Artykuł metodologiczny

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

DOI:

10.3791/57492

⸱

11 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy wprowadzenie leków modulujących CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) zrewolucjonizowało opiekę nad pacjentami z mukowiscydozą (CF), obecnie stosowany model terapii ukierunkowanej na genotyp ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, rzadkie lub niedostatecznie zbadane grupy mutacji są wykluczone z ostatecznych badań klinicznych. Co więcej, w miarę pojawiania się na rynku kolejnych leków modulujących, trudno będzie zoptymalizować wybór modulatorów dla poszczególnych pacjentów. Oba te zagadnienia są rozwiązywane za pomocą opracowanych przez pacjenta, zindywidualizowanych modeli przedklinicznych funkcji i modulacji CFTR. Ludzkie komórki nabłonka nosa (HNE) są łatwo dostępnym źródłem tkanki oddechowej dla takiego modelu. W niniejszym artykule opisano generowanie trójwymiarowego modelu sferoidalnego funkcji i modulacji CFTR przy użyciu pierwotnych HNE. HNE są izolowane od badanych w minimalnie inwazyjny sposób, namnażane w warunkach warunkowego przeprogramowania i zasiewane do kultury sferoidalnej. W ciągu 2 tygodni od wysiewu kultury sferoidalne wytwarzają sferoidy HNE, które mogą być stymulowane przez agonistów wytwarzających 3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP) w celu aktywacji funkcji CFTR. Obrzęk sferoidalny jest następnie określany ilościowo jako wskaźnik aktywności CFTR. Sferoidy HNE wykorzystują minimalnie inwazyjne, ale oddechowe pochodzenie komórek nosa, aby wygenerować dostępny, spersonalizowany model odpowiedni dla nabłonka odzwierciedlającego zachorowalność i śmiertelność choroby. W porównaniu z kulturami HNE na granicy faz powietrze-ciecz, sferoidy dojrzewają stosunkowo szybko, co zmniejsza ogólny wskaźnik zanieczyszczenia. W swojej obecnej formie model jest ograniczony niską przepustowością, choć jest to równoważone przez względną łatwość pozyskiwania tkanek. Sferoidy HNE mogą być wykorzystywane do wiarygodnego ilościowego określania i charakteryzowania aktywności CFTR na poziomie indywidualnym. Trwające badanie mające na celu powiązanie tej kwantyfikacji z odpowiedzią na leki in vivo określi, czy sferoidy HNE są prawdziwym przedklinicznym predyktorem odpowiedzi pacjenta na modulację CFTR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukowiscydoza (CF) jest śmiertelną, autosomalną recesywną chorobą, która dotyka ponad 70 000 osób na całym świecie1. Ta skracająca życie choroba genetyczna jest spowodowana mutacjami w białku regulatora przewodnictwa transbłonowego mukowiscydozy (CFTR)2. CFTR należy do rodziny kaset wiążących trifosforan adenozyny i działa jako kanał jonowy umożliwiający ruch chlorków i wodorowęglanów przez błony wierzchołkowe wielu spolaryzowanych nabłonków, w tym między innymi przewodu pokarmowego, gruczołu potowego i drzewa oddechowego3,4. W związku z tym dysfunkcyjny CFTR prowadzi do dysfunkcji nabłonka wieloukładowego, przy czym większość śmiertelności wynika z choroby układu oddechowego1. W płucach z mukowiscydozą utrata regulacji powierzchni dróg oddechowych (ASL) i uwalnianie śluzu przez CFTR prowadzi do zagęszczenia śluzu, niedrożności dróg oddechowych, przewlekłej infekcji oraz postępującej przebudowy dróg oddechowych i utraty funkcji płuc1,5.

Pomimo identyfikacji dysfunkcji CFTR jako przyczyny choroby, terapie w CFTR tradycyjnie koncentrowały się na łagodzeniu objawów (np. terapia zastępcza enzymami trzustkowymi, terapie oczyszczające drogi oddechowe)1. Podejście to zostało niedawno zrewolucjonizowane przez pojawienie się nowych środków terapeutycznych, określanych jako "modulatory CFTR", które są bezpośrednio ukierunkowane na dysfunkcyjny CFTR. To podejście zmieniło krajobraz kliniczny z leczenia objawów na opiekę modyfikującą przebieg choroby, ale niesie ze sobą kilka ograniczeń6,7,8,9,10. Aktywność modulatora jest specyficzna dla defektu białka towarzyszącego każdej mutacji CFTR i ograniczona do wybranych populacji genetycznych11. Ograniczenie to wynika z niejednorodnego charakteru defektów białek, ale także z niepraktyczności badań klinicznych w grupach z rzadkimi mutacjami. Ponadto wśród osób o dobrze zbadanych genotypach (np. F508del/F508del CFTR, najczęstsza mutacja CFTR), występuje duża zmienność w obciążeniu chorobą i odpowiedzi modulatora6,7,8,9,11.

