Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

DOI:

10.3791/57486

⸱

16 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cykl życia Leishmania, czynnika wywołującego leiszmaniozę, przebiega naprzemiennie między stadiami promastygoty i amastigoty odpowiednio u gospodarzy owadów i kręgowców. Podczas gdy objawy chorobotwórcze leiszmaniozy mogą się znacznie różnić, od łagodnych zmian skórnych po wysoce śmiertelne formy choroby trzewnej w zależności od gatunku zakaźnego, wszystkie gatunki Leishmania przebywają w makrofagach gospodarza na etapie ich cyklu życiowego u kręgowców. Zakaźność Leishmania jest zatem bezpośrednio związana z jej zdolnością do inwazji, przetrwania i replikacji w wakuolach parazytoforycznych (PV) wewnątrz makrofagów. W związku z tym ocena zdolności pasożyta do replikacji wewnątrzkomórkowej służy jako niezawodna metoda określania zjadliwości. Badanie rozwoju leiszmaniozy przy użyciu modeli zwierzęcych jest czasochłonne, żmudne i często trudne, szczególnie w przypadku patogennie ważnych form trzewnych. Opisujemy tutaj metodologię śledzenia wewnątrzkomórkowego rozwoju Leishmania w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Liczbę pasożytów wewnątrzkomórkowych określa się w odstępach 24 godzin przez 72 - 96 godzin po zakażeniu. Metoda ta pozwala na wiarygodne określenie wpływu różnych czynników genetycznych na zjadliwość Leishmania. Jako przykład pokazujemy, w jaki sposób delecja pojedynczego allelu genu mitochondrialnego transportera żelaza Leishmania (LMIT1) upośledza zdolność zmutowanego szczepu Leishmania amazonensis LMIT1 / ΔLmit1 do wzrostu wewnątrz BMM, odzwierciedlając drastyczne zmniejszenie zjadliwości w porównaniu z typem dzikim. Test ten pozwala również na precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych, którymi można indywidualnie manipulować w celu analizy wpływu różnych czynników (składników odżywczych, reaktywnych form tlenu itp.) na interakcję gospodarz-patogen. W związku z tym odpowiednie wykonanie i kwantyfikacja badań nad zakażeniem BMM stanowi nieinwazyjną, szybką, ekonomiczną, bezpieczną i niezawodną alternatywę dla konwencjonalnych badań na modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis odnosi się do szerokiego spektrum chorób ludzkich wywoływanych przez gatunki pasożytów pierwotniaków z rodzaju Leishmania. Około 12 milionów ludzi na całym świecie jest obecnie zarażonych Leishmanią, a ponad 350 milionów jest zagrożonych. Patologia choroby zależy od gatunku Leishmania i czynników gospodarza, a objawy wahają się od nieszkodliwych, samoleczących się zmian skórnych po śmiertelne formy trzewne. Nieleczona leiszmanioza trzewna jest śmiertelna, plasując się tylko po malarii jako najbardziej śmiertelna choroba człowieka spowodowana zakażeniem pasożytem pierwotniaka1. Pomimo szerokich różnic w patologii i objawach choroby, wszystkie gatunki Leishmania mają digeniczny cykl życiowy naprzemiennie w stadiach promastygoty i amastigoty odpowiednio u gospodarzy owadów i kręgowców. Wewnątrz kręgowców Leishmania atakuje makrofagi gospodarza do inwazji i indukuje tworzenie parazytoforycznych wakuoli (PV), kwaśnych przedziałów o właściwościach fagolizosomów, w których replikują się wysoce zjadliwe formy amastigotów. Amastigoty utrzymują się w tkankach gospodarza podczas przewlekłych infekcji i mogą być przekazywane niezakażonym muchom piaskowym, kończąc cykl transmisji. Dlatego też, w kontekście rozwoju chorób u ludzi, amastigoty są najważniejszą formą cyklu życiowego Leishmania2. Zbadanie, w jaki sposób amastigoty replikują się wewnątrz fotowoltaików makrofagów<, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zjadliwości Leishmania class=sup class="xref">3,4,5,6,7 oraz dla opracowania nowych skutecznych terapii.

