Artykuł metodologiczny

Zastosowanie przeciwciał anty-fosfo-girdyny do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jejunum myszy

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57475

⸱

21 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Perinatology, Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center, 2Surgery Department, Anjo Kosei Hospital, 3Department of Pathology, Nagoya University Graduate School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Kuga i in. odkryli, że przeciwciała specyficzne dla statusu fosforylacji przeciwko białku wiążącemu aktynę, które fosforyluje się w tyrozynie 1798 (pY1798), mogą być używane do znakowania komórek kępek (TC). Protokół ten umożliwia solidną wizualizację TC przy użyciu barwienia immunofluorescencyjnego swobodnie pływających kriosekcji jelita czczego z przeciwciałami pY1798.

Streszczenie

Białko wiążące aktynę girdyna jest białkiem cytozolowym, które jest niezbędne do przebudowy aktyny, aby wywołać migrację komórek w różnych tkankach. Girdin jest fosforylowany zarówno przez receptorowe, jak i niereceptorowe kinazy tyrozynowe w tyrozynie 1798. Omori i in. opracowali przeciwciała specyficzne dla miejsca i fosforylacji przeciwko ludzkiej girdynie w tyrozynie-1798 (pY1798), które specyficznie wiążą się z fosforylowaną tyrozyną-1798, ale nie z nieufosforylowaną tyrozyną-1798. Przeciwciała pY1798 zostały użyte do specyficznego znakowania komórek kępek (TC), które są obecne w tkankach przewodu pokarmowego ssaków, ale funkcja tych komórek jest niejasna. Protokół ten umożliwia solidną wizualizację TC w jelicie czczym przy użyciu przeciwciał pY1798 i immunofluorescencji. Aby zapewnić skuteczną i prostą wizualizację TC, protokół ten obejmuje dwie techniki histologiczne: wytwarzanie swobodnie pływających kriosekcji z tkanki jelita czczego wypełnionej żelatyną oraz pobieranie antygenu w niskiej temperaturze w temperaturze 50 °C przez 3 godziny. Wypełnienie jelita czczego żelatyną zachowuje kształt swobodnie unoszących się skrawków przez cały czas trwania procedury barwienia, podczas gdy pobieranie antygenu w niskiej temperaturze zapewnia silne sygnały z TC. Pomyślne zastosowanie tego protokołu powoduje barwienie pY1798 TC rozmieszczonych od końcówki kosmków do krypty. Barwione TC mają somę w kształcie szpuli, a sygnały fluorescencyjne kondensują się na końcu światła, co odpowiada wystającej "kępce". Barwienie falloidyną kolokalizuje się z pY1798-dodatnimi TC na pogrubionej granicy szczotki i odpowiada masie korzonka wystającej z kępki TC. Protokół ten może być wykorzystany do badania TC w próbkach biopsji ludzkiej pobranych za pomocą endoskopów przewodu pokarmowego. Co więcej, niedawno doniesiono, że TC gromadzą się po zakażeniu pasożytami u myszy, co sugeruje, że protokół ten może mieć zastosowanie w diagnostyce infekcji pasożytniczych w ludzkich jelitach.

Wprowadzenie

Komórki kępek (TCs) są drobnymi rozproszonymi składnikami nabłonka przewodu pokarmowego, które charakteryzują się wierzchołkowymi kępkami i somasami w kształcie szpuli1. Chociaż TC zostały po raz pierwszy opisane w 19562, funkcja TC pozostaje niejasna, częściowo z powodu braku wiarygodnych znaczników TC.

Enomoto et al. Po raz pierwszy scharakteryzowano białko wiążące aktynę girdin3, które ulega ekspresji w układzie nerwowym, a także w tkankach nienerwowych, takich jak naczynia krwionośne, zastawki serca, ścięgna i mięśnie szkieletowe4. Myszy z genetyczną ablacją girdyny wykazują opóźnienie wzrostu i liczne anomalie mózgu4,5,6. Tymczasem mutacja powodująca utratę funkcji u ludzkiego girdyny jest związana z postępującą encefalopatią, ciężkim opóźnieniem i wczesnymi napadami padaczkowymi7.

W 2011 roku Lin i wsp. zidentyfikowali dynamiczną fosforylację girdyny w tyrozynie 1798, w której pośredniczą kinazy tyrozynowe, takie jak EGFR i Src8. Wykazali również, że fosforylowana girdyna jest niezbędna do przebudowy aktyny w celu wywołania migracji komórek8. Omori i in. opracowali przeciwciała specyficzne dla statusu miejsca i fosforylacji przeciwko ludzkiej girdynie fosforylowanej w tyrozynie 1798 (przeciwciała pY1798) zgodnie z protokołem Goto i zwalidowali przeciwciała za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce wektorów ekspresyjnych niosących pełnowymiarową girdin9,10. W 2017 r. Kuga i wsp. poinformował, że pY1798 oznacza TC o wysokiej specyficzności i wysokiej czułości1. Wykazano, że przeciwciała pY1798 są lepsze od poprzednich markerów TC w oparciu o doskonałe właściwości barwienia, które ujawniły cały kształt komórki, w tym charakterystyczną "kępkę" na końcu światła, jednak biologiczna rola girdyny i fosfo-girdyny w funkcji TC pozostała niejasna1.

