Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57474

⸱

18 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Streszczenie

Chociaż udowodniono, że hematopoetyczne komórki macierzyste (SC) CD133+ mają duży potencjał w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, ich niskie wskaźniki retencji po wstrzyknięciu do uszkodzonych tkanek, jak również obserwowane masowe wskaźniki śmierci komórek prowadzą do bardzo ograniczonych efektów terapeutycznych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, staraliśmy się ustalić protokół nieoparty na wirusach dla odpowiedniej inżynierii komórkowej przed ich podaniem. Modyfikacja ludzkich SC z ekspresją CD133+ za pomocą polipleksów magnetycznych obciążonych mikroRNA (miR) została skupiona pod kątem wydajności i bezpieczeństwa wychwytu, a także potencjału celowania komórek. Opierając się na naszym protokole, możemy osiągnąć wysokie wskaźniki wychwytu miR na poziomie 80-90%, podczas gdy właściwości komórek macierzystych CD133+ pozostają nienaruszone. Co więcej, te zmodyfikowane ogniwa oferują opcję celowania magnetycznego. Opisujemy tutaj bezpieczną i wysoce wydajną procedurę modyfikacji SC CD133+. Oczekujemy, że takie podejście zapewni standardową technologię optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych i monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI).

Wprowadzenie

CD133+ SCs reprezentują heterogeniczną populację komórek macierzystych i progenitorowych z obiecującym potencjałem dla medycyny regeneracyjnej. Ich hematopoetyczny, śródbłonkowy i miogenny potencjał różnicowania1,2,3 umożliwia komórkom CD133+, np. przyczynianie się do procesów neowaskularyzacji poprzez różnicowanie się w nowo tworzące się naczynia krwionośne i aktywację sygnalizacji proangiogennej przez mechanizmy parakrynne4,5,6,7.

Pomimo ich wysokiego potencjału wykazanego w ponad 30 zatwierdzonych badaniach klinicznych (ClinicalTrails.gov), ich wynik terapeutyczny jest nadal przedmiotem kontrowersyjnych dyskusji4. Rzeczywiście, kliniczne zastosowanie SC jest utrudnione przez niską retencję w narządzie będącym przedmiotem zainteresowania i masywną początkową śmierć komórki5,8,9. Dodatkowa inżynieria CD133+ SC przed przeszczepem może pomóc w przezwyciężeniu tych wyzwań.

Jednym z warunków wstępnych skutecznej terapii komórkowej byłoby zmniejszenie masowej początkowej śmierci komórki, aby zwiększyć wszczepianie komórek istotnych terapeutycznie10. Obecne badania wykazały ogromną utratę komórek wynoszącą 90–99% w wysoce ukrwionych narządach, takich jak mózg i serce, w ciągu pierwszych 1–2 godzin, niezależnie od typu przeszczepionej komórki lub drogi aplikacji11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Znakowanie SC za pomocą nanocząstek magnetycznych (MNP) umożliwia innowacyjną, nieinwazyjną strategię kierowania komórek w miejsce zainteresowania22,23,24,25,26 i jednocześnie umożliwia monitorowanie komórek za pomocą MRI27 i obrazowania cząstek magnetycznych (MPI). Najbardziej efektywne badania in vivo z zastosowaniem ukierunkowania na namagnesowane komórki wykorzystywały retencję komórek po miejscowym podaniu zamiast kierowania komórkami po wstrzyknięciu dożylnym23,24,28. Dlatego nasza grupa zaprojektowała system dostarczania składający się z superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza29. Dzięki tej technice, CD133+ SC i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) mogą być skutecznie celowane, jak wykazano w próbach in vitro30,31.

Kolejną przeszkodą w terapiach SC jest wrogie środowisko zapalne dotkniętej tkanki po przeszczepie, które przyczynia się do początkowej śmierci komórki32. Oprócz kilku badań kondycjonowania wstępnego, przetestowano zastosowanie terapeutycznych miR 33; Udało się wykazać, że antyapoptotyczne miR hamują apoptozę in vitro i zwiększają wszczepianie komórek in vivo33. Te małe cząsteczki, złożone z 20–25 nukleotydów, odgrywają kluczową rolę jako posttranskrypcyjne modulatory informacyjnego RNA (mRNA), a tym samym wpływają na los i zachowanie komórek macierzystych34. Co więcej, egzogenne wprowadzenie miR pozwala uniknąć niepożądanej stabilnej integracji z genomem gospodarza34.