Aby przezwyciężyć oba te problemy, badacze zaproponowali użycie spersonalizowanych modeli do badań przedklinicznych12. Koncepcja ta wykorzystuje tkankę specyficzną dla pacjenta do wygenerowania zindywidualizowanego systemu modelowego ex vivo do testowania związków, przewidując reakcję pacjenta in vivo na terapie w spersonalizowany sposób. Po walidacji taki model może być wykorzystywany przez klinicystów do prowadzenia terapii precyzyjnej niezależnie od podstawowego genotypu CFTR pacjenta.

Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (HBE) uzyskane z tkanki eksplantacji w czasie przeszczepu płuc ustaliły możliwość takiego modelu dla CF13,14. HBE hodowane na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) pozwalają na funkcjonalną kwantyfikację CFTR bezpośrednio za pomocą testów elektrofizjologicznych lub pośrednio za pomocą pomiarów homeostazy ASL13,15. Model ten miał kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii CFTR i był kluczowym czynnikiem w rozwoju modulatorów CFTR16. Niestety, modele HBE nie są możliwe do utrzymania jako model spersonalizowany ze względu na inwazyjny charakter pozyskiwania (przeszczep płuc lub szczotkowanie oskrzeli) oraz brak próbek dla osób z rzadkimi mutacjami lub łagodną chorobą. I odwrotnie, tkanka jelitowa, uzyskana z próbek z biopsji odbytnicy lub dwunastnicy, może być wykorzystana do pomiaru prądu jelitowego (ICM) lub testu organoidowego opartego na obrzęku do badania zindywidualizowanej funkcji CFTR17,18,19. Testy organoidowe, w szczególności, są bardzo czułymi modelami aktywności CFTR20,21,22. Oba modele są ograniczone przez źródło tkankowe (tkanka jelitowa, podczas gdy większość patologii chorobowej ma charakter oddechowy) i półinwazyjną metodę pozyskiwania. Alternatywnie, kilku badaczy badało ludzkie komórki nabłonka nosa (HNE) w celu modelowania odbudowy CFTR23,24,25. HNE mogą być bezpiecznie zbierane za pomocą pędzla lub łyżeczkowania u osób w każdym wieku, a gdy są hodowane w ALI, podsumowują wiele cech HBEs25,26,27,28. Kultury jednowarstwowe HNE były tradycyjnie ograniczone transformacją płaskonabłonkową i długim czasem do dojrzałości29. Co więcej, zgłoszone pomiary prądu zwarciowego w HNE są mniejsze niż w HBE, co sugeruje mniejsze okno do wykrycia skuteczności terapeutycznej25.

Biorąc pod uwagę potrzebę spersonalizowanego, nieinwazyjnego modelu hodowli tkanek oddechowych funkcji CFTR, staraliśmy się połączyć czułość testu organoidowego opartego na obrzęku z nieinwazyjnym i oddechowym charakterem HNE. W tym miejscu opisujemy naszą metodę generowania trójwymiarowych "sferoidalnych" kultur HNE do zindywidualizowanego badania CFTR w teście opartym na pęcznieniu30. Sferoidy HNE polaryzują się niezawodnie z wierzchołkiem nabłonka w kierunku środka kuli lub światła. Model ten podsumowuje wiele cech nabłonka dolnych dróg oddechowych i dojrzewa szybciej niż kultury ALI. Jako test funkcjonalny, sferoidy HNE niezawodnie określają ilościowo zakres funkcji CFTR, a także modulacji w dobrze zbadanych grupach mutacji (np. F508del CFTR). Ten test oparty na pęcznieniu wykorzystuje właściwości transportowe jonów / soli CFTR, pośrednio mierząc napływ płynu do sferoidy, gdy woda podąża za wierzchołkowym wypływem soli. W ten sposób stymulowane sferoidy z w pełni funkcjonalnym CFTR silnie pęcznieją, podczas gdy te z dysfunkcyjnym CFTR puchną mniej lub kurczą się. Jest to określane ilościowo poprzez analizę obrazu sferoid przed i 1 godziną po stymulacji, mierząc powierzchnię światła i określając zmianę procentową. Pomiar ten można następnie porównać w różnych grupach eksperymentalnych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem bioaktywności leku w sposób specyficzny dla pacjenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki HNE zostały pobrane od osób zrekrutowanych przez Centrum Badań nad CF w Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Przed badaniem uzyskano pisemną zgodę od wszystkich badanych.

