Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kotransplantacja ludzkiej tkanki jajnika za pomocą zmodyfikowanych komórek śródbłonka: strategia oparta na komórkach łącząca przyspieszoną perfuzję z bezpośrednim dostarczaniem parakrynnym

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57472

⸱

16 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Dla niektórych pacjentek jedyną opcją zachowania płodności jest kriokonserwacja tkanki jajnika. Niestety, opóźniona rewaskularyzacja osłabia żywotność pęcherzyków. W tym miejscu przedstawiamy protokół wspólnego przeszczepiania ludzkiej tkanki jajnika z komórkami śródbłonka do wykorzystania jako strategia oparta na komórkach łącząca przyspieszoną perfuzję z bezpośrednim parakrynnym dostarczaniem cząsteczek bioaktywnych.

Streszczenie

Niepłodność jest częstym skutkiem ubocznym chemioterapii i/lub radioterapii, a dla niektórych pacjentów kriokonserwacja oocytów lub zarodków nie wchodzi w grę. Alternatywnie, coraz większa liczba tych pacjentek decyduje się na kriokonserwację tkanki jajnikowej do autoprzeszczepu po powrocie do zdrowia i remisji. Pomimo poprawy wyników leczenia wśród pacjentek poddawanych autotransplantacji kriokonserwowanej tkanki jajnika, główną przeszkodą pozostaje skuteczna rewaskularyzacja przeszczepionej tkanki. Aby złagodzić niedokrwienie, a tym samym poprawić wyniki leczenia u pacjentek poddawanych autotransplantacji, opracowaliśmy strategię opartą na komórkach naczyniowych w celu przyspieszenia perfuzji tkanki jajnika. Opisano metodę kotransplantacji egzogennych komórek śródbłonka (ExECs) z kriokonserwowaną tkanką jajnika w mysim modelu ksenoprzeszczepu. Rozszerzamy to podejście, aby zastosować ExEC, które zostały zaprojektowane do konstytutywnej ekspresji hormonu anty-Mullera (AMH), umożliwiając w ten sposób trwałe wejście sygnalizacji parakrynnej do przeszczepów jajników. Jednoczesna transplantacja z ExEC zwiększyła objętość pęcherzyków i poprawiła rozwój pęcherzyków antralnych, a ExEC wykazujące ekspresję AMH sprzyjały zatrzymywaniu spoczynkowych pęcherzyków pierwotnych. Ta połączona strategia może być użytecznym narzędziem do łagodzenia niedokrwienia i modulowania aktywacji pęcherzyków w kontekście zachowania płodności i/lub niepłodności w ogóle.

Wprowadzenie

Rak pozostaje jedną z głównych przyczyn zgonów w krajach rozwiniętych, jednak dziesięciolecia badań przyniosły znaczny postęp w przypadku większości rodzajów raka, a w niektórych przypadkach prawie podwoiły wskaźniki przeżycia1. Niestety, chemioterapeutyki są często gonadotoksyczne, wyczerpując zapasy pierwotnych pęcherzyków w jajnikach i zmniejszając płodność2. Ta rosnąca populacja może korzystać z różnych metod zachowania płodności, w tym kriokonserwacji oocytów i/lub zarodków, jednak pacjenci wymagający natychmiastowego rozpoczęcia terapii przeciwnowotworowej i pacjenci przed okresem dojrzewania nie kwalifikują się do tych opcji. Alternatywnie, niektóre pacjentki zdecydowały się na kriokonserwację tkanki jajnikowej przed podjęciem schematu terapeutycznego, a po wyzdrowieniu i remisji, automatyczne przeszczepienie tkanki w celu przywrócenia płodności3. Jednak do tej pory przeżywalność przeszczepu i produkcja pęcherzyków jajnikowych po autotransplantacji pozostają stosunkowo niskie4, głównie z powodu niedokrwienia tkanek i niedotlenienia5,6,7. Pomimo licznych wysiłków mających na celu poprawę żywotności przeszczepów kory jajnikowej przy użyciu przeciwutleniaczy8,9, cytokiny proangiogenne10,11,12,13, lub mechaniczne manipulacje14, niedokrwienie przeszczepu w okresie od 5 do 7 dni po przeszczepie podważa żywotność i przeżywalność Graft7. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy strategię opartą na komórkach, która ułatwia zespolenie naczyń gospodarza i przeszczepu, a tym samym przyspiesza reperfuzję tkanki jajnika.

