Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57491

⸱

17 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biology at Irkutsk State University, 2Institute of Biology at Karelian Research Centre of Russian Academy of Sciences, 3Baikal Research Centre, 4Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology, and Research (A*STAR), 5University of Oulu, Optoelectronics and Measurement Techniques Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł demonstruje zasady szybkiego, minimalnie inwazyjnego wstrzykiwania mikrocząsteczek fluorescencyjnych do układu krążenia małych ryb oraz wizualizacji in vivo mikrocząsteczek we krwi ryb.

Streszczenie

Systemowe podawanie mikrocząsteczek do żywego organizmu może być stosowane do wizualizacji naczyń krwionośnych, dostarczania leków i szczepionek, implantacji komórek transgenicznych i maleńkich czujników optycznych. Jednak mikroiniekcje dożylne małym zwierzętom, które są najczęściej stosowane w laboratoriach biologicznych i weterynaryjnych, są bardzo trudne i wymagają przeszkolonego personelu. W niniejszym artykule przedstawiamy solidną i skuteczną metodę wprowadzania mikrocząstek do układu krążenia dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) poprzez wstrzyknięcie do nerki ryby. Aby uwidocznić wprowadzone mikrocząstki do układu krwionośnego, proponujemy prostą technikę obrazowania przyżyciowego w skrzelach ryb. Monitorowanie in vivo pH krwi danio pręgowanego przeprowadzono za pomocą wstrzykiwanej mikrokapsułkowanej sondy fluorescencyjnej SNARF-1, aby zademonstrować jedno z możliwych zastosowań opisanej techniki. W artykule przedstawiono szczegółowy opis enkapsulacji barwnika wrażliwego na pH oraz przedstawiono zasady szybkiego wstrzykiwania i wizualizacji otrzymanych mikrokapsułek w celu rejestracji sygnału fluorescencyjnego in vivo. Proponowana metoda iniekcji charakteryzuje się niską śmiertelnością (0-20%) i wysoką skutecznością (70-90% sukcesu), a także jest łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu. Wszystkie opisane zabiegi można wykonywać na innych małych gatunkach ryb, takich jak gupiki i medaka.

Wprowadzenie

Podawanie mikrocząsteczek do organizmu zwierzęcego jest ważnym zadaniem w takich dziedzinach jak dostarczanie leków i szczepionek1, wizualizacja naczyń krwionośnych2, implantacja komórek transgenicznych3, oraz implantacja małego czujnika optycznego4,5. Jednak procedura implantacji mikrocząstek do układu naczyniowego małych zwierząt laboratoryjnych jest trudna, szczególnie w przypadku delikatnych organizmów wodnych. W przypadku popularnych okazów badawczych, takich jak danio pręgowany, zaleca się wyjaśnienie tych procedur za pomocą protokołów wideo.

Mikroiniekcje dosercowe i kapilarne wymagają przeszkolonego personelu i unikalnego zaplecza mikrochirurgicznego do dostarczania mikroobiektów do krwi danio pręgowanego. Wcześniej, manualne wstrzykiwanie po orbicie po orbicie3 było sugerowane jako łatwa i skuteczna metoda podawania całych komórek. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że ze względu na mały obszar sieci naczyń włosowatych oka, osiągnięcie pożądanego rezultatu tej techniki wymaga dużo praktyki.

Tutaj opisujemy metodę solidnego i skutecznego wszczepiania mikrocząsteczek do układu krążenia poprzez ręczne wstrzykiwanie bezpośrednio do tkanki nerkowej dorosłego danio pręgowanego, która jest bogata w naczynia włosowate i nerkowe. Technika ta opiera się na protokole wideo do przeszczepu komórek do nerki danio pręgowanego6, ale traumatyczne i czasochłonne etapy mikrochirurgiczne zostały wyeliminowane. Proponowana metoda charakteryzuje się niską śmiertelnością (0-20%) i wysoką skutecznością (70-90% skuteczności), a także jest łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu.

