Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57466

⸱

10 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Postgraduate institution, Guangzhou Medical University, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, 3Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopaedic Engineering, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 4Department of Chemistry, Chinese University of Hong Kong, 5Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są głównym źródłem komórek w terapii komórkowej. MSCs z mazi stawowej jamy stawowej mogą być potencjalnie wykorzystywane do inżynierii tkanki chrzęstnej. MSCs z mazi stawowej (SF-MSC) są uważane za obiecujących kandydatów do regeneracji stawów, a ich potencjalne korzyści terapeutyczne sprawiły, że stały się ostatnio ważnym tematem badawczym. SF-MSC z jamy kolana białego królika nowozelandzkiego można wykorzystać jako zoptymalizowany model translacyjny do oceny medycyny regeneracyjnej człowieka. Dzięki technologiom magnetycznego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) opartym na CD90, protokół ten z powodzeniem uzyskuje królicze SF-MSC (rbSF-MSC) z tego modelu królika i dalej w pełni demonstruje fenotyp MSC tych komórek, indukując je do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty. Dlatego podejście to może być stosowane w badaniach biologii komórki i inżynierii tkankowej przy użyciu prostego sprzętu i procedur.

Wprowadzenie

MSCs zostały zasugerowane jako cenne źródło dla medycyny regeneracyjnej, szczególnie dla zmian w chrząstkach. MSCs, w tym chondrocyty, osteoblasty, adipocyty, miocyty szkieletowe i komórki zrębu trzewnego, szeroko rozszerzają obszary do przeszczepu komórek macierzystych ze względu na ich wysoki współczynnik ekspansji i potencjał różnicowania wieloliniowego1. MSCs można izolować z mięśni szkieletowych, błony maziowej, szpiku kostnego i tkanki tłuszczowej2,3,4. Wyniki potwierdziły również obecność MSCs w płynie maziowym, a wcześniejsze badania zidentyfikowały MSCs pochodzące z mazi stawowej (SF-MSC) jako obiecujących kandydatów do regeneracji stawów5,6.

Jednak badania i eksperymenty przedkliniczne na próbkach ludzkich podlegają wielu problemom etycznym. Zamiast tego króliki były i nadal są najczęściej wykorzystywanymi gatunkami zwierząt, aby wykazać, że przeszczepienie MSC może naprawić uszkodzenia chrząstki. W ostatnich latach coraz więcej badaczy bada mezenchymalne komórki macierzyste królika (rbMSC) zarówno in vitro, jak i in vivo, ponieważ komórki te są podobne do ludzkich MSCs pod względem biologii komórkowej i fizjologii tkanek. Podobnie, rbMSC są zdolne do przylegania do powierzchni z tworzywa sztucznego, wykazując morfologię wrzeciona-fibroblastów, jak w MSC u ludzi. Co więcej, próbki mezenchymalne królików są proste i łatwe do uzyskania7. Dodatkowo, najważniejszymi punktami są to, że rbMSC wyrażają markery powierzchniowe, takie jak CD44, CD90 i CD105, oraz że zachowany jest potencjał różnicowania wieloliniowego, co jest zgodne z kryteriami identyfikacji populacji MSC określonymi przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej8,9. W szczególności chondroprogenitorzy płynu maziowego są zdolne do nieprzerostowej chondrogenezy, gdy są indukowane przez TGF-β1, co czyni je odpowiednimi źródłami komórek do fenotypowo regeneracji chrząstki stawowej10,11,12.

Jednak izolacja SF-MSC znacznie różni się od innych tkanek, w tym pępowiny, tkanki tłuszczowej, krwi obwodowej i szpiku kostnego. Obecnie najczęstszymi metodami oczyszczania i sortowania SF-MSC są cytometria przepływowa i sortowanie oparte na kulkach immunomagnetycznych, chociaż metoda cytometrii przepływowej wymaga specyficznego środowiska i bardzo drogich instrumentów13.

Ten artykuł przedstawia procedurę prostego i minimalnie inwazyjnego pobierania próbek płynu maziowego od białych królików z Nowej Zelandii. Podczas zabiegu rbSF-MSC są stabilnie namnażane in vitro, a następnie izolowane za pomocą procedur opartych na dodatnich kulkach magnetycznych CD90. Wreszcie, protokół pokazuje, w jaki sposób uzyskać MSCs o wysokiej czystości i żywotności z pobranych źródeł komórkowych.

