Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57482

⸱

5 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje mięsień levator auris longus (LAL) myszy do rejestrowania spontanicznych i wywołanych przez nerwy potencjałów postsynaptycznych (zacisk prądowy) i prądów (zacisk napięcia) w złączu nerwowo-mięśniowym. Zastosowanie tej techniki może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów transmisji synaptycznej w warunkach normalnych i chorobowych.

Streszczenie

Ten protokół opisuje technikę rejestrowania transmisji synaptycznej z połączenia nerwowo-mięśniowego w warunkach zacisku prądowego i napięcia zaciskowego. Stosuje się preparat ex vivo dźwigacza długiego ulga długiego (LAL), ponieważ jest to cienki mięsień, który zapewnia łatwą wizualizację połączenia nerwowo-mięśniowego w celu przebicia mikroelektrod na płytce końcowej silnika. Metoda ta pozwala na rejestrację spontanicznych miniaturowych potencjałów i prądów płytki końcowej (mEPP i mEPC), potencjałów i prądów płytki końcowej wywołanych przez nerwy (EPP i EPC), a także właściwości membrany płyty końcowej silnika. Wyniki uzyskane tą metodą obejmują zawartość ilościową (QC), liczbę miejsc uwalniania pęcherzyków (n), prawdopodobieństwo uwolnienia pęcherzyków (prel), ułatwienie synaptyczne i depresję, a także stałą czasową błony mięśniowej (τm) i opór wejściowy. Zastosowanie tej techniki do mysich modeli chorób u ludzi może uwypuklić kluczowe patologie w stanach chorobowych i pomóc w identyfikacji nowych strategii leczenia. Dzięki pełnemu zaciskaniu napięcia pojedynczej synapsy, metoda ta zapewnia jedną z najbardziej szczegółowych analiz transmisji synaptycznej dostępnych obecnie na rynku.

Wprowadzenie

Badanie transmisji synaptycznej w połączeniu nerwowo-mięśniowym dostarcza wglądu w dynamiczną relację między układem nerwowym i mięśniowym i jest doskonałym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Dźwigacz auris longus (LAL) jest cienkim mięśniem, co pozwala na łatwą wizualizację połączeń nerwowo-mięśniowych. Poprzednie raporty opisywały wygodę korzystania z LAL do badania leków synaptycznych i toksyn oraz charakteryzowały charakterystykę typu włókien mięśni szkieletowych w LAL1,2. W licznych badaniach wykorzystano LAL do zbadania fizjologii nerwowo-mięśniowej3,4,5,6,7,8. W elektrofizjologii możliwość łatwej obserwacji połączeń nerwowo-mięśniowych LAL pozwala na dokładne umieszczenie mikroelektrod na płytce końcowej silnika i znacznie zmniejsza problemy z zaciskiem przestrzennym podczas nagrywania transmisji synaptycznej. Łatwo uzyskuje się zapisy cęgów prądowych właściwości błony mięśniowej, takie jak stała czasowa membrany (τm) i rezystancja wejściowa (Rin). Co więcej, właściwości te można mierzyć na podstawie tych samych włókien mięśniowych, które są używane do rejestrowania przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego, co pozwala na bezpośrednie porównanie funkcji synaptycznych z właściwościami błony mięśniowej. Analiza tych danych może dostarczyć kluczowych informacji na temat fizycznych mechanizmów wielu chorób nerwowo-mięśniowych i stanów zmienionej aktywności.

Kluczowym aspektem opisanej tutaj techniki jest użycie zacisku napięcia do nagrań synaptycznych, które nie podlegają nieliniowości spotykanej w zaciskach prądowych i są niezależne od właściwości błony mięśniowej. Zalety używania cęgów napięciowych w przeciwieństwie do cęgów prądowych do badania przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego zostały ustalone przez pionierskie wysiłki w latach 19509. Pod cęgami prądowymi EPP, które przekraczają 10-15 mV amplitudy, nie są liniowym iloczynem amplitudy mEPP amplitude9. Na przykład, jeżeli średnia wartość mEPP wynosi 1 mV, można założyć, że EPP wynoszące 5 mV jest iloczynem 5 mEPP (QC wynoszącej 5); podczas gdy EPP 40 mV będzie iloczynem ponad 40 mEPP. Ta nieliniowość przy większych EPP występuje, ponieważ siła napędowa EPP, która jest różnicą między potencjałem błonowym a potencjałem równowagowym dla receptora acetylocholiny (~-10 mV), znacznie zmniejsza się podczas dużych EPP. Tego problemu unika się w eksperymentach z zaciskami napięciowymi, ponieważ potencjał błony mięśniowej nie zmienia się podczas eksperymentów z zaciskami napięciowymi. Wadą jest to, że eksperymenty z cęgami napięciowymi są technicznie trudniejsze do wykonania niż nagrywanie z cęgami prądowymi. Mając to na uwadze, McLachlan i Martin opracowali prostą poprawkę matematyczną, która uwzględnia nieliniowość w nagraniach cęgowych EPPs10. Poprawki działają dobrze11,12,13, ale co ważne, zakładaj, że właściwości błony mięśniowej nie zostały naruszone.