Opisujemy tutaj metodę regularnie używaną przez nasze laboratorium do badania infekcji Leishmania i replikacji w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM), która polega na ilościowej ocenie liczby wewnątrzkomórkowych Leishmania w czasie. Proces ten obejmuje pobieranie monocytów ze szpiku kostnego myszy i różnicowanie do makrofagów w hodowli, zakażenie in vitro formami infekcyjnymi (metacykliczne promastigoty lub amastigoty) Leishmania oraz oznaczanie ilościowe liczby pasożytów wewnątrzkomórkowych w odstępie co 24 godziny przez okres 72 - 96 godzin po zakażeniu. Test ten został wykorzystany w naszym laboratorium do określenia wpływu kilku czynników środowiskowych i genów pasożytów, w tym identyfikacji krytycznej roli żelaza w promowaniu zjadliwości L. amazonensis, która została następnie potwierdzona w badaniach rozwoju uszkodzeń opuszków stóp u myszy6,8,9,10,11,12,13,14,15. Ponieważ wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania tworzą swoją niszę replikacyjną wewnątrz makrofagów gospodarza, test ten może być powszechnie stosowany do oznaczania wirulencji u wszystkich gatunków Leishmania.

Przeprowadzanie infekcji BMM pozwala na analizę interakcji gospodarz-pasożyt na poziomie pojedynczej komórki, a tym samym na dokładniejsze zrozumienie, w jaki sposób pasożyty Leishmania oddziałują z preferowanym mikrośrodowiskiem gospodarza, PV makrofagów. Testy infekcji makrofagami są z powodzeniem stosowane przez wiele grup16,17,18,19,20,21,22 w celu zbadania funkcji zarówno makrofagów gospodarza, jak i Leishmanii specyficzne geny i ich potencjalny udział w złożonej wzajemnej zależności, która charakteryzuje infekcję wewnątrzkomórkową. Infekcje BMM pozwalają na ilościowe określenie wzrostu pasożyta jako odczyt wpływu czynników gospodarza, które wpływają na przeżycie wewnątrzkomórkowe, takich jak mikrobójcza produkcja tlenku azotu, wytwarzanie reaktywnych form tlenu i inne niekorzystne warunki występujące wewnątrz lizosomopodobnych PVs23. Testy infekcji makrofagami zostały również wykorzystane do identyfikacji potencjalnych potencjalnych leków przeciwleiszmanialnych do opracowania terapeutycznego13,24.

Natura in vitro zakażeń BMM zapewnia kilka zalet w porównaniu z innymi metodami oceny zjadliwości Leishmania. Jednak kilka wcześniejszych badań badających mechanizmy przetrwania pasożyta wewnątrzkomórkowego w czasie nie określiło ilościowo infekcji jako wskaźnika20,21,24. Co więcej, wiele badań skupiających się na śledzeniu zakażeń in vivo w czasie robiło to poprzez pomiar wielkości zmiany skórnej i innych objawów fizjologicznych, które są tylko pośrednio związane z replikacją pasożyta25,26,27. Zakażenie in vivo jest rygorystycznym podejściem do oceny zjadliwości pasożytów, ale pomiary wielkości zmian na podstawie samego obrzęku opuszki stopy są często niewystarczające, ponieważ odzwierciedlają odpowiedź zapalną w zakażonych tkankach, a nie bezwzględną liczbę pasożytów. Z tego powodu po testach rozwoju zmian w opuszkach stóp musi nastąpić kwantyfikacja obciążenia pasożytami w zakażonych tkankach, procedura, która wymaga długotrwałych testów rozcieńczenia28. Ponadto badania in vivo często polegają na poświęceniu wielu zwierząt w różnych momentach w czasie w celu ekstrakcji interesujących ich tkanek6,8,9,10,11,13. W przeciwieństwie do tego, dużą liczbę BMM można uzyskać od tylko jednego zwierzęcia, a komórki te mogą być posiane w warunkach, które pozwalają na ocenę infekcji w różnych momentach w czasie. Ponadto, w porównaniu z badaniami in vivo, wykonywanie zakażeń BMM in vitro pozwala na większą kontrolę nad warunkami eksperymentalnymi. Ilościowe określenie makrofagów, które mają zostać zakażone, wraz z samymi pasożytami pozwala na precyzyjną kontrolę mnogości infekcji (MOI) i warunków hodowli. Precyzyjna kontrola nad tymi czynnikami może mieć kluczowe znaczenie dla identyfikacji cech dyskretnych szlaków komórkowych i zrozumienia ich wpływu na przebieg infekcji.