Ważną częścią proponowanego protokołu jest wizualizacja wszczepionych mikrocząsteczek (jeśli są fluorescencyjne lub kolorowe) w naczyniach włosowatych skrzelowych, co pozwala na weryfikację jakości iniekcji, przybliżoną względną ocenę liczby wstrzykniętych cząstek, oraz wykrywanie sygnału spektralnego do pomiarów fizjologicznych bezpośrednio z krążącej krwi. Jako przykład możliwych zastosowań opisanej techniki przedstawiamy protokół pomiarów in vivo pH krwi danio pręgowanego za pomocą mikrokapsułkowanej sondy fluorescencyjnej SNARF-1, pierwotnie zasugerowanej w Borvinskaya i wsp. 20175.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/EU dotyczącą eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami Instytutu Biologii Uniwersytetu Państwowego w Irkucku.

1. Wytwarzanie mikrokapsułek

UWAGA: Mikrokapsułki zawierające barwnik fluorescencyjny są przygotowywane z wykorzystaniem montażu warstwa po warstwie przeciwstawnie naładowanych polielektrolitów7,8. Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze pokojowej.

  1. Aby zsyntetyzować porowate mikroot rdzenie CaCO3 zamykające barwnik fluorescencyjny, wymieszać 2 mL roztworu SNARF-1-dekstranu (można użyć większości barwników fluorescencyjnych związanych z polimerem, np. FITC-BSA) o stężeniu ~2 mg/mL z 0,6 mL roztworów 1 mol/L CaCl2 oraz Na2CO3 przy szybkim mieszaniu.
    UWAGA: Należy zwrócić uwagę na różną wrażliwość barwników fluorescencyjnych na fotowyblakanie; w przypadku użycia światłoczułej sondy fluorescencyjnej (takiej jak SNARF-1), manipulacje i przechowywanie mikrocząstek muszą być wykonywane przy jak najmniejszym oświetleniu.
  2. Po 5-10 s mieszania przenieść zawiesinę do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL i wirować przez 15 s przy 10 000-12 000 g, aby osadzić mikroot rdzenie CaCO3.
  3. Odlać nadsącz, przemyć rdzenie ~2 mL wody dejonizowanej i ponownie zawiesić osad poprzez wstrząsanie.
  4. Powtórzyć procedurę wirowania i płukania łącznie trzy razy. Po ostatnim wirowaniu odlać nadsącz.
  5. Inkubować mikroot rdzenie przez 1 min w kąpieli ultradźwiękowej, aby zmniejszyć ich agregację.
    OSTROŻNIE: Nie zapomnieć o ochronie uszu za pomocą słuchawek.
  6. Aby nanieść pierwszą warstwę polimerową na matryce, ponownie zawiesić rdzenie w ~2 mL roztworu poli(chlorowodorku allyloaminy) (PAH) o stężeniu 4 mg/mL w 1 mol/L NaCl.
    1. Pozostawić mikroot rdzenie w roztworze przez ~5 min przy stałym wstrząsaniu.
    2. Po 15 s wirowania odlać nadsącz z niezwiązanym PAH. Przemyć pokryte mikroot rdzenie wodą dejonizowaną co najmniej 3 razy poprzez wielokrotne etapy wirowania i płukania. Po ostatnim wirowaniu odlać nadsącz.