Właściwości błony mięśniowej są szczególnie ważne do rozważenia podczas badania stanów chorobowych lub stanów chorobowych, które zakłócają pracę mięśnia. Na przykład mięśnie szkieletowe z transgenicznego modelu choroby Huntingtona R6/2 są nadpobudliwe z powodu postępującego zmniejszania się spoczynkowych prądów chlorkowych i potasowych14,15. W konsekwencji mEPP i EPP są amplifikowane w mięśniach szkieletowych R6/2. Z pewnością dodatkowe czynniki mogą zmienić mEPP i EPP. Praca z innym modelem myszy z chorobą Huntingtona (R6/1) wykazała zmiany w EPP, które wydawały się być związane z SNARE-proteins8. Aby ocenić mechanizmy powodujące zmienione przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe, korzystne byłoby wyeliminowanie skutków zmienionych właściwości błony mięśniowej za pomocą zacisku napięciowego. W niedawnym badaniu przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe R6/2 badano zarówno w warunkach cęgów prądowych, jak i napięciowych przy użyciu techniki opisanej w niniejszym dokumencie. Wszystkie płyty końcowe silnika zostały zaciśnięte napięciem z błędem mniejszym niż 1% poprzez umieszczenie dwóch mikroelektrod w stałej długości płyty końcowej16. Wykazano, że zapisy cęgów napięciowych i skorygowanych cęgów prądowych dały kontrastujące pomiary przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego w mięśniu R6/2. Podkreśla to, że skorygowanie EPP pod kątem nieliniowości może być trudne, jeśli właściwości błony mięśniowej zostały zmienione, i pokazuje korzyści płynące z uzyskania zapisów napięciowych, które są niezależne od właściwości błony mięśniowej. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół jest idealny do badania stanów lub stanów chorobowych, które wpływają na przekaźnictwo synaptyczne i właściwości błony postsynaptycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Stanowego Wright.

1. Eutanazja myszy

  1. W dygestorium umieść mysz w hermetycznej szklanej komorze znieczulającej.
  2. Wystaw mysz poprzez wdychanie na śmiertelną dawkę izofluranu (nasycającą lub ~25%). Pozostaw mysz w komorze, aż nie będzie można zaobserwować oddechu.
  3. Wyjmij mysz z komory i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną metodę eutanazji.

2. Usuwanie włosów z grzbietowej powierzchni głowy, szyi i pleców

  1. Użyj golarki elektrycznej, aby usunąć większość włosów z grzbietowej powierzchni głowy, szyi i grzbietu myszy. Usuń również włosy wokół i na lewym uchu.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas golenia skóry wokół uszu, ponieważ skóra może zostać złapana przez ostrza golarki i uszkodzić leżącą pod nią tkankę mięśniową.
  2. Nałóż krem do depilacji za pomocą bawełnianego wacika na ogolony obszar, aby usunąć pozostałe włosy. Odczekaj około 1 minuty i spłucz krem do depilacji wodą za pomocą wyciśniętej butelki do mycia, a następnie zetrzyj pozostały krem lub włosy za pomocą bawełnianego wacika i osusz skórę.