Biorąc pod uwagę te zalety, jest nieco zaskakujące, że bardzo niewiele grup badających zjadliwość Leishmania do tej pory w pełni wykorzystało ilościową ocenę wewnątrzkomórkowej replikacji makrofagów. W tym artykule omawiamy typowe pułapki, które mogą utrudniać szersze wykorzystanie tego testu, i przedstawiamy protokół krok po kroku, aby ułatwić jego prawidłowe wdrożenie. Biorąc pod uwagę jego precyzję i wszechstronność, opisywany tutaj test infekcji BMM może być wykorzystany nie tylko do zbadania interakcji gospodarz-patogen wpływających na zjadliwość Leishmania, ale także do badania innych mikroorganizmów, które replikują się wewnątrz makrofagów29. Co ważne, test ten może być również opracowany jako szybka i ekonomiczna przedkliniczna metoda przesiewowa do opracowywania leków przeciwleiszmanialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych przez National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Maryland. Wszystkie czynności opisane w sekcjach od 1 do 4 powinny być wykonywane w sposób aseptyczny w biologicznych komorach laminarnych. Należy stosować środki ochrony osobistej i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z żywymi pasożytami Leishmania na wszystkich etapach eksperymentów.

1. Izolacja i różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM)8,30,31

  1. Dzień 0: Złożenie w ofierze 4 - 6-tygodniowej samicy myszy C57BL/6 lub BALB/c w komorze CO2 i potwierdzenie zgonu w wyniku zwichnięcia szyjki macicy. Zapewnij sterylizację nożyczek i kleszczy, trzymając je namoczone w 70% etanolu. Spryskaj rękawice 70% etanolem, aby umożliwić sterylną obsługę podczas całego procesu izolacji komórek szpiku kostnego.
  2. Przymocuj ofiarowaną mysz do deski preparucyjnej, przypinając jej przednie kończyny i zdezynfekuj, obficie spryskując 70% etanolem.
  3. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) nożyczkami w pobliżu stawu biodrowego. Ostrożnie włóż nożyczki pod skórę, aby oddzielić mięsień leżący pod spodem i przeciąć skórę dookoła stawu biodrowego.
    UWAGA: Deska preparcyjna może być obracana, aby umożliwić lepszy dostęp do stawu biodrowego.
  4. Ostrożnie odizoluj skórę od nogi, pociągając w kierunku kostki i usuń. Odetnij stopę w kostce, bardzo ostrożnie, aby przeciąć na lub poniżej stawu skokowego, aby pozostawić kość piszczelową w pełni nienaruszoną.
    UWAGA: Kość strzałkowa na tym etapie jest luźno przymocowana i można ją łatwo oddzielić za pomocą kleszczy.
  5. Ręcznie zlokalizuj staw biodrowy, manipulując kością udową, aby określić punkt obrotu. Ostrożnie użyj nożyczek, aby odciąć nogę powyżej stawu biodrowego, aby pozostawić nienaruszoną bliższą głowę kości udowej.
  6. Usuń jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej z nogi za pomocą nożyczek. Usuń pozostałą skórę z kostki i nadmiar materiału kostnego powyżej stawu biodrowego.
  7. Umieść oczyszczone kości nóg w sterylnym RPMI uzupełnionym penicyliną/streptomycyną (1% stężenie końcowe) na szalce Petriego na lodzie.
  8. Powtórz kroki od 1.4 do 1.6, aby odizolować kość piszczelową i kość udową od drugiej tylnej nogi.
  9. Usuń wszelkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną z kości moczących się w RPMI za pomocą wysterylizowanych kleszczy i sterylnego ostrza #10.
