Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Podsumowanie

Agregacja białek wywołuje komórkowy stres oksydacyjny. Protokół ten opisuje metodę monitorowania stanów wewnątrzkomórkowych białek amyloidogennych i związanego z nimi stresu oksydacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to służy do badania zachowania rozpuszczalnych i podatnych na agregację wariantów peptydu β amyloidu.

Streszczenie

Nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek w konformacje amyloidu były związane z początkiem i progresją kilku chorób neurodegeneracyjnych. Jednak nadal niewiele jest informacji na temat tego, w jaki sposób nierozpuszczalne agregaty białkowe wywierają swoje toksyczne działanie in vivo. Proste modelowe organizmy prokariotyczne i eukariotyczne, takie jak bakterie i drożdże, znacząco przyczyniły się do naszego obecnego zrozumienia mechanizmów stojących za wewnątrzkomórkowym tworzeniem amyloidu, propagacją agregatów i toksycznością. W tym protokole zastosowanie drożdży jest opisane jako model do analizy związku między powstawaniem agregatów białkowych a ich wpływem na komórkowy stres oksydacyjny. Metoda łączy wykrywanie wewnątrzkomórkowego stanu rozpuszczalnego/zagregowanego białka amyloidogennego z ilościowym określeniem komórkowego uszkodzenia oksydacyjnego wynikającego z jego ekspresji za pomocą cytometrii przepływowej (FC). To podejście jest proste, szybkie i ilościowe. Badanie ilustruje tę technikę poprzez korelację komórkowego stresu oksydacyjnego wywołanego przez duży zestaw wariantów peptydów β amyloidu z ich odpowiednimi wewnętrznymi skłonnościami do agregacji.

Wprowadzenie

Proteostaza jest podstawowym wyznacznikiem sprawności komórek i procesów starzenia. W komórkach homeostaza białek jest utrzymywana przez zaawansowane sieci kontroli jakości białek, których celem jest zapewnienie prawidłowego fałdowania nieprawidłowo sfałdowanych konformerów białkowych przez białka opiekuńcze i/lub ich ukierunkowanej proteolizy z kilkoma dobrze zachowanymi mechanizmami1^,2,3,4,5. Duża liczba badań potwierdza związek między wystąpieniem i progresją szerokiego zakresu chorób u ludzi a niepowodzeniem proteostazy, prowadzącym do nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek. Na przykład obecność złogów białkowych jest uważana za patologiczną cechę charakterystyczną wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona^6,7,8, choroby prionogenne i amyloidozy niezwyrodnieniowe⁹. Zasugerowano, że wczesne zespoły oligomeryczne i protofibrylarne w reakcji agregacji są głównymi elicytorami cytotoksyczności, ustanawiającymi nieprawidłowe interakcje z innymi białkami w zatłoczonym środowisku komórkowym¹⁰. Ponadto inkluzje białkowe (PI) mogą być przenoszone między komórkami, propagując ich toksyczne działanie^11,12. W związku z tym może się zdarzyć, że tworzenie PI może rzeczywiście stanowić mechanizm detoksykacyjny, który ogranicza obecność niebezpiecznych zagregowanych gatunków do określonych miejsc w komórce, gdzie mogą być przetwarzane lub akumulowane bez większych skutków ubocznych^13,14.

Standardowe podejścia biochemiczne in vitro dostarczyły ważnych informacji na temat różnych gatunków, które zamieszkują reakcje agregacji i ich właściwości^15,16. Jednak warunki stosowane w tych testach wyraźnie różnią się od tych występujących w komórce, a zatem kwestionują ich fizjologiczne znaczenie. Ze względu na godną uwagi ochronę szlaków komórkowych, takich jak kontrola jakości białek, autofagia lub regulacja komórkowego stanu redoks^17,18 wśród eukariontów^{19,20,21,22,23}, pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) pojawił się jako uprzywilejowany prosty model komórkowy do badania molekularnych uwarunkowań agregacji białek i związanego z tym wpływu cytotoksycznego w biologicznie istotnych środowiskach^24,25,26.