Oprócz niedokrwiennego uszkodzenia przeszczepionej tkanki jajnikowej w oknie po przeszczepie, zakłócenie sygnalizacji międzypęcherzykowej może przyczynić się do wyczerpania puli15,16. Ponieważ egzogenne komórki śródbłonka (ExEC) przyczyniają się do stabilnych i funkcjonalnych naczyń na obrzeżach przeszczepu, stanowią wyjątkową okazję do przekazania określonego wkładu molekularnego do przeszczepionej tkanki. Jako dowód zasady, ExEC zostały zaprojektowane tak, aby wyrażały superfizjologiczne poziomy hormonu anty-Mullera (AMH), członka nadrodziny transformującego czynnika wzrostu beta (TGFβ), który, jak wykazano, ogranicza wzrost pęcherzyków włosowych17. Porównanie rozmieszczenia pęcherzyków w przeszczepach przeszczepionych jednocześnie z komórkami kontrolnymi i wykazującymi ekspresję AMH weryfikuje aktywność biologiczną i siłę działania zmodyfikowanych exEC.

Podsumowując, poprzez poprawę żywotności przeszczepów i zahamowanie przedwczesnej mobilizacji puli pęcherzykowej, to podejście może zwiększyć produktywność automatycznie przeszczepionej tkanki jajnikowej u pacjentek poddawanych zachowaniu płodności. Co więcej, platforma oparta na ExEC umożliwia eksperymentalne badanie regulatorów molekularnych, które są zaangażowane w rozwój pęcherzyków włosowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Weill Cornell Medical College. Wszystkie eksperymenty ksenotransplantacyjne z wykorzystaniem tkanki jajnikowej przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Ludzka tkanka jajnika została pobrana od pacjentek, u których zaplanowano chemioterapię lub radioterapię w celu leczenia raka lub wcześniejszego przeszczepu szpiku kostnego. Komisja ds. Przeglądu Instytucjonalnego (IRB) Weill Cornell Medical College zatwierdziła pobranie tkanki do potencjalnego zastosowania autologicznego, a po uzyskaniu świadomej zgody pacjentki wykonano oddanie do 10% tkanki jajnikowej do użytku badawczego.

1. Pobieranie tkanki jajnika ludzkiego

UWAGA: Gdy tkanka jajnika jest transportowana z odległego obiektu, czas nie powinien przekraczać 5 h18,19.

  1. Pobrać tkankę jajnika i spłukać sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
  2. Umieść jajnik w sterylnym pojemniku.
  3. Wlewać pożywkę L-15 Leibovitz, aż jajnik całkowicie zanurzy się w pożywce.
  4. Zamknij i zamknij pojemnik.
  5. Pojemnik należy transportować na lodzie.