  10. Umieść kości na pokrywie szalki Petriego. Ostrożnie przetnij kość piszczelową ostrzem bezpośrednio nad stawem skokowym, aby uzyskać dostęp do szpiku. Usuń kość piszczelową z reszty nogi, przecinając ją bezpośrednio pod stawem kolanowym.
  11. Pobrać 10 ml sterylnego RPMI uzupełnionego penicyliną/streptomycyną (1% stężenia końcowego) do strzykawki o pojemności 10 ml i przymocować igłę 25G.
  12. Trzymaj kość piszczelową mocno kleszczami, pionowo nad stożkową rurką o pojemności 50 ml na lodzie. Za pomocą strzykawki delikatnie wstrzyknąć około 5 ml RPMI w koniec kości, aby wypłukać szpik kostny z drugiego końca do stożkowej rurki. Przepłucz szpik kostny łącznie 10 ml RPMI, aż kość stanie się biała.
    UWAGA: Po dokładnym spłukaniu kość powinna zmienić kolor na biały. Jeśli nie, kontynuuj płukanie, aby usunąć szpik. Dystalny koniec kości piszczelowej może wymagać przycięcia ostrza, jeśli jest zbyt wąski, aby wprowadzić igłę.
  13. Przeciąć kość udową bezpośrednio nad stawem kolanowym i bezpośrednio poniżej stawu biodrowego, aby odsłonić oba końce kości w celu uzyskania dostępu do szpiku. Przepłucz szpik kostny z kości udowej łącznie 10 ml RPMI w taki sam sposób jak kość piszczelowa.
  14. Powtórzyć kroki czyszczenia i płukania od 1,6 do 1,13 z pozostałymi kośćmi i zebrać przepłukane komórki szpiku kostnego w pojedynczej stożkowej probówce o pojemności 50 ml
    UWAGA: Jeśli kość pęknie w dowolnym momencie podczas sekcji przed zaczerwienieniem kości, nie używaj szpiku z tej kości.
  15. Odwirować stożkową probówkę używaną do zbierania szpiku kostnego wypłukanego ze wszystkich czterech kości przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 300 x g.
  16. Umieścić 60 ml sterylnej pożywki BMM (RPMI o końcowym stężeniu 20% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1,2 mM Nas-pirogronianu, 25 μg/ml ludzkiego M-CSF) w 175 cm 2 kolbie do hodowli komórkowych z nasadką filtrującą.
  17. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół, używając 5 ml pożywki BMM z kolby.
  18. Przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej i dwukrotnie przepłukać stożkową probówkę pożywką BMM z kolby hodowlanej, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek. Upewnij się, że zawiesina komórek jest dokładnie wymieszana z pożywką i rozprowadzić 30 ml z początkowej kolbydo hodowli komórkowych o długości 175 cm 2 do drugiej kolby do hodowli komórkowych o średnicy 175 cm z nasadką filtrującą.
  19. Inkubować obie kolby zawierające 30 ml zawiesiny komórek każda przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu oddzielenia wszelkich zanieczyszczających fibroblastów, rezydujących makrofagów i innych przylegających komórek.
  20. DZIEŃ 1: Przenieść supernatant zawierający niezróżnicowane komórki szpiku kostnego z kolb na polistyrenowe płytki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm niepoddanych działaniu TC w ilości około 10 ml na szalkę i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wyrzucić kolby.
  21. DZIEŃ 3 lub 4: Dodać dodatkowe 5 ml pożywki BMM (wstępnie podgrzanej do 37 °C) do każdej płytki Petriego i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