Obecne próby skutecznego wprowadzenia kwasów nukleinowych (NA) do pierwotnych SC opierają się głównie na rekombinowanych wirusach8,35. Pomimo wysokiej skuteczności transfekcji, manipulacja rekombinowanym wirusem stanowi główną przeszkodę dla translacji z laboratorium na łóżko, np. niekontrolowana ekspresja genów, patogenność, immunogenność i mutageneza insercji35,36. Dlatego opracowanie niewirusowych systemów dostarczania, takich jak konstrukty na bazie polimerów, ma kluczowe znaczenie. Wśród nich polietylenenina (PEI) stanowi ważny nośnik oferujący korzyści dla miR, takie jak kondensacja NA w celu ochrony przed degradacją, wychwytem komórkowym i uwalnianiem wewnątrzkomórkowym poprzez ucieczkę endosomalną37,38. Ponadto kompleksy miR-PEI wykazały wysoką biokompatybilność w badaniach klinicznych39. Dlatego nasz system dostarczania składa się z biotynylowanego, rozgałęzionego PEI o masie 25 kDa związanego z pokrytym streptawidyną rdzeniem MNP30,31,40.

W tym manuskrypcie prezentujemy obszerny protokół opisujący (i) ręczną izolację CD133+ SC od dawcy ludzkiego szpiku kostnego (BM) ze szczegółową charakterystyką produktu SC oraz (ii) efektywną i delikatną strategię transfekcji magnetycznie niewirusowego systemu dostarczania opartego na polimerach do inżynierii genetycznej SC CD133+ przy użyciu miRs. CD133+ SC są izolowane i magnetycznie wzbogacane z ludzkich aspiracji BM mostka przy użyciu systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) opartego na przeciwciałach powierzchniowych. Następnie żywotność i czystość komórek są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie przygotowuje się kompleksy miR/PEI/MNP i transfekuje CD133+ SC. 18 godzin po transfekcji analizowana jest skuteczność wychwytu i wpływ transfekcji na ekspresję markera SC i żywotność komórek. Ponadto ocena wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia związków kompleksu transfekcji odbywa się za pomocą znakowania czterokolorowego i mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzki szpik kostny (BM) z mostka do izolacji komórek pobrano od świadomych dawców, którzy wyrazili pisemną zgodę na wykorzystanie ich próbek do celów badawczych zgodnie z Deklaracją Helsińską. Komisja etyczna Uniwersytetu w Rostocku zatwierdziła przedstawione badanie (nr rej. A 2010 23, przedłużone w 2015 r.).

1. Przygotowanie komórek

UWAGA: W celu zapobiegania krzepnięciu podczas badania BM należy zastosować heparynę sodową (250 IU/mL BM).