2. Przetwarzanie pobranej tkanki jajnika, na podstawie Schmidt et al.18

  1. Preparaty do przetwarzania i zamrażania jajników
    1. Przygotuj 100 ml pożywki do przetworzenia: Leibovitz's L-15 podłoże 99 ml + 1 ml roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Media filtracyjne za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowuj podłoże w lodówce.
    2. Przygotuj 100 ml roztworu do zamrażania, używając DMSO jako krio-protektoru. Dodać 69,64 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz, 17,66 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 3,42 g sacharozy (aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mol/l), 10,65 ml DMSO (aby uzyskać końcowe stężenie 1,5 mol/l) i 1 ml roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Przefiltrować pożywkę za pomocą jednostki filtrującej o pojemności 150 ml, 0,2 μm. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C.
    3. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu zaprogramowanego do cyklu sterylizacji owiniętych ciał stałych.
  2. Po przybyciu tkanki
    1. Umieść sterylne narzędzia chirurgiczne w szafie bezpieczeństwa biologicznego: skalpel z ostrzem nr 21, ostre, drobno zakrzywione nożyczki i kleszcze w różnych rozmiarach: długie (około 150 mm długości) i 2 średniej wielkości (około 110 mm długości).
    2. Załóż sterylne rękawice, otwórz pojemnik w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Pobrać jajnik i umieścić go na szalce Petriego o średnicy 150 mm, a następnie zalać wierzch jajnika zimnym podłożem przygotowanym w kroku 2.1.1, aby zapobiec odwodnieniu tkanki jajnika.
    3. Odizoluj jajnik od wszelkich resztek tkanki i przepłucz go zimnym podłożem, aż będzie pozbawiony tkanki i krwi.
    4. Umieścić jajnik na czystej szalce Petriego o średnicy 150 mm, dodać zimne podłoże przygotowane w kroku 2.1.1, aż jajnik będzie w nim zanurzony do połowy.
  3. Rozwarstwienie tkanki jajnikowej
    1. Przetnij jajnik na pół i najpierw usuń rdzeń przez ostre rozwarstwienie, używając zakrzywionych cienkich nożyczek. Następnie zeskrob rdzeń za pomocą sterylnego skalpela z ostrzem numer 21. Poprzedzać, aż tkanka korowa osiągnie grubość 1-1,5 mm.
    2. Pokrój tkankę korową na kawałki o szerokości 2-3 mm, długość paska będzie równa całej długości przetworzonego kawałka jajnika.

3. Powolne zamrażanie tkanki jajnikowej, na podstawie Newton et al. i Oktay et al.6,20

  1. Przygotowanie do zamrażania
    1. Oznaczyć kriowiale (1,8 ml).
    2. Dodać 1,5 ml roztworu do zamrażania przygotowanego w kroku 2.1.2 do każdej fiolki.
    3. Przenieść jeden pasek korowy na fiolkę kriogeniczną zawierającą roztwór do zamrażania.
    4. Równowaga paska korowego przez 20 minut na obracającej się płytce, delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C.
  2. Powolne zamrażanie tkanki jajnikowej
    1. Załaduj kriowiale do programowalnej zamrażarki strugarki, zaczynając od 0 °C.
    2. Schłodzić w temperaturze od 2 °C/min do -7 °C.
    3. Utrzymuj chusteczki w tej stałej temperaturze przez 10 minut.
    4. Wykonaj ręczne wysiewanie w celu indukcji zarodkowania kryształków lodu, dotykając każdego kriowialu bawełnianą końcówką zanurzoną w ciekłym azocie (LN2).
    5. Kontynuować chłodzenie w temperaturze 0,3 °C/min, aż temperatura próbki osiągnie -40 °C.
    6. Schładzać z większą prędkością od 10 °C/min do -140 °C.
    7. Przenieść kriowiale do dewara w celu przechowywania w LN2 (-196 °C).

4. Przygotowania do operacji (obustronna resekcja jajników i kotransplantacja)

  1. Przygotowanie talerzy
    1. Dzień przed rozmrożeniem tkanki jajnikowej do przeszczepu
      1. Umieść kawałek plastikowej folii parafinowej na dnie szalki Petriego o średnicy 50 mm, spryskaj ją 70% etanolem, aż zostanie całkowicie pokryta.
      2. Pozostaw szalki Petriego na noc w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotuj 2 szalki Petriego na mysz.
    2. W dniu operacji
      1. Odessać etanol z szalki Petriego zawierającej folię parafinową z tworzywa sztucznego w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      2. Pozostawić ołowiany przewód szalki Petriego do połowy otwarty, aż etanol całkowicie odparuje.
      3. Zamknij pokrywę szalki Petriego, gdy plastikowa folia parafinowa całkowicie wyschnie. Przechowuj go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      4. Oznaczyć odpowiednio studzienki na płytce 6-dołkowej, 0,1 mol/l Sacharoza + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L Sacharoza + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sacharozy, zasadowy roztwór do rozmrażania (BTS), pożywka.
  2. Przygotowanie roztworów
    1. Przygotuj 100 ml BTS: Leibovitz's L-15 medium 79 ml + FBS 20 ml + Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy roztwór 1 ml. Filtr z systemem filtrów 0,22 μm.
    2. Przygotuj 10 ml BTS z sacharozą o scharozie 0,1 mol/l. Skaluj 0,342 g sacharozy i dodaj 10 ml BTS przygotowanego w kroku 4.2.1, delikatnie mieszaj, aż sacharoza całkowicie się rozpuści. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    3. Przygotować roztwory zgodnie z tabelą 1. Przykryj probówki zawierające DMSO folią aluminiową. Przechowywać w lodówce do czasu użycia.