2. Poszycie BMM na szkiełkach nakrywkowych na infekcję (DZIEŃ 7 lub 8)

  1. Przygotować 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, umieszczając cztery (4) sterylne szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm (autoklawowane i przechowywane w zamkniętym szklanym pojemniku) na dnie każdej pustej studzienki.
    UWAGA: Podnieś każde sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm za pomocą końcówki zasysającej zamontowanej na przewodzie próżniowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w studzienkach bez zachodzenia na siebie, zwalniając w żądanej pozycji, ściskając rurkę, aby przerwać próżnię.
  2. Odessać pożywkę (i wszelkie nieprzylegające komórki) z szalek Petriego pokrytych przylegającymi makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego i delikatnie przepłukać przylegające komórki 2x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem Dulbecco bez chlorku wapnia i magnezu (PBS -/-) wstępnie podgrzanym do 37 °C.
  3. Dodawać kroplami, 5 ml sterylnego 1x PBS -/- o końcowym stężeniu 1 mM EDTA do każdej szalki Petriego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia przylegających BMM. Sprawdzić, czy komórki są odłączone za pomocą mikroskopu.
  4. Zbierz wszystkie odłączone komórki zawieszone w 1x PBS -/- uzupełnione 1 mM EDTA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Opłucz każde naczynie 2x 5 ml PBS -/- i dodaj do puli zawiesiny komórkowej.
    UWAGA: Zawiesinę komórkową można rozcieńczyć dodatkowym PBS -/- w celu ochrony makrofagów przed toksycznością EDTA podczas procesu pobierania.
  5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić makrofagi w pożywce o objętości 5 - 10 ml BMM przez pipetowanie. Umieść zawieszone komórki na lodzie, aby zapobiec przyczepianiu się do rurek i zbrylaniu.
  6. Policz żywe komórki, korzystając z wykluczenia błękitu trypanowego w hemocytometrze.
    UWAGA: Aby policzyć komórki BMM zawieszone w pożywce o pojemności 5 ml, mieszanina rozcieńczania 25 μl zawiesiny komórek w 445 μl PBS -/- i 30 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego zazwyczaj umożliwia łatwe oznaczanie ilościowe w hemocytometrze (biorąc pod uwagę 20-krotny współczynnik rozcieńczenia dla końcowych obliczeń). Policz tylko komórki, które nie zostały wybarwione błękitem trypanowym (komórki żywotne). Objętość zawiesiny komórek może ulec zmianie, jeśli mieszanina ta jest zbyt stężona lub rozcieńczona. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność BMM na preparat waha się od 2 x 107 do 5 x 107 komórek z jednej myszy.
  7. Przygotować zawiesinę komórek w pożywce BMM o pożądanym stężeniu galwanicznym (5 x 105/ml) i zdyspergować zawiesinę na 6 płytkach dołkowych w pożywce po 2 ml na studzienkę, tak aby każda studzienka otrzymała 1 x 106 makrofagów.
    UWAGA: Jest to krytyczny krok, który zapewnia, że każda studzienka otrzymuje odpowiednią liczbę makrofagów, aby równomiernie pokryć szkiełka nakrywkowe. Sprawdź, czy szkiełka nakrywkowe w studzienkach nie zachodzą na siebie ani nie unoszą się w podłożu. Jeśli tak, delikatnie wyreguluj za pomocą sterylnej końcówki do pipety.
  8. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

3. Oczyszczanie z form zakaźnych L. amazonensis

UWAGA: Przygotuj Leishmania na infekcje - oczyść metacykliczne promastigoty ze stacjonarnych kultur promastigoty8,13, lub rozróżnij promastigoty w kulturze do formy amastigotycznej, używając standardowego protokołu różnicowania aksenicznego L. amazonensis6,8.

