Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

Summary

Ten artykuł demonstruje zasady szybkiego, minimalnie inwazyjnego wstrzykiwania mikrocząsteczek fluorescencyjnych do układu krążenia małych ryb oraz wizualizacji in vivo mikrocząsteczek we krwi ryb.

Abstract

Systemowe podawanie mikrocząsteczek do żywego organizmu może być stosowane do wizualizacji naczyń krwionośnych, dostarczania leków i szczepionek, implantacji komórek transgenicznych i maleńkich czujników optycznych. Jednak mikroiniekcje dożylne małym zwierzętom, które są najczęściej stosowane w laboratoriach biologicznych i weterynaryjnych, są bardzo trudne i wymagają przeszkolonego personelu. W niniejszym artykule przedstawiamy solidną i skuteczną metodę wprowadzania mikrocząstek do układu krążenia dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) poprzez wstrzyknięcie do nerki ryby. Aby uwidocznić wprowadzone mikrocząstki do układu krwionośnego, proponujemy prostą technikę obrazowania przyżyciowego w skrzelach ryb. Monitorowanie in vivo pH krwi danio pręgowanego przeprowadzono za pomocą wstrzykiwanej mikrokapsułkowanej sondy fluorescencyjnej SNARF-1, aby zademonstrować jedno z możliwych zastosowań opisanej techniki. W artykule przedstawiono szczegółowy opis enkapsulacji barwnika wrażliwego na pH oraz przedstawiono zasady szybkiego wstrzykiwania i wizualizacji otrzymanych mikrokapsułek w celu rejestracji sygnału fluorescencyjnego in vivo. Proponowana metoda iniekcji charakteryzuje się niską śmiertelnością (0-20%) i wysoką skutecznością (70-90% sukcesu), a także jest łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu. Wszystkie opisane zabiegi można wykonywać na innych małych gatunkach ryb, takich jak gupiki i medaka.

Introduction

Podawanie mikrocząsteczek do organizmu zwierzęcego jest ważnym zadaniem w takich dziedzinach jak dostarczanie leków i szczepionek¹, wizualizacja naczyń krwionośnych², implantacja komórek transgenicznych³, oraz implantacja małego czujnika optycznego^4,5. Jednak procedura implantacji mikrocząstek do układu naczyniowego małych zwierząt laboratoryjnych jest trudna, szczególnie w przypadku delikatnych organizmów wodnych. W przypadku popularnych okazów badawczych, takich jak danio pręgowany, zaleca się wyjaśnienie tych procedur za pomocą protokoł....

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą UE 2010/63/UE dla eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet Badawczy ds. Zwierząt Instytutu Biologii na Irkuckim Uniwersytecie Państwowym.

1. Wytwarzanie mikrokapsułek

UWAGA: Mikrokapsułki zawierające barwnik fluorescencyjny są przygotowywane przy użyciu zestawu warstwa po warstwie przeciwnie naładowanych polielektrolitów^7,8. Wszystkie zabiegi wykonywano w temperaturze pokojowej.

1. Aby zsyntetyzować porowate mikrordzenie CaCO₃ otacza....

Results

Uzyskane wyniki pochodzą z jednej z trzech głównych kategorii prezentowanego protokołu: tworzenie mikrocząstek fluorescencyjnych przez enkapsulację barwnika fluorescencyjnego (Rysunek 1), wstrzyknięcie mikrokapsułek do nerki z dalszą wizualizacją w naczyniach skrzelowych (Rysunek 2 i 3) i wreszcie in vivo spektralny zapis fluorescencji SNARF-1 w celu monitorowania poziomu pH krwi (