1. Przygotuj pożywkę ekspansywną i pożywkę z antybiotykiem

  1. Zbierz składniki nośnika wymienione w Tabeli 1. Rozmrozić zamrożone materiały w temperaturze pokojowej i przygotować niezbędne roztwory podstawowe, jak wskazano w tabeli 1 pod "Podłoża rozprężne".
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z toksyną, która jest toksyczna w przypadku spożycia i działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe. Przygotuj i połącz wszystkie roztwory i media w czystych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml wyjąć i wyrzucić 50 ml pożywki bazowej (Dulbecco Modified Eagle Medium/F12) z jednego pojemnika, aby skompensować dodanie innych materiałów. Wlej ręcznie wszystkie podłoża bazowe do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 1 l.
  3. Używając pipety serologicznej o pojemności 50 ml lub pipety o pojemności 1 ml, w zależności od przypadku, przenieść wszystkie pozostałe składniki z sekcji "Pożywka eksplatacyjna" w tabeli 1 do autoklawowanej szklanej butelki zawierającej pożywkę. Delikatnie zakręć butelką ręcznie, aby wymieszać.
  4. Przefiltrować media do świeżej, sterylnej kolby filtracyjnej z polieterosulfonu (PES) o pojemności 1 l, 0,22 μm, postępując zgodnie z instrukcjami producenta i opatrzoną adnotacją "Pożywka rozprężna" i datą.
  5. Przygotuj pożywkę z antybiotykiem. Przygotować niezbędne roztwory podstawowe antybiotyków, jak wskazano w Tabeli 1 w części "Pożywki z antybiotykami".
    1. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml przenieś 150 ml podłoża ekspandującego do świeżej szklanej butelki o pojemności 250 ml w autoklawie.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml dodać wszystkie składniki z sekcji "Pożywki antybiotykowe" w tabeli 1 do autoklawowanej szklanej butelki zawierającej pożywkę. Obracaj ręcznie, aby wymieszać, aż podłoże będzie miało jednolity wygląd.
    3. Przefiltrować pożywkę do świeżej, sterylnej kolby filtracyjnej PES o pojemności 250 ml i 0,22 μm, postępując zgodnie z instrukcjami producenta i opatrzoną adnotacją "Pożywka antybiotykowa" i datą.
  6. Przechowywać nośniki w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca, wyrzucając je w przypadku zmętnienia, co sugeruje zanieczyszczenie.

2. Przygotuj nośniki różnicujące

  1. Zbierz składniki nośnika wymienione w Tabeli 2. Rozmrozić zamrożone materiały w temperaturze pokojowej i przygotować niezbędne roztwory podstawowe, jak wskazano w tabeli 2.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z kwasem retinowym, który jest toksyną reprodukcyjną, może być toksyczny w przypadku połknięcia i powoduje podrażnienie skóry. Przyrządzić, poddzielić i połączyć wszystkie roztwory i media w czystych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Wyjąć i wyrzucić 52 ml podłoża bazowego z jednego pojemnika, aby skompensować dodanie innych materiałów. Wlej wszystkie podłoża bazowe do autoklawizowanej szklanej butelki o pojemności 1 l.
  3. Używając odpowiednio pipety serologicznej o pojemności 25 ml lub pipety o pojemności 1 ml, przenieść wszystkie pozostałe składniki z tabeli 2 do szklanej butelki z autoklawem zawierającej pożywkę i delikatnie obracać ręcznie w celu wymieszania.
  4. Przefiltrować media do świeżej, sterylnej kolby filtracyjnej z polieterosulfonu (PES) o pojemności 1 l, 0,22 μm, postępując zgodnie z instrukcjami producenta i opatrzoną adnotacją "Pożywka różnicująca" i datą.
  5. Przechowywać nośniki w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca, wyrzucając je w przypadku zmętnienia, co sugeruje zanieczyszczenie.

3. Naczynia do hodowli płaszczy i fibroblasty do karmienia talerzy

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w czystych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Wymieszaj 0,5 ml bulionu kolagenowego i 37,5 ml sterylnej wody w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  2. Odpipetować 4-5 ml roztworu kolagenu do każdego czystego naczynia hodowlanego P100, upewniając się, że cała powierzchnia jest pokryta.
  3. Przykryć naczynia pokrywkami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego zdejmij wszystkie pokrywki naczyń. Zamieszaj roztwór, aby przykryć naczynie, a następnie aspirować.
  5. Sterylizuj przez wystawienie na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 1 godzinę. Umieść pokrywki z powrotem na naczyniach, ułóż naczynia i przykryj je folią aluminiową.
  6. Naczynia powlekane należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3-6 miesięcy, ponownie sterylizując w świetle UV 15-30 minut przed użyciem hodowli komórkowej.
  7. 24 godziny przed pobraniem próbki HNE wysterylizować wstępnie powlekane naczynie i oznaczyć jako Fibroblasty embrionalne myszy (MEF) i datę.
  8. Dodać pożywkę eksplatacyjną, aby przykryć płytkę (około 5 ml) pipetą serologiczną.
  9. Rozmrozić fiolkę z 2 x 106 napromieniowanymi MEF-ami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Jak tylko MEF-y zostaną rozmrożone, dodaj połowę fiolki (około 10-6 komórek) do naczynia za pomocą pipety o pojemności 1 ml, obracając ręcznie w celu rozproszenia.
  10. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc w celu przygotowania do hodowli HNE.
    UWAGA: W razie potrzeby kroki 3.7-3.10 można wykonać dopiero 60 minut przed posiewem komórek, chociaż idealna jest noc.

