Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cykl życia Leishmania, czynnika wywołującego leiszmaniozę, przebiega naprzemiennie między stadiami promastygoty i amastigoty odpowiednio u gospodarzy owadów i kręgowców. Podczas gdy objawy chorobotwórcze leiszmaniozy mogą się znacznie różnić, od łagodnych zmian skórnych po wysoce śmiertelne formy choroby trzewnej w zależności od gatunku zakaźnego, wszystkie gatunki Leishmania przebywają w makrofagach gospodarza na etapie ich cyklu życiowego u kręgowców. Zakaźność Leishmania jest zatem bezpośrednio związana z jej zdolnością do inwazji, przetrwania i replikacji w wakuolach parazytoforycznych (PV) wewnątrz makrofagów. W związku z tym ocena zdolności pasożyta do replikacji wewnątrzkomórkowej służy jako niezawodna metoda określania zjadliwości. Badanie rozwoju leiszmaniozy przy użyciu modeli zwierzęcych jest czasochłonne, żmudne i często trudne, szczególnie w przypadku patogennie ważnych form trzewnych. Opisujemy tutaj metodologię śledzenia wewnątrzkomórkowego rozwoju Leishmania w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Liczbę pasożytów wewnątrzkomórkowych określa się w odstępach 24 godzin przez 72 - 96 godzin po zakażeniu. Metoda ta pozwala na wiarygodne określenie wpływu różnych czynników genetycznych na zjadliwość Leishmania. Jako przykład pokazujemy, w jaki sposób delecja pojedynczego allelu genu mitochondrialnego transportera żelaza Leishmania (LMIT1) upośledza zdolność zmutowanego szczepu Leishmania amazonensis LMIT1 / ΔLmit1 do wzrostu wewnątrz BMM, odzwierciedlając drastyczne zmniejszenie zjadliwości w porównaniu z typem dzikim. Test ten pozwala również na precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych, którymi można indywidualnie manipulować w celu analizy wpływu różnych czynników (składników odżywczych, reaktywnych form tlenu itp.) na interakcję gospodarz-patogen. W związku z tym odpowiednie wykonanie i kwantyfikacja badań nad zakażeniem BMM stanowi nieinwazyjną, szybką, ekonomiczną, bezpieczną i niezawodną alternatywę dla konwencjonalnych badań na modelach zwierzęcych.
Wprowadzenie
Leishmaniasis odnosi się do szerokiego spektrum chorób ludzkich wywoływanych przez gatunki pasożytów pierwotniaków z rodzaju Leishmania. Około 12 milionów ludzi na całym świecie jest obecnie zarażonych Leishmanią, a ponad 350 milionów jest zagrożonych. Patologia choroby zależy od gatunku Leishmania i czynników gospodarza, a objawy wahają się od nieszkodliwych, samoleczących się zmian skórnych po śmiertelne formy trzewne. Nieleczona leiszmanioza trzewna jest śmiertelna, plasując się tylko po malarii jako najbardziej śmiertelna choroba człowieka spowodowana zakażeniem pasożytem pierwotniaka1. Pomimo szerokich różnic w p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych przez National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Maryland. Wszystkie czynności opisane w sekcjach od 1 do 4 powinny być wykonywane w sposób aseptyczny w biologicznych komorach laminarnych. Należy stosować środki ochrony osobistej i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z żywymi pasożytami Leishmania na wszystkich etapach eksperymentów.
1. Izolacja i różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM)8....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Leishmania występuje w dwóch formach zakaźnych – promastygotach metacyklicznych, które różnicują się z promastygot procyklicznych w fazie stacjonarnej hodowli, oraz amastygotach, które stanowią stadia wewnątrzkomórkowe (Rycina 1). U niektórych gatunków Leishmania, takich jak L. amazonensis, amastygoty można również różnicować w hodowli aksenicznej poprzez przeniesienie komórek promastygot do środowiska o niższym pH (4.5) i podwyższo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dane ilościowe uzyskane za pomocą opisanego powyżej testu infekcji BMM pozwalają badaczom uzyskać wskaźniki infekcji i wiarygodne określenie zmian właściwości wirulencji w stosunkowo krótszym okresie czasu (maksymalnie 2 tygodnie, w porównaniu z 2 miesiącami wymaganymi w przypadku eksperymentów in vivo ). Metoda ta opiera się na barwniku specyficznym dla DNA DAPI, który specyficznie barwi makrofagi i jądra pasożytów oraz umożliwia szybką identyfikację i kwantyfikację zakażonych komórek. Dla porównania, inne plam.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych,
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health RO1 AI067979 dla NWA.
YK jest stypendystką Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland College Park.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Końcówki do pipet z barierą aerozolową (100-1000 μ L) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Końcówki do pipet z barierą aerozolową (20-200 μ L) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Końcówki do pipet z barierą aerozolową (2-20 μ L) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej Bard-Parker Rib-Back #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Końcówka 10 ml Strzykawka | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| Igła BD Precisionglide, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Kolba do hodowli komórkowych | Cellstar | 660175 | |
| Okulary nakrywkowe: koła 12 mm | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotyna | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alkohol etylowy 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm polistyren bez TC szalka Petriego | Corning | 351029 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Nikon | E200 | |
| Koza anty-mysia IgG Texas czerwony | Invitrogen | T-862 | |
| Koza anty-królik IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Rozcieńczalnik Isoton II | Beckman Coulter | ||
| L-Glutamina | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pirogronian (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyd | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Gemini | 400-109 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polipropylinowe stożkowe probówki wirówkowe 15 ml | Cellstar | 188 271 | |
| Polipropylinowe stożkowe probówki wirówkowe 50 ml | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu | ThermoFisher | P36930 | |
| Przeciwciało przeciw myszom Lampa-1 dla szczurów | Badania rozwojowe Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Rekombinowany ludzki M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometr | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfaktant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delikatne nożyczki, 4 1/2 | "VWR | 82027-582 | |
| Kleszcze preparacyjne, cienka końcówka | VWR | 82027-386 | |
| Szkiełka mikroskopowe | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Licznik cząstek redlic dwuprogowych | Beckman Coulter | 6605699 |
Bibliografia
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