Skłonność do agregacji białek jest cechą wpisaną w sekwencję pierwotną. W ten sposób powstawanie struktur podobnych do amyloidu można przewidzieć na podstawie identyfikacji i oceny siły działania regionów promujących agregację w polipeptydach²⁷. Jednak pomimo sukcesu algorytmów bioinformatycznych w przewidywaniu właściwości agregacji in vitro sekwencji białek, nadal są one dalekie od prognozowania, w jaki sposób skłonności te przekładają się na wpływ cytotoksyczny in vivo. Badania, które w sposób systematyczny zajmują się związkiem między stanem zagregowanym danego białka a powiązanym z nim uszkodzeniem komórek, mogą pomóc w obejściu tego ograniczenia obliczeniowego. Związek ten został rozwiązany w niniejszym badaniu, wykorzystując duży zestaw wariantów peptydu Aβ42 β amyloidu, różniących się tylko pojedynczą resztą, ale wykazujących ciągły zakres skłonności do agregacji in vivo²⁸. W szczególności opisano oparte na FC podejście do identyfikacji gatunków konformacyjnych odpowiedzialnych za uszkodzenia oksydacyjne wywoływane przez białka podatne na agregację w komórkach drożdży. Metodologia zapewnia wiele korzyści, takich jak prostota, wysoka przepustowość i dokładne pomiary ilościowe. Takie podejście pozwoliło potwierdzić, że PI odgrywają rolę ochronną przed stresem oksydacyjnym.

Protokół

1. Kultury S. cerevisiae i ekspresja białek

Uwaga: warianty Aβ wykazują różne względne skłonności do agregacji z powodu mutacji w pojedynczej reszcie na pozycji 19 (Phe19) peptydu Aβ42 (Rysunek 1A). Te warianty peptydów są oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), które działa jako reporter agregacji ( Rysunek 1) < sup class = "xref">29.

1. Przekształć plazmidy kodujące 20 wariantów Aβ42-GFP w komórki drożdży z tłem rodzicielskim BY4741 (MATa jego3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)³⁰. Każdy plazmid koduje mutanta Aβ42 połączonego z GFP przez łącznik GSSGSSG. Plazmidy to pESC(-URA) i zawierają wybieralny marker URA3²⁹.
   1. Przygotować syntetyczną kompletną pożywkę bez uracylu (SC-URA) z następującymi składnikami: 1,9 g/l drożdżowej zasady azotowej bez uracylu, 5 g/l siarczanu amonu i 900 ml ddH₂O w połączeniu ze 100 ml 20% (w/v) glukozy.
   2. Umieścić jedną kolonię przekształconych komórek drożdży w 20 ml pożywki SC-URA zawierającej 2% glukozy i hodować kultury przez noc w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 210 obr./min.
2. Następnego dnia wyhoduj nowe kultury komórek drożdży, zaszczepiając 100 μl nocnej kultury w 5 ml świeżej pożywki SC-URA.
3. Przy OD₅₉₀ wynoszącym 0,5 odwirować kultury przy 3 000 x g przez 4 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w tej samej objętości świeżej pożywki SC-URA zawierającej 2% rafinozy.
4. Inkubować w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 210 obr./min przez 30 min. Następnie odwirować komórki o stężeniu 3 000 x g przez 4 minuty i wyrzucić supernatant. Zawiesić komórki w świeżej pożywce SC-URA zawierającej 2% galaktozy w celu indukcji ekspresji białka rekombinowanego.
5. Po 16 godzinach indukowania ekspresji białka w pożywce SC-URA zawierającej 2% galaktozy, zebrać 1 ml indukowanych komórek w sterylnych probówkach do mikrowirówek przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 4 min.
   UWAGA: Najistotniejsze różnice występują po okresie indukcji wynoszącym 16 godzin. Indukowane komórki drożdży wykazujące ekspresję wariantów Aβ42-GFP można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu określenia rozkładu rekombinowanych białek wewnątrz komórek (Rysunek 2B).

2. Barwienie komórek

Uwaga: Świeże nieindukowane komórki są wymagane jako kontrola negatywna do ustalenia progu fluorescencyjnego podczas analizy FC.

1. Weź 16 komórek drożdży indukowanych przez H i określ ich gęstość optyczną przy 590 nm (OD₅₉₀). Rozcieńczyć je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do OD₅₉₀ 0,1.
   1. Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami w następujący sposób: dodać 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ do 800 ml DDH₂O. Napełnić roztwór do 1 l ddH₂O po dostosowaniu pH do 7,4 za pomocą HCl. Przefiltrować bufor przez filtr 0,2 μm.
2. Zawiesiny komórek odciągających należy przenieść do odpowiednio oznakowanych probówek (12 × 75 mm polistyren okrągłodenny) i chronić je przed światłem. Upewnij się, że są gotowe do załadowania do cytometru przepływowego w celu analizy, wraz z nieindukowanymi i niebarwionymi komórkami.
3. Dodać sondę stresu oksydacyjnego (np. CellROX Deep Red) do każdej próbki o końcowym stężeniu 5 μM i inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 30 minut w ciemności.
4. Po inkubacji przemyć komórki 3 razy 1x PBS i ponownie zawiesić je w tej samej objętości buforu przed ich analizą przez FC.