4. Pobieranie i przetwarzanie próbki HNE

  1. Upewnij się, że uzyskano zgodę/zgodę zatwierdzoną przez IRB dla wszystkich uczestników.
  2. Poproś pacjenta o wydmuchanie nosa, aby usunąć luźny śluz.
  3. Wizualizuj małżowinę dolną za pomocą rinoskopu. Upewnij się, że nie ma żadnych zmian chorobowych ani polipów, które mogą uniemożliwić pobranie próbki.
  4. Zbierz komórki nosa z pierwszego nozdrza za pomocą łyżeczkowania lub szczotkowania.
    1. Łyżeczkowanie: Zegnij łyżeczkę w jej środku, aby utworzyć niewielki kąt ~ 135 ° z wierzchołkiem odchylonym od kubka na łyżeczkę. Włóż łyżeczkę do nozdrza i wsuń kubek kiretki pod dolną małżowinę. Delikatnie dociśnij kubek kiretki do dolnej małżowiny i zeskrob małżowinę, ciągnąc łyżeczkę do przodu, powtarzając łącznie 3-4 razy.
    2. Szczoteczka: Przełóż szczoteczkę cytologiczną poniżej dolnej małżowiny, a następnie obróć i lekko wsuń i wysuń szczoteczkę 4-5 razy, nie wychodząc z nozdrza.
  5. Umieść kiretę/pędzel w stożkowym pojemniku o pojemności 15 ml wypełnionym pożywką antybiotykową. Powtórz kroki 4.3-4.4 dla drugiego nozdrza, umieszczając łyżeczkę/szczoteczkę w tej samej stożkowej rurce.
  6. Przechowywać stożkowy na lodzie, aż będzie gotowy do obróbki. Upewnij się, że przetwarzanie odbywa się w ciągu 4 godzin od pobrania próbki, ale w razie potrzeby może nastąpić dopiero po 24 godzinach od pobrania.

5. Przetwarzanie i rozszerzanie komórek HNE w naczyniach

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w czystych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Używając pipety o pojemności 1 ml i pożywki ze stożkowej próbki, zmyj wszystkie komórki z łyżeczki/szczoteczek cytologicznych do tej samej stożkowej probówki. Po oczyszczeniu wyrzuć kirety / pędzle.
  2. Wirówka stożkowa przy 360 x g i 4 °C przez 5 min.
  3. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml roztworu do oddzielania komórek, pipetując końcówką o pojemności 1 ml w celu homogenizacji mieszaniny.
  5. Wirówka stożkowa przy 360 x g i 4 °C przez 5 min.
  6. Powtórz kroki 5.3-5.5 raz.
  7. Odessać pozostały supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  8. Ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki antybiotykowej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  9. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml umieść komórki kroplami na pokrytym naczyniem wysiewanym przez fibroblasty, przygotowanym w kroku 3.10. Dodaj pożywkę z antybiotykiem, aby całkowicie pokryć naczynie i rozproszyć komórki po powierzchni. Oznaczyć naczynie zawartością i datą i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  10. Po 48 godzinach upewnij się, że komórki są przymocowane do naczynia hodowlanego. Odessać podłoże i zastąpić je wystarczającą ilością świeżego podłoża antybiotykowego, aby pokryć płytkę.
  11. Zmieniaj pożywkę 3 razy w tygodniu, odsysając stare podłoża za pomocą przewodu próżniowego i pipety Pasteura, a następnie zastępując je wystarczającą ilością świeżego podłoża, aby pokryć płytkę. Po 5 dniach stosowania pożywki z antybiotykami zmień pożywkę na pożywkę rozszerzającą, kontynuując wymianę trzy razy w tygodniu.
    UWAGA: Ryzyko zanieczyszczenia jest wysokie w pierwszym tygodniu hodowli. Świeże próbki należy przechowywać w oddzielnym inkubatorze, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego.
  12. Sprawdzaj wzrost komórek kilka razy w tygodniu. Gdy komórki zlewają się w około 70-80%, przejdź do komórek pasażowych.