Metoda opisana w tym badaniu obejmuje barwienie immunofluorescencyjne, technikę histologiczną oznaczania specyficznego białka na tkance za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko białku docelowemu i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorescencją przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Celem tej metody jest umożliwienie badaczom z ograniczonym doświadczeniem histologicznym uzyskania wysokiej jakości obrazów TC. Protokół ten wykorzystuje kriosekcje swobodnie pływające, które pozwalają uniknąć konieczności wykonywania kriosekcji montowanych na szkiełku lub sekcji parafinowej. Jednak sekcje swobodnie pływające są kruche ze względu na brak podparcia ze szklanego szkiełka, a grubość przekroju może zmniejszyć przepuszczalność przeciwciał. Protokół ten obejmuje dwa podejścia, które przezwyciężają te problemy: 1) wypełnienie całego światła jelita czczego żelatyną w celu zachowania morfologii swobodnie unoszących się odcinków podczas procedur barwienia oraz 2) zastosowanie niskotemperaturowego pobierania antygenu w celu zintensyfikowania sygnałów pY1798.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Badań Rozwojowych, Centrum Obsługi Człowieka w Aichi (numer wniosku: M-03).

1. Przygotowania

  1. Przygotować 10 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS): 32,27 g Na2HPO4·12H2O, 4,5 g NaH2PO4·2H2O, 80,0 g NaCl dodać do wody ultraczystej do końcowej objętości 10 L. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Przygotować 200 ml PBS-T: 200 ml PBS z etapu 1.1 ze 100 μl eteru oktylofenylowego polioksyetylenu(10) do końcowego stężenia 0,05% (obj. Sklep w RT.
  3. Nosząc rękawice i ochronę oczu, przygotuj 50 ml 15% sacharozy w 10% buforowanym obojętnym roztworze formaliny: 7,5 g sacharozy dodać do 10% buforowanego obojętnego roztworu formaliny (tabela materiałów) do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w RT.
    UWAGA: Wdychanie i/lub kontakt ze skórą/oczami z formaldehydem w 10% buforowanym neutralnym roztworze formaliny może być niebezpieczne. Obchodź się ostrożnie.
  4. Przygotować 1,5 ml roztworu podstawowego sprzężonego z barwnikiem falloidyną i fluorescencyjnym o stężeniu 200 jednostek/ml: koniugat farby falloidynowo-fluorescencyjnej (300 jednostek w 1 fiolce, liofilizowane ciała stałe, długości fal wzbudzenia i emisji: odpowiednio 581 nm i 609 nm) zawieszony w 1,5 ml metanolu. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotować 5 mg/ml roztworu podstawowego dichlorowodorku 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI): 10 mg DAPI w 2 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF). Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS: 0,5 g BSA, 10 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Usuń ściętą końcówkę prostej igły o rozmiarze 18 za pomocą szczypiec i ściśnij ściśnięty koniec szczypcem w kierunku wzdłużnym, aby umożliwić przepływ płynu przez światło igły (Rysunek 1A1).
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Sekcja zwierząt i izolacja Jejunum