W tym protokole, izolowane rbSF-MSC są charakteryzowane na podstawie ich morfologii, ekspresji specyficznych markerów i pluripotencji komórek macierzystych. Immunofenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej ujawnia znaczącą dodatnią ekspresję CD44 i CD105, podczas gdy ekspresja CD45 i CD34 jest ujemna. Wreszcie, test in vitro na obecność rbSF-MSC wykazuje osteogenne, adipogenne i chondrogenne różnicowanie tych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi regionalnego Komitetu Etyki, a wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Shenzhen Second People's Hospital, Shenzhen University.

1. Izolowanie i hodowla rbSF-MSC

  1. Przygotowania do zabiegu na zwierzętach
    1. Przygotowanie dojrzałych szkieletowo samic białych królików nowozelandzkich do kolekcji rbSF-MSC. Przeprowadzić badanie kliniczne królików na dzień przed zabiegiem znieczulenia i artrocentezy.
      UWAGA: Badania fizykalne powinny obejmować wagę (2,0 - 2,5 kg), płeć (kobieta) oraz temperaturę ciała, częstość oddechów i tętno. Przedziały parametrów dla klinicznie zdrowych królików wynoszą 30 - 50 minut dla częstości oddechów, 220 - 280 minut dla tętna i 38 - 39 °C dla temperatury ciała.
    2. Pościć zwierzęta przez 6 godzin przed znieczuleniem.
  2. Przygotowanie i procedura znieczulenia zwierząt
    1. Unieruchomić królika klatką (patrz tabela materiałów), a następnie wstrzyknąć 3% pentobarbitalu sodu do żyły ucha brzeżnego w dawce 1 ml/kg do znieczulenia ogólnego.
    2. Ułóż królika w wygodnej pozycji grzbietowo-leżącej.
    3. Monitoruj częstość oddechów, tętno i temperaturę ciała królika podczas znieczulenia.
    4. Użyj maści okulistycznej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    5. Oceń głębokość znieczulenia zgodnie z klasyfikacją Guedela14.
  3. Przygotowanie do izolacji i hodowli MSCs
    1. Aby wyhodować rbSF-MSC, należy przygotować 500 ml komercyjnej pożywki hodowlanej (patrz Tabela materiałów) uzupełnionej 10% komercyjnym suplementem (patrz Tabela materiałów), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
    2. Inkubować pożywkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    3. Przygotuj 500 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) do izolacji komórek i przemywania komórek.
    4. Przygotuj 100 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej do zabiegu artrocentezy jamy kolana.
  4. Pobranie stawowej błony maziowej z kolana królika
    1. Wybierz obszar o wymiarach około 5 x 5 cm wokół kolana i ogol sierść królika z tego obszaru za pomocą bezpiecznej golarki elektrycznej.
    2. Alternatywnie zdezynfekuj miejsce zabiegu 3x roztworem jodu powidonu i 75% etanolem. Następnie nałóż sterylne zasłony po dokładnym wyschnięciu obszaru.
    3. Wstrzyknąć 1 - 2 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej, za pomocą sterylnej strzykawki podskórnej (2 ml), do jamy stawu kolanowego z bocznej przestrzeni stawowej, przesunąć kolano 3 - 4x, a następnie odessać cały płyn maziowy w temperaturze pokojowej.
    4. Przefiltruj płyn maziowy przez sitko nylonowe o wielkości 40 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia w ciągu 4 godzin.
  5. Kultura rbSF-MSCs
    1. Przefiltrowany płyn należy zebrać do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i odwirować z prędkością 1 500 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Po odwirowaniu odrzucić supernatant, przemyć osad PBS, ponownie zawiesić osad z kompletną pożywką hodowlaną, a następnie umieścić pożywkę w naczyniach o średnicy 100 mm.
    3. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
    4. Po 48 godzinach uzupełnij naczynia świeżą pożywką, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki. Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie jako pasaż 0 (P0).
      UWAGA: Powinno być około 1 x 104 przylegających komórek. Żywe komórki/ml w SF to około 2 x 102/ml.
    5. Po 14 dniach od początkowego posiewu w szalkach hodowlanych powinno powstać wiele kolonii. Wybierz kolonie o średnicy większej niż 2 mm. Zaznacz miejsce, w którym znajdują się wybrane kolonie, śledząc ich obwód na dnie naczynia.
    6. Wyrzuć kolonie < szerokości 2 mm za pomocą skrobaków do komórek. Strawić wybrane kolonie za pomocą około 5 μl 0,25% trypsyny za pomocą cylindra do klonowania i przenieść kolonie do nowego naczynia jako pasaż 1 (P1).
  6. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami
    1. Postępuj zgodnie ze standardowymi instytucjonalnymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi monitorowania pooperacyjnego i powrotu do zdrowia po znieczuleniu.
    2. Monitoruj parametry życiowe królika co 10 minut, aż odzyska przytomność. Na koniec przenieś przytomne zwierzę do klatki. Nie należy zwracać królika, który przeszedł operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
    3. Po operacji zdezynfekuj miejsce 0,1% jodowidonu, 2x dziennie przez 3 dni.