  1. Oczyszczanie metacyklicznych promastigotów Leishmania przy użyciu mediów o gradimencie gęstości (Materiały)33
    1. Przygotować 40% roztwór podstawowy pożywek o gradiencie gęstości w sterylnej wodzie wolnej od endotoksyn.
    2. Rozcieńczyć roztwór gradientu gęstości w 10x pożywce M199 (bez surowicy), aby przygotować 10% stężenie w pożywce M199.
    3. Przefiltruj wszystkie roztwory przez filtr 0,22 μm.
      UWAGA: Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze 4 oC w ciemności nie dłużej niż 1 miesiąc.
    4. Dodaj 2 ml roztworu pożywki o gradientzie gęstości 40% na dno stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    5. Warstwę 2 ml roztworu pożywki gradientowej o gęstości 10% w M199 ostrożnie nałożyć na warstwę podłoża o gradiencie o gęstości 40%, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania się między dwiema warstwami.
    6. Zebrać 1 x 109 pasożytów z hodowli w fazie stacjonarnej przez odwirowanie przy 1 900 x g przez 10 minut.
    7. Zawieś komórki w 6 ml zmodyfikowanej pożywki niezbędnej (DMEM) firmy Dulbecco.
    8. Warstwę 2 ml zawiesiny komórek bezpośrednio na warstwę pożywki o gradiencie gęstości 10%, delikatnie, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania między warstwami.
    9. Odwirowywać gradient przez 10 minut przy 1 300 x g w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Ze względu na różnice we właściwościach fizycznych między gatunkami Leishmania, warunki wirowania dla każdego z nich mogą wymagać nieznacznego dostosowania, aby zapewnić maksymalną wydajność.
    10. Zbierz pasożyty (wzbogacone w metacykliczną formę promastygoty) z pasma utworzonego na górnej granicy ośrodków gradientu gęstości 10% (interfejs między warstwami ośrodków gradientu gęstości 0% i 10%).
    11. Rozcieńczyć pasożyty jedną objętością DMEM i zebrać przez odwirowanie (1 900 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej).
    12. Ponownie zawiesić w pożywce DMEM o pojemności 500 μl i policzyć w hemocytometrze, aby określić ilościowo wydajność.
  2. Wytwarzanie L. amazonensis amastigotes w warunkach hodowli aksonicznej (niskie pH / podwyższona temperatura)6,8,13
    1. Zmieszać 5 ml kultury promastigoty w fazie logarytmicznej (pH 7,4 w temperaturze 26 °C) z równą objętością pożywki amastigoty (pH 4,5), używając kolb o długości 25cm2 (łącznie 10 ml pożywki) i inkubować przez noc w temperaturze 26 °C.
    2. Przesunąć kolbę z 26 °C do 32 °C.
    3. Po 3 lub 4 dniach rozdzielić kulturę 1:5 w pożywce amastigote w temperaturze 32 °C.
    4. Sprawdź pasożyty w ciągu najbliższych 3 - 4 dni (maksymalnie 7 dni), aby zobaczyć, czy są gotowe do użycia w infekcjach.
      UWAGA: Zdrowe akskoniczne amastigoty powinny mieć owalny kształt, bez widocznych wici. Częściowo zróżnicowane amastigoty mają duży owalny kształt z krótkimi wiciami. Kultura nie powinna mieć wielu grudek - wiele grudek wskazuje na nierosnące, umierające pasożyty. Kulturę amastigoty można podzielić w stosunku 1:5 i utrzymywać przez maksymalnie 3 tygodnie.

4. Zakażenie L. amazonensis

  1. Rozcieńczyć zawiesiny pasożytów zgodnie z pożądanym MOI (zwykle 3-5 metacyklicznych promastigotów na makrofaga [MOI 1:3 lub 1:5] i 1 amastigota na makrofaga [MOI 1:1]). Dodać Leishmania w PBS -/- w objętości 50 - 100 μl do każdej studzienki zawierającej już 2 ml pożywki.
  2. Inkubować BMM przez 1 godzinę z amastigotami i 3 godziny z metacyklicznymi promastigotami w temperaturze 34 oC w celu zakażenia.
    UWAGA: Optymalna temperatura infekcji może się różnić w zależności od gatunku.
  3. Po inkubacji dokładnie zmyć wolne pasożyty w każdym dołku 3x za pomocą 2 ml PBS -/- podgrzanego do 37 °C.
    UWAGA: Delikatnie rozprowadź PBS, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe nie unoszą się nad sobą. Delikatnie zakręć płytką, a następnie odessaj płyn. Użyj oddzielnej końcówki zasysającej, jeśli używasz wielu szczepów pasożytów, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
  4. Ustalić 1 h lub 3 h punkty czasowe próbki, inkubując każdą studzienkę z 1,5 - 2 ml 2% PFA w PBS -/- przez 10 min. Przemyć 3x PBS -/-. Nie odsysać ostatniego mycia i przechowywać w lodówce płytki zawierające szkiełka nakrywkowe w PBS do czasu zabarwienia.
  5. Dodać 2 ml świeżej pożywki BMM do każdego dołka na płytkach w celu uzyskania dalszych punktów czasowych i inkubować w temperaturze 34 °C.
  6. Napraw pozostałe punkty czasowe zgodnie z potrzebami, jak opisano w kroku 4.3, i wstaw płytki do lodówki do czasu zabarwienia.