  1. Izolacja SC CD133+
    1. Przygotowanie wymaganych roztworów
      1. Przygotować roztwór zapasowy fosforanu buforu soli (PBS)/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (2 mM), mieszając 996 mL 1x PBS z 4 mL EDTA (0,5 M). Roztwór energicznie wymieszać i przefiltrować przez filtr 0,45 µm. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
      2. Przygotować bufor MACS, mieszając 995 mL 2 mM PBS/EDTA z 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Roztwór energicznie wymieszać i przefiltrować przez filtr 0,45 µm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      3. Przygotować roztwór zapasowy kolagenazy B (40 mg/mL), rozcieńczając 500 mg kolagenazy B (z Clostridium histolyticum) w 12,5 mL PBS. Roztwór energicznie wymieszać, rozdzielić na aliquoty po 350 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      4. Przygotować roztwór zapasowy doksyrybonukleazy (DNAza) I (10 mg/mL), rozcieńczając 100 mg DNazy I (z trzustki bydlęcej) w 10 mL PBS. Roztwór energicznie wymieszać, rozdzielić na aliquoty po 350 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Trawienie enzymatyczne ludzkiego BM
      1. Podgrzać medium do ludzkich limfocytów do temperatury RT i rozmrozić enzymy (po jednej aliquocie kolagenazy B i DNAzy na każde 20 mL BM).
      2. Przenieść BM ze strzykawek do probówki stożkowej 50 mL i delikatnie wymieszać. Usunąć wszelkie istniejące skrzepy.
        UWAGA: Przenieść 200 µL nierozcieńczonego BM do probówki 1,5 mL do późniejszej analizy cytometrycznej. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      3. Przenieść 10 mL BM do nowej probówki stożkowej 50 mL, dodać 6 mL PBS/EDTA (2 mM), 20 mL medium do ludzkich limfocytów, 175 µL kolagenazy B (40 mg/mL) i 175 µL DNAzy I (10 mg/mL). Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować przez 30 min w temperaturze RT na wytrząsarce. Powtórzyć dla pozostałej próbki BM.
    3. Wirowanie w gradiencie gęstości
      1. Przygotować probówkę do wirowania w gradiencie gęstości 50 mL, aplikując 15 mL medium do separacji ludzkich limfocytów do probówki 50 mL. Wirować przy 1 000 x g przez 30 s.
      2. Ostrożnie nanieść 35 mL rozcieńczonego BM na wierzch filtra probówki do wirowania w gradiencie gęstości i wirować przy 445 x g przez 35 min w temperaturze RT.
        UWAGA: Ustawienia wirówki to niskie przyspieszenie (3) i brak hamowania (1).
      3. Ostrożnie wyjąć probówkę z wirówki, unikając wstrząsania. Ostrożnie odpiąć ok. 20 mL z górnej, klarownej części roztworu, nie dotykając bezpośrednio mętnej warstwy znajdującej się nad filtrem.
      4. Ostrożnie przenieść mętną warstwę (znajdującą się bezpośrednio nad filtrem i zawierającą komórki mononuklearne (MNCs)) do nowej probówki stożkowej 50 mL i dopełnić PBS/EDTA do końcowej objętości 50 mL.
        UWAGA: Połączyć wszystkie MNCs z próbki BM jednego pacjenta w jednej nowej probówce.
      5. Policzyć MNCs, przenosząc 10 µL zawiesiny komórkowej 50 mL do probówki 1,5 mL. Dodać 10 µL 3% kwasu octowego z błękitem metylenowym. Delikatnie wymieszać i nanieść 10 µL do komory licznikowej. Obliczyć liczbę MNCs.
      6. Wirować zawiesinę MNC przy 300 x g przez 10 min. Odpiąć nadsącz.
        UWAGA: Podczas wirowania obniżyć temperaturę wirówki z RT do 4 °C.
    4. Magnetyczna selekcja SC CD133+ przy użyciu superparamagnetycznych cząsteczek dekstranu żelazowego sprzężonych z przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD133
      UWAGA: Na tym etapie pracować w lodzie. Przechowywać roztwory do momentu użycia w temperaturze 4 °C. Przechowywać magnes trwały MACS, kolumny separacyjne i filtr przedseparacyjny w temperaturze 4 °C.
      1. Wybrać rozmiar kolumny. Dla <1,2 x 108 MNCs użyć kolumn MS, a dla >1,2 x 108 MNCs użyć kolumn LS (patrz Tabela materiałów).
      2. Aby przygotować selekcję magnetyczną dla całkowitej liczby komórek 1 x 108, ostrożnie resuspendować MNCs w 300 µL buforu MACS (4 °C). Dodać 100 µL odczynnika blokującego FcR (4 °C) i 100 µL superparamagnetycznych cząsteczek dekstranu żelazowego sprzężonych z przeciwciałem przeciwko CD133 (4 °C).
      3. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C. Podczas inkubacji delikatnie wstrząsać zawiesiną komórkową (2–3x).
      4. Dodać 2 mL buforu MACS (4 °C) na każde 1 x 108 całkowitych MNCs. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