    3. Inkubować mikroot rdzenie przez 1 min w kąpieli ultradźwiękowej, aby zmniejszyć ich agregację.
      UWAGA: Jeśli zastosowany barwnik fluorescencyjny jest kationowy, należy zacząć od poli(4-styrenosulfonianu sodu) (PSS) w 1 mol/L NaCl (patrz krok 1.7).
  7. Powtórzyć krok 1.6 z ~2 mL roztworu PSS o stężeniu 4 mg/mL (zawierającego również 1 mol/L NaCl), aby nanieść drugą warstwę polimerową na matryce.
  8. Powtórzyć kroki 1.6 i 1.7 sześć razy, aby nanieść 12 warstw polimerowych.
    UWAGA: Nie zaleca się robienia długich przerw (~12 h lub więcej) w procedurze, dopóki nie zostanie naniesionych ~3-5 warstw, ponieważ niepokryte mikroot rdzenie CaCO3 mogą mieć tendencję do rekrystalizacji. Należy zauważyć, że pokrycie PSS powoduje większą agregację mikroot rdzeni, a długa przerwa jest zalecana tylko wtedy, gdy zewnętrzną warstwą jest PAH lub poli-L-lizyna szczepiona glikolem polietylenowym (PLL-g-PEG).
  9. Inkubować pokryte mikroot rdzenie w 2 mg/mL PLL-g-PEG (~1 mL na mikroprobówkę) przez co najmniej 2 h.
    1. Przemyć mikroot rdzenie wodą poprzez sekwencyjne etapy wirowania i ponownego zawieszania. Po ostatnim wirowaniu odlać nadsącz.
  10. Aby uzyskać puste mikrokapsułki, rozpuścić matryce CaCO3, dodając 2 mL roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o stężeniu 0,1 mol/L (dostosowanego do pH 7,1 za pomocą NaOH) do pokrytych mikroot rdzeni.
    1. Po ~5 min inkubacji wirować mikrokapsułki przez 45 s i odlać nadsącz z EDTA.
    2. Powtórzyć kroki 1.10-1.10.1 dwukrotnie.
  11. Przemyć mikrokapsułki 0,9% NaCl trzy razy poprzez wielokrotne etapy wirowania (przez 45 s), a następnie etapy płukania. Po ostatnim etapie wirowania odlać nadsącz.
    UWAGA: Końcowy roztwór mikrokapsułek do iniekcji musi być sterylny (np. poprzez dodanie ampicyliny, 0,1 mg/mL), a medium powinno być biokompatybilne z obiektem badania (medium izotoniczne o neutralnym pH).
  12. Oszacować stężenie przygotowanych mikrokapsułek w komorze licznikowej pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wykonać serię zdjęć mikrokapsułek, zmierzyć średnicę około stu mikrokapsułek przy użyciu programu ImageJ9 lub równoważnego oprogramowania i zbadać rozkład wielkości za pomocą histogramu.
  13. Przechowywać otrzymaną enkapsulowaną sondę w ciemności.
    UWAGA: Po kilkukrotnym przemyciu w sterylny 0,9% NaCl mikrokapsułki można przechowywać przez miesiące w 4 °C. Nie zaleca się całkowitego wysuszenia mikrokapsułek podczas przechowywania.