3. Usuń skórę, aby odsłonić mięsień dźwigacza długiego aury

  1. Pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie (wystarczająco głębokie, aby przeniknąć przez skórę) na grzbiecie myszy na poziomie łopatek. Przeciąć skórę za pomocą nożyczek do mikropreparacji, postępując zgodnie ze ścieżką pokazaną w Rysunek 1A-B.
  2. Za pomocą cienkich kleszczy (takich jak nr 5) pociągnij skórę wzdłuż nacięcia w pobliżu łopatek. Za pomocą nożyczek sprężynowych przetnij tkankę łączną, aby oddzielić skórę od leżącej pod nią tkanki mięśniowej, zbliżając się do ucha. Co ważne, przetnij tkankę łączną z ostrzami skierowanymi w skórę, aby uniknąć przypadkowego przecięcia odsłoniętej tkanki mięśniowej.
  3. Okresowo perfunduj odsłonięty mięsień fizjologicznym roztworem soli fizjologicznej, takim jak następujący zewnętrzny bufor Na+, który składa się z (w mM): 144 NaCl, 4 KCl, 1,2 CaCl2, 0,6 MgCl2, 5 glukozy, 1 NaH2PO4, pH 7,4 z NaOH i ma osmolalność 300 ± 5 mmol/kg. Po przecięciu tkanki łącznej do lewego ucha przetnij skórę wokół ucha, aby całkowicie usunąć skórę z myszy i wyrzuć ją.
    UWAGA: LAL mocuje się do podstawy ucha i może zostać łatwo uszkodzony podczas usuwania skóry. Dobrze jest pozostawić około 1 mm skóry wokół podstawy ucha, aby uniknąć przecięcia LAL.

4. Usunięcie mięśnia dźwigacza bocznego długiego i otaczającej tkanki

  1. Używając nożyczek sprężynowych, zacznij od przecięcia mięśni niższych od LAL, które łączą się z kręgosłupem między łopatkami. Zacznij od prawej łopatki, tuż po prawej stronie linii środkowej i tnij w kierunku rostralnego końca myszy, pozostając po prawej stronie linii środkowej. Kontynuuj cięcie aż do końca tkanki mięśniowej na czaszce.
    UWAGA: LAL jest najbardziej powierzchownym mięśniem połączonym z przyśrodkową stroną ucha i linią środkową, jak pokazano na Rysunek 2. Aby uzyskać dodatkowe zdjęcia, książka autorstwa E.C. Greene17 pokazuje doskonałe, ręcznie rysowane obrazy LAL.
  2. Użyj kleszczy, aby chwycić przeciętą tkankę bezpośrednio po prawej stronie linii środkowej, a następnie delikatnie podnieś i zacznij ciąć tkankę w kierunku lewego ucha ostrzami nożyczek przyciśniętymi do czaszki, aby usunąć kilka warstw mięśni, które są niższe od lewego LAL. Pozostaw wszystkie warstwy przymocowane tymczasowo, aby uniknąć przypadkowego przecięcia LAL podczas usuwania.
  3. Ciąć ostrzami równolegle do czaszki i dociskać do niej, aby uniknąć przecięcia nerwu unerwiającego LAL, który owija się wokół kanału słuchowego i wchodzi do mięśni po przyśrodkowej stronie ucha. Kontynuuj przecinanie kanału słuchowego, utrzymując jak największą część nerwu przyczepionego.
    UWAGA: Nerw zaopatrujący LAL rozgałęzia się od nerwu twarzowego i powinien zostać zachowany, ponieważ zostanie wykorzystany w dalszej części zabiegu.
  4. Przetnij tkankę tłuszczową, która znajduje się tuż za kanałem słuchowym, wzdłuż tej samej ścieżki, którą pokazano na Rysunek 1B na brzuszno-bocznej części ucha. Przetnij również wzdłuż lewej łopatki, tak jak to zostało zrobione po prawej stronie, aby całkowicie usunąć mięsień z myszy.

