają się do tectum przez płytę podłogową.
4. Usuń przezroczystą błonę komorową, która pokrywa neurony tektalne.
   1. Przenieś naczynie nagrywające na stanowisko do elektrofizjologii i użyj potłuczonej szklanej końcówki pipety, aby usunąć błonę komorową pokrywającą tektalne ciała komórek neuronów. Złam końcówkę, delikatnie przeciągając ją po delikatnej wycieraczce roboczej.
   2. Wkręć pipetę w uchwyt pipety i opuść ją do osłony optycznej za pomocą mikromanipulatora.
   3. Użyj złamanej pipety, aby oderwać błonę komorową od tectum.
      UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie membrany z całego tectum; Wystarczy małe okienko, które zapewni dostęp do wielu neuronów.
5. Uzyskaj nagrania z całego zacisku łaty komórkowej.
   UWAGA: Podejście od tego momentu jest podobne do przeprowadzania nagrań całych komórek z wycinków mózgu myszy, jak opisano w Segev i wsp.¹⁶(Rysunek 1C).
6. Rejestruj reakcje neuronów tektalnych na cały błysk światła rzucany na siatkówkę.
   1. Aby rzutować całe pole światła na siatkówkę, umieść światłowód w pobliżu oka kijanki. Na drugim końcu światłowodu znajduje się dioda LED w linii z rezystorem zmiennym, który pozwala na kontrolowanie luminancji światła. Wyzwalaj diodę LED przez wyjście cyfrowe amplifier. W ten sposób można rejestrować rozbłyski całego pola o różnym natężeniu światła (Rysunek 4A).

2. Przygotowanie całego mózgu

1. Wykonaj kroki od 1.1 do 1.3.
   Uwaga: Nie ma potrzeby stosowania tubokuraryny w roztworze zewnętrznym do tego preparatu.
2. Odizoluj mózg.
   1. Użyj igły 25-G, aby przeciąć tyłomózgowie (Rysunek 2A).
   2. Aby odizolować cały mózg od kijanki, delikatnie przeciągnij igłę pod mózgiem, w kierunku ogonowo-rostralnym, aby przeciąć całą boczną i brzuszną tkankę łączną oraz włókna nerwowe.
3. Przymocuj mózg do bloku elastomeru silikonowego.
   1. Po całkowitym uwolnieniu przymocuj mózg do bloku elastomeru krzemowego, umieszczając jedną szpilkę przez jedną z opuszki węchowych, a drugą szpilkę przez tyłomózgowie (Rysunek 2B). Jest to optymalna konfiguracja do nagrywania z neuronów tektalnych.
4. Przenieś naczynie zawierające przypięty preparat całego mózgu z lunety prosektoryjnej do stanowiska do elektrofizjologii. Usunąć błonę komorową za pomocą pipety z potłuczonego szkła, jak opisano w kroku 1.4.
5. Umieść bipolarną elektrodę stymulującą na skrzyżowaniu wzrokowym (gdzie akson przechodzi od każdego oka krzyżującego się w śródmózgowiu), aby bezpośrednio aktywować aksony RGC.
   1. Umieść bipolarną elektrodę stymulującą rostral i prawie przylegającą do dużej środkowej komory. Skrzyżowanie wzrokowe znajduje się bezpośrednio rostralnie do dużej środkowej komory (Ryc. 2B).
      1. Delikatnie opuść elektrodę stymulującą w dół na skrzyżowanie optyczne, tak aby w tkance powstało małe wgniecenie. Elektroda bipolarna napędzana jest stymulatorem impulsów, który pozwala na precyzyjną kontrolę siły stymulacji.
6. Wykonaj zapis całego zacisku łaty komórkowej (Rysunek 2C) zgodnie z opisem Segev i wsp.¹⁶