Discussion

Aby zademonstrować wstrzykiwanie mikrocząstek do nerki danio pręgowanego, użyliśmy półprzepuszczalnych mikrokapsułek wypełnionych barwnikiem wskaźnikowym. W związku z tym protokół zawiera instrukcje dotyczące wytwarzania mikrokapsułek przy użyciu montażu warstwa po warstwie przeciwnie naładowanych polielektrolitów 7,8,15,16,17,18 (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	. Jako wypełniacz mikrokapsułek można użyć dowolnego innego odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego związanego z polimerem
Koniugat izotiocyjanianu albuminy-fluoresceiny (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Sonda fluorescencyjna
Izotiocyjanian rodaminy B (RITC-dektran)	SIGMA	R9379	Sonda fluorescencyjna
Chlorek wapnia	SIGMA	C1016	Tworzenie
szablonów CaCO3Węglan sodu	SIGMA	S7795	CaCO3 tworzenie matryc
Poli(chlorowodorek alliloaminy), MW 50000 (WWA)	SIGMA	283215	polimer kationowy
Poli(4-styrenosulfonian sodu), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionowy polimer
Poli-L-lizyna [20 kDa] szczepiony glikolem polietylenowym [5 kDa], g = 3,0 do 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)Końcowy	polimer zwiększający biokompatybilność mikrokapsułek
Chlorek sodu	SIGMA	S8776	Do rozpuszczania zastosowanych polimerów
System oczyszczania wody	Millipore	SIMSV0000	Do przygotowania wody dejonizowanej
Mieszadło magnetyczne	Stegler		Do tworzenia
szablonów CaCO3Eppendorf  Badania  plus pipeta, 1000 i mikro; L	Eppendorf		Rozwiązania dozujące
Eppendorf  Badania  plus pipeta, 10 i mikro; L	Eppendorf		Rozwiązania dozujące
Końcówki do pipet, zakres objętości od 200 do 1000 i mikro; L	F.L. Medical	28093	Roztwory dozujące
Końcówki do pipet, zakres objętości 0,1-10  μ L	Eppendorf	Z640069	Roztwory dozujące
Miniwirówka Microspin 12, szybkoobrotowa	BioSan		Do procedury wirowania i mycia mikrokapsułek
Probówki do mikrowirówek, 2 ml	Eppendorf	Z666513	Synteza i przechowywanie mikrokapsułek
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Sp. z o.o.		Aby zmniejszyć agregację mikrokapsułek
Myjka			Aby zmniejszyć agregację mikrokapsułek
Słuchawki			Do ochrony uszu przed ultradźwiękami
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	SIGMA	EDS	Do rozpuszczania matryc CaCO3
Fosforan sodowy	SIGMA	S9638	Przygotowanie pH Fosforan
disodowy	SIGMA	S9390	Przygotowanie pH
Wodorotlenek sodu	SIGMA	S8045	Do regulacji pH roztworu EDTA i
Komora			Do suszenia mikrokapsułek na szkiełku Komora
do zliczania krwinek Hemocytometr Badanie			rozkładu wielkości i stężenia przygotowanych mikrokapsułek
Mikroskop fluorescencyjny Mikmed 2	LOMO		Wizualizacja in vivo mikrokapsułek we krwi ryb
Zestaw filtrów fluorescencyjnych do SNARF-1 (należy dobrać w zależności od modelu mikroskopu; przykład jest podany)	Chroma	79010	Wizualizacja mikrokapsułek z sondami fluorescencyjnymi
Spektrometr światłowodowy QE Pro	Ocean Optics		Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Światłowód QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 m	Optyka oceaniczna		Do połączenia spektrometru z portem mikroskopu
Kolimator F280SMA-A	Thorlabs		Do połączenia spektrometru z portem mikroskopu
Szkiełko mikroskopowe	Fisherbrand	12-550-A3	Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Szkiełka nakrywkowe, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Mikrokapilary szklane Intra MARK, 10 µ L	Blaubrand	BR708709	Do pobierania krwi ryb
Olejek goździkowy	SIGMA	C8392	Lancet do znieczulenia ryb
Lancet nr 11	Apexmed international B.V.	P00588	Aby przeciąć rybi ogon i zwolnić stalową igłę z końcówki automatycznego wstrzykiwacza insuliny
Heparyna, 5000 U/ml	Calbiochem	L6510-BC	Do leczenia wszystkich powierzchni, które mają kontakt z krwią ryb podczas pobierania krwi ryb
PH-metr Seven 2 Go Pro z mikroelektrodą	Mettler Toledo		Aby określić pH krwi ryb
Igły do wstrzykiwacza insuliny Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Do zabiegu iniekcyjnego. Każda cienka igła (Ø 0,33 mm lub mniej) jest odpowiednia
Kapilary szklane, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	Do procedury iniekcyjnej
Palnik			Do stalowej igły do szklanej kapilary
Mikrowtryskiwacz IM-9B	NARISHIGE		Do precyzyjnego dozowania zawiesiny mikrokapsułek
Petriego, 60 mm x 15 mm, polistyren	SIGMA	P5481	Do manipulacji rybami pod narkozą
Łyżka			plastikowaDo manipulacji rybami pod narkozą
Wilgotna gąbka			Do manipulacji rybami pod narkozą
Nożyczki preparacyjne	Thermo Scientific	31212	Aby usunąć pokrywę skrzeli z głowy ryby
Pipeta Pasteura, 3,5 ml	MARKI	Z331767	Do nawilżania skrzeli ryb