5. Barwienie DAPI i montaż szkiełek nakrywkowych

  1. Odessać PBS ze studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i dodać 1,5 ml PBS -/- z 0,1% niejonowym detergentem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 3x przemyć 2 ml PBS -/-.
  2. Dodać 1 ml PBS -/- z 2 μg/ml DAPI (rozcieńczony z 5 mg/ml roztworu podstawowego w wodzie) do studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i inkubować przez kolejną 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Czas inkubacji z DAPI ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej wizualizacji wewnątrzkomórkowych pasożytów Leishmania. Jądra makrofagów barwią się szybko, ze względu na ich większy rozmiar i zawartość DNA, ale barwienie jąder pasożytów wewnątrzkomórkowych jest wolniejsze. Tak więc wydłużenie czasu inkubacji poza to, co jest wymagane do wizualizacji jąder BMM, jest konieczne, aby DAPI mogło przeniknąć przez błonę plazmatyczną pasożyta i błonę jądrową pasożyta. Przy prawidłowym barwieniu DAPI oprócz DNA jądrowego można również uwidocznić mitochondrialne DNA kinetoplastu w pobliżu kieszeni wiciowej pasożyta.
  3. Umyj każdą studzienkę zawierającą szkiełka nakrywkowe 3x 2 ml PBS -/-, a następnie podnieś i odwróć szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków, aby położyć komórkę do dołu i zamontować na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą dostępnego w handlu odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe są niezwykle delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się. Unikaj wywierania na nie nacisku, zwłaszcza na ścianę boczną studni podczas podnoszenia. Dodanie kilku kropli PBS -/- zmniejsza napięcie powierzchniowe między szkiełkiem nakrywkowym a studnią i ułatwia proces podnoszenia. Można użyć cienkiej igły, aby pomóc w podważeniu szkiełek nakrywkowych z dna studni. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na szkiełku należy delikatnie docisnąć kleszkami, aby wypchnąć wszelkie pęcherzyki powietrza z nośnika montażowego. Jeśli szkiełko nakrywkowe zostało złamane lub prawdopodobnie przewróciło się podczas procesu podnoszenia, nie montuj go ponownie; Wystarczy użyć zapasowego czwartego szkiełka nakrywkowego.
  4. Szkiełka należy przechowywać w lodówce do momentu oznaczania ilościowego.

6. Kwantyfikacja infekcji

  1. Zbadaj szkiełka zabarwione DAPI pod mikroskopem fluorescencyjnym, skupiając się na makrofagach za pomocą soczewki obiektywowej 100X z olejkiem immersyjnym (wzbudzenie przy 358 nm; optymalna emisja przy 461 nm).
    Upewnij się, że fokus jest skupiony na warstwie makrofagów między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
  2. Określ ilościowo liczbę makrofagów (dużych jąder barwionych DAPI) i liczbę mniejszych jąder amastigotów skupionych wokół każdego jądra makrofaga (patrz Rysunek 2A, DAPI) dla każdego pola widzenia, używając ręcznego licznika.
    UWAGA: Jądra Amastigota mogą nie być widoczne w jednej płaszczyźnie ogniska ze względu na ich mały rozmiar. Policz te, które są widoczne, gdy skupiasz się na jądrach makrofagów, a następnie użyj precyzyjnej ostrości, aby sprawdzić, czy w płaszczyznach powyżej i poniżej jąder makrofagów nie ma jąder pasożytów.
  3. Przejdź do innego pola widzenia, aby powtórzyć kwantyfikację. Użyj oddzielnego klucza licznika, aby śledzić liczbę zliczonych pól. Poruszaj się po polach widzenia w równoległych rzędach na każdym szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec nakładaniu się liczenia.
  4. Określ ilościowo co najmniej 200 makrofagów na szkiełko nakrywkowe. Określić ilościowo każdy punkt czasowy infekcji w trzech egzemplarzach (3 szkiełka nakrywkowe). Policz czwarte szkiełko nakrywkowe, jeśli jedno z poprzednich nie nadaje się do liczenia z powodu nakładania się szkiełek nakrywkowych, złego montażu, stłuczenia szkła itp.
    UWAGA: Jeśli nie można policzyć 200 makrofagów na jednym szkiełku nakrywkowym, policz zapasowe czwarte.
  5. Oblicz wskaźniki infekcji jako amastigoty/makrofagi lub amastigoty/100 makrofagów i określ procent zakażonych makrofagów na podstawie surowych danych ilościowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmania ma dwie formy zakaźne - metacykliczne promastigoty, które odróżniają się od procyklicznych promastigotów w stacjonarnej fazie hodowli, oraz amastigoty, które są stadiami wewnątrzkomórkowymi (Rysunek 1). U niektórych gatunków Leishmania, takich jak L. amazonensis, amastigoty można również różnicować w kulturze aksonicznej poprzez przestawienie komórek promastynu na niższe pH (4,5) i podwyższoną temperaturę (32 °C), warunki podobne d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane ilościowe uzyskane za pomocą opisanego powyżej testu infekcji BMM pozwalają badaczom uzyskać wskaźniki infekcji i wiarygodne określenie zmian właściwości wirulencji w stosunkowo krótszym okresie czasu (maksymalnie 2 tygodnie, w porównaniu z 2 miesiącami wymaganymi w przypadku eksperymentów in vivo ). Metoda ta opiera się na barwniku specyficznym dla DNA DAPI, który specyficznie barwi makrofagi i jądra pasożytów oraz umożliwia szybką identyfikację i kwantyfikację zakażonych komórek. Dla porównania, inne plam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych,