3. Poziome przygotowanie wycinka mózgu

1. Wykonaj kroki od 2.1 do 2.3.
2. Użyj żyletki, aby wyciąć najbardziej boczną czwartą część (która in vivo odpowiada najbardziej grzbietowej ćwiartce) z jednej strony jednego tektum optycznego. To cięcie jest wykonane równolegle do płaszczyzny rostralno-ogonowej, jak pokazano na Rysunek 3A.
3. Ponownie przypnij mózg do boku elastomeru silikonowego przekrojoną stroną skierowaną do góry (tak, aby somata i neuropil były bezpośrednio dostępne do nagrywania) i powierzchni komorowej mózgu skierowanej od bloku elastomeru silikonowego (Rysunek 3B) (tak, aby można było umieścić elektrodę bipolarną na skrzyżowaniu wzrokowym).
4. Wykonaj zapis całego zacisku łaty komórkowej lub lokalnego potencjału pola (Rysunek 3C) zgodnie z opisem Segev i wsp.¹⁶

Aby zarejestrować reakcje wywołane światłem, na siatkówkę rzutowany jest cały błysk światła, podczas gdy wynikowa odpowiedź jest rejestrowana z indywidualnych neuronów tektalnych (Rysunek 4A). Ten konkretny protokół jest przeznaczony do pomiaru zarówno odpowiedzi neuronu na włączenie światła ("odpowiedź On"), jak i wyłączenia 15 s później, aby zmierzyć "Odpowiedź Off". Neurony tektalne zazwyczaj wykazują silne reakcje włączania i wyłączania (pokazane tutaj nagrane w trybie zacisku napięcia, z neuronem zaciśniętym na -60 mV w celu pomiaru prądu synaptycznego ( Rysunek 4B)). Ilość popędu synaptycznego odbieranego przez pojedynczy neuron może być określona ilościowo, rejestrując spontaniczne zdarzenia synaptyczne (Rysunek 4C). Zależności prąd-napięcie (krzywe I-V) mogą być generowane z tego samego neuronu poprzez stopniowanie neuronu do coraz bardziej zdepolaryzowanych potencjałów i rejestrowanie powstałych prądów Na+ i K+ aktywowanych napięciem, określanych jako "nagrania prądów mieszanych" (Rysunek 4D, E). Ustalono, że w przypadku tych neuronów szczytowe prądy Na+ i K+ można określić ilościowo za pomocą zapisów prądów mieszanych, ponieważ piki nie nakładają się czasowo na siebie4,7.

Bezpośrednia aktywacja aksonów RGC na skrzyżowaniu wzrokowym omija wszystkie wcześniejsze obliczenia i przetwarzanie bodźców wzrokowych, które mają miejsce w oku, i pozwala na badanie transmisji synaptycznej między presynaptycznymi aksonami RGC a postsynaptycznymi neuronami tektalnymi w jej najczystszej i zredukowanej formie. Odpowiedzi neuronów tektalnych na aktywację RGC są generowane przez RGC stymulowane światłem lub bezpośrednio za pomocą bipolarnej elektrody stymulującej składającej się z dwóch składników: komponentu monosynaptycznego (bezpośrednie wejście synaptyczne z aktywowanych RGC) i komponentu polisynaptycznego (lokalna powtarzająca się aktywność sieci przekazująca się z powrotem do rejestrowanego neuronu). W przypadku reakcji wywołanych światłem, składowe monosynaptyczne i polisynaptyczne nakładają się na siebie w pewnej nieokreślonej ilości. To czasowe nakładanie się ogranicza to, co można wywnioskować na temat transmisji synaptycznej między siatkówką a tektum optycznym. Użycie preparatu całego mózgu i aktywacja drogi aksonowej RGC bezpośrednio przez elektrodę umieszczoną na skrzyżowaniu wzrokowym (Rysunek 5A), wytwarza jednak mono- i polisynaptyczny komponent, które zasadniczo nie nakładają się na siebie w czasie. Siłę stymulacyjną elektrody bipolarnej można regulować. Wraz ze wzrostem siły stymulującej aktywowana jest większa liczba aksonów RGC (Rysunek 5B). Protokół minimalnej stymulacji określa siłę synaptyczną pojedynczego aksonu RGC na pojedynczym neuronie tektalnym; protokół maksymalnej stymulacji odzwierciedla całkowity lub maksymalny wkład synaptyczny ze wszystkich aksonów RGC łącznie (Rysunek 5C). Właściwy stosunek pobudzających do hamujących wejść synaptycznych (stosunek E:I) odbieranych przez pojedynczy neuron tektalny ma kluczowe znaczenie dla prawidłowych funkcji wzrokowych18. Rysunek 5D pokazuje przykład śladów prądu pobudzającego i hamującego wywołanych przez RGC, zarejestrowanych z pojedynczego neuronu tektalnego. Prawdopodobieństwo uwolnienia nadajnika z presynaptycznych końców aksonów RGC mierzy się za pomocą sparowanych zapisów impulsów. W tym celu postsynaptyczny neuron tektalny jest rejestrowany w trybie cęgów napięciowych w celu pomiaru prądów synaptycznych, podczas gdy aksony RGC są aktywowane kolejno, oddzielone odstępem czasu 50 ms (Rysunek 5E).