  1. Fiksacja perfuzyjna myszy
    1. Noś rękawice i pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
    2. Przygotuj szklaną zlewkę o pojemności 100 ml, 10% buforowany neutralny roztwór formaliny, narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze), metalową tackę, nylonowe szwy 6-0, prostą igłę 18 G przygotowaną jak w 1,7, igłę skrzydełkową 22G, strzykawkę 20 ml.
    3. Załadować 20 ml 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny ze szklanej zlewki do strzykawki o pojemności 20 ml i przymocować igłę skrzydełkową o rozmiarze 22 do wylotu.
    4. Przygotuj płynną żelatynę, dodając 1 g żelatyny w proszku do 20 ml PBS (końcowe 5% żelatyny) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Po namoczeniu w temperaturze pokojowej przez 15 minut, inkubować w temperaturze 50 °C w łaźni wodnej przez 15 minut bez wstrząsania.
    5. Krótko zwirować i inkubować w temperaturze 50 °C przez kolejne 15 minut, aby całkowicie rozpuścić żelatynę. Pozostaw tubkę w pozycji RT do czasu użycia.
    6. Poddaj eutanazji dorosłą mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
    7. Umieść mysz z kroku 2.1.6 na metalowej tacy i wykonaj małe nacięcie na skórze przez chrząstkę za pomocą narzędzi chirurgicznych.
    8. Rozszerz nacięcie obiema rękami, aby odsłonić okolice klatki piersiowej i brzucha.
    9. Otwórz otrzewną, aby odsłonić membranę, a następnie otwórz przeponę po obu stronach.
    10. Przeciąć klatkę piersiową wzdłuż przednich linii pachowych po obu stronach, a następnie usunąć ścianę klatki piersiowej, przecinając w kierunku poprzecznym w miejscu grasicy, aby odsłonić serce.
    11. Wykonaj małe nacięcie na małżowinie usznej prawego przedsionka, aby odprowadzić krew i włóż igłę ze skrzydłami o rozmiarze 22 do wierzchołka lewej komory. Nacisnąć tłok, aby przetoczyć perfuzję tkanek 10% buforowanym roztworem neutralnej formaliny.
    12. Po odsłonięciu narządów w miednicy odetnij koniec odbytnicy od odbytu i oddziel jelita od ciała, przecinając krezkę.
    13. Aby wyizolować jelito czcze, przetnij jelita na 4 cm od antrum żołądka od strony odbytu. Wyrzuć odbytową połowę pozostałego jelita cienkiego.
    14. Przytnij jelito czcze na pół, aby ułatwić procedurę spłukiwania. Załaduj 20 ml 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny do strzykawki o pojemności 20 ml i przymocuj prostą igłę o rozmiarze 18 przygotowaną w kroku 1.7 do wylotu.
    15. Wstrzyknąć 10% buforowany neutralny roztwór formaliny z jednego końca przyciętego jelita czczego, aby wypłukać treść jelitową i utrwalić powierzchnię światła jelita (Rysunek 1A2).
    16. Przemyć światło jelita, wstrzykując PBS zgodnie z opisem w kroku 2.1.15.
    17. Przepłukać płynną żelatynę do światła jelita zgodnie z opisem w kroku 2.1.15, aby zastąpić PBS płynną żelatyną.
    18. Zamknij jeden koniec przyciętego jelita czczego przez podwiązanie szwem za pomocą nylonowego szwu 6-0, wypełnij jelito czcze płynną żelatyną i zamknij przeciwległy koniec przez podwiązanie szwem (Rysunek 1A3).
    19. Dodaj cztery węzły szwów, aby dopasować przekrój jelita czczego w kształcie kiełbasy do wklęsłej części kriomoldu (Rysunek 1A4).
      UWAGA: W przypadku krioform o przekroju wklęsłym 20 mm x 25 mm x 5 mm preferowany jest przekrój jelita czczego przypominający kiełbasę ~20 mm.
    20. Namocz tkanki w 50 ml 15% sacharozy w 10% buforowanym obojętnym roztworze formaliny przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Te kroki zapewniają krioochronę poprzez wiązanie sacharozy i białka przez formalinę żelatyny i tkanki. Żelatyna żelatyna żelatyna w formalinie nie topi się w temperaturze pokojowej, podczas gdy żelatyna żelatyniowana bez utrwalenia w temperaturze 4 °C topi się w temperaturze pokojowej.

3. Błyskawiczne zamrażanie wypełnionych żelatyną tkanek jejunum

  1. Przecinając jelito czcze na węzłach szwu, uzyskuje się trzy kawałki jelita czczego przypominające kiełbasę z podwiązanymi obydwoma końcami (Rysunek 1A4). Wyrównaj kawałki przypominające kiełbasę w kriomold w celu dodania związku do zatapiania w celu przygotowania zamrożonych próbek tkanek.
  2. Zamroź kriomold w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem. Przechowywać krioformy w temperaturze -80 °C
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Immunofluorescencja komórek kępki za pomocą swobodnie pływających kriosekcji