2. CD90-dodatnie magnetyczne aktywowane sortowanie komórek (MACS) rbSF-MSC i hodowla pierwotna

  1. Przygotowanie próbki
    1. Gdy komórki osiągną około 80% zbieżności, odessaj pożywkę, a następnie dodaj 1-2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do każdego naczynia.
    2. Inkubuj naczynia przez 2-3 minuty, aby umożliwić oderwanie komórek.
    3. Po odłączeniu komórek dodaj równą ilość pożywki hodowlanej, aby dezaktywować trypsynę.
    4. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, zebrać filtrat do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować komórki w temperaturze 600 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do pracy MACS (PBS, pH 7,2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA), a następnie policz liczbę komórek.
  2. Etykiety magnetyczne<br /> UWAGA: Sortuj rbSF-MSC za pomocą zestawu do sortowania komórek aktywowanego magnetycznie, zawierającego kolumny, stojak i separatory (patrz Tabela materiałów).
    1. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
    2. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie zassać supernatant.
    3. Dodać 80 μl buforu do sporządzania zawiesiny na 107 komórek.
    4. Na 107 komórek ogółem dodaj 20 μl mikrogranulek sprzężonych z monoklonalnym przeciwciałem anty-króliczym CD90.
    5. Wymieszaj równomiernie kulki magnetyczne i komórki w probówkach, a następnie inkubuj je w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
    6. Dodać 1 ml buforu na 10-7 komórek do probówki, a następnie odwirować go w stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu przepłukania komórek. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
    7. Zawiesić osad w 500 μl buforu na 107 komórek.
  3. Separacja magnetyczna
    1. Umieść kolumnę ze skrzydłami kolumny do przodu w polu magnetycznym separatora magnetycznego.
    2. Przepłukać kolumnę separatora magnetycznego (MS) 500 μl buforu na 10-7 komórek.
    3. Przenieść zawiesinę jednokomórkową do kolumny. Pozwól ujemnym komórkom przejść przez pole magnetyczne, aby odrzucić te nieoznakowane komórki.
    4. Przemyć kolumnę 1 - 2x 500 μl buforu na 10,7 komórek i wyrzucić przepływ.
    5. Przenieść kolumnę do probówki wirówkowej (15 ml).
    6. Dodać 1 ml buforu na 107 komórek do kolumny, a następnie natychmiast wepchnąć tłok do kolumny, aby wypłukać magnetycznie znakowane komórki.
    7. Powtórz powyższą procedurę z drugą kolumną MS, aby zwiększyć czystość komórek CD90 +, które mogą wzbogacić eluowaną frakcję.
    8. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 × g przez 10 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić go z pożywką hodowlaną.
  4. Posiew CD90+ rbSF-MSC
    1. Zaszczepić komórki w szalkach o średnicy 100 mm po magnetycznym sortowaniu komórek.
    2. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżanymi komórkami z 5% CO2 .
    3. Po osiągnięciu 80 - 90% zbiegu kultury pierwotnej, po około 7 - 10 dniach, trawić przylegające komórki 0,25% trypsyny-EDTA i pasażować je w rozcieńczeniu 1:2, aby uzyskać pasaż 2 (P2).
    4. Użyj tej samej metody, aby przekazać komórki do pasażu 3 (P3), który można wykorzystać do testów in vitro.
      UWAGA: Po subkulturze i oczyszczeniu otrzymuje się około 1 x 107 rbSF-MSC.