2. Przygotowanie układu optycznego i kalibracja mikrokapsułkowanego SNARF-1

Uwaga: Przybliżone pomiary pH z wykorzystaniem mikrokapsułkowanego SNARF-1 można przeprowadzić, używając obrazów z dwóch kanałów mikroskopu fluorescencyjnego7, jednak w niniejszym protokole zastosowano jednokanałowy mikroskop fluorescencyjny połączony ze spektrometrem światłowodowym.

  1. Zamontuj w mikroskopie fluorescencyjnym odpowiedni zestaw filtrów fluorescencyjnych, zgodnie z charakterystyką zastosowanego barwnika fluorescencyjnego, a następnie włącz lampę fluorescencyjną.
    1. Odciągnij dźwignię w kierunku okularów.
      UWAGA: Nadmierne światło może uszkodzić matrycę spektrometru. Należy zatem upewnić się, że dźwignia znajduje się w trybie „okular”, gdy spektrometr nie jest używany.
    2. Podłącz jeden koniec światłowodu do spektrometru, a drugi do kolimatora. Za pomocą adapterów umieść kolimator w ognisku tubusu kamery lub innym dostępnym porcie mikroskopu fluorescencyjnego.
    3. Włącz spektrometr. Uruchom program sterujący spektrometrem i przygotuj urządzenie do pomiarów.
  2. W celu kalibracji partii mikrokapsułek nanieś ~5 µL zawiesiny mikrokapsułek (~10 000 mikrokapsułek na µL w wodzie dejonizowanej) na szkiełko przedmiotowe i wysusz kroplę w ciemnym miejscu (np. w termostacie w temperaturze 35 °C).
    1. Aby skalibrować charakterystykę spektralną zmikrokapsułkowanego SNARF-1, użyj serii buforów o różnych wartościach pH z zakresu ~6-9. Nanieś kroplę ~10 µL buforu na wysuszone mikrokapsułki z SNARF-1-dekstranem i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.
    2. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj mikrokapsułki, korzystając z obiektywu ×40.
    3. Przełącz dźwignię mikroskopu na port kamery. Zarejestruj ich fluorescencję za pomocą spektrometru. Przełącz dźwignię z powrotem na okulary.
      UWAGA: Upewnij się, że sygnał spektralny znacznie przekracza poziom tła oraz że mikrokapsułki w polu widzenia nie znajdują się w pęcherzyku powietrza (w razie potrzeby przełączając na mniejsze powiększenie). Unikaj długotrwałego naświetlania tych samych mikrokapsułek. SNARF-1 jest podatny na fotoblaknięcie.
    4. Powtórz krok 2.2.3 dla różnych mikrokapsułek 10-15 razy.
  3. Oblicz stosunki maksimów fluorescencji (np. przy użyciu programu R lub Scilab) dla wszystkich zarejestrowanych widm i wyznacz linię regresji między stosunkiem mediany (dla każdego buforu) a pH ośrodka, korzystając z następującego wzoru:
    Wzór na obliczanie pH, równanie do wyznaczania pH przy użyciu stosunków absorbancji, do celów edukacyjnych.
    UWAGA: SNARF-1 posiada widmo z dwoma maksimami odpowiadającymi emisji barwnika w formie protonowanej i deprotonowanej, a stosunek między tymi maksimami zależy od pH ośrodka. W niniejszym badaniu zastosowano stosunek intensywności fluorescencji dla 605 i 660 nm. Długości fal te są dobierane w zależności od użytego zestawu filtrów. a i b to współczynniki wyznaczane metodą regresji nieliniowej (np. przy użyciu programu R). Wartości 0,15 i 1,1 to odpowiednio minimalna i maksymalna wartość I605/I660 zaobserwowana podczas kalibracji.
  4. Pobierz około 10 µL krwi ryb od ok. 5 dorosłych osobników. Umieść ryby w czarce Petriego z zawiesiną olejku goździkowego w wodzie o stężeniu 1 µL/mL w celu znieczulenia i poczekaj, aż zwierzę położy się na boku i przestanie reagować na uciśnięcia płetwy (zazwyczaj ~2-3 min). Przenieś rybę na szkiełko przedmiotowe. Odetnij ogon ryby lancetem i pobierz około 2 µL krwi z żyły ogonowej.
    UWAGA: Aby zapobiec krzepnięciu krwi, potraktuj miejsce nacięcia heparyną (5000 U/mL) i używaj heparynowanych kapilar szklanych oraz probówek do mikrowirówek do pobierania krwi.
    1. Nanieś pipetą około 10 µL krwi na końcówkę mikroelektrody i wyznacz pH za pomocą pH-metru.
    2. Nanieś krew na szkiełko z wysuszonymi mikrokapsułkami i zarejestruj stosunek intensywności fluorescencji zgodnie z opisem dla buforów kalibracyjnych (kroki 2.2 - 2.3).
  5. Dostosuj współczynnik liniowy krzywej kalibracyjnej tak, aby krzywa odpowiadała pomiarom wykonanym we krwi ryb (szczegóły patrz: Borvinskaya et al. 20175).

3. Przygotowanie do iniekcji

  1. Uwolnić stalową igłę z końcówki penu insulinowego (lub strzykawki), usuwając plastik za pomocą ostrego lancetu.
    UWAGA: Do mikroiniekcji można przygotować dowolną cienką igłę (Ø0,33 mm lub mniejszą) lub kapilarę szklaną (zazwyczaj Ø1 mm)10,11.
  2. Wsunąć igłę do połowy do szklanej mikrokapiilary; szybko i ostrożnie przylutować ją za pomocą palnika gazowego.
  3. Podłączyć szklaną mikrokapilarę do mikroinjektora i przepłukać ją trzy razy sterylną wodą. Upewnić się, że ciecz przepływa przez igłę.
  4. Wypełnić układ wodą destylowaną.
    UWAGA: Należy upewnić się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza.