5. Izolacja mięśni dźwigacza aury długiej

  1. Umieść LAL i otaczającą tkankę w pojemniku. Użyj pojemnika, w którym wypreparowaną tkankę można przypiąć do dna, takiego jak szalka Petriego z dnem z elastomeru silikonowego. Kąp się i często myj tkankę w roztworze soli fizjologicznej.
  2. Odetnij małżowinę uszną ucha wzdłuż podstawy ucha, pozostawiając chrzęstną część ucha przyczepioną do LAL. Odwróć mięsień tak, aby dolna strona była skierowana do góry (LAL na dnie naczynia).
  3. Umieść szpilkę, taką jak szpilka przeciw owadom, przez przewód słuchowy, aby utrzymać preparat na miejscu. Następnie za pomocą mniejszych szpilek przypnij pozostałą tkankę po przeciwnej stronie linii środkowej LAL. Za pomocą kleszczy delikatnie pociągnij skórę po bocznej części ucha, aby rozciągnąć mięsień i umieść małą szpilkę przez skórę. Powtarzaj ten krok, aż tkanka zostanie dobrze przymocowana do naczynia, jak pokazano na Rysunek 3.
    UWAGA: Małe szpilki preparacyjne można wykonać, przycinając końcówki igieł do akupunktury na żądaną długość. Te małe szpilki minimalizują uszkodzenia tkanki i mogą być używane z obiektywami mikroskopowymi zanurzonymi w wodzie o dużych odległościach roboczych.
  4. Rozpocznij usuwanie mięśni (pokazanych na Ryc. 4), które pokrywają LAL (auricularis superior, abductor auris longus i interscutularis) oraz te związane z LAL poprzez tkankę łączną i są szczególnie napięte w pobliżu linii środkowej, używając kleszczy nr 5 i nożyczek sprężynowych.
  5. Używając kleszczy do podciągnięcia na leżącej warstwie mięśniowej, przetnij tkankę łączną ostrzami skierowanymi w stronę ciągniętej warstwy mięśniowej i uważaj, aby nie przeciąć ani nie naciąć LAL. Cięcie w kierunku linii środkowej i przestań ciąć około trzech czwartych drogi do linii środkowej. Następnie przetnij równolegle do linii środkowej, aby usunąć każdą warstwę mięśni. Kontynuuj usuwanie warstw mięśniowych, aż pozostanie tylko LAL.
  6. Usuń część pozostałej tkanki łącznej, która pokrywa LAL, co pomaga w przebijaniu elektrod. Delikatnie użyj kleszczyków nr 5, aby odciągnąć tkankę łączną od LAL i odciąć ją za pomocą nożyczek sprężynowych. Usuwaj tylko te tkanki, które można tak łatwo zrobić bez ryzyka uszkodzenia LAL w tym procesie. Usuń wszelkie duże nerwy, które unerwiają dolne warstwy mięśni pozostające na dolnej powierzchni LAL, które mogą utrudniać wizualizację połączeń nerwowo-mięśniowych.

6. Izolacja nerwu

  1. Zidentyfikuj nerw, który unerwia LAL za pomocą stymulatora nerwów (na przykład dwóch platynowych przewodów połączonych z generatorem impulsów); od kanału słuchowego do mięśni będzie kilka nerwów. Dotknij nerwów stymulatorem nerwów dostarczającym trochę prądu (prąd będzie się wahał około 5 V). Kiedy mięsień się kurczy, zidentyfikowano właściwy nerw.
  2. Ostrożnie chwyć tkankę w pobliżu nerwu i użyj nożyczek sprężynowych, aby oddzielić nerw od tkanki otaczającej ucho. Aby zminimalizować uszkodzenia, utrzymuj większość nerwu osadzonego w otaczającej tkance, która zostanie później wykorzystana do przymocowania nerwu do naczynia nagrywającego.
    UWAGA: Nerw ruchowy, który unerwia LAL, znajduje się po przyśrodkowej stronie otworu przewodu słuchowego.
  3. Jeśli używasz bipolarnej elektrody stymulującej, usuń otaczającą tkankę tylko wokół obszaru nerwu, dystalnie od mięśnia. Jeśli używasz elektrody ssącej, usuń otaczającą tkankę na przeciętym końcu nerwu.
    UWAGA: To dobry punkt zatrzymania. To dobry punkt zaczepienia. Jeśli potrzebna jest przerwa, wypreparowany preparat LAL można utrzymać w roztworze fizjologicznym lub stałej perfuzji przez kilka godzin, aby zapewnić, że szkodliwe metabolity nie gromadzą się. Używaj dużej objętości roztworu lub stałej perfuzji, aby upewnić się, że szkodliwe metabolity nie gromadzą się.
  4. Następnie odpiąć i przenieść mięsień do komory perfuzyjnej w celu przeprowadzenia eksperymentów elektrofizjologicznych pod pionowym mikroskopem złożonym.
    UWAGA: Użyj komory perfuzyjnej z miękkim dnem, do której można bezpiecznie przypiąć tkankę (Rysunek 5A).
  5. Przypnij mięsień na końcach (ucho i linia środkowa) oraz wzdłuż krawędzi mięśnia. Ustaw nerw prostopadle do włókien mięśniowych i przypnij go do dna naczynia przez nadmiar tkanki, która pozostała nienaruszona na końcu nerwu. Przez cały czas utrzymuj tkankę skąpaną w roztworze soli fizjologicznej.
    UWAGA: Pomocne jest również posiadanie zaokrąglonego, wyniesionego materiału bezpośrednio pod włóknami mięśniowymi LAL. To dodatkowe podparcie pomaga w przebijaniu elektrody i może być wykonane z niewielkiego odcinka elastomeru silikonowego odlanego w stożkowej rurce o pojemności 50 ml leżącej na boku. Zaokrąglony przekrój elastomeru można przymocować do dna komory perfuzyjnej za pomocą niewielkiej ilości świeżego silikonu. Schemat komory perfuzyjnej jest pokazany w Rysunek 5B-C. Włókna mięśniowe mogą bardzo ściśle przylegać do nowo odlanego elastomeru silikonowego (który jest bardzo hydrofobowy) i mogą ulec uszkodzeniu. Pomocne jest powlekanie lub blokowanie nowo odlanego silikonu białkiem, podobnie jak w przypadku etapu blokowania w immunoblocie. Aby go zablokować, inkubowaliśmy nowo odlany silikon w stężonym roztworze albuminy surowicy bydlęcej przez noc.