3. Identyfikacja rbSF-MSCs

  1. Potwierdzenie markerów powierzchniowych rbSF-MSC za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Gdy MSCs osiągną 80-90% zlewu P3, przemyj komórki PBS i potraktuj je 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Następnie inkubować MSCs w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty, aż do odłączenia komórek.
    2. Zebrać komórki za pomocą 10 ml PBS, przenieść je do stożkowej probówki (15 ml) i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odrzucić supernatanty. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PBS i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Inkubować przeciwciała sprzężone z FITC i sprzężone z PE w rozcieńczeniu 1:100 (izotyp, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C.
    5. Odwirować tę mieszaninę przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i dwukrotnie przepłukać komórki PBS przez odwirowanie przy 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Odrzucić supernatanty.
    6. Zawiesić komórki w 500 μl PBS, przenieść zawiesinę komórek do probówki okrągłodennej (5 ml) i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego.
      UWAGA: Pozyskaj dane na cytometrze wyposażonym w dwa kanały fluorescencyjne: 533/30 i 585/40. Dla każdej fluorescencji izotypu użyj kontrolki izotypu, aby dostosować odpowiednie napięcie lasera i ustawić minimalną intensywność wymaganą do uzyskania histogramu fluorescencji, który wyświetla zarówno lewą, jak i prawą krawędź piku. Zbierz co najmniej 10 000 zdarzeń do analiz statystycznych.
  2. Zróżnicowanie rbSF-MSCs
    UWAGA: Użyj P3 rbSF-MSC do testów wielokrotnego różnicowania in vitro.
    1. Różnicowanie osteogenne
      1. Przygotować osteogenną pożywkę indukcyjną: zasadę DMEM (1x) zawierającą 50 mM kwasu L-askorbinowego-2-fosforanu, 10 mM α-glicerofosforanu i 100 nM deksametazonu.
      2. Zasiać komórki w 103 komórkach/cm2 na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej i wyhodować je w pożywce indukcyjnej osteogennej.
      3. Zmieniaj pożywkę indukcyjną co 3 dni przez 3 tygodnie.
      4. Utrwal komórki 4% formaldehydem przez 30 minut w temperaturze pokojowej po zakończeniu różnicowania, zabarwić komórki 1% czerwienią alizarynową przez 5 minut, a następnie umyj je 3x PBS15.
    2. Różnicowanie adipogenne
      1. Przygotować pożywkę do indukcji adipogennej: DMEM zasadowy (1x) składający się ze 100 mM indometacyny, 10 mg/ml rekombinowanej insuliny ludzkiej, 1 mM deksametazonu i 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny.
      2. Traktuj P3 rbSF-MSC przez 3 tygodnie w pożywce do indukcji adipogennej.
      3. Po 3 tygodniach wybarwić obojętne wakuole lipidowe za pomocą Oil Red O, aby potwierdzić różnicowanie adipogenne. Utrwal komórki w 4% roztworze formaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj je 3x za pomocą PBS16.
    3. Różnicowanie chondrogenne
      1. Przygotować pożywkę do indukcji chondrogennej: zasadę DMEM (1x) składającą się z 10 ng/ml TGFβ1, 1% suplementu ITS, 0,35 mM L-proliny, 100 nM deksametazonu, 50 mM kwasu L-askorbinowego-2-fosforanu i 1 mM pirogronianu sodu.
      2. Użyj hodowli osadów do indukcji chondrogennej. Odwirować 5×105 P3 rbSF-MSC przy 1500 obr./min przez 10 minut w probówce polipropylenowej (15 ml), aby utworzyć osad