      5. Przygotować uchwyt magnesu MACS i zamocować magnes trwały MACS. Zainstalować kolumnę MACS i nanieść na nią filtr przedseparacyjny.
      6. Eqwilibrować pierwszą kolumnę MACS MS/LS oraz filtr przedseparacyjny 0,5 mL (MS) lub 3 mL (LS) buforu MACS (4 °C).
        UWAGA: Nie dopuszczać do wyschnięcia kolumn MACS po ekwilibracji.
      7. Odpiąć nadsącz i resuspendować otrzymany osad w 500 µL buforu MACS (4 °C) na każdą całkowitą ilość komórek 1 x 108. Nanieść zawiesinę komórkową na filtr przedseparacyjny.
      8. Przemyć kolumnę MACS i filtr przedseparacyjny trzy razy, używając przy każdym płukaniu 0,5 mL (MS) lub 3 mL (LS) buforu MACS (4 °C).
        UWAGA: Podczas trzeciego etapu płukania zainstalować drugą kolumnę MACS w magnesie trwałym MACS i ekwilibrować drugą kolumnę MACS MS/LS 0,5 mL (MS) lub 3 mL (LS) buforu MACS (4 °C).
      9. Usunąć filtr przedseparacyjny.
      10. Eluować frakcję komórkową bezpośrednio na drugą kolumnę MACS: dodać 1 mL (MS) lub 5 mL (LS) buforu MACS (4 °C) na pierwszą kolumnę MACS i wyjąć kolumnę MACS z magnesu trwałego MACS. Natychmiast przenieść pierwszą kolumnę MACS nad drugą kolumnę MACS i przepchnąć zawiesinę komórkową przez kolumnę MACS za pomocą dołączonego tłoka.
      11. Przemyć kolumnę MACS trzy razy, używając przy każdym płukaniu 0,5 mL (MS) lub 3 mL (LS) buforu MACS (4 °C).
      12. Eluować frakcję komórkową z kolumny, dodając 1 mL (MS) lub 5 mL (LS) buforu MACS (4 °C) na drugą kolumnę MACS i wyjmując kolumnę MACS z magnesu trwałego MACS. Natychmiast przenieść drugą kolumnę MACS nad probówkę 1,5 mL (MS) lub probówkę stożkową 15 mL (LS) i przepchnąć zawiesinę komórkową przez kolumnę MACS za pomocą dołączonego tłoka.
      13. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odpiąć nadsącz i resuspendować otrzymany osad w 100 µL buforu MACS (4 °C).
      14. Policzyć komórki CD133+: przenieść 6 µL zawiesiny komórkowej do probówki 1,5 mL. Dodać 6 µL roztworu błękitu trypanu (0,4%). Delikatnie wymieszać i nanieść 10 µL do komory licznikowej. Obliczyć liczbę komórek CD133+.
      15. Przechowywać komórki CD133+ w lodzie do momentu wysiewania.
  2. Charakterystyka świeżo izolowanych SC CD133+
    UWAGA: Poniższe prace powinny być prowadzone w pomieszczeniu chronionym przed jasnym światłem (tylko przy przygaszonym oświetleniu). Przechowywać probówki, bufory i przeciwciała w lodzie, chyba że wskazano inaczej.
    1. Przygotowanie SC do analizy cytometrycznej
      1. Do analizy użyć dwóch próbek (każda 10 µL) aliquotów BM oraz jednej próbki świeżo izolowanych SC CD133+ (minimum 1 x 104 komórek). Przenieść komórki do probówki 1,5 mL. Dodać 10 µL odczynnika blokującego FcR i dopełnić buforem MACS (4 °C) do objętości 33 µL.
      2. Nanieść następujące przeciwciała na wewnętrzną ściankę odpowiednich probówek (patrz Tabela 1): przeciw-CD34-izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) (klon: AC136), przeciw-CD133/2-fykoerytrynę (PE) (klon: 293C3), kontrolę izotypową mysiej IgG 2b-PE, przeciw-CD45-allofikocyjaninę (APC)-H7 (klon: 2D1) oraz 7-aminoaktynomycynę (AAD). Po dodaniu wszystkich przeciwciał strząsnąć ściankę probówki z przeciwciałami. Delikatnie wymieszać roztwór (końcowa objętość 50 µL) i inkubować przez 10 min w temperaturze 4 °C.
      3. Dodać 1 mL 1x buforu do lizy erytrocytów (RBC), delikatnie wymieszać zawiesinę i inkubować w lodzie przez 10 min. Wirować zawiesinę przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
      4. Odpiąć nadsącz i resuspendować otrzymany osad w 100 µL PBS (4 °C). Przechowywać w lodzie do momentu analizy cytometrycznej.
    2. Analiza cytometryczna SC CD133+
      1. Aby zbadać żywotność i czystość komórek SC CD133+, zastosować zaadaptowaną strategię bramkowania cytometrii przepływowej International Society of Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE)41 (patrz reprezentacyjny schemat na Rysunku 1). Zastosować następującą kolejność:
        Krok 1: selekcja populacji komórek (Rysunek 1A)
        Krok 2: selekcja komórek CD45+ (Rysunek 1B)
        Krok 3: selekcja żywych komórek CD45+ (Rysunek 1C)
        Krok 4: selekcja żywych komórek CD45+/CD34+ (Rysunek 1D)
        Krok 5: selekcja żywych komórek CD45+/CD34+/CD133+ (Rysunek 1E)
        Uruchomić cytometr przepływowy (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Obliczyć żywotność i czystość komórek, korzystając z następujących równań:

Wzór na żywotność komórek, Żywotność [%] = (żywe komórki CD45+ / komórki CD45+) × 100, równanie.   Równanie 1

Równanie czystości dla analizy komórek, wzór do obliczania procentowego udziału populacji komórek, markery CD.   Równanie 2

  1. Hodowla komórkowa świeżo wyizolowanych komórek SC CD133+
    1. Rozdziel 100-krotny suplement rekombinowanych ludzkich cytokin na aliquoty po 100 µL i przechowuj w temperaturze -20 °C. Rozmroź jeden 100-krotny alikwot przed przygotowaniem medium.
    2. Przygotuj medium hodowlane dla komórek SC CD133+: bezzserwatkowe medium do ekspansji komórek krwiotwórczych uzupełnione o suplement rekombinowanych ludzkich cytokin (stężenie końcowe 1x) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.
    3. Wysiej 5 x 104 świeżo wyizolowanych komórek SC CD133+ do transfekcji w płytce 24-dołkowej w 500 µL medium hodowlanego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 20% O2.
      UWAGA: Wysiej 5 x 104 świeżo wyizolowanych komórek SC CD133+ jako kontrolę do analizy cytometrycznej.

2. Przygotowanie kompleksów do transfekcji

UWAGA: Na tym etapie należy utrzymać całe miejsce pracy w stanie wolnym od rybonukleazy (RNAse), używając roztworu do dekontaminacji RNAse oraz wyłącznie materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNAse.