6. Komórki HNE przejścia

  1. Przygotować 0,1% roztwór trypsyny w kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z trypsyną, która działa drażniąco na skórę, drogi oddechowe i oczy.
    1. Odważyć 15 mg trypsyny z trzustki świni w stożkowej probówce.
    2. Odważyć 56 mg EDTA w oddzielnej stożkowej probówce.
    3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś trypsynę i EDTA do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 250 ml. Użyj małej porcji sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do przepłukania probówek trypsyna/EDTA, aby zapewnić całkowity transfer.
    4. Dodaj sterylny PBS, aby uzyskać całkowitą zawartość roztworu do 150 ml. Szczelnie zamknij pokrywę.
    5. Inkubować roztwór trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Sprawdzaj co 15 minut i natychmiast usuń po rozpuszczeniu.
      UWAGA: Nie pozostawiaj bez kontroli przez dłuższy czas (np. na noc), ponieważ trypsyna w roztworze ulegnie denaturacji, jeśli będzie podgrzewana zbyt długo.
    6. Wyczyść butelkę 2-3 rozpyleniami 70% etanolu i włóż z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    7. Przefiltrować 0,1% roztwór trypsyny-EDTA do świeżej, sterylnej kolby filtracyjnej PES o pojemności 250 ml i 0,22 μm, postępując zgodnie z instrukcjami producenta i opatrzoną adnotacją z zawartością i datą.
    8. Roztwór trypsyny-EDTA przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca, wyrzucając w przypadku zmętnienia.
  2. Doprowadź pożywkę różnicującą, 0,1% roztwór trypsyny-EDTA i sterylny PBS do temperatury pokojowej w ciągu 30 minut. Wyczyść 70% etanolem i przenieś do czystej szafki bezpieczeństwa biologicznego.
  3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj przewodu próżniowego i pipety Pasteura, aby odessać i wyrzucić pożywkę z naczynia do hodowli tkankowej. Umyj naczynie, dodając, mieszając i odsysając 5 ml PBS za pomocą czystej pipety serologicznej.
  4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać 5 ml 0,1% roztworu trypsyny-EDTA do naczynia do hodowli tkankowej i powrócić do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut.
  5. Wizualizuj komórki pod odwróconym mikroskopem z powiększeniem 4-10X. Sprawdź, czy komórki odłączają się od naczynia, stają się okrągłe i unoszą się na wodzie. Delikatnie postukaj w bok naczynia hodowlanego, aby usunąć komórki i/lub ponownie inkubować przez dodatkowe 5 minut, aż większość komórek zostanie odłączona.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby szybko usunąć komórki po odłączeniu od naczynia hodowlanego; długotrwała ekspozycja na 0,1% trypsyny-EDTA upośledza żywotność komórek.
  6. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj 5 ml pożywki ekspansywnej do naczynia i zbierz całą płynną zawartość (łącznie 10 ml) do oznakowanej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  7. Jeśli komórki pozostają przylegające do szalki hodowlanej, powtórz kroki od 6.4 do 6.6 do dwóch razy, zbierając zawartość do tej samej stożkowej probówki.
    1. Jeśli komórki pozostają przylegające do szalki hodowlanej po trzech rundach ekspozycji na roztwór trypsyny, użyj sterylnego skrobaka do komórek, delikatnie usuń resztę. Po zeskrobaniu naczynia umyj skrobak i naczynie 5 ml pożywki rozprężnej i zbierz w tej samej oznaczonej stożkowej probówce.
      UWAGA: W przypadku przechodzenia do sferoid zmodyfikuj tę procedurę, aby przeprowadzić trypsynizację różnicową. Po dodaniu roztworu trypsyny (krok 6.4.) często sprawdzaj naczynie, aż fibroblasty oderwą się (zwykle 1-2 minuty), pozostawiając tylko wielokątne komórki nabłonkowe przyczepione do naczynia. Zbierz i odłóż na bok ten supernatant, który może być przenoszony do przodu w celu ekspansji. Powtórz kroki 6.4-6.6 używając tego samego roztworu trypsyny i zbierz tylko pozostałe komórki nabłonka do hodowli sferoidalnej.
  8. Wirować stożkowo przy 360 x g przez 5 min i 4 °C. Zasysać pożywkę ze stożkowej.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki eksplatacyjnej i policzyć komórki za pomocą hemacytometru.
  10. Po ilościowym określeniu komórek można w razie potrzeby podzielić i albo przenieść do przodu na nową szalkę hodowlaną (w tym przygotowanie kokultury fibroblastów, etap 3 i posianie komórek do ekspansji, kroki 5.9-5.12), albo hodować jako sferoidy (etap 7).
    UWAGA: W przypadku przejścia do nowej szalki hodowlanej w celu ekspansji zalecana jest gęstość wysiewu 0,5-1 × 106 komórek w naczyniu P100.

7. Komórki wysiewające dla kultur sferoidalnych HNE

UWAGA: Przeprowadź wszystkie procedury w tym kroku, inne niż wirowanie, w czystej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie zgodnie z instrukcjami producenta (100 μl na studzienkę sferoidalną).
    UWAGA: Rozważ wykonanie sterylnych 500 μl podwielokrotności matrycy membrany podstawnej przy odbiorze; Ta ilość wysiewa pojedynczą 4-dołkową płytkę.
  2. Oddzielić odpowiednią liczbę różnie trypsynizowanych, pasażowanych komórek (od kroku 6.9) do końcowego stężenia 500 000 komórek na ml matrycy. W przypadku płytki 4-dołkowej użyj 200 000 komórek. Zebrać w probówce o pojemności 1,5 ml.
  3. Odwirować mieszaninę komórek i pożywki przy 360 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie, ale ostrożnie, odessać i wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  4. Używając końcówki do pipety o pojemności 1 ml, dodaj 100 μl na planowaną studzienkę matrycy błony podstawnej do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej komórki. Trzymaj probówkę na lodzie.
  5. Pipetować w górę i w dół, aby ostrożnie i dokładnie zawiesić komórki w matrycy błony podstawnej. Poruszaj się szybko, aby uniknąć zestalenia się matrycy. Unikaj całkowitego opróżniania końcówki pipety, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza nie zostaną wprowadzone do mieszanki matrycy/komórki.
  6. Wysiewać 100 μl podwielokrotności matrycy do każdej studzienki 4-dołkowej płytki hodowlanej IVF.
    1. Za pomocą czystych nożyczek odetnij dystalną 3-4 mm końcówkę pipety o pojemności 200 μl.
    2. Za pomocą przyciętej końcówki ostrożnie odpipetuj 100 μl mieszaniny komórek/matryc do środka każdej studzienki. Pipetuj powoli, mając na celu zrobienie pojedynczej "kropli" matrycy w środku każdego dołka. Kropla powinna pozostać kulista i nie powinna dotykać boków studni. Podczas przesuwania płytki należy robić to ostrożnie, aby nie naruszyć tych kropli.
    3. Inkubować krople matrycy błony podstawnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut, aż do zestalenia.
    4. Ostrożnie odpipetować 500 μl pożywki różnicującej do każdego dołka, uważając, aby nie naruszyć kropli matrycy. Upewnij się, że nośnik po prostu zakrywa kroplę matrycy i dodaj więcej, jeśli to konieczne.