7. Konfiguracja sprzętu do elektrofizjologii

  1. Przygotuj lub rozmroź porcje barwnika, aby pomóc w wizualizacji połączenia nerwowo-mięśniowego, takiego jak barwnik mitochondrialny 4-(4-dietyloaminostyryl)-1-metylopirydyn18, który jest wrażliwy na światło i powinien być przechowywany z dala od światła. Rozmrażaj również roztwory elektrod. Zwirować wszystkie podwielokrotności, aby upewnić się, że wszystkie substancje rozpuszczone są w roztworze. Przygotować roztwór soli fizjologicznej zawierający 1 μM μ-konotoksynę GIIIB (μ-CTX) i 80 μM BTS (opcjonalnie).
  2. Przymocuj komorę perfuzyjną za pomocą LAL do stolika mikroskopu. Umieścić elektrodę odniesienia w kubku wypełnionym 3 M KCl, który jest połączony z komorą rejestracyjną za pomocą mostka agarowego. Podłącz elektrodę odniesienia do amplifier zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. W tym momencie umieść elektrodę stymulującą nerwy na nerwie. Użyj elektrody ssącej lub małej elektrody bipolarnej, ponieważ dobrze sprawdzają się one w stymulacji nerwów.
    1. Umieść elektrodę stymulującą jak najdalej od mięśnia, aby zminimalizować liczbę artefaktów stymulacji w nagraniach.
      UWAGA: Elektroda stymulująca powinna być kontrolowana za pomocą jednostki izolującej bodziec, która może kontrolować amplitudę napięcia w razie potrzeby.
  4. Powoli zwiększaj napięcie, obracając voltage pokrętło na jednostce izolacji bodźca, aż do zaobserwowania skurczów. Punkt, w którym po raz pierwszy zaobserwowano skurcz, jest progiem. Po zidentyfikowaniu progu ustaw napięcie na jednostce izolacji bodźca na próg 1.5* (lub zdefiniowany w eksperymencie).
    UWAGA: Rysunek 6 pokazuje przygotowanie mięśni ustawione pod pionowym mikroskopem i małą dwubiegunową elektrodę umieszczoną na nerwie za pomocą manipulatora przegubu kulowego. Korzystne jest, aby mieć najniższe możliwe napięcie stymulacji, a jednocześnie być wystarczająco powyżej progu. Niższe napięcie bodźca zmniejsza liczbę artefaktów stymulacji podczas nagrań. Ponadto umieszczenie elektrody stymulującej z dala od mięśnia zmniejszy rozmiar artefaktu stymulacji. Czasami koniec nerwu zostanie uszkodzony w wyniku rozwarstwienia, więc może być konieczne eksperymentowanie z tym, gdzie wzdłuż nerwu należy umieścić stymulator.
  5. Usunąć roztwór soli fizjologicznej do kąpieli i zastąpić go roztworem 5 μM 4-Di-2-Asp. Wystaw preparat LAL na działanie 4-Di-2-Asp przez 10 minut, aby uzyskać odpowiednią fluorescencję do wizualizacji połączenia nerwowo-mięśniowego (Rysunek 7).
  6. Przygotować dwa roztwory elektrod, 3 M KCl i roztwór wewnętrzny K+ składający się z (w mM) 75 asparaginianu, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP disodu, 5 disodu fosfokreatyny, 5 glutationu, 20 MOPS, 30 EGTA, pH 7,2 z KOH.
    UWAGA: Roztwory należy przygotować z wyprzedzeniem; roztwór wewnętrzny K+ może być przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
  7. Napełnij wyciągniętą szklaną kapilę elektrody wykrywającej napięcie 3 M KCl. Użyj wewnętrznego roztworu K+ (przygotowanego w kroku 7.6) dla elektrody przepuszczającej prąd; użyj wąskiej niemetalowej igły (o rozmiarze ~34) przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml, aby łatwo napełnić szklane naczynia włosowate. Delikatnie postukaj w naczynia włosowate, aby usunąć pęcherzyki powietrza; upewnij się, że każda wypełniona elektroda ma rezystancję 10-15 MΩ,
    UWAGA: Sprawdź i zanotuj rezystancję obu elektrod za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.
  8. Po 10 minutach należy wymienić roztwór 4-Di-Asp na normalny roztwór Ca2+.

8. Identyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą fluorescencji

  1. Używając pionowego mikroskopu ze standardowym jasnym polem i oświetleniem fluorescencyjnym, poszukaj jasnego pasma fluorescencyjnych zielonych połączeń nerwowo-mięśniowych biegnących prostopadle do włókien mięśniowych wzdłuż preparacji, jak pokazano na Rysunek 7A. Użyj obiektywu zanurzeniowego w wodzie o małym powiększeniu (~10X), aby zidentyfikować połączenia nerwowo-mięśniowe
    UWAGA: Mikroskop powinien być wyposażony w kostkę FITC (np. 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50) oraz diodę LED, laser, lampę halogenową lub lampę rtęciową do fluorescencji. Aby zminimalizować wybielanie zdjęć, przełączaj się między oświetleniem jasnego pola a oświetleniem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Ta opaska jest zwykle bardziej proksymalna do podstawy ucha niż do linii środkowej. Pasma to obszar, w którym połączenia nerwowo-mięśniowe są najbardziej skoncentrowane.
  2. Przełącz się na obiektyw zanurzony w wodzie o większym powiększeniu (~40X) i zidentyfikuj połączenie nerwowo-mięśniowe na górnej warstwie mięśni, aby zbadać je za pomocą elektrofizjologii (Rysunek 7B).
  3. Zamocuj napełnione pipety w uchwytach na pipety na odpowiednich głowicach, zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj mikromanipulatorów, aby umieścić elektrody nad błoną mięśniową w odległości 100 μm od zidentyfikowanego połączenia nerwowo-mięśniowego (Rysunek 7C). Ustawić elektrody, używając głównie mikroskopii w jasnym polu; Użyj fluorescencji, aby potwierdzić położenie elektrod względem połączenia nerwowo-mięśniowego.
  4. Najpierw użyj obiektywu o małym powiększeniu (~10X), aby zlokalizować elektrody, a następnie przełącz się na obiektyw o wyższym powiększeniu (~40X), aby ostatecznie ustawić elektrody. Nie wbijaj elektrod w mięsień w tym momencie, najpierw dostrój elektrody.

9. Strojenie i przebijanie elektrod

  1. Gdy elektrody zostaną umieszczone nad żądanym włóknem, wyzeruj i dostrój elektrodę wykrywającą napięcie, równoważąc mostek (lub analogiczne podejście) i neutralizując pojemność elektrody zgodnie z instrukcjami producenta. Wyzeruj również elektrodę przepuszczającą prąd.
  2. Przyłóż obie elektrody do powierzchni włókna. Powoli wyreguluj położenie elektrod w drodze w dół do włókna, tak aby elektrody pozostały zorientowane w stosunku do połączenia nerwowo-mięśniowego, jak opisano w krokach 8.3 i 8.4.
  3. Po tym, jak obie elektrody zetkną się z powierzchnią włókna mięśniowego, najpierw przebij elektrodę przepuszczającą prąd. Użyj technik takich jak brzęczenie (krótkie impulsy kompensacji nadmiernej pojemności), krótkie impulsy prądu lub delikatne stukanie w stół, aby ułatwić nabijanie elektrody.
    1. Monitoruj sygnał za pomocą protokołu oscyloskopu lub oscyloskopu w oprogramowaniu do akwizycji danych, aż zostanie zidentyfikowany ujemny potencjał błony, co wskazuje, że elektroda została przebita.
  4. Wciśnij ostrzejszą elektrodę wykrywającą napięcie na mięsień do poziomu przebitej elektrody przepuszczającej prąd. Gdy obie elektrody znajdą się w jednej linii ze sobą, wbij elektrodę wykrywającą napięcie, stosując te same techniki, które zastosowano w przypadku elektrody przepuszczającej prąd.
  5. Po pomyślnym wbiciu na pal, za pomocą sterownika wzmacniacza, zastosuj stały ujemny prąd podtrzymujący z prądem przepływającym elektrodą, aby skompensować wszelkie uszkodzenia membrany spowodowane przebiciem elektrody. Gdy ogniwo zacznie powoli ładować się w kierunku -80 mV, zwiększ prąd podtrzymania w razie potrzeby, aby doprowadzić ogniwo do pożądanego potencjału spoczynkowego (tj. -80 do -85 mV).
    UWAGA: Unikaj nagrywania z włókien, które wymagają prądu podtrzymania większego w wartości bezwzględnej niż -25 nA w mięśniach typu dzikiego, aby zminimalizować ryzyko nagrywania z niezdrowych włókien.
  6. Gdy włókno ustabilizuje się przez kilka minut przy pożądanym potencjale spoczynkowym, przystąp do rejestrowania właściwości błony mięśniowej lub przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego.