  1. Przygotowanie miR
    UWAGA: Poniższe czynności należy przeprowadzać w pomieszczeniu chronionym przed jasnym światłem (wyłącznie przy przyciemnionym oświetleniu).
    UWAGA: Dla próbek miR: należy użyć prekursora miR znakowanego barwnikiem Cyanine 3 oraz nieznakowanego prekursora miR.
    1. Aby przygotować roztwór zapasowy miR (50 µM), rozcieńczyć pożądaną ilość miR w odpowiedniej objętości wody wolnej od nukleaz (np. rozcieńczyć 5 nmol miR w 100 µL wody). Delikatnie wymieszać roztwór, podzielić zapas miR na aliquoty (5 µL) i przechowywać w temperaturze poniżej -20 °C.
  2. Przygotowanie PEI
    1. Przygotować PEI zgodnie ze standardowymi protokołami i odnotować stężenie zapasowe PEI31,42.
  3. Przygotowanie MNP
    1. Przygotować MNP zgodnie ze standardowymi protokołami i odnotować stężenie zapasowe MNP31,42.
  4. Przygotowanie kompleksów miR/PEI
    1. Przygotować 5% roztwór glukozy poprzez rozcieńczenie D-(+)-glukozy w wodzie wolnej od nukleaz. Delikatnie wymieszać roztwór, podzielić zapas na aliquoty (1,5 mL) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Poniższe czynności należy przeprowadzać w pomieszczeniu chronionym przed jasnym światłem (wyłącznie przy przyciemnionym oświetleniu).
    2. Użyć 20 pmol miR na dołek płytki 24-dołkowej30. Rozcieńczyć miR w 5% roztworze glukozy do końcowego stężenia 0,25 pmol miR/µL.
    3. Obliczyć ilość wymaganego PEI na podstawie ilości miR (20 pmol, krok 2.3.1) oraz optymalnego stosunku azotu (z PEI) do fosforu (z miR) (N/P) w zależności od stężenia zapasowego PEI (krok 2.2.1; w tym przypadku użyto stosunku 7,5)30. Rozcieńczyć PEI w równoważnej ilości 5% roztworu glukozy zgodnie z równaniem:
      Równanie stosunku N/P dla optymalizacji wydajności dostarczania genów; formuła obejmuje stężenie PEI i miR.
      które po przekształceniu przyjmuje postać
      Wzór na objętość PEI, równanie matematyczne używane w obliczeniach biochemicznych dla transfekcji genów.    Równanie 3
      gdzie objętość PEI podana jest w µL, a [PEI] w mM, a N/P (zoptymalizowane dla tego protokołu) wynosi 0,75. Wartość 0,12 jest współczynnikiem konwersji specyficznym dla miR.
    4. Dodać uprzednio rozcieńczony PEI do uprzednio rozcieńczonego miR i mieszać w wirówce typu vortex przez 30 s.
    5. Inkubować kompleks miR/PEI przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Przygotowanie kompleksów miR/PEI/MNP
    UWAGA: Poniższe czynności należy przeprowadzać w pomieszczeniu chronionym przed jasnym światłem (wyłącznie przy przyciemnionym oświetleniu).
    1. Podczas inkubacji kompleksów miR/PEI przygotować MNP poprzez sonikację przez 20 min przy 35 kHz w wodnej kąpieli sonikacyjnej w temperaturze pokojowej (RT), aby upewnić się, że cząstki są w zawiesinie i nie ulegają agregacji.
    2. Obliczyć liczbę wymaganych MNP (3 µg żelaza/mL) na podstawie roztworu zapasowego MNP (krok 2.3.1).
    3. Dodać sonikowane MNP do kompleksów miR/PEI i mieszać w wirówce typu vortex przez 30 s. Inkubować kompleksy miR/PEI/MNP przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Przygotowanie kompleksów transfekcyjnych do znakowania czterokolorowego z użyciem SIM
    UWAGA: Należy użyć nieznakowanego prekursora miR.
    1. Znakować miR barwnikiem Cyanine 5 za pomocą zestawu do znakowania miR barwnikiem Cyanine 5 (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierzyć końcowe stężenie miR za pomocą wymienionego spektrofotometru (patrz Tabela materiałów) zgodnie z ustawieniami producenta (kwas nukleinowy, RNA-40). Podzielić miR na aliquoty (5 µL) i przechowywać w temperaturze -80 °C, chroniąc przed światłem.
    2. Znakować PEI barwnikiem fluorescencyjnym w kolorze jasnej zieleni za pomocą odpowiedniego zestawu do znakowania białek (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Określić końcowe stężenie PEI za pomocą testu z ninhydryną (krok 2.2.1). Podzielić PEI na aliquoty (w objętości obliczonej na podstawie Równania 3) i przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
    3. Znakować MNP barwnikiem rodamynowym sprzężonym z biotyną w stosunku 1:1000 w/w (barwnik do MNP). Wymieszać barwnik rodamynowy i MNP równolegle z procesem tworzenia kompleksów miR/PEI i inkubować roztwór przez 30 min w ciemności. Użyć bezpośrednio znakowanych MNP.

3. Transfekcja komórek SC CD133+

UWAGA: Podczas tego etapu należy zapewnić, aby cały obszar roboczy był wolny od rybonukleazy (RNAzy), używając roztworu do dekontaminacji RNAz, oraz stosować wyłącznie materiały eksploatacyjne wolne od RNAz
UWAGA: Poniższe czynności powinny być wykonywane w pomieszczeniu chronionym przed jasnym światłem (wyłącznie przy przyćmionym oświetleniu).

  1. Przygotowany kompleks miRNA/PEI/MNP dodawać kroplami bezpośrednio do odpowiedniej studni zawierającej świeżo wyizolowane komórki SC CD133+ w medium hodowlanym.
  2. Wymieszać delikatnie, kołysząc płytką w przód i w tył. Inkubować komórki przez 18 h w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 20% O2.