8. Różnicowanie i dojrzałość sferoid HNE

  1. Używając końcówki do pipety o pojemności 1 ml, delikatnie odessać wszystkie podłoża ze studzienki; unikać zasysania matrycy, ponieważ spowoduje to zniszczenie sferoid w tej części matrycy, chociaż wszelkie sferoidy pozostawione mogą pozostać żywe.
  2. Używając świeżej końcówki do pipety o pojemności 1 ml, delikatnie dodaj 500 μl pożywki różnicującej do dołka wokół matrycy. Nie dotykaj matrycy pipetą i nie należy naruszać kropli matrycy.
  3. Przywrócić sferoidy do inkubatora w temperaturze 37 oC i 5% CO2 w celu dalszego wzrostu. Powtarzaj kroki od 8.1 do 8.3 trzy razy w tygodniu.
  4. Morfologię sferoidów należy oceniać codziennie pod mikroskopem odwróconym pod kątem 20X. Sferoidy powinny powstać w ciągu 3-5 dni od posiewu i osiągnąć dojrzałość w ciągu około 10 dni.

9. Preklecja, stymulacja i obraz sferoid HNE do analizy

  1. Przed przystąpieniem do obrazowania należy wstępnie przygotować sferoidy zgodnie z wcześniejszym opisem30.
    UWAGA: W przypadku obróbki wstępnej VX809 dodaj 3 μM VX809 do podłoża przez 48-72 godziny przed obrazowaniem. Wymieszaj 1 μl 10 mM bulionu VX809 (patrz tabela materiałów) w 3,3 ml pożywki dla tego stężenia.
  2. Zmienić każdą studzienkę sferoid na 1 ml świeżej pożywki różnicującej, w tym obróbkę wstępną (kroki 8.1-8.3) przed obrazowaniem sferoid.
  3. Przygotuj świeże roztwory leków stymulujących (forskolina, 3-izobutylo-1-metyloksantyna [IBMX], VX770 i inhibitor CFTR 172 [Inh172]) z zapasów (patrz tabela materiałów). W przypadku forskoliny/IBMX dodać 1 μl każdego bulionu do 98 μl sterylnej wody w pojedynczej, oznakowanej probówce o pojemności 1,5 ml. W przypadku VX770 i Inh172 dodaj 1 μl każdego bulionu do 99 μl sterylnej wody w oddzielnych oznakowanych probówkach o pojemności 1,5 ml. Uzupełnić całkowitą objętość pozwalającą na dodanie 50 μl roztworu na każdy dobrze przetestowany egzemplarz. Przygotować roztwory w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Przenieść płytkę sferoidalną do komory inkubacyjnej ustawionej na 37 °C i 5% CO2 , zamontowanej na mikroskopie odwróconym wyposażonym w elektroniczne oprogramowanie do przechwytywania obrazu i mechaniczny stolik do regulacji XY. Włącz mikroskop i kamerę, a także komputer do obrazowania.
  5. Przechwytywanie podstawowych obrazów sferoid w jednym dołku.
    1. Otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu (Slidebook 5.5, aby uzyskać wskazówki poniżej). Po zainicjowaniu otwórz nowy plik, klikając "Plik", a następnie "Nowy". Nazwij plik odpowiednio i kliknij "Zapisz".
    2. Ostrożnie zdejmij pokrywę płytki hodowlanej i wyśrodkuj jedną kroplę matrycy nad obiektywem.
    3. Zaczynając od górnej części kropli matrycy, poruszaj się po siatce, aby znaleźć sferoidy w 20-krotnym powiększeniu za pomocą okularu mikroskopu. Ustaw ostrość w górę i w dół, aby uchwycić kulę w jej najszerszym punkcie. Opisz położenie każdej sferoidy na mapie kropli matrycy, aby ponownie zidentyfikować ją po zobrazowaniu.
    4. W oprogramowaniu kliknij "Image-Capture". W polu Ekspozycja wybierz "Ręcznie" i wprowadź 50 ms. Upewnij się, że inne ustawienia są odpowiednie (współczynnik kosza: 1x1, W: 512, H: 512, przesunięcie X i Y: 0). Wprowadź odpowiednią nazwę dla każdego obrazu w polu "Nazwa" (np. Spheroid 1 Baseline). Kliknij "Start", aby wyświetlić obraz na żywo, i "Zapisz", aby przechwycić obraz linii bazowej.