4. Iniekcja

  1. Resuspend przygotowaną zawiesinę mikrokapsułek (w sterylnym 0,9% NaCl lub innym medium używanym do iniekcji, o stężeniu od 0,5 do 6 milionów mikrokapsułek na mikrolitr), korzystając z kąpieli ultradźwiękowej przez 1 min.
    UWAGA: Ponieważ mikrokapsułki mają tendencję do osiadania, podczas następnej iniekcji należy wstrząsać fiolką z mikrokapsułkami mechanicznie (za pomocą rotora) lub ręcznie co kilka minut, aby je resuspendować i zapobiec ich agregacji.
  2. Umieść rybę w szalce Petriego z anestetykiem (0,1 mL/L olejku goździkowego zawieszonego w wodzie) na ok. 2-3 min. Czekaj, aż ryba położy się na boku i przestanie reagować na lekkie uszczypnięcie płetwy.
  3. Używając łyżki, przenieś rybę z anestetyku i delikatnie połóż ją na wilgotnej gąbce w pozycji bocznej, głową skierowaną w lewo (dla osoby praworęcznej) lub w prawo (dla osoby leworęcznej).
  4. Tuż przed iniekcją nabierz 1-2 mm powietrza do kapilary szklanej połączonej z mikroinjektorem. Następnie nabierz do niej około 2 µL zdyspergowanych mikrokapsułek.
    UWAGA: Przed iniekcją roztwór mikrokapsułek musi zostać dostosowany do temperatury, w której utrzymywane są ryby.
  5. Delikatnie ustabilizuj ciało ryby na gąbce niedominującą ręką.
    1. Zlokalizuj linię boczną ryby. Wyznacz w myśli odcinek rozciągający się od pokrywy skrzelowej do końca jamy brzusznej. Znajdź środek tego odcinka. Umieść igłę 1 mm niżej w kierunku brzuchnym.
    2. Ruchom skrobiącym delikatnie odsuń łuski ryby i wykonaj nakłucie. Wprowadź igłę w ciało pod kątem 45° do powierzchni stołu.
    3. Wsuń igłę w kierunku kręgosłupa, aż ostrożnie go dotknie.
    4. Podaj około 1 µL zawiesiny mikrokapsułek do nerki i powoli wycofaj igłę.
      UWAGA: Aby łatwiej znaleźć odpowiednie miejsce nakłucia, warto poćwiczyć lokalizację nerki tułowiałej poprzez prześwietlenie ryb światłem dolnym, jak pokazano na Rysunku 2A i 2B.
  6. Opłucz rybę od głowy do ogona strumieniem wody, aby usunąć wszelkie rozlane mikrokapsułki z miejsca iniekcji.