Zapisy klamer całych komórek mogą być prowadzone z neuronów tektalnych znajdujących się w dowolnej warstwie somatycznej. Podobnie jak w przypadku preparatu całego mózgu, aksony RGC mogą być aktywowane poprzez umieszczenie bipolarnej elektrody rejestrującej na skrzyżowaniu wzrokowym (Rysunek 6A). Wszystkie nagrania przeprowadzone w ramach całego preparatu mózgu mogą być również wykonane przy użyciu tego poziomego preparatu wycinków mózgu. Rysunek 6B pokazuje przykładowy ślad wywołanej przez RGC odpowiedzi zarejestrowanej przez neuron w warstwie powierzchownej. Preparat ten pozwala również na pomiar przestrzennego wzorca danych wejściowych synaptycznych RGC do dendrytów tektalnych. W tym celu potencjały pola wywołane RGC są rejestrowane co 10 μm wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej (tj. osi dystalno-proksymalnej) neuropilu (Rysunek 6C). W ten sposób generowany jest profil o wysokiej rozdzielczości wzorca funkcjonalnych danych wejściowych RGC. Potencjały pola można następnie przekształcić w bieżące gęstości źródła, obliczając drugą pochodną przestrzenną14, a obecne gęstości źródła można z kolei przekształcić w wykres obrazu. Wykres obrazu w Rysunek 6C pokazuje, że najsilniejsze wejście RGC jest ukierunkowane na bardziej dystalny obszar neuropilu.