        3. .
      3. Hoduj granulki przez 3 tygodnie za pomocą pożywki do indukcji chondrogenicznej.
      4. Zmieniaj podłoże co 3 dni przez 3 tygodnie.
      5. Po 3 tygodniach indukcji zanurz osad komórkowy w parafinie, podziel go na plastry o średnicy 4 mm i zabarwij je za pomocą 0,1% błękitu toluidynowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej17.
  3. Ekstrakcja i analiza całkowitego RNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
    1. Wyizoluj całkowite RNA komórek po 3 tygodniach indukcji różnicowania za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).
      1. Usunąć pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego, a następnie dodać 1 ml odczynnika izolacyjnego.
      2. Poddać komórki lizie przez wielokrotne pipetowanie, aż roztwór stanie się jednorodny. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
      3. Przenieś lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      4. Dodać 100 μl chloroformu, wstrząsnąć ręcznie 15x i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 3 min.
      5. Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      6. Dodać 500 μl izopropanolu i wytrącać RNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Wirować w temperaturze 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Osad RNA powinien być widoczny na dnie probówki.
      8. Usunąć supernatant, a następnie dodać 500 μl 75% etanolu. Krótko obracaj probówkę przez kilka sekund, aby umyć osad RNA. Odwirować w temperaturze 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      9. Usuń resztki etanolu.
      10. Rozpuść osad RNA w 10 μl wody DEPC i umieść probówki na lodzie.
    2. Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA na cDNA za pomocą zestawu do syntezy DNA (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe procedury na lodzie.
      1. Przygotuj główny miks do odwrotnej transkrypcji.
      2. Dodaj 25 μl RNA poddanego działaniu DNazy do każdej probówki z 1 μg RNA.
      3. Inkubować mieszaninę w następujących temperaturach przy użyciu termocyklera PCR: 26 °C przez 10 minut (aby umożliwić losowe wyżarzanie heksamerów), 42 °C przez 45 minut (odwrotna transkrypcja) i 75 °C przez 10 minut (w celu dezaktywacji odwrotnej transkryptazy).
      4. Natychmiast przeanalizuj otrzymane cDNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym lub przechowuj je w temperaturze -20 °C.
    3. Wykonaj analizę ekspresji genów za pomocą ilościowego systemu PCR w czasie rzeczywistym.
      1. Do przeprowadzenia PCR należy użyć qRT-PCR Master Mix (patrz Tabela materiałów). Startery PCR dla GAPDH, Runx2, Agg i PPARγ są wymienione w Tabeli 1.
      2. Oblicz ekspresję genów metodą 2−ΔΔCT.
      3. Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu standardowego oprogramowania statystycznego. Użyj testu t dla próby niezależnej, aby porównać średnie grupowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja, oczyszczanie i hodowla rbSF-MSCs:
Niniejszy protokół wykorzystuje metodę MACS do izolacji rbSF-MSCs w oparciu o ekspresję markera powierzchniowego MSC CD90. Schemat blokowy procesu izolacji, oczyszczania i charakterystyki rbSF-MSCs oraz protokół hodowli in vitro przedstawiono na Rysunku 1.