  1. Kriosekcja
    1. Ustaw zarówno temperaturę komory kriostatu (CT), jak i temperaturę obiektu (OT) na -22 °C. Umieść zamrożony blok tkanki w kriofordzie w komorze kriostatu na co najmniej 15 minut.
    2. Dodać 3 ml PBS do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego.
    3. Usuń zamrożony blok tkanki z kriomoldu i przetnij go na pół żyletką, aby odsłonić poprzeczny przekrój jelita czczego. Zamontuj połowę bloku na uchwycie (adapterze do kriostatu), aby przeciąć płaszczyznę cięcia za pomocą żyletki.
    4. Jelito czcze wypełnione żelatyną podzielić na odcinki o grubości 30 μm. Użyj zamrożonych kleszczy, aby delikatnie przenieść skrawki do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego przygotowanego w kroku 4.1.2 (Rysunek 2B, po prawej).
  2. Zastosowanie przeciwciał pierwszorzędowych
    1. Umyć swobodnie pływające sekcje w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm 3 razy po 5 minut za pomocą 3 ml PBS-T, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce przeciwstawnej (około 36 razy/min).
    2. Przygotować roztwór do pobierania antygenu: 0,3 ml koncentratu roztworu do pobierania antygenu (tabela materiałów) w 2,7 ml ultraczystej wody. Dodać 3 ml roztworu do pobierania antygenu do 35-milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej swobodnie pływające sekcje.
    3. Zamknąć pokrywę, uszczelnić szczelinę między naczyniem a pokrywką paskiem taśmy winylowej i inkubować w temperaturze 50 °C w inkubatorze do hybrydyzacji przez 3 godziny bez wstrząsania.
    4. Wyjąć naczynie z inkubatora i schłodzić w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po usunięciu taśmy winylowej umyj sekcje 3 razy po 5 minut każdy 3 ml PBS-T i delikatnie potrząśnij.
    5. Zassać PBS-T i dodać 5 kropli roztworu blokującego (Tabela materiałów) na sekcje. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, lekko wstrząsając.
    6. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego: 495 μl 5% BSA w PBS z 5 μl przeciwciał fosfo-Y1798 girdyny (pY1798) (tabela materiałów). Dodać 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na skrawki (nie trzeba usuwać roztworu blokującego).
    7. Umieścić naczynie w wilgotnej komorze inkubacyjnej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając.
      UWAGA: Nocną inkubację można przedłużyć do trzech nocy.
  3. Zastosowanie przeciwciał drugorzędowych
    1. Umyj sekcje 3 razy po 5 minut w 3 ml PBS-T delikatnie wstrząsając.
    2. Przygotować rozcieńczony roztwór podstawowy DAPI: 2 μl roztworu podstawowego DAPI (krok 1.5), 998 μl PBS.
    3. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego: 476 μl 5% BSA w PBS, 10,5 μl rozcieńczonego roztworu DAPI, 12,5 μl sprzężonego roztworu podstawowego z barwnikiem falloidynowym i fluorescencyjnym, 1 μl koniugatu koziego barwnika anty-króliczego IgG-fluorescencyjnego (długość fali: wzbudzenie 496 nm, emisja 520 nm).
    4. Po odessaniu PBS-T należy zastosować roztwór przeciwciała drugorzędowego i inkubować w komorze inkubacyjnej z osłoną światła w temperaturze pokojowej przez 30 minut z łagodnym wstrząsaniem.
    5. Umyj sekcje 3 razy po 5 minut za pomocą 3 ml PBS-T i delikatnie wstrząsając.
    6. Po ostatnim umyciu usuń PBS-T i zastąp go 3 ml PBS bez eteru oktylofenylowego polioksyetylenowego(10). Przenieś naczynie do mikroskopu stereoskopowego.
    7. Umieścić 200 μl PBS w kropli na środku szkiełka z białego szkła pokrytego MAS i przenieść jeden odcinek jelita czczego z naczynia do kropli za pomocą końcówki do pipety P200.
    8. Po wyregulowaniu wyrównania przekroju pod mikroskopem stereoskopowym, odessać wszystkie pozostałe PBS otaczające przekrój.
    9. Dodać 20 μl wodnego podłoża montażowego i umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 20 x 20 mm na wierzchu podłoża.
    10. Natychmiast uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego środkami montażowymi na bazie ksylenu. Umieść szkiełko na drewnianej mapie i poczekaj, aż media montażowe na bazie ksylenu zestalą się w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Po zestaleniu się nośników montażowych na bazie ksylenu szkiełka można przechowywać przez 2 - 3 tygodnie w osłoniętej światłem skrzynce na suwaki w temperaturze pokojowej.

5. Mikroskopia konfokalna

  1. Nałóż olejek immersyjny na obiektyw 63X mikroskopu konfokalnego. Obróć szkiełko nakrywkowe w dół i umieść szkiełko na stoliku.
  2. Digitalizacja obrazów TC uzyskanych na długościach fal laserowych 405, 488 i 555 nm i zapisywanie obrazów w formacie tiff (.tiff).
    UWAGA: Wybierz zestaw filtrów detekcyjnych, który jest odpowiedni dla barwników fluorescencyjnych (tj. maksima wzbudzenia/emisji: 358/461 nm, 490/525 i 590/617).

Wyniki

Wypełnianie jelita czczego żelatyną

Typowa procedura wypełniania jelita czczego myszy żelatyną została przedstawiona na (Rysunek 1A), podobnie jak korzyści wynikające z wypełniania żelatyną (Rysunek 1B). W skrócie, ścięta końcówka igły prostej o rozmiarze 18G została usunięta, aby zapobiec przebiciu ściany jelita (Rysunek 1A1). Wypełnienie żelatyną osiągnięto poprzez wstrzyknięcie 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny z jednego końca odciętego odcinka jelita czczego w celu przepłukania jelita i utrwalenia powierzchni światła jelita (Rysunek 1A2) przed wypełnieniem płynną żelatyną (Rysunek 1A3). Powstałe fragmenty o kształcie kiełbasek (Rysunek 1A4) zostały zatopione, zamrożone i pocięte w poprzek na plastry o grubości 30 µm w kriotomie. W przypadku braku wypełnienia żelatyną, sekcje jelita czczego mają tendencję do załamywania się, co powoduje odchylanie się kosmków do tyłu (Rysunek 1B, lewo). Wypełnienie żelatyną zachowuje okrągły kształt przekrojów i utrzymuje pionowe ustawienie kosmków (Rysunek 1B, prawo). Obrazy wyraźnie wskazują na korzyść wynikającą z wypełnienia żelatyną w zakresie zachowania morfologii wolno pływających przekrojów jelita czczego.