    5. Powtarzaj kroki 9.5.1-9.5.4, aż zostanie osiągnięty numer celu lub zostanie zobrazowany cały spadek matrycy.
      UWAGA: Różnice grupowe można wykryć już przy 3-5 sferoidach na warunek, jednak naszą praktyką stało się obrazowanie 10 lub więcej sferoid na warunek w celu zwiększenia mocy. Zmienność testu jest pokazana na Rysunek 2 w sekcji "Reprezentatywne wyniki", z próbkami 8-10 sferoid na obiekt jako przykładem.
  6. Stymuluj sferoidy.
    1. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl dodać 50 μl odpowiedniego leku stymulującego do pożywki w studzience, uważając, aby nie naruszyć matrycy.
      UWAGA: Po tym 10-krotnym rozcieńczeniu (50 μL na 500 μL pożywki) końcowe stężenie leku wynosi: forskolina 10 μM, IBMX 100 μM, VX770 1 μM, Inh172 10 μM.
    2. Tylko w przypadku cAMP dodaj tylko forskolinę/IBMX.
    3. W przypadku cAMP + VX770 najpierw dodaj forskolinę/IBMX, a następnie VX770 po 2 minutach.
    4. W stanach zahamowanych należy najpierw dodać Inh172, a następnie forskolinę/IBMX po 2 minutach.
  7. Bezpośrednio po stymulacji monitoruj obrzęk sferoidalny za pomocą obrazowania poklatkowego przez 1 godzinę. W oprogramowaniu kliknij "Image-Capture". Kliknij "Timelapse" i ustaw interwał na 30 s, z czasem trwania 60 min. Wprowadź odpowiednią nazwę i kliknij "Zapisz", aby uruchomić timelapse.
    UWAGA: Standardowy timelapse polega na przechwytywaniu obrazów pojedynczej sferoidy co 30 sekund, aby zapewnić wysoką jakość wideo. Alternatywnie, wykonaj przechwytywanie całego dołka w mniejszym powiększeniu (np. 4X) i mniej przechwytywanych obrazów, jeśli jest to pożądane. Jeśli używany jest etap automatyczny, wykonaj timelapse wszystkich sferoid przy użyciu predefiniowanych współrzędnych; W przeciwnym razie należy użyć timelapse podzbioru sferoid, aby zapewnić jakościowy przegląd obrzęku i upewnić się, że podczas obrazowania nie wystąpią żadne systematyczne problemy (np. oderwanie się matrycy od studzienki).
  8. Natychmiast po wykonaniu 1-godzinnego zdjęcia poklatkowego uchwyć obrazy wszystkich sferoid po stymulacji (zgodnie z krokiem 9.5), korzystając z mapy utworzonej w kroku 9.5.3.
    1. Zapoznaj się z obrazami przed stymulacją, aby upewnić się, że ta sama płaszczyzna ostrości jest używana do obrazów uzupełniających (jakość ogniskowania otaczających komórek, sferoid lub szczątków znacznie ułatwia ten proces).
    2. Zapisz pliki ze sparowaną adnotacją z kroku 9.5.4 (np. Spheroid 1 Post-Stimulation).
      UWAGA: Wykonaj ten krok natychmiast po timelapse, ponieważ sferoidy mogą nadal puchnąć.
  9. Zastąp nośniki w dobrze obrazowanym nośnikiem na nowe nośniki różnicujące.
  10. Powtórz kroki od 9.5 do 9.9 dla każdej studzienki/stanu, dostosowując leki stymulujące zgodnie ze wskazaniami dla warunków eksperymentalnych.
  11. Po zakończeniu wszystkich obrazowań należy umieścić sferoidy z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: W zależności od sterylności inkubowanej komory mikroskopowej, zanieczyszczenie sferoid po stymulacji może być dość powszechne. Zobrazowane sferoidy należy przechowywać w oddzielnym inkubatorze, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, lub wyrzucić sferoidy natychmiast po obrazowaniu.