5. Wizualizacja in vivo

  1. Za pomocą nożyczek sekcyjnych należy usunąć pokrywę skrzelową z głowy ryby i odsłonić skrzela. Skrzela należy wypłukać wodą.
  2. Za pomocą łyżeczki przenieś rybę na szkiełko przedmiotowe, a następnie umieść je na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.
    UWAGA: Należy dopilnować, aby skrzela ryby nie wyschły podczas kolejnych etapów procedury. Aby tego uniknąć, należy je okresowo nawilżać wodą za pomocą pipety Pasteura (mniej więcej co 1–2 min).
  3. Przyciemnij pomieszczenie i przy użyciu małego powiększenia (obiektyw x10) obejrzyj skrzela, aby zlokalizować fluorescencyjne mikrokapsułki.
    UWAGA: W przypadku stosowania tej procedury w celu wprowadzenia cząstek fluorescencyjnych do układu krążenia ryb, zaleca się sprawdzenie skrzeli kilku osobników pod kątem obecności nieoczekiwanych cząstek fluorescencyjnych przed przystąpieniem do iniekcji. Skrzela zebrafish typu dzikiego nie wykazują autofluorescencji, jednak w niektórych przypadkach na skrzelach mogą wystąpić sporadyczne cząstki fluorescencyjne (takie jak fragmenty pokarmu lub symbionty jednokomórkowe). W razie potrzeby cząstki te można rozpoznać na podstawie ich specyficznego kształtu (na przykład fragmenty pokarmu mają nieregularny kształt, w przeciwieństwie do sferycznych mikrokapsułek) lub widma fluorescencji (t. j. kolor).
    1. Przełącz obiektyw na większe powiększenie (obiektyw ×40) i ustaw mikrokapsułkę lub grupę mikrokapsułek w centrum pola widzenia.
    2. Przełącz dźwignię na port, do którego podłączony jest spektrometr. Zarejestruj sygnał widmowy.
    3. Przesuń dźwignię z powrotem w stronę okularu.
    4. Powtórz pomiary dla różnych mikrokapsułek kilkukrotnie.
  4. Przenieś ryby do akwarium z odpowiednim napowietrzaniem w celu rekonwalescencji.
    UWAGA: Przy minimalnej wprawie możliwe jest przeprowadzenie iniekcji i rejestracji sygnału w tempie około 2–3 min na rybę. Pomiar u jednego osobnika można powtórzyć kilka razy, stosując wielokrotne niskie, nieszkodliwe dawki anestetyku lub inną metodę unieruchomienia. Do obserwacji długoterminowych należy użyć systemu z ciągłą anestezją.12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Uzyskane wyniki pochodzą z jednej z trzech głównych kategorii przedstawionego protokołu: tworzenia fluorescencyjnych mikrocząsteczek poprzez enkapsulację barwnika fluorescencyjnego (Rysunek 1), wstrzykiwania mikrokapsułek do nerki z późniejszą wizualizacją w kapilarach skrzelowych (Rysunek 2  i 3) oraz, na koniec, rejestracji spektralnej fluorescencji SNARF-1 in vivo w celu monitorowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zademonstrować wstrzykiwanie mikrocząstek do nerki danio pręgowanego, użyliśmy półprzepuszczalnych mikrokapsułek wypełnionych barwnikiem wskaźnikowym. W związku z tym protokół zawiera instrukcje dotyczące wytwarzania mikrokapsułek przy użyciu montażu warstwa po warstwie przeciwnie naładowanych polielektrolitów 7,8,15,16,17,18 (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy bardzo dziękują Bogdanowi Osadchiyowi i Evgenii Protasovowi (Irkucki Uniwersytet Państwowy, Rosja) w przygotowaniu protokołu wideo. Badania te były wspierane przez Rosyjską Fundację Naukową (#15-14-10008) i Rosyjską Fundację Badań Podstawowych (#15-29-01003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SNARF-1-dextran, 70000 MWThermo Fisher ScientificD3304. Jako wypełniacz mikrokapsułek można użyć dowolnego innego odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego związanego z polimerem
Koniugat izotiocyjanianu albuminy-fluoresceiny (FITC-BSA)SIGMAA9771Sonda fluorescencyjna
Izotiocyjanian rodaminy B (RITC-dektran)SIGMAR9379Sonda fluorescencyjna
Chlorek wapniaSIGMAC1016Tworzenie
szablonów CaCO3Węglan soduSIGMAS7795CaCO3 tworzenie matryc
Poli(chlorowodorek alliloaminy), MW 50000 (WWA)SIGMA283215polimer kationowy
Poli(4-styrenosulfonian sodu), MW 70000 (PSS)SIGMA243051Anionowy polimer
Poli-L-lizyna [20 kDa] szczepiony glikolem polietylenowym [5 kDa], g = 3,0 do 4,5 (PLL-g-PEG)SuSoSPLL(20)- g[3.5]-PEG(5)Końcowypolimer zwiększający biokompatybilność mikrokapsułek
Chlorek soduSIGMAS8776Do rozpuszczania zastosowanych polimerów
System oczyszczania wodyMilliporeSIMSV0000Do przygotowania wody dejonizowanej
Mieszadło magnetyczneSteglerDo tworzenia
szablonów CaCO3Eppendorf  Badania  plus pipeta, 1000 i mikro; LEppendorfRozwiązania dozujące
Eppendorf  Badania  plus pipeta, 10 i mikro; LEppendorfRozwiązania dozujące