10. Rejestrowanie właściwości błony postsynaptycznej i transmisji synaptycznej

  1. Rozpocznij od zapisów cęgów prądowych, stosując równą liczbę dodatnich i ujemnych kroków prądu w celu zmierzenia odpowiednich odpowiedzi napięciowych membrany, które zostaną wykorzystane do wyznaczenia płyty końcowej silnika Rin i τm. Aby zapewnić właściwości pasywne, należy używać małych odpowiedzi napięciowych, które osiągają stan ustalony i mają liniową zależność napięcie-prąd16,19,20. Unikaj nagrywania z włókien z uszkodzonym lub niezdrowym nerwem, takie włókna mają częstotliwość mEPP >3 Hz.
  2. Następnie wprowadź dwuelektrodowe cęgi napięciowe zgodnie z instrukcjami producenta. Włókna zaciskowe napięciowe o potencjale membranowym -85 mV. Ustawienia napięcia cęgowego powinny osiągać stosunek sygnału do szumu, który pozwoli na wykrycie mEPCs.
    UWAGA: Utrzymanie odpowiedniej objętościtage kontrola może być problemem. Używamy dwóch metod, aby zminimalizować te problemy. Po pierwsze, włókna są wbijane w promieniu 100 μm od płyty końcowej silnika, jak opisano wcześniej, co mieści się w stałej długości tych włókien21. Po drugie, korzystamy z funkcji przywracania prądu stałego wzmacniacza. Ta funkcja ustawia bardzo wysokie wzmocnienie cęgów napięcia. W naszej poprzedniej pracy szczegółowo opisaliśmy tę metodę i nakreśliliśmy metodę oceny płyty końcowej z zaciskiem napięciowym16.
  3. Po umieszczeniu w cęgach napięciowych rejestruj prądy synaptyczne (mEPC i eEPC) przy użyciu różnych protokołów stymulacji nerwów, w oparciu o wymagania eksperymentu.
    1. Rejestruj spontaniczne mEPC i EPC za pomocą protokołu stymulacji nerwów o niskiej częstotliwości (≤0,5 Hz), który umożliwia rejestrowanie EPC bez modulacji synaptycznej (ułatwienia lub modulacji) w celu oceny zawartości ilościowej. Aby ocenić ułatwienie synaptyczne lub depresję, użyj protokołu stymulacji nerwów o wysokiej częstotliwości (10 impulsów przy 50 Hz).
    2. Stymuluj nerw z żądaną częstotliwością za pomocą jednostki izolującej bodźce, która może być wyzwalana za pomocą generatora impulsów, który jest sterowany za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.
  4. Po zakończeniu nagrań cęgów napięciowych przywróć amplifier do ustawienia cęgów prądowych, wyłącz wszystkie prądy i wyjmij elektrody ze światłowodu. Sprawdź, czy elektrody nie zostały zatkane lub nie dryfowały w linii podstawowejtage podczas nagrywania.
    UWAGA: Jeśli chodzi o dryft, napięcie elektrody powinno wynosić 0 woltów w roztworze zewnątrzkomórkowym, ponieważ zostały ustawione przed nabiciem włókien. Na przykład zarejestrowane napięcia byłyby niepewne, gdyby napięcie dryfowało podczas eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 8 przedstawia przykład impulsów prądowych (Rysunek 8A) oraz odpowiedzi napięciowych (Rysunek 8B) z jednego włókna LAL w trybie clampy prądowej (current-clamp) pobranych od 12-tygodniowej myszy szczepu dzikiego R6/2. Obecność mEPP wskazuje, że rejestracje te zostały wykonane z płytki motorycznej. Pomiary przeprowadzono w normalnym fizjologicznym roztworze soli. Te zapisy w trybie clampy prądow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano tutaj przygotowanie i zastosowanie mięśnia LAL myszy do pomiaru przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego w warunkach cęgów prądowych lub napięciowych. Istnieje kilka ważnych punktów, które należy wziąć pod uwagę przy analizowaniu LAL. Oczyszczanie nadmiaru tkanki łącznej z mięśni pomaga w przebijaniu elektrod, ponieważ elektrody mogą zaczepić tkankę łączną podczas ustawiania ich do nabicia. Jednak usuwaj tylko tkankę łączną, którą można łatwo usunąć, aby ograniczyć ryzyko uszkodzenia mięśnia. Izolacja nerwu powinna być ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Markowi M. Richowi i Danielowi Mirandzie za komentarze redakcyjne, Ahmadowi Khedraki za pomoc w ustanowieniu tej techniki, oraz Wright State University za wsparcie finansowe (fundusz startowy dla A.A.V.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop złożony OlympusOlympusBX51WI
