Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są głównym źródłem komórek w terapii komórkowej. MSCs z mazi stawowej jamy stawowej mogą być potencjalnie wykorzystywane do inżynierii tkanki chrzęstnej. MSCs z mazi stawowej (SF-MSC) są uważane za obiecujących kandydatów do regeneracji stawów, a ich potencjalne korzyści terapeutyczne sprawiły, że stały się ostatnio ważnym tematem badawczym. SF-MSC z jamy kolana białego królika nowozelandzkiego można wykorzystać jako zoptymalizowany model translacyjny do oceny medycyny regeneracyjnej człowieka. Dzięki technologiom magnetycznego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) opartym na CD90, protokół ten z powodzeniem uzyskuje królicze SF-MSC (rbSF-MSC) z tego modelu królika i dalej w pełni demonstruje fenotyp MSC tych komórek, indukując je do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty. Dlatego podejście to może być stosowane w badaniach biologii komórki i inżynierii tkankowej przy użyciu prostego sprzętu i procedur.
Wprowadzenie
MSCs zostały zasugerowane jako cenne źródło dla medycyny regeneracyjnej, szczególnie dla zmian w chrząstkach. MSCs, w tym chondrocyty, osteoblasty, adipocyty, miocyty szkieletowe i komórki zrębu trzewnego, szeroko rozszerzają obszary do przeszczepu komórek macierzystych ze względu na ich wysoki współczynnik ekspansji i potencjał różnicowania wieloliniowego1. MSCs można izolować z mięśni szkieletowych, błony maziowej, szpiku kostnego i tkanki tłuszczowej2,3,4. Wyniki potwierdziły również obecność MSCs w płynie maziowym, a wcześniejsze badania zidentyfik....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi regionalnego Komitetu Etyki, a wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Shenzhen Second People's Hospital, Shenzhen University.
1. Izolowanie i hodowla rbSF-MSC
- Przygotowania do zabiegu na zwierzętach
- Przygotowanie dojrzałych szkieletowo samic białych królików nowozelandzkich do kolekcji rbSF-MSC. Przeprowadzić badanie kliniczne królików na dzień przed zabiegiem znieczulenia i artrocentezy.
UWAGA: Badania fizykalne powinny obejmować....
- Przygotowanie dojrzałych szkieletowo samic białych królików nowozelandzkich do kolekcji rbSF-MSC. Przeprowadzić badanie kliniczne królików na dzień przed zabiegiem znieczulenia i artrocentezy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Izolacja, oczyszczanie i hodowla rbSF-MSCs:
Niniejszy protokół wykorzystuje metodę MACS do izolacji rbSF-MSCs w oparciu o ekspresję markera powierzchniowego MSC CD90. Schemat blokowy procesu izolacji, oczyszczania i charakterystyki rbSF-MSCs oraz protokół hodowli in vitro przedstawiono na Rysunku 1.