5. Szybkie rozmrażanie tkanki jajnikowej

  1. Wyjąć z LN2 dewar fiolkę zawierającą zamrożoną tkankę jajnika i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 sekund.
  2. Wytrzeć fiolkę do czysta za pomocą bibuły.
  3. Zanurzyć fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na 1-2 minuty, aż jej zawartość zostanie rozmrożona.
  4. Otworzyć fiolkę i umieścić pasek korowy w pierwszym dołku, który zawiera 3 ml pierwszego roztworu (0,1 mol/l sacharozy + 1 mol/l DMSO, przygotowanego w kroku 4.2.3).
    UWAGA: Wszystkie czynności związane z otwarciem pokrywy płytki będą wykonywane przy przepływie laminarnym.
  5. Inkubować płytkę 6-dołkową na obracającej się płytce w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Na tym etapie należy przykryć płytkę folią aluminiową.
  6. Przenieść pasek korowy do drugiego dołka zawierającego 3 ml drugiego roztworu (0,1 mol/l Sacharoza + 0,5 mol/l DMSO, przygotowany w kroku 4.2.3).
  7. Inkubować płytkę 6-dołkową na obracającej się płytce w celu delikatnego mieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Na tym etapie należy przechowywać płytkę przykrytą folią aluminiową.
  8. Przenieść pasek korowy do trzeciego dołka, zawierającego 4 ml roztworu (BTS z sacharozą o scharozie 0,1 mol/l, przygotowany w kroku 4.2.2).
  9. Inkubować na obracającej się płytce do delikatnego mieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  10. Przenieść pasek korowy do czwartego dołka zawierającego 4 ml roztworu (BTS, przygotowanego w kroku 4.2.1).
  11. Inkubować na obracającej się płytce do delikatnego mieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  12. Przenieść pasek korowy do ostatniej studzienki zawierającej 4 ml zimnego podłoża (przygotowanego w kroku 2.1.1). Rozmrożoną tkankę jajnika należy przechowywać na lodzie do czasu wykonania przeszczepu.