3. Analiza cytometrii przepływowej

Uwaga: Użyj konfiguracji FC z odpowiednimi laserami i filtrami do wykrywania sygnału fluorescencji GFP i sondy stresu oksydacyjnego. Można zastosować cytometr przepływowy wyposażony w niebieski laser 488 nm do wykrywania GFP i czerwony laser 635 nm do wykrywania fluorescencji sondy stresu oksydacyjnego. Akwizycja fluorescencji emisyjnej GFP i sondy stresu oksydacyjnego odbywa się odpowiednio za pomocą filtra BP 530/30 nm i filtra 660/20 BP (tab. 1).

1. Kliknij Otwórz nowy panel arkusza roboczego i utwórz następujące wykresy kropkowe akwizycji.
   1. Wybierz narzędzie Wykres punktowy z paska narzędzi i utwórz wykres ze zmiennymi Boczny obszar rozproszenia (SSC-A) na osi y i obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) w skali liniowej na osi x.
   2. Kliknij narzędzie Wykres punktowy na pasku narzędzi i utwórz wykres ze zmiennymi FL1-Area (FITC) na osi x vs. FL3-Area (APC) w skali logarytmicznej na osi y.
2. Kliknij ikonę Instruments Settings (Ustawienia instrumentów). Kliknij kartę Wynagrodzenie i ustaw wszystkie poziomy wynagrodzeń. Kliknij zakładkę Akwizycja i wybierz łączną liczbę 20 000 zdarzeń, które mają zostać zarejestrowane.
3. Kliknij ikonę Natężenie przepływu, aby przełączyć natężenie przepływu na Niskie.
4. Kliknij kartę Acquire, aby rozpocząć uruchamianie nieindukowanych, niebarwionych komórek i dostosuj napięcie w Ustawieniach instrumentu rozproszenia do przodu i boku, aż populacja zostanie rozłożona w środkowym lewym kwadrancie.
   1. Kliknij ikonę wielokąta, aby ustawić region R1 wokół populacji komórek z wyłączeniem szczątków komórek, a następnie użyj tej bramkowanej populacji P1 = R1 dla wszystkich fluorescencyjnych wykresów punktowych i reprezentacji histogramu (Rysunek 3).
5. Aby wyregulować napięcie PMT sygnału fluorescencji, uruchom niebarwione komórki na wykresie punktowym FL1-FL3, dostrajając wzmocnienie w zakładce Ustawienia instrumentu, aż komórki zostaną rozmieszczone w lewym dolnym kwadrancie.
6. Zmień próbkę na indukowane komórki, aby zmierzyć fluorescencję GFP. Na karcie Instrument Setting (Ustawienia instrumentu) ustaw wzmocnienie w FSC-A vs. FL1 (FITC), gdy populacja jest rozłożona w prawym dolnym kwadrancie. Zdefiniuj dodatnią populację komórek za pomocą bramki (bramka P2).
7. Zmień próbkę na nieindukowane barwione komórki, aby wyświetlić stres oksydacyjny przez fluorescencję na wykresie punktowym FSC-A w porównaniu z FL3 (APC). Dostosuj wzmocnienie, aż populacja komórek zostanie rozłożona w lewym górnym kwadrancie. Bramka dodatniej populacji komórek w P3.
8. Utwórz dwa wykresy histogramu z ikoną histogramu, aby przedstawić fluorescencję komórki. Aby przedstawić intensywność fluorescencji, upewnij się, że FL1 (FITC) reprezentujący fluorescencję GFP znajduje się na osi x, a FL3 (APC) reprezentujący fluorescencję znajduje się na osi y, stosując populacje P2 i P3 odpowiednio w skali logarytmicznej.
   UWAGA: Nakładki histogramu to dobry sposób na zilustrowanie różnic między profilami fluorescencji komórek wyrażających różne warianty Aβ.