Pomyślne obrazowanie komórek kępkowych jelit

Przeciwciała pY1798 można stosować w różnych technikach immunobarwienia, w tym w dot blottingu, western blottingu, barwieniu skrawków parafiny, barwieniu krioprzekrojów montowanych po rozmrożeniu lub barwieniu wolno pływających krioprzekrojów1,9. W niniejszym protokole skupiliśmy się na wolno pływających krioprzekrojach w celu barwienia fluorescencyjnego komórek tuftowych (TC) w jelicie cienkim (część jejunalna) myszy z użyciem przeciwciał pY1798, faloidyny oraz barwienia DAPI, aby wykazać cechy strukturalne TC1. Generalnie TC są rozproszone w proporcji około jednej TC/100 komórek nabłonkowych od szczytu kosmka do krypty1. Reprezentatywne wyniki pokazują, że pY1798 w sposób powtarzalny obrysowuje całe TC, w tym błonę, cytoplazmę wrzecionowatego ciała komórki oraz silnie zabarwiony koniec światłowy, w którym intensywna kondensacja sygnału odpowiada wystającym „kępkom” TC1 (Rycina 2A-2B). Z kolei faloidyna jest falotoksyną, należącą do rodziny trujących bicyklicznych heptapeptydów z grzyba Amanita phalloides, i wykazuje wysokie powinowactwo do aktyny włóknistej (F-actin), która występuje w mikrokosmkach tworzących rąbek szczoteczkowy jelita11. Faloidyna w sposób powtarzalny i wyraźny znakuje pogrubiony rąbek szczoteczkowy, który odpowiada masie korzonków rozchodzących się z kępki1. Zatem spójna ko-lokalizacja sygnałów pY1798 (wrzecionowate ciało komórki, kondensacja sygnału na końcu światłowym) z wyraźnie pogrubionym, faloidyna-dodatnim rąbkiem szczoteczkowym dowodzi, że protokół ten skutecznie identyfikuje TC niezależnie od tego, czy znajdują się one na kosmku (Rycina 2A), czy w krypcie (Rycina 2B).

Niskotemperaturowe odmaskowanie antygenów jest skuteczne w barwieniu przekrojów swobodnie pływających

Odzyskiwanie antygenów metodą termiczną w temperaturze 95 - 99 °C jest powszechnie stosowane do analizy skrawków parafina oraz krioskrawków zamontowanych na szkiełkach. Jednak zastosowanie tego podejścia do skrawków swobodnie pływających bez powodowania ich uszkodzenia jest trudne, ponieważ skrawki te są zazwyczaj bardziej kruche niż skrawki zamontowane na szkiełkach, które są przez nie podpierane12. Ponieważ niskotemperaturowe odzyskiwanie antygenów (50 °C przez 3 h) z użyciem kąpieli wodnej nie wpłynęło na morfologię swobodnie pływających skrawków jelita czczego w eksperymentach wstępnych, oceniliśmy obiektywną skuteczność odzyskiwania antygenów w ślepej próbie, która statystycznie potwierdziła efektywność niskotemperaturowego odzyskiwania antygenów (Rysunek 3).