6. Obudowa tkanki jajnika

  1. Przygotuj następujące rozwiązania
    1. Przygotować 25 ml buforu HEPES o stężeniu 20 mmol/l w 0,9% roztworze soli fizjologicznej. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować 1 ml CaCl2 o stężeniu 1 mol/l. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować roztwór podstawowy fibrynogenu o stężeniu 50 mg/ml
    1. Dodać 1 g fibrynogenu do 20 ml 20 mmol/l buforu HEPES w 0,9% soli fizjologicznej, powoli mieszając fibrynogen z buforowanym roztworem soli fizjologicznej HEPES przez kilka godzin w temperaturze 37 °C.
    2. Oznaczyć mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,7 ml.
    3. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,45 μm, a następnie przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
    4. Podwielokrotność roztworu rozdzielić na 200 μl do mikroprobówki wirówkowej i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotować roztwór podstawowy trombiny 100 j./ml
    UWAGA: Roztwory trombiny adsorbują się ze szkłem, porcjować roztwór w plastikowych probówkach/fiolkach.
    1. Dodaj 2,5 ml 0,9% sterylnej soli fizjologicznej do 250 j. trombiny.
    2. Delikatnie wstrząsaj, aż roztwór całkowicie się rozpuści.
    3. Oznaczyć mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,7 ml.
    4. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, porcjować 50 μl do probówek mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Przygotować skrzep fibrynowy o objętości 70 μl, uzyskując końcowe stężenie 10 mg/ml fibrynogenu i 5 U/ml trombiny
    UWAGA: Upewnij się, że pracujesz szybko, roztwór krzepnie w ciągu kilku sekund. Unikaj również dodawania bąbelków do mieszanki.
    1. Przygotuj roztwór fibrynogenu w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
      1. Dodać 360 μl 20 mmol/l buforu HEPES w 0,9% roztworze soli do poddanych 200 μl podstawowego fibrynogenu, przygotowanego w kroku 6.2.4.
      2. Wymieszać delikatnie pipetując.
      3. Trzymaj go na lodzie.
    2. Przygotować roztwór trombiny w drugiej probówce do mikrowirówki.
      1. Dodać 148,7 μl DMEM do porcjowanych 50 μl trombiny, przygotowanej w kroku 6.3.4.
      2. Wymieszać delikatnie pipetując.
      3. Dodać 1,3 μl o stężeniu 1 mol/l CaCl2.
      4. Wymieszać delikatnie pipetując.
      5. Trzymaj go na lodzie.
    3. Przygotować zawiesinę jednokomórkową w trzeciej probówce do mikrowirówki.
      1. Odłącz zmodyfikowane komórki śródbłonka od płytki za pomocą pożywki do oddzielania komórek enzymatycznych.
      2. Zakręć i policz komórki za pomocą hemocytometru ze szkłem nakrywkowym.
      3. Użyj 20 000 komórek na każdy 1mm2 tkanki jajnika. Oblicz 20 000x powierzchnia tkanki jajnikowej w mm2.
      4. Odwiruj zmodyfikowane komórki śródbłonka i ponownie zawieś je w pożywce zasadowej (DMEM), aby osiągnąć całkowitą objętość 16,8 μl.
      5. Trzymaj go na lodzie.
    4. Umieść kawałek tkanki jajnikowej na sterylnej gąbce z gazy, aby wysuszyć ją przez kilka sekund.
    5. Umieść kawałek tkanki jajnikowej na plastikowej folii parafinowej na szalce Petriego o średnicy 50 mm.
    6. Dodać 39,2 μl roztworu fibrynogenu, przygotowanego w kroku 6.4.1.2, do zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 6.4.3.4, wymieszać przez delikatne pipetowanie. Trzymaj go na lodzie.
    7. Dodać 14 μl roztworu trombiny przygotowanego w kroku 6.4.2.4. Delikatnie wymieszać, pipetując jeden raz. Pracuj szybko.
    8. Umieść mieszaninę na wierzchu tkanki jajnika, odpipetuj ją w postaci wydłużonej kropli.
    9. Umieścić szalkę Petriego ze skrzepem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.

7. Obustronna resekcja jajników i kotransplantacja ludzkiej tkanki jajnika z zmodyfikowanymi komórkami śródbłonka myszom NSG

UWAGA: Użyto dziesięciu do czternastu tygodni samic myszy NSG21 (Jackson Labs).