4. Immunodetekcja białek rekombinowanych

1. Aby określić poziom ekspresji białka, należy zebrać kultury drożdży indukowane przez 16 godzin przez wirowanie przy 4 000 x g przez 6 minut i przechowywać granulki komórkowe w temperaturze -80 °C.
   1. Ponownie zawiesić pobrane komórki wykazujące ekspresję rekombinowanego białka przez 16 godzin w PBS. Przygotować 200 μl zawiesin komórkowych każdego mutanta Aβ42-GFP do OD₅₉₀ 20.
2. W celu analizy całkowitej frakcji białkowej należy zebrać 100 μl każdego mutanta przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić granulki komórek w tej samej objętości buforu do lizy drożdży Y-PER (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA zawierające 10 mg/ml SB3-14 (sulfobetaina myrystylu) uzupełniona 1 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu (PMSF)).
   1. Próbki należy inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
3. Określ stężenie ekstraktu białkowego za pomocą testu Bradforda. Załadować do 5 μg ekstraktu białkowego z każdej próbki na 15% akryloamidowy żel do elektroforezy SDS-PAGE i osuszyć na membranie z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 100 V przez 60 minut.
   1. Przygotować odczynnik Bradford ze 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 rozpuszczonego w 50 ml 95% etanolu i dodać 100 ml 85% (w/v) kwasu fosforowego. Następnie, gdy barwnik jest całkowicie rozpuszczony, rozcieńczyć mieszaninę za pomocą ddH₂O do 1 L i przefiltrować przez celulozową bibułę filtracyjną tuż przed użyciem.
      UWAGA: Odczynnik Bradford powinien być jasnobrązowy.
   2. Przygotować wzorzec albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w zakresie od 5 do 100 μg białka w 1000 μl odczynnika Bradforda.
   3. Dodać 1 - 10 μl ekstraktu białkowego do 1 ml odczynnika Bradford i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   4. Zmierzyć absorbancję wzorców i próbek ekstraktu białkowego przy OD₅₉₅.
   5. Do analizy należy wykonać wykres z wartościami absorbancji uzyskanymi dla wzorców w funkcji μg białka. Na podstawie krzywej wzorcowej oznaczyć stężenia pierwotnych próbek na podstawie ilości białka, biorąc pod uwagę objętość i rozcieńczenie, jeśli występuje.
4. Przepłucz membranę 1x solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS), 0,1% Tween 20 (TTBS) i zablokuj ją za pomocą 5% (w/v) beztłuszczowego mleka w proszku w 1x TTBS.
   1. Aby przygotować 1 l 10x TBS, rozpuść 24 g zasady Tris i 88 g NaCl w 900 ml H₂O_dd i dostosuj pH do 7,6. Dodać ddH₂O do końcowej objętości 1 L. Aby uzyskać 1x roztwór, wymieszaj 1 część 10x bulionu z 9 częściami ddH₂O.
5. Inkubować błonę przez 1 godzinę z pierwszorzędowym przeciwciałem β-amyloidowym 6E10 rozcieńczonym w stosunku 1:1,000 i przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wtórnym koniugatem przeciwciała koziego przeciwko mysim IgG-HRP rozcieńczonym w stosunku 1:10,000.
6. Opracować membrany przy użyciu 1 ml odczynnika fluorescencyjnego Luminata i określić ilościowo pasma za pomocą analizy densytometrycznej, jak opisano w kroku 5.2.

5. Analiza danych

1. Aby przeanalizować dane uzyskane przez FC, należy utworzyć tabelę przedstawiającą średnią intensywność fluorescencji (MFI) i medianę fluorescencji wraz z odpowiadającym im błędem standardowym i/lub współczynnikiem wariancji (CV) dla poziomów fluorescencji GFP i stresu oksydacyjnego.
   1. Kliknij kartę Inspector (Inspektor) i ikonę Statistics (Statystyki), aby dostosować dane statystyczne wymagane dla każdego kanału.
      UWAGA: Porównując warianty białek, przekonwertuj dane wartości fluorescencji na składane tło lub metrykę rozdzielczości (RD):
      