Morfologia komórek po magnetycznej separacji komórek (MACS) z u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecność MSCs w płynie maziowym stanowi alternatywę dla terapii komórkowej. Wcześniejsze badania wykazały, że miejsca urazu zawierają większe ilości mezenchymalnych komórek macierzystych w płynie stawowym, co może być dodatnio skorelowane z okresem po urazie5. MSCs w płynie maziowym może być korzystny dla tkanek w celu przyspieszenia spontanicznego gojenia się po urazie18,19. Kliniczne zastosowanie SF-MSCs rzadko było omawiane w literaturz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane finansowo przez następujące granty: Chińska Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81572198; Nr 81772394); Fundusz Budowy Dyscypliny Medycznej Wysokiego Szczebla Uniwersytetu w Shenzhen (nr 2016031638); Fundacja Badań Medycznych Prowincji Guangdong, Chiny (nr A2016314); oraz Projekty Naukowo-Technologiczne w Shenzhen (nr JCYJ20170306092215436; Nie. JCYJ20170412150609690; Nie. JCYJ20170413161800287; Nie. SGLH20161209105517753; Nie. JCYJ20160301111338144).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
MesenGroStemRDMGro-500 1703Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem
MesenGro SuplementStemRDMGro-500 M1512Składnik pożywki hodowlanej MSCs
DMEM basicGibco Inc.C11995500BTPożywka różnicująca MSCs
Izotoniczny roztwór soliLitai, Chiny5217080305Odczynnik do procedury artrocentezy ubytków
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BPBS, nie zawiera Ca2+/Mg2+
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco Inc.10099-141Składnik pożywki hodowlanej MSCs
Roztwór jodu powidonuGuangdong, Chiny150605Środek sterylizujący
75% etanolLircon, Chiny170917Środek sterylizujący
0,25% Trypsyna / EDTAGibco Inc.25200-056Odczynnik do dysocjacji komórek
1% Penicylina-StreptomycynaGibco Inc.15140-122Składnik pożywki MSCs
MACS Bufor do bieganiaMiltenyiBiotec5160112089Zawierający sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mMEDTA
CD90 sprzężone z przeciwciałami MicroBeadsMiltenyiBiotec5160801456Do magnetycznego sortowania komórek aktywowanych
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256Składnik chondrogenetycznych MSCs różnicowanie
DeksametazonSigma-AldrichD1756Składnik różnicowania osteogennego MSCs
ITSBD3543521%, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs
L-prolinaSigma-AldrichP56070,35 mM, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs
Kwas L-askorbinowy-2-fosforanSigma-AldrichA896050 mM, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-AldrichI58790,5 mM, Składnik różnicowania adipogennego
IndometacynaSigma-AldrichI7378100 mM, Składnik różnicowania adipogennego
TGFβ 1Peprotech100-2110 ng / ml, Składnik różnicowania chondrogennego MSCs
i alfa;-glicerofsphateSigma-AldrichG6751Składnik różnicowania osteogennego MSCs
Przeciwciało poliklonalne CD34, FITC ConjugatedBiossbs-0646R-FITCMarker hematopoetycznych komórek macierzystych
Mysz antykrólik CD44Bio-RadMCA806GAbłona Thy-1 glikoproteina (marker MSCs)
CD45 (przeciwciało monoklonalne)Bio-RadMCA808GAmarker hematopoetycznych komórek macierzystych
Przeciwciało CD105GenetexGTX11415marker MSCs
Alkohol izopropylowySigma-AldrichI9030Wytrąca się Ekstrakcja RNA Fazy organiczne
TrichlorometanWenge, Chiny61553Ekstrakt całkowity RNA
TrizolInvitrogen15596-018Izolat całkowitego RNA
SYBR zielona mieszanka mistrzowskaTakara Bio, Japoniado syntezy cDNA do testu PCRRR420A
Takara Bio, JaponiaRR047AOdwrotna transkrypcja na komplementarne DNA
Alizaryn RedSigma-AldrichA5533Barwienie związków wapnia
Toluidyna BlueSigma-Aldrich89640Barwienie tkanki chrzęstnej
Roztwór czerwieni olejowej OSigma-AldrichO1391LBarwienie wakuoli lipidowej
Sprzęt
MiniMACS SeparatorMiltenyiBiotec130-042-102Do magnetycznego sortowania komórek
MultiStandMiltenyiBiotec130-042-303Do magnetycznego aktywowanego sortowania komórek
Kolumny MSMiltenyiBiotec130-042-201Do magnetycznego aktywowanego sortowania komórek
Sitkokomórkowe FALCON Inc.35234040 μ m
nylonowy hemocytometrISOLAB Inc.075.03.001Zliczanie komórek
Falcon 100 mm talerzCorning353003Naczynie do hodowli komórkowych
Probówka do mikrowirówkiAxygenMCT-150-CEkstrakcja RNA i
probówki wirówkoweSigma-Aldrich91050sterylizowana promieniami gamma
Eppendorf5804RKomory wirówki
Komórka dwutlenku węgla inkubatorThermo scientific3111Hodowla komórkowa
Instrument do PCR w czasie rzeczywistym LifeTechQuantStudioIlościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
Cytometr przepływowyBD Biosciences342975Analizator komórek
PipettorEppendorfO25456FPrzenieś ciecz
Cylinder klonującySigma-AldrichC3983-50EAIzoluj i wybieraj poszczególne kolonie komórek
Sterylna strzykawka podskórnaDouble-Dove, Chiny131010Procedura artrocentezy
Klatka dla królikówZhike, ChinyZC-TGDSkrępuj królika
Zestaw do PCR Wirówka szybkoobrotowa

Bibliografia

  1. Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
  2. Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
  3. De, B. C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
  4. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  5. McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
  6. Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
  7. Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
  8. Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
  9. Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390(2014).
  10. Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
  11. Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281(2015).
  12. Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
  13. Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
  14. John, T., Lerche, P. Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , Mosby Elsevier. St. Louis, Missouri. (2011).
  15. Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
  16. Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
  17. Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
  18. Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
  19. Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
  20. Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
  21. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  22. Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
  23. Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
  24. Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
  25. Gronthos, S., Zannettino, A. C. W. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. , Vol. 449 of Methods in Molecular Biology 45-57 (2008).
  26. Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616(2012).
  27. Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096(2015).
  28. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  29. Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308(2008).
  30. Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
  31. Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzyste z p ynu stawowegoizolacja w modelu kr likaselekcja pozytywna CD90analiza cytometrycznar nicowanie osteogenneadipogenne i chondrogenneprzygotowanie zawiesiny pojedynczych kom rekprotok selekcji koloniiekspresja marker w MSCregeneracja chrz stki stawowej
Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.