Rysunek 1. Procedury przygotowawcze in vivo. (A) Kijanka przypięta do kawałka elastomeru silikonowego. Piny są oznaczone białymi strzałkami. Zwróć uwagę na bardziej ogonowe ułożenie sworznia, aby uniknąć przebijania dróg wzrokowych. Biała przerywana linia oznacza linię środkową. (B) Powiększony widok całego mózgu po przecięciu wzdłuż grzbietowej linii środkowej i usunięciu nakładającej się skóry. (C) Zapis clampu krosowego całej komórki in vivo. (L: Boczne. M: Środkowy. R: Rostral. C: Przyczynowy. D: Grzbietowy. V: Brzuszny. OB: Opuszka węchowa. OT: Tectum optyczne. HB: Tyłomózgowie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Procedury przygotowania całego mózgu. (A) Po tym, jak mózg zostanie wyfiletowany wzdłuż linii środkowej, tyłomózgowie zostaje odcięte. (B) Cały mózg jest wycinany i przypinany do elastomeru silikonowego. Biała gwiazdka oznacza szpilkę w lewej opuszce węchowej. Czerwona ramka wskazuje środkową trzecią część tectum, tj. obszar docelowy do rejestracji. (C) Zapis klamry z całych komórek przy użyciu preparatu całego mózgu. gwiazdka oznacza obszar niezeskrobanej błony komorowej, w którym nie można uzyskać dostępu do komórek w celu rejestracji. Tam, gdzie błona została pomyślnie usunięta, somaty wydają się bardziej wyraźne i zdefiniowane. Strzałka wskazuje na niezdrowy neuron. (PZ: Strefa proliferacyjna . LMV: Duża komora przyśrodkowa. OB: Opuszka węchowa. OT: Tectum optyczne. HB: Tyłomózgowie. L: Poprzecznie. M: Środkowy. R: Rostral. C: Przyczynowy. D: Grzbietowy. V: brzuszny). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Procedury poziomego przygotowania wycinków mózgu. (A) Najbardziej boczna część jednej strony tektum wzrokowego zostanie przecięta (oznaczona linią przerywaną) po przygotowaniu całego mózgu. (B) Poziome przygotowanie wycinka mózgu po przygwożdżeniu do boku elastomeru silikonowego. Podwójne białe linie reprezentują elektrodę stymulającą umieszczoną na skrzyżowaniu wzrokowym. (C) Powiększony widok warstw somy i neuropilu przy użyciu poziomego preparatu wycinków mózgu. Krzywa przerywana wyznacza granicę między warstwami somy a neuropilem. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Hamodiego i wsp.14 (L: Lateral. M: Środkowy. R: Rostral. C: Przyczynowy. D: Grzbietowy. V: Brzuszny. OB: Opuszka węchowa. OC: skrzyżowanie wzrokowe. OT: Tectum optyczne. HB: Tyłomózgowie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Nagrania z preparatu in vivo. (A) Schemat przedstawiający typową konfigurację zapisu in vivo. (B) Światło wywołało reakcje, w tym reakcje włączania i wyłączania światła. Ślady wstawki są powiększone odpowiednio dla odpowiedzi włączonej i wyłączonej. (C) Zarejestrowano spontaniczne pobudzające prądy postsynaptyczne. (D) Prądy Na+ i K+ w odpowiedzi na kroki cęgów napięcia od -60 mV do 30 mV z pojedynczego neuronu. (E) Wykresy IV wygenerowane ze śladów w (D). Wszystkie nagrania zostały wykonane z neuronem utrzymywanym na poziomie -60 mV, z wyjątkiem (D) w celu wygenerowania wykresów IV; Neurony są przekształcane w coraz bardziej zdepolaryzowane potencjały, w krokach co 10 mV, aby aktywować prądy zależne od napięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Nagrania z całego preparatu mózgu. (A) Schemat pokazujący typową konfigurację zapisu całego mózgu z elektrodą stymulującą umieszczoną na skrzyżowaniu wzrokowym (zielone i czerwone linie reprezentują aksony RGC). (B) Nakładanie na siebie śladów odpowiedzi RGC na zmiany siły stymulacji RGC. (C) Maksymalna reakcja na stymulację (po lewej) i minimalna reakcja na stymulację (po prawej). (D) Wywołana przez RGC odpowiedź pobudzająca i hamująca na pojedynczy neuron. (E) Sparowane impulsowe ułatwienie odpowiedzi pojedynczego neuronu wywołanej przez RGC. (OB: Opuszka węchowa. OC: skrzyżowanie wzrokowe. OT: Tectum Optyczne). Wszystkie nagrania zostały wykonane z neuronem utrzymywanym pod napięciem -60 mV, z wyjątkiem (D) w celu pomiaru wejść pobudzających i hamujących: wejście pobudzające jest rejestrowane przez utrzymywanie neuronu przy potencjale odwrócenia prądów chlorkowych, w których pośredniczy kwas γ-aminomasłowy (GABA) (-45 mv); wejście hamujące poprzez utrzymywanie neuronu przy potencjale odwrócenia prądów za pośrednictwem kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego (AMPA) (+5 mV). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Nagrania z poziomego przygotowania wycinków mózgu. (A) Schemat pokazujący konfigurację poziomego preparatu wycinka mózgu. Należy zauważyć, że chociaż elektroda stymulująca pozostaje na skrzyżowaniu wzrokowym, pipeta rejestrująca jest teraz ustawiona tak, aby uzyskać dostęp do komórek we wszystkich warstwach tektalnych odsłoniętych przez poziome przygotowanie wycinka mózgu. (B) Odpowiedź RGC z neuronu znajdującego się w powierzchownej warstwie tectum. (C) Zarejestrowane potencjały pola w neuropolu i przekształcone gęstości źródeł prądu (CSD) pokazane na mapach cieplnych na wykresie obrazu. (OC: skrzyżowanie wzrokowe. OT: Tectum optyczne. HB: Tyłomózgowie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.