      W tej metryce średnia próbka jest średnią fluorescencją próbek problemowych, średnia kontrola to średnia fluorescencja komórek używanych jako kontrola, a SD to odchylenie standardowe średniej fluorescencji. Współczynnik RD jest dokładniejszym indeksem niż wartość MIF, ponieważ nie tylko oblicza różnicę między próbami, ale także uwzględnia rozłożenie danych. Obliczenia te są szczególnie istotne przy porównywaniu danych pochodzących z różnych eksperymentów przeprowadzonych na przestrzeni czasu. Po obliczeniu RD zaleca się zastosowanie testu statystycznego w celu potwierdzenia istotności zaobserwowanych różnic między wariantami białka.
2. W celu immunodetekcji białek należy określić ilościowo poziomy rekombinowanych białek za pomocą Western blot za pomocą oprogramowania ImageJ.
   1. Przed analizą densytometryczną należy przekonwertować oryginalne surowe obrazy wywołanej membrany na format pliku JPEG i tryb skali szarości.
   2. Dostosuj sekcję Set Measurements (Ustaw pomiary) w menu Analyze (Analizuj) do wartości Mean Grey Value (Średnia wartość szarości).
   3. Kliknij narzędzie Prostokąt w ImageJ i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) o stałym rozmiarze dla analizy gęstości pasma. Wyśrodkuj każde pasmo na obrazie membrany wewnątrz utworzonej prostokątnej ramki i zapisz pomiar jeden po drugim za pomocą Ctrl+M (polecenie pomiaru).
   4. Zmierz lokalne tło przylegające do każdego pasma, stosując ten sam obszar ROI. Po pomiarze odejmij odpowiednie lokalne tło od każdego pojedynczego pasma.

Wyniki

Ten protokół opisuje, jak wykorzystać zbiór 20 wariantów peptydu Aβ42, w którym Phe19 został zmutowany do wszystkich naturalnych aminokwasów proteinogennych²⁸. Teoretyczne skłonności do agregacji tych białek można analizować za pomocą dwóch różnych algorytmów bioinformatycznych (AGGRESCAN i TANGO^31,32). W obu przypadkach analiza ta przedstawia postępującą gradację tendencji agregacji, przypisując, z reguły,...

Dyskusja

Szeroki zakres chorób jest związany z akumulacją nieprawidłowo sfałdowanych białek w złogi komórkowe 6,7,8,33. Podjęto wiele wysiłków w celu rozwikłania mechanizmów molekularnych, które wywołują wystąpienie tych chorób, przy użyciu podejść obliczeniowych, które nie uwzględniają stężeń białek, lub podejść in vitro, w których stężenie białka pozostaje stałe podczas reakcji. Jednak w komó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki drożdży BY4741	ATCC	201388	Genotyp: MATa his3Δ 1 leu2Δ 0 met15 i Delta; 0 ura3 i Delta; 0
plazmid pESC(-Ura)	Agilent Genomics	217454	plazmid ekspresji drożdży z promotorem Gal. Marker do wyboru URA3
Syntetyczne pożywki drożdżowe Drop-out	Sigma	Y1501	Drożdże w proszku
Azot bazowy bez aminokwasów	Sigma	Y0626	Proszek
Rafinoza	Sigma	R7630	Proszek
Glukoza	Sigma	G7021	W proszku
Galaktoza	Sigma	G0750	Fosforan w proszku
Buforowana sól fizjologiczna (PBS)	Fisher Scientific	BP3991	Rozwiązanie 10X
Odczynnik CellROX Deep Red	Life Technologies	C10422	Czujnik fluorescencyjny przenikający się z wolnymi rodnikami, niefluorescencyjny w stanie zredukowanym, wykazujący jasną fluorescencję po utlenieniu przez reaktywne formy tlenu (ROS), z maksimami absorpcji/emisji przy 644/665 nm.
Odczynnik do ekstrakcji białek Y-PER	Thermo Scientific	78990	Bufor do lizy komórek płynnych
Akrylamid/Bis-akryloamid	Sigma	A6050	Roztwór
odczynnik barwnika Bradford	Bio-Rad	5000205	Odczynnik barwnikowy do jednoetapowego oznaczania stężenia białka
i przeciwciała beta-amyloidowego 6E10	BioLegend	803001	Mysz IgG1. Epitop znajduje się w aminokwasach 3-8 beta-amyloidu (EFRHDS).
Kozioł anty-mysi koniugat IgG-HRP	Bio-Rad	1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Premiksowany, gotowy do użycia chemiluminescencyjny odczynnik do wykrywania HRP
Roztwór fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF)	Sigma	93482	Inhibitor proteazy. Rozpuszczony w 0,1 M w etanolu
FACSCanto cytometr przepływowy	BD Biosciences	657338	Wyposażony w 488  niebieski laser nm do wykrywania GFP i 635  czerwony laser nm / filtr BP 530/30 nm i filtr 660/20 BP
Elektroforeza Mini Trans-Blot Komórka transferowa	Bio-Rad	1703930	System przenoszenia białek System do elektroforezy
Mini-PROTEAN Tetra System	elektroforezy	Bio-Rad	1658000FC