Morfologia komórek po magnetycznej separacji komórek (MACS) z u.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecność MSCs w płynie maziowym stanowi alternatywę dla terapii komórkowej. Wcześniejsze badania wykazały, że miejsca urazu zawierają większe ilości mezenchymalnych komórek macierzystych w płynie stawowym, co może być dodatnio skorelowane z okresem po urazie5. MSCs w płynie maziowym może być korzystny dla tkanek w celu przyspieszenia spontanicznego gojenia się po urazie18,19. Kliniczne zastosowanie SF-MSCs rzadko było omawiane w literaturz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane finansowo przez następujące granty: Chińska Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81572198; Nr 81772394); Fundusz Budowy Dyscypliny Medycznej Wysokiego Szczebla Uniwersytetu w Shenzhen (nr 2016031638); Fundacja Badań Medycznych Prowincji Guangdong, Chiny (nr A2016314); oraz Projekty Naukowo-Technologiczne w Shenzhen (nr JCYJ20170306092215436; Nie. JCYJ20170412150609690; Nie. JCYJ20170413161800287; Nie. SGLH20161209105517753; Nie. JCYJ20160301111338144).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| MesenGro Suplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Składnik pożywki hodowlanej MSCs |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | Pożywka różnicująca MSCs |
| Izotoniczny roztwór soli | Litai, Chiny | 5217080305 | Odczynnik do procedury artrocentezy ubytków |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, nie zawiera Ca2+/Mg2+ |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Składnik pożywki hodowlanej MSCs |
| Roztwór jodu powidonu | Guangdong, Chiny | 150605 | Środek sterylizujący |
| 75% etanol | Lircon, Chiny | 170917 | Środek sterylizujący |
| 0,25% Trypsyna / EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Odczynnik do dysocjacji komórek |
| 1% Penicylina-Streptomycyna | Gibco Inc. | 15140-122 | Składnik pożywki MSCs |
| MACS Bufor do biegania | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Zawierający sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mMEDTA |
| CD90 sprzężone z przeciwciałami MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | Do magnetycznego sortowania komórek aktywowanych |
| Pirogronian sodu | Sigma-Aldrich | P2256 | Składnik chondrogenetycznych MSCs różnicowanie |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D1756 | Składnik różnicowania osteogennego MSCs |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs |
| L-prolina | Sigma-Aldrich | P5607 | 0,35 mM, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs |
| Kwas L-askorbinowy-2-fosforan | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs |
| 3-izobutylo-1-metyloksantyna | Sigma-Aldrich | I5879 | 0,5 mM, Składnik różnicowania adipogennego |
| Indometacyna | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Składnik różnicowania adipogennego |
| TGFβ 1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng / ml, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs |
| i alfa;-glicerofsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Składnik różnicowania osteogennego MSCs |
| Przeciwciało poliklonalne CD34, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Marker hematopoetycznych komórek macierzystych |
| Mysz antykrólik CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | błona Thy-1 glikoproteina (marker MSCs) |
| CD45 (przeciwciało monoklonalne) | Bio-Rad | MCA808GA | marker hematopoetycznych komórek macierzystych |
| Przeciwciało CD105 | Genetex | GTX11415 | marker MSCs |
| Alkohol izopropylowy | Sigma-Aldrich | I9030 | Wytrąca się Ekstrakcja RNA Fazy organiczne |
| Trichlorometan | Wenge, Chiny | 61553 | Ekstrakt całkowity RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Izolat całkowitego RNA |
| SYBR zielona mieszanka mistrzowska | Takara Bio, Japonia | do syntezy cDNA do testu PCR | RR420A |
| Takara Bio, Japonia | RR047A | Odwrotna transkrypcja na komplementarne DNA | |
| Alizaryn Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Barwienie związków wapnia |
| Toluidyna Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Barwienie tkanki chrzęstnej |
| Roztwór czerwieni olejowej O | Sigma-Aldrich | O1391L | Barwienie wakuoli lipidowej |
| Sprzęt | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | Do magnetycznego sortowania komórek |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | Do magnetycznego aktywowanego sortowania komórek |
| Kolumny MS | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | Do magnetycznego aktywowanego sortowania komórek |
| Sitko | komórkowe FALCON Inc. | 352340 | 40 μ m |
| nylonowy hemocytometr | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Zliczanie komórek |
| Falcon 100 mm talerz | Corning | 353003 | Naczynie do hodowli komórkowych |
| Probówka do mikrowirówki | Axygen | MCT-150-C | Ekstrakcja RNA i |
| probówki wirówkowe | Sigma-Aldrich | 91050 | sterylizowana promieniami gamma |
| Eppendorf | 5804R | Komory wirówki | |
| Komórka dwutlenku węgla inkubator | Thermo scientific | 3111 | Hodowla komórkowa |
| Instrument do PCR w czasie rzeczywistym Life | Tech | QuantStudio | Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym |
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences | 342975 | Analizator komórek |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Przenieś ciecz |
| Cylinder klonujący | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Izoluj i wybieraj poszczególne kolonie komórek |
| Sterylna strzykawka podskórna | Double-Dove, Chiny | 131010 | Procedura artrocentezy |
| Klatka dla królików | Zhike, Chiny | ZC-TGD | Skrępuj królika |
Bibliografia
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