10x ObiektywOlympusUMPLFLN10XW
40xOlympusLUMPLFLN40XW
Sutterze szkła borokrzemianowegoBF150-86-7.5
Kamera CCD SantaBarbara Instruments GroupST-7XMEI
Mater-9 Pulse GeneratorAMPI
Iso-flex Izolator bodźcówAMPI
pCLAMP 10 Oprogramowanie do akwizycji i analizy danychUrządzenia molekularne1-2500-0180
Koncentryczna elektroda bipolarnaFHCCBDSH75
Manipulator kulowyNarishige 
Niemetalowe strzykawki 34 GaugeWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Nikon StereomikroskopNikonSMZ800N
nr 5 KleszczeNarzędzia
Narzędzia sprężynoweNarzędzia do nauki15006-09
Kleszcze nr 2RobozRS-5Q41
Mikropreparacja NożyczkiRobozRS-5912SC
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning2404019862
Krem do depilacjiNair
Grass SD9 Stymulatortrawy Model medyczny
P-1000 Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-1000
Axon Digidata 1550 Niskoszumowy system pomiaru danychmolekularne
Dolnoprzepustowy filtr Besselella WarnerInstrument Corp.LPF-8
Mikromanipulator leworęcznySiskiyou Corp.MX1641/45DL
Mikromanipulator praworęcznySiskiyou Corp.MX1641/45DR
Pojedynczy kontroler ruchuSiskiyou Corp.MC100e
Mikromanipulator z krzyżowymi rolkamiSiskiyou Corp.MX1641RZostało to dodane do osi Z mikromanipulatorów leworęcznych i praworęcznych, aby umożliwić zmotoryzowanie osi z. Ta niestandardowa konfiguracja jest tańsza i mniej nieporęczna niż zakup 4-osiowego mikromanipulatora z napędem silnikowym. Pozwala nam to również na sterowanie oboma mikromanipulatorami za pomocą jednego kontrolera
Wszystkie chemikalia zostały zamówione od Fishera,
BTSToronto Research ChemicalsB315190
CTXAlomone LabsC-270
4-Di-2-AspSondymolekularne nie są już firmą. Teraz zamówione przez Fisher
Instrumenty do nauki precyzyjnej Urządzenia z wyjątkiem

Bibliografia

  1. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
  2. Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
  3. Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
  4. Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
  5. Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
  6. Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67(2016).
  7. Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).
  8. Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
  9. Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
  10. McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
  11. Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80(2015).
  12. Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
  13. Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
  14. Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
  15. Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
  16. Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
  17. Greene, E. C. The anatomy of the rat. , Hafner Pub. (1955).
  18. Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
  19. Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. Electric current flow in excitable cells. , Clarendon Press. (1983).
  20. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
  21. Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
  22. Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).
  23. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
  24. Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

z cze nerwowo mi niowerejestracja elektrofizjologicznaimpalacja mikroelektrodminiaturowe potencja y p ytki ko cowejstymulacja nerwuprzeka nictwo synaptycznepobudliwo mi nifizjologiczny roztw r soli
Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.