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health RO1 AI067979 dla NWA.
YK jest stypendystką Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland College Park.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCellstar657160
AdenineAcros OrganicsAC147440250
Końcówki do pipet z barierą aerozolową (100-1000 μ L)Fisherbrand02-707-404
Końcówki do pipet z barierą aerozolową (20-200 μ L)Fisherbrand02-707-430
Końcówki do pipet z barierą aerozolową (2-20 μ L)Fisherbrand02-707-432
Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej Bard-Parker Rib-Back #10Aspen Surgical371110
BD Luer-Lok Końcówka 10 ml StrzykawkaBecton Dickinson (BD)309604
Igła BD Precisionglide, 25G Becton Dickinson (BD)305124
Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm x 10 mmCellstar627 160
Kolba do hodowli komórkowychCellstar660175
Okulary nakrywkowe: koła 12 mmFisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)InvitrogenD1306
D-BiotynaJ.T. BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS
Alkohol etylowy 200 proofPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm polistyren bez TC szalka PetriegoCorning351029
Płodowa surowica bydlęcaSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Mikroskop fluorescencyjnyNikonE200
Koza anty-mysia IgG Texas czerwonyInvitrogenT-862
Koza anty-królik IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LTDH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Rozcieńczalnik Isoton IIBeckman Coulter
L-GlutaminaGemini400-106
Medium 199 (10X)Gibco11825-015
Na pirogronian (100 mM)Gibco11360-070
ParaformaldehydAlfa Aesar43368
Penicylina/StreptomycynaGemini400-109
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-/-)ThermoFisher14200166
Polipropylinowe stożkowe probówki wirówkowe 15 mlCellstar188 271
Polipropylinowe stożkowe probówki wirówkowe 50 mlCellstar227 261
ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciuThermoFisherP36930
Przeciwciało przeciw myszom Lampa-1 dla szczurówBadania rozwojowe Hybridoma Bank1D4B
Rekombinowany ludzki M-CSFPeproTech300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometr Hausser Scientific1492
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 SurfaktantMillipore SigmaTX1568-1
Trypan BlueSigma AldrichT8154
Delikatne nożyczki, 4 1/2"VWR82027-582
Kleszcze preparacyjne, cienka końcówkaVWR82027-386
Szkiełka mikroskopoweVWR16004-368
Z1 Licznik cząstek redlic dwuprogowychBeckman Coulter6605699
8546719

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888(2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340(2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901(2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804(2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022(2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084(2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671(2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12(2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469(2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wirulencja Leishmaniamakrofagi pochodz ce z szpiku kostnegokwantyfikacja paso yt wmitochondrialny transporter elazamikroskopia fluorescencyjnabarwienie DAPIwakuole paso ytniczej dra amastigot winterakcja gospodarz patogen

Powiązane artykuły