  1. Przygotuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, jak opisano w kroku 2.1.3, upewnij się, że masz pod ręką wszystkie szwy, elektrody i taśmy chirurgiczne.
  2. Znieczulij mysz za pomocą systemu znieczulającego z izofluranem.
    1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej, zamknij pokrywę i otwórz odpowiedni kran.
    2. Otwórz przepływomierz do 1 000 ml/min. Włącz parownik i ustaw go na dostarczanie 2-3,5%.
    3. Obserwuj efekty znieczulenia; utrata przytomności, powolne i regularne oddechy.
    4. Przenieś do stożka nosowego w celu utrzymania znieczulenia. Obróć waporyzator tak, aby dostarczał 1-3%, w zależności od parametrów życiowych.
    5. Sprawdź, czy nie ma odruchu pedału lub ogona. Jeśli odruch jest obecny, zwiększaj dawkę izofluranu, aż do jego zabraknięcia.
  3. Przytnij włosy z tyłu myszy, od ogona do linii obojczyków, za pomocą elektrycznego trymera do włosów.
  4. Umieść mysz w pozycji leżącej na platformie chirurgicznej.
  5. Przymocuj stożek nosowy do platformy operacyjnej za pomocą taśmy chirurgicznej.
  6. Delikatnie przyklej kończyny myszy do platformy chirurgicznej za pomocą papierowej taśmy chirurgicznej o szerokości 1,25 cm.
  7. Użyj sterylnej galaretki z lubrykantem i włóż termometr PR. Zamocuj termometr, przyklejając go do platformy chirurgicznej za pomocą perforowanej plastikowej taśmy chirurgicznej o szerokości 1,25 cm.
  8. Przyklej ogon do platformy chirurgicznej za pomocą papierowej taśmy chirurgicznej o szerokości 2,5 cm.
  9. Podgrzej za pomocą podczerwieni lub podkładki grzewczej z gorącą wodą i monitoruj temperaturę ciała myszy przez cały czas trwania zabiegu. Utrzymuj temperaturę ciała w zakresie 35-37 °C.
  10. Oczyść przycięty obszar sterylnym patyczkiem wacikowym z roztworem powidonu i jodu i wytrzyj sterylnym preparatem nasączonym alkoholem.
  11. Powtórz krok 6.9 jeszcze dwa razy.
  12. Umieść kroplę sterylnej maści weterynaryjnej z lubrykantem do oczu na każdym z oczu myszy, aby chronić przed odwodnieniem i uszkodzeniem rogówki.
  13. Przykryj mysz sterylnym serwetem chirurgicznym.
  14. Wstrzyknąć buprenorfinę (1 mg/kg) podskórnie (S/C).
  15. Wykonaj podłużne przyśrodkowe nacięcie grzbietowe za pomocą skalpela (ostrze #21).
  16. Wykonaj obustronną resekcję jajników, użyj dostępu grzbietowego.
    1. Uwolnij podskórną tkankę łączną przez rozwarstwienie za pomocą nożyczek.
    2. Ściśnij powięź bocznie do linii środkowej, wykonaj nacięcie i dotrzyj do jamy otrzewnej za pomocą ostrych nożyczek.
    3. Chwyć delikatnie pęsetą poduszeczkę tłuszczową jajnika i jajnik i wyciągnij ją z jamy brzusznej.
    4. Chwyć jajnik i poduszeczkę tłuszczową za pomocą zacisku naczyniowego.
    5. Podwiązać jajnik i poduszeczkę tłuszczową za pomocą wchłanialnego szwu monofilamentowego 4/0 u podstawy jajnika, dystalnie do jajowodu.
    6. Przypnij jajnik dystalnie do krawata. Upewnij się, że nie ma krwawienia z podstawy kikuta.
    7. Umieść tkankę z powrotem w jamie brzusznej i zszyj powięź za pomocą plecionego szwu wchłanialnego 6/0.
    8. Powtórzyć etapy 7.15.1-7.15.7 po stronie przeciwnej.
  17. Jednoczesny przeszczep tkanki jajnika.
    1. Wykonaj poziome nacięcie w powięzi powyżej pośladka wielkiego, na długości pasującej do wymiarów skrzepu. Stwórz kieszeń w tej wirtualnej przestrzeni, otwierając nożyczki pod deską rozdzielczą.
    2. Weź jeden kawałek kapsułkowanej tkanki korowej, jak to przygotowano w kroku 6.4.8, i umieść go w tej kieszeni.
    3. Zszyj powięź za pomocą plecionego szwu wchłanialnego 6/0.
  18. Powtórz etapy 7.16.1-7.16.3 również po stronie przeciwnej.
  19. Zamknij ścianę grzbietową za pomocą prostych przerywanych szwów z wchłanialnym szwem monofilamentowym 4/0.
  20. Wstrzyknąć lidokainę 0,5% (1,2 ml/kg) S/C w miejsce nacięcia.
  21. Użyj sterylnego preparatu nasączonego alkoholem, aby oczyścić skórę.
  22. Wyłącz izofluran podczas monitorowania temperatury myszy.
  23. Dostarczyć 1-2 minutyO2, bez izofluranu. Kontynuuj ogrzewanie myszy, aż zacznie się poruszać i powróci do przytomności.
  24. Umieść mysz w czystej klatce rekonwalescencji, a później umieść ją w osobnej klatce, aż do całkowitego zagojenia się rany pooperacyjnej.
  25. Buprenorfinę (1 mg/kg) S/C należy wstrzykiwać w razie potrzeby co 8-12 godzin, przez 24 godziny po operacji.
  26. Trzymaj myszy w oddzielnych klatkach, gdy całe jedzenie, woda, ściółka i klatki są sterylizowane w autoklawie, aż do punktu końcowego eksperymentu. Klatki należy przechowywać w wentylowanym pomieszczeniu pod ciśnieniem. Używaj środków ochrony osobistej podczas pracy z myszami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby określić, czy wspólny przeszczep ExEC zapewnia korzyść dla tkanki pacjentów, rozmrożone paski kory jajnika podzielono na równe części i wszczepiono obustronnie immunokompromitowanym myszom NOD scid gamma (NSG). Każda mysz służyła jako własna kontrola, przy czym jedna strona była osadzona w samym skrzepie fibryny (bez EC), a druga zawierała ExEC (Rysunek 1a). ExEC uzyskano poprzez izolację pierwotnego śródbłonka z ludzkich pępowin i następującą po niej obr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy, że kotransplantacja exEC zapewnia znaczące korzyści dla żywotności i funkcji tkanki jajnikowej po ksenoprzeszczepie u myszy. Nie ustalono standardów klinicznego zastosowania autotransplantacji tkanki jajnikowej w celu zachowania płodności oraz optymalnych parametrów (wielkość, miejsce przeszczepienia, czas trwania przeszczepu itp.) 32,33,34 dla zwiększonej regeneracji puli pęcherzykowej pozostają nieokreślone.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Michael Ginsberg jest pracownikiem firmy Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Stany Zjednoczone, która wyizolowała, przetransfekowała E4-ORF-1 i oznaczyła użyte przez nas komórki śródbłonka.