Proces tworzenia hydrożelu; ekstruzja strzykawką; porównanie żelatyny; obraz mikroskopowy; rusztowanie tkankowe.
Rysunek 1: Wypełnianie odcinków jelita czczego żelatyną w celu zachowania morfologii skrawków mrożonych
(A) Zdjęcia procedur wewnątrzwłóknistego wypełniania jelita czczego myszy żelatyną. (A1) Skośny czubek igły prostej o rozmiarze 18G został usunięty, aby uniknąć przebicia ściany jelita. (A2) Buforowy neutralny roztwór formaliny (10%) został wstrzyknięty w jeden koniec ściętego jelita czczego w celu wypłukania treści jelitowej i utrwalenia powierzchni światła jelita. (A3) Ścięte jelito czcze wypełnione płynną żelatyną, a oba końce podwiązane szwem nylonowym 6-0 (czarne strzałki). (A4) Umieszczenie czterech kolejnych węzłów szwu (białe strzałki) pomiędzy istniejącymi węzłami (czarne strzałki) pozwoliło na uzyskanie trzech krótszych fragmentów. Następnie tkanka zostanie podzielona na trzy kawałki przypominające kiełbaski w dwóch wskazanych miejscach (białe groty strzałek). (B) Korzystny wpływ wypełnienia żelatyną na morfologię wolno pływających skrawków mrożonych. Bez wypełnienia żelatyną skrawki mają tendencję do załamywania się, co pozwala kosmkom na łatwe odchylenie się do tyłu (lewo); przy wypełnieniu żelatyną skrawka o grubości 30 µm zachowuje on kształt dysku, a pionowa pozycja kosmków zostaje zachowana (prawo). Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopii kontrastowej Nomarskiego (DIC). Paski skali, 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazująca barwienie pY1798, faloidyną i DAPI w komórkach nabłonkowych.
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne komórek kępkowych jelita myszy
Konfokalne obrazy fluorescencyjne komórek kępkowych (TCs) na kosmku (A) lub w kryptcie (B), w wolno pływających przekrojach jelita cienkiego (jejunum) myszy, zabarwionych przeciwciałami swoistymi dla miejsca oraz stanu fosforylacji przeciwko girdinowi fosforylowanemu w tyrozynie 1798 (pY1798, zielony, optymalne długości fal wzbudzenia/emisji 490/525 nm), faloidyną (czerwony, 590/617 nm) oraz 4,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, niebieski, 358/461 nm). Obszar ograniczony białymi ramkami na obrazach o małym powiększeniu (paski skali, 50 µm) został powiększony po prawej stronie (paski skali, 10 µm). Przeciwciała pY1798 powtarzalnie barwią TCs niezależnie od lokalizacji (na kosmku (A) lub w kryptcie (B)), przy czym barwienie występuje w wierzchołku skierowanym do światła jelita (strzałki), w błonie oraz w cytoplazmie wrzecionowatego somy TCs. Kolejną charakterystyczną cechą TCs jest wyraźnie pogrubiona bordura szczoteczkowa w barwieniu faloidyną (groty strzałek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy, widoczne komórki kępkowe pY1798-dodatnie, efekt odmaskowania antygenów, istotność statystyczna P=0.00075.
Rycina 3: Niskotemperaturowe odmaskowanie antygenów zwiększa immunofluorescencję pY1798
W celu potwierdzenia skuteczności niskotemperaturowego odmaskowania antygenów porównano dwie grupy procedur eksperymentalnych. Wolno pływające przekroje jelita czczego (grubość 30 µm, n = 13) z jednego zamrożonego bloku podzielono na dwie grupy; przekroje z każdej grupy barwiono zgodnie z pełnym protokołem lub tym samym protokołem z pominięciem niskotemperaturowego odmaskowania antygenów (krok 4.2.2). Po barwieniu przekroje zamontowano na oddzielnych szkiełkach opisanych numerami grup, a opisy na każdym szkiełku zaklejono taśmą maskującą. Wszystkie szkiełka wymieszano, oznaczono nowymi numerami na taśmie i obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu filtra FITC. Całkowitą liczbę widocznych pY1798-dodatnich TCs uśredniono dla każdej grupy i przedstawiono na wykresie słupkowym (średnia ± odchylenie standardowe). W celu porównania średnich liczebności między dwiema grupami przeprowadzono dwustronny test t. Wartości P poniżej 0,05 uznano za istotne statystycznie. Niskotemperaturowe odmaskowanie antygenów znacząco poprawiło skuteczność immunofluorescencji pY1798. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten został opracowany, aby umożliwić naukowcom bez doświadczenia w histologii uzyskanie wiarygodnych obrazów komórek kępkowych (TC). Protokół ten ma trzy punkty krytyczne: 1) Zastosowanie specyficznych dla statusu miejsca i fosforylacji króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko ludzkiej girdynie fosforylowanej w tyrozynie 1798 (przeciwciała pY1798), które uzyskano z określonej firmy (Laboratoria Immunobiologiczne = Firma X); 2) Żelatynowe wypełnienie jelita czczego; oraz 3) Pobieranie antygenu w niskiej temperaturze. W najszerszym znaczeniu przeciwciała specyficzne dla statusu fosforylacji można sklasyfikować jako przeciwciała specyficzne dla modyfikacji, które rozpoznają określony rodzaj modyfikacji potranslacyjnej (np. acetylacji, metylacji lub fosforylacji) białka na określonej reszcie aminokwasowej. Omori i wsp. i firma X wspólnie wygenerowały przeciwciała pY1798 poprzez immunizację królików fosforylowanym peptydem i oczyszczenie powstałych przeciwciał za pomocą chromatografii w fazie stałej z niefosforylowanym peptydem zgodnie z metodą Goto 9,10. Przeciwciała pY1798 były intensywnie weryfikowane za pomocą testów fosforylacji in vitro przy użyciu pełnowymiarowych ludzkich wektorów ekspresyjnych girdyny z / bez mutacji punktowej w tyrozynie 17989. Następnie Kuga i wsp. odkryli, że przeciwciała pY1798 firmy X są specyficznym i czułym markerem jelitowego TCs1. Tak więc włączenie przeciwciał pY1798 z firmy X jest krytycznym punktem tego protokołu.