Końcówki do pipet, zakres objętości od 200 do 1000 i mikro; LF.L. Medical28093Roztwory dozujące
Końcówki do pipet, zakres objętości 0,1-10  μ LEppendorfZ640069Roztwory dozujące
Miniwirówka Microspin 12, szybkoobrotowaBioSanDo procedury wirowania i mycia mikrokapsułek
Probówki do mikrowirówek, 2 mlEppendorfZ666513Synteza i przechowywanie mikrokapsułek
Shaker Intelli-mixer RM-1LELMY Sp. z o.o.Aby zmniejszyć agregację mikrokapsułek
MyjkaAby zmniejszyć agregację mikrokapsułek
Słuchawki Do ochrony uszu przed ultradźwiękami
Kwas etylenodiaminotetraoctowySIGMAEDSDo rozpuszczania matryc CaCO3
Fosforan sodowySIGMAS9638Przygotowanie pH Fosforan
disodowySIGMAS9390Przygotowanie pH
Wodorotlenek soduSIGMAS8045Do regulacji pH roztworu EDTA i
KomoraDo suszenia mikrokapsułek na szkiełku Komora
do zliczania krwinek Hemocytometr Badanierozkładu wielkości i stężenia przygotowanych mikrokapsułek
Mikroskop fluorescencyjny Mikmed 2LOMOWizualizacja in vivo mikrokapsułek we krwi ryb
Zestaw filtrów fluorescencyjnych do SNARF-1 (należy dobrać w zależności od modelu mikroskopu; przykład jest podany)Chroma79010Wizualizacja mikrokapsułek z sondami fluorescencyjnymi
Spektrometr światłowodowy QE ProOcean OpticsKalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Światłowód QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 mOptyka oceanicznaDo połączenia spektrometru z portem mikroskopu
Kolimator F280SMA-AThorlabsDo połączenia spektrometru z portem mikroskopu
Szkiełko mikroskopoweFisherbrand12-550-A3Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Szkiełka nakrywkowe, 22 x 22 mmPearlMS-SLIDCVKalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Mikrokapilary szklane Intra MARK, 10 µ LBlaubrandBR708709Do pobierania krwi ryb
Olejek goździkowySIGMAC8392Lancet do znieczulenia ryb
Lancet nr 11Apexmed international B.V.P00588Aby przeciąć rybi ogon i zwolnić stalową igłę z końcówki automatycznego wstrzykiwacza insuliny
Heparyna, 5000 U/mlCalbiochemL6510-BCDo leczenia wszystkich powierzchni, które mają kontakt z krwią ryb podczas pobierania krwi ryb
PH-metr Seven 2 Go Pro z mikroelektrodąMettler ToledoAby określić pH krwi ryb
Igły do wstrzykiwacza insuliny Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mmBecton, Dickinson and CompanyDo zabiegu iniekcyjnego. Każda cienka igła (Ø 0,33 mm lub mniej) jest odpowiednia
Kapilary szklane, 1 x 75 mmHirschmann Laborgerä te GmbH & Co9201075Do procedury iniekcyjnej
PalnikDo stalowej igły do szklanej kapilary
Mikrowtryskiwacz IM-9BNARISHIGEDo precyzyjnego dozowania zawiesiny mikrokapsułek
Petriego, 60 mm x 15 mm, polistyrenSIGMAP5481Do manipulacji rybami pod narkozą
ŁyżkaplastikowaDo manipulacji rybami pod narkozą
Wilgotna gąbkaDo manipulacji rybami pod narkozą
Nożyczki preparacyjneThermo Scientific31212Aby usunąć pokrywę skrzeli z głowy ryby
Pipeta Pasteura, 3,5 mlMARKIZ331767Do nawilżania skrzeli ryb
Sonda fluorescencyjna ultradźwiękowa termostatyczna gazowy szalki

Bibliografia

  1. Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
  2. Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
  3. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).
  4. Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427(2016).
  5. Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
  6. Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).
  7. Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
  8. Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
  9. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
  10. Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).
  11. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960(2008).
  12. Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).
  13. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).
  14. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
  15. Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
  16. Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
  17. Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
  18. Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
  19. Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wstrzykiwanie mikrocząsteczeknerka rybyobrazowanie intravitalneprzygotowanie mikrokapsułeksonda fluorescencyjnamonitorowanie pH krwiukład krwionośny danio pręgowanegoenkapsulacja warstwa po warstwiewizualizacja skrzelianaliza spektralna
Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.