Podziękowania

Omar Alexander Man za ilustracje.
Projekt L.M. otrzymał nagrodę Pilot Award przyznaną przez Cornell Clinical and Translational Science Center oraz grant badawczy ASRM.
Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Jamesa za krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Leibovitz' s L-15 mediumGibco11415064
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyGibco15240062Anti-Anti X100
SacharozaSigma S 1888
FibrynogenSigmaF 8630z osocza bydlęcego
TrombinaSigmaT 1063z osocza ludzkiego
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzyme Cell Detachment MediumInvitrogen00-4555-56Accutase
Plastikowa folia parafinowaBemis NAParafilm M
Taśma chirurgiczna papierowa 2,5 cm3M1530-1Micropore
Taśma chirurgiczna papierowa 1,25 cm3M1530-0Micropore
Perforowana plastikowa taśma chirurgiczna 1,25 cm3M1527-0Transpore
Monofilamentowy wchłanialny szewCovidienUM-203
Pleciony wchłanialny szewCovidienGL-889Polysorb
Powidon i roztwór jodu USP 10%Produkty Purdue67618-153-01Wacik w roztworze Betadine
CryovialesNunc377267
sterylna okularowa CryoTube lubrykantDechra17033-211-38Puralube
1,7 ml probówka do mikrowirówekDenvilleC-2172System
anestezjologicznyVetEquipV-1 z oczyszczaczem
Komórki śródbłonkaAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USAIzolowane, transfekowane E4-ORF-1 i znakowane komórki śródbłonka
Barwienie trójchromatoweSigmaHT15-1ktZestaw bejc trichromowych (Masson)
IzolektynaInvitrogenI32450izolektyna GS-IB4 z Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate
Biosyn Eppendorf System stołowy

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475(2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003(2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162(2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wsp przeszczep tkanki jajnikain ynieria kom rek r db onkaformowanie skrzepu fibrynowegomodel ksenoprzeszczepu mysiegoanaliza rozwoju p cherzyk wdostarczanie sygna w parakrynnychstrategia agodzenia niedokrwieniamodulacja aktywacji p cherzykowejywotno tkanki krio konserwowanejekspresja hormonu antym llera
Kotransplantacja ludzkiej tkanki jajnika za pomocą zmodyfikowanych komórek śródbłonka: strategia oparta na komórkach łącząca przyspieszoną perfuzję z bezpośrednim dostarczaniem parakrynnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.