Żelatyna zawiera kolagen ekstrahowany z tkanek zwierzęcych i od dawna jest używana do osadzania próbek tkanek do badań histochemicznych przy użyciu kriosekcji13. Żelatyna o niskiej temperaturze topnienia, która jest żelatynizowana w temperaturze 4 °C, ale topi się w temperaturze pokojowej, zaczęła być stosowana w celu uniknięcia niekorzystnego wpływu ciepła potrzebnego do utrzymania żelatyny w stanie ciekłym podczas zatapiania14. W tym protokole zastosowano żelatynę o niskiej temperaturze topnienia wykonaną z proszku żelatynowego, która żeluje w temperaturze 4 °C i topi się w temperaturze pokojowej, aby zachować morfologię poprzecznych kriosekcji jelita czczego myszy. Kiedy ta żelatyna została użyta do całkowitego wypełnienia jelita czczego, próbki zostały następnie utrwalone formaliną, aby uzyskać nieodwracalną żelatynizację. Pobieranie antygenu wywołane ciepłem jest skuteczną metodą ujawniania antygenów, które są maskowane przez utrwalacze zawierające aldehydy12. Jednak wysokie temperatury (95 - 99 °C przez 30 min) powszechnie stosowane do analizy skrawków parafiny mogą uszkodzić morfologię kompleksu tkanka/żelatyna. W tym przypadku zastosowaliśmy niskotemperaturowe pobieranie antygenu (50 °C przez 3 godziny), które umożliwia zarówno pobranie antygenu, jak i zachowanie morfologii tkanki.

Przeciwciała pY1798 mogą znakować TC nie tylko w jelicie czczym myszy, ale także w wielu narządach (żołądek, jelito kręte, okrężnica i woreczek żółciowy) myszy i ludzi1. Ponieważ jednak sygnały pY1798 w nieutrwalonych tkankach z dowolnej tkanki ulegną szybkiej degradacji, protokół ten obejmuje wstrzyknięcie formaliny do światła jelita czczego (krok 2.1.15., Rysunek 1A2).

Istnieją ograniczenia związane z grubością kriosekcji swobodnie pływających. Chociaż cienkie kriosekcje mogą być korzystne pod względem przezierności dla mikroskopii, cienkość sprawia, że te sekcje są fizycznie wrażliwe. W przeciwieństwie do tego, grube kriosekcje są fizycznie wytrzymałe, ale mają niższą przepuszczalność przeciwciał w przekroju. W tym protokole użyto skrawków o grubości 30 μm, które były zarówno fizycznie stabilne, jak i przepuszczalne dla przeciwciał. Chociaż metoda ta została opracowana dla badaczy bez dużego doświadczenia w histologii, jeśli protokół zawiedzie, potrójne barwienie skrawków parafiny pY1798/villin/DAPI jest podobne do tego stosowanego przez Kuga i wsp. można wykonać1. Nie stosowano tu skrawków parafinowych, aby uniknąć trudności związanych z barwieniem F-aktyny przez falloidynę w skrawkach parafinowych.

Ze względu na zachowanie sekwencji aminokwasów sąsiadujących z tyrozyną girdyny-1798, przeciwciała pY1798 mogą być stosowane do barwienia TC u gatunków innych niż myszy, w tym szczurów i ludzi. Nadzienie żelatynowe stosowane w tym protokole może być również stosowane do innych pustych narządów. Rzeczywiście, oprócz pY1798 lub TC, połączenie żelatynowego wypełnienia z niskotemperaturowym pobieraniem antygenu może być przydatne do ujawnienia notorycznie "trudnych" epitopów w jelicie myszy, a w konsekwencji może być interesujące dla wielu badaczy.