4. Analiza transfekcji miR

  1. Ocena wydajności poboru miR oraz cytotoksyczności kompleksów transfekcyjnych
    UWAGA: Dla próbek miR: do oceny poboru należy użyć prekursora miR znakowanego barwnikiem Cyanine 3, a do wyznaczenia bram kontrolnych w cytometrii przepływowej – nietransfekowanych komórek SC CD133+.
    UWAGA: Poniższe czynności należy przeprowadzać w pomieszczeniu chronionym przed silnym światłem (wyłącznie przy przyciemnionym oświetleniu).
    UWAGA: Probówki, bufory i przeciwciała należy przechowywać w lodzie, chyba że wskazano inaczej.
    1. Przygotować roztwór stokowy paraformaldehydu (PFA, 4%), rozpuszczając 4 g PFA w 100 mL PBS i podgrzewając roztwór do 80 °C. Intensywnie wymieszać roztwór i dostosować wartość pH do 7,3. Rozdzielić roztwór stokowy PFA na alikwoty (1,5 mL) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. 18 h po transfekcji zebrać zawartość każdej studni do osobnej probówki 1,5 mL. Przemyć każdą studnię raz 500 µL PBS i przenieść tę zawiesinę komórkową do tej samej probówki.
    3. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz i zawiesić otrzymany osad w 100 µL buforu MACS w temperaturze 4 °C.
    4. Dodać 0,5 µL barwnika reaktywnego z grupami aminowymi w celu odróżnienia komórek żywych od martwych, delikatnie wymieszać zawiesinę i inkubować przez 10 min w temperaturze 4 °C. Dodać 1 mL PBS (4 °C) i wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić nadsącz, zawiesić otrzymany osad w 100 µL PBS, dodać 33 µL PFA (4%) i przechowywać w lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu analizy cytometrycznej.
    6. Ustawić strategię bramkowania zgodnie z reprezentacyjnym schematem na Rysunku 2. Próbki należy analizować na cytometrze przepływowym (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Charakterystyka transfekowanych miR komórek SC CD133+
    UWAGA: Do wyznaczenia bram kontrolnych w cytometrii przepływowej użyto nieznakowanego prekursora miR oraz nietransfekowanych komórek SC CD133+.
    1. Zebrać zawartość każdej studni do osobnej probówki 1,5 mL i wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    2. Zastosować strategię bramkowania opisaną w kroku 1.2.
  3. Badanie wewnątrzkomórkowej dystrybucji kompleksów transfekcyjnych metodą SIM
    1. Przygotować kompleksy i przeprowadzić transfekcję komórek zgodnie z opisem w Sekcji 2 i Sekcji 3.
    2. 18 h po transfekcji zebrać zawartość każdej studni do osobnej probówki 1,5 mL. Przemyć każdą studnię raz 500 µL PBS i przenieść płuczkę do odpowiedniej probówki z danej studni. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić nadsącz i zawiesić otrzymany osad w 1 mL 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS, delikatnie wymieszać zawiesinę i wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    4. Odrzucić nadsącz, zawiesić otrzymany osad w 100 µL PBS i dodać 33 µL PFA (4%) na 20 min.
    5. Przenieść zawiesinę komórkową do nowej płytki 24-dołkowej zawierającej sterylne szkiełka nakrywkowe i wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    6. Odrzucić nadsącz i dodać 500 µL PBS. Delikatnie potrząsnąć płytką i usunąć PBS.
    7. Umieścić przygotowane szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych, używając wodnego medium montażowego w celu zachowania fluorescencji, i suszyć w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 h.
    8. Nabyć obrazy przy użyciu obiektywu imersyjnego 100X. Ustawienia SIM: linie laserowe 405, 488, 561 i 633 nm do wzbudzenia oraz z-stacks z głębokością 16 bitów pod 3 kątami, 3 fazami, przy uśrednianiu 4; siatki na linię laserową: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół opisuje ręczną izolację i magnetyczne wzbogacenie ludzkich komórek macierzystych CD133+ pochodzących z szpiku kostnego, z następującą strategią inżynierii komórkowej niezależnej od wirusów, jako nieinwazyjną technologię do manipulacji komórkami in vitro oraz narzędzie do monitorowania in vivo.