Biologiczna rola girdyny i znaczenie jej fosforylacji w TC jest niejasne. Jednak badanie przeprowadzone przez Lin i wsp. zasugerował, że fosforylacja tyrozyny girdyny jest związana ze stopniem polimeryzacji F-aktyny8. Tymczasem Kuga i wsp. odkryli, że śmiertelne dawki induktorów apoptozy (np. cisplatyny, promieniowania rentgenowskiego) spowodowały duży wzrost względnej częstości TC w jelicie cienkim myszy, co do którego przypuszczali, że może być związane z możliwą konwersją z enterocytów do TC, w synchronizacji z fosforylacją girdyny w mikrokosmkach1. Możliwość ta będzie wymagała dodatkowych badań w przyszłości. Trzy grupy zaobserwowały ostatnio szybki wzrost częstości występowania TC po zakażeniu pasożytami 15,16,17. W związku z tym to swobodnie unoszące się barwienie może być wykorzystane nie tylko do analizy endoskopowo pobranych ludzkich tkanek jelitowych, ale akumulacja TC może również pomóc w diagnozowaniu infekcji pasożytniczej w ludzkim jelicie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Naoya Asai z Uniwersytetu w Nagoi za dostarczenie użytecznych sugestii dotyczących rozwoju niskotemperaturowego pobierania antygenu dla swobodnie pływających odcinków jelita czczego. Prace te były wspierane przez Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) w 2012 r. (JP25460493) i (B) w 2017 r. (JP17H04065) od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS), granty A-STEP w 2014 r. (AS251Z02522Q) i w 2015 r. (AS262Z00715Q) od Japońskiej Agencji ds. Nauki i Technologii (JST) oraz grant Takeda Visionary Research Grant 2014 od Fundacji Naukowej Takeda (dla magistra).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Slc:DDY 6-tygodniowe samice myszyChubu Kagaku ShizaiNie dotyczy
Wodorofosforan disodowy 12-woda (Na2HPO412H2O)Wako196-02835
Dihydroenfosforan sodu dwuwodny (NaH2PO42H2OWako199-02825
Chlorek sodu (NaCl)Wako199-10665
Triton X-100,  Eter oktylofenylowy polioksyetylenu(10)Katayama ChemicalNie dotyczy
SacharozaWako190-00013
10% buforowany neutralny roztwór formalinyMuto Chemical20215Krok 1.3.
Koniugat barwnika falloidynowo-fluorescencyjnego, Alexa Fluor 594 falloidynaThermoFisher ScientificA12381
MetanolNacalai Tesque21915-35
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)ThermoFisher ScientificD1306
N.N-dimetyloformamid (DMF)Nacalai Tesque13015-75
Surowica bydlęca albuminaSigmaA9647-10G
igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18 mmTerumoNN-1838R
U.S.P. 6-0, szew nylonowy 60 cm, CrownjunKono SeisakushoNie dotyczy
Igła skrzydełkowa o rozmiarze 22TerumoSV-22DLK
Strzykawka TERUMO 20 mlTerumoSS-20ES
50 ml probówka wirówkowaTPP91050
15 ml probówki wirówkowe IwakiIwaki2325-015
1,5 ml mikroprobówkaStarRSV-MTT1.5
Żelatyna w proszku, Gelare-blancNitta Biolab2809
Związek do zatapiania zamrożonej próbki tkanki, związek OCT 118 ml 12 sztukSakura FineTech4583
Cryomold, CRYO DISH nr 3, 125 sztuk, rozmiar studzienki 20 x 25 x 5 (mm)Shoei Work's1101-3
IsopentaneNacalai Tesque26404-75
Naczynie do hodowli komórek Falcon 35 x 10mm Easy-GripCorning353001
Koncentrat roztworu do pobierania antygenu, roztwór do pobierania docelowego pH 9 10xDakoS2367Koncentrat roztworu do odzyskiwania antygenu w kroku 4.2.2.
Blok białkowyDakoX0909Roztwór blokujący w 4.2.5.
Przeciwciała Phospho-Y1798 girdin (pY1798)Laboratoria Immunobiologiczne (IBL) = Firma X28143Przeciwciała Phospho-Y1798 girdin w kroku 4.2.6.
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11034
Aquous media montażowe, Prolong Gold Anti-fade MountantThermoFisher ScientificP36930
Szkiełka nakrywkowe, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 szt Grubość nr 1Matsunami GlassC022221
Entellan Nowe, ksylenowe media montażowe do mikroskopiaMerck Millipore107961
szkiełkowe powlekane MAS białeSzkło MatsunamiMI-MAS-01
Drewniana mapa typu KOOlejek immersyjny Shoei Work's99-40007
518 F bez fluorescencji 20 mlPipety Zeiss444960
, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)GilsonF144801, F123600, F123601, F123602
System produkcji wody ultraczystejAdvantecGS-590
Rękawica plastikowa, Rękawica nitrylowa StarStar RSU-NGVM
KriostatLeica MicrosystemsCM1950
Zamrażarka głęboka, SANYO Ultra LowSanyoMDF-382
Lodówka gablomowaNihon FreezerNC-ME50EC
Łaźnia wodna, Thermominder SDminiN (do rozpuszczania żelatyny w temperaturze 50 C)Taitec0068750-000
Inkubator do hybrydyzacji (do pobierania antygenu w temperaturze 50 C)TaitecHB-100
Komora inkubacyjna do barwienia immunologicznegoCosmo Bio10DO
Wytrząsarka przeciwposuwisto-zwrotna do immunohistochemii (do temperatury pokojowej)TaitecNR-1
Wytrząsarka odwrotna do immunohistochemii (dla 4 C)Tokyo Rika KikaiMMS-3010
Mikroskop stereoskopowy (do obsługi tkanek)OlympusSZ61
(dla rysunku 1B)Leica MicrosystemsM165FC
(dla rysunku 3)mikroskop skaningowy NikonE800
ZeissZobacz materiał LSM700
prosta szkło Mikroskop stereoskopowy Mikroskop fluorescencyjny Konfokalny laserowo-skaningowy

Bibliografia

  1. Kuga, D., et al. Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut. J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).
  2. Jarvi, O., Keyrilainen, O. On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).
  3. Enomoto, A., et al. Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE. Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).
  4. Asai, M., et al. Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage. Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).
  5. Kitamura, T., et al. Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin. Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).
  6. Wang, Y., et al. Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain. J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).
  7. Nahorski, M. S., et al. CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse. Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).
  8. Lin, C., et al. Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration. Science signaling. 4 (192), ra64(2011).
  9. Omori, K., et al. Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration. Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).
  10. Goto, H., Inagaki, M. Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody. Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).
  11. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).
  12. Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
  13. Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue. J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).
  14. Ushida, K. Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections. Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).
  15. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  16. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  17. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przekroje swobodnewypełnianie żelatynąniskotemperaturowe odsłanianie antygenówbarwienie immunofluorescencyjnebarwienie faloidynąmikroskopia konfokalnainfekcja pasożytnicza
Zastosowanie przeciwciał anty-fosfo-girdyny do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jejunum myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.