Ta trzyetapowa technologia izolacji umożliwia oddzielenie MNC z uprzednio strawionego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich latach SC CD133 + okazały się obiecującą populacją komórek dla terapii opartych na SC, o czym świadczy kilka badań klinicznych fazy I, II i III 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemcy (FKZ 0312138A i FKZ 316159), Kraj Związkowy Meklemburgia-Pomorze Przednie z funduszy strukturalnych UE (ESF/IVWM-B34-0030/10 i ESF/IVBM-B35-0010/12), DFG (DA1296/2-1), Niemiecka Fundacja Kardiologiczna (F/01/12), BMBF (VIP+ 00240) i Fundacja DAMP. Ponadto F.H. i P.M. są wspierani przez program FORUN Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku (889001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
7-AADBD Biosciences559925
Kwas octowy z błękitem metylenowymTechnologie komórek macierzystych70603%
anty-CD133/2-PE (klon: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anty-CD34-FITC (klon: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
anty-CD45-APC-H7 (klon: 2D1)BD Biosciences
barwnik rodaminy; Barwnik Atto 565 sprzężony z biotynąATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII cytometr przepływowyBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 superparamagnetyczne cząstki dekstranu żelaza sprzężone z przeciwciałem; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
kolagenaza BRoche Diagnostics GmbH11088831001
komora liczącaPaul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyjanina 3 barwnik oznaczony jako prekursor miR; Cy3 Znakowana barwnikiem kontrola ujemna Pre-miR #1Zestaw
Cyjanina 5 barwnik miR; Cy5 dye Label IT Zestaw do znakowania miRNA MirusBioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 mikroskop konfokalnyCarl Zeiss Jena GmbH
Odczynnik blokujący FcR, ludzkiMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
jasnozielony zestaw do znakowania białek; Oregon Green 488 Zestaw do znakowania białekThermo Fisher ScientificO10241
wodne podłoże montażowe; FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
probówka wirówkowa z gradientem gęstości; Probówka wirówkowa LeukosepGreiner Bio-One89048-932
MACS uchwyt magnetyczny; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
Filtr do separacji wstępnej MACSMiltenyi Biotec GmbH130-041-40730 µ m
Kolumna separacyjna MACS (MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
Magnes trwały MACS; Separator MACSMiltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV Filtr PVDFMerckSLHV013SL0,45 μ m
mysz IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
barwnik reaktywny aminowy; Near-IR LIVE/DEAD Zestaw do naprawy barwienia martwych komórekThermo Fisher ScientificL10119
pożywka do separacji ludzkich limfocytów; PancollPan Biotech GmbHP04-60500gęstość: 1,077 g/ml
PBSPan Biotech GmbHP04-53500bez Ca i Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727rozgałęziony; 25 kDa
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 μ g/ml
PFA, Merck, Schuchardt, OHG1040051000
nieznakowany prekursor miR; Pre-miR miRNA Prekursor Kontrola negatywna #1AmbionAM17110
Bufor do lizy RBCeBioscience00-4333-57
Roztwór do dekontaminacji RNAzy; RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
pożywka dla ludzkich limfocytów; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumPan Biotech GmbHP04-16500
rekombinowany suplement cytokin ludzkich; StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
pożywka do namnażania komórek krwiotwórczych bez surowicy; StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Streptawidyna MagneSphere Cząstki paramagnetycznePromega CorporationZ5481
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-Aldrich GmbHT81540,4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200,5 M; pH 8,0
ZEN2011 oprogramowanieCarl Zeiss Jena GmbH
Spektrofotometr NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonikująca łaźnia wodnaBandelin elektronicznaUltradźwiękowa moc nominalna: 80 W; Częstotliwość ultradźwiękowa: 35 kHz
560178 do znakowania Ambion AM17120

Bibliografia

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023(2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149(2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154(2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700(2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342(2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33(2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023(2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki CD133 dodatnieizolacja szpiku kostnegoanaliza cytometrycznamagnetyczna separacja kom rektransfekcja polimerowymi nanocz steczkamimikroskopia strukturalnego o wietleniaocena ywotno ci kom rek
Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.