10. Analizuj obrazy sferoidalne HNE

  1. Eksportuj wszystkie przechwycone obrazy do formatu zgodnego z oprogramowaniem do analizy obrazów. W oprogramowaniu kliknij "Widok", najedź kursorem na "Eksportuj" i wybierz "Domyślne widoki wszystkich obrazów jako TIFF... ". Zapisz na dysku twardym lub dysku flash do analizy.
    UWAGA: Komercyjne oprogramowanie analityczne (Tabela materiałów) i pliki .tiff działają dobrze i są opisane tutaj, chociaż analizę można również przeprowadzić za pomocą innych platform. Podczas nazywania plików personel analizujący obrazy powinien być ślepy na warunki eksperymentalne, ale świadomy, które obrazy są sparowane (przed i po stymulacji), aby zapewnić równoważną analizę.
  2. Korzystając z oprogramowania analitycznego, wyznacz obszar światła każdego obrazu sferoidalnego i wyeksportuj go do oprogramowania do analizy danych.
    1. Otwarte oprogramowanie analityczne. Kliknij "Plik", a następnie "Otwórz" i przejdź do folderu plików zawierającego obrazy sferoidalne. Wybierz wszystkie obrazy do analizy i kliknij "Otwórz".
    2. Kliknij "Pomiar" i wybierz "Pomiary regionu". W oknie dialogowym Pomiary regionu wybierz kartę rozwijaną "Konfiguracja" i upewnij się, że pola "Nazwa obrazu" i "Obszar" są zaznaczone.
    3. Kliknij "Zaloguj" i wybierz "Otwórz dziennik danych". Kliknij "OK" w oknie dialogowym Dziennik danych i odpowiednio nazwij plik (np. Warunek X, Data). Spowoduje to przeniesienie wszystkich pomiarów do arkusza kalkulacyjnego.
    4. Wybierz przycisk narzędzia "Śledź region" i ostrożnie prześledź światło sferoidy na pierwszym obrazie do analizy. W oknie dialogowym Pomiar regionu kliknij "Rejestruj dane", aby zarejestrować pomiar w programie Excel.
    5. Powtarzaj kroki 10.2.2-10.2.4, aż wszystkie sferoidy zostaną przeanalizowane.
  3. Oblicz procentową zmianę (100 * [Post-stim - Linia bazowa] ÷ Linia bazowa) w obszarze światła od linii podstawowej dla każdej pojedynczej pary obrazów sferoidalnych i skompiluj dane do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNE powinny przyczepić się do naczynia hodowlanego i utworzyć małe wyspy komórek w ciągu 72 godzin od wysiewu; przykłady dobrego i złego tworzenia się wysp w ciągu jednego tygodnia są pokazane odpowiednio w Rysunek 1A i 1B. Wyspy te powinny się rozszerzyć, aby pokryć danie w ciągu 15-30 dni. Małe lub nieoptymalne próbki mogą potrzebować więcej czasu i często nie dają użytecznych sferoid. O zakażeniu czynnikami zakaźnymi świadczy ciemnożółte/m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje generowanie hodowli sferoidalnych komórek nosa pochodzących od pacjenta, które są w stanie wytworzyć zindywidualizowany, specyficzny model funkcji CFTR. Istnieje kilka kluczowych kroków w procesie, które należy uważnie obserwować, aby uniknąć trudności. Pierwszym z nich jest dobre pobranie próbki z nosa pacjenta. Dobra próbka powinna mieć >50 000 komórek, ograniczoną ilość śluzu/zanieczyszczeń i być gotowa do przetworzenia w ciągu 4 godzin (chociaż sukces jest również łatwy do osiągnięcia dzięki nocn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, grant numer CLANCY14XX0, oraz przez Cystic Fibrosis Foundation, grant numer CLANCY15R0. Autorzy pragną podziękować Kristinie Ray za jej pomoc w rekrutacji pacjentów i nadzorze regulacyjnym. Autorzy pragną również podziękować grupie roboczej HNE, wspieranej przez Fundację Mukowiscydozy, która pomogła w tworzeniu możliwości hodowli HNE: Prestonowi Bratcherowi, Calvinowi Cottonowi, Martinie Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michaelowi Myerburgowi, Dave'owi Nicholsowi, Scottowi Randellowi, Steve'owi Rowe'owi, G. Marty'emu Solomonowi i Katherine Tuggle.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka EppendorfUSA Scientific 4036-3204
Kolba filtracyjna 150 ml Midsci TP99150Do filtrowania mediów
15 ml Rurka stożkowaMidsci 
1 L Kolba filtracyjna Midsci TP99950Do filtrowania mediów
35 mm Naczynie ze szklanym dnemMatTek CorporationP35G-0-20-COpcjonalnie
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)Fisher Scientific AC228420010 Przygotować 100 mM roztwór podstawowy 22,0 mg w 1 ml DMSO
Rurka stożkowa 50 ml Midsci  
AccutaseInnovative Cell Technologies, Inc.AT-104Roztwór do odrywania komórek
AdeninaSigma-AldrichA2786-25GZobacz tabelę 1
Amfoterycyna BSigma-AldrichA9528-100MGZobacz tabelę 1
Ekstrakt z mózgu bydlęcego (9 mg / ml)Lonza CC-4098Patrz Tabela 2
Hydrat ceftazydymuSigma-AldrichC3809-1GPatrz Tabela 1
Skrobaki do komórek 20 cm Średnia 
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430Przygotuj 10 mM roztwór podstawowy 4,0 mg w 1 ml DMSO
Toksyna B (z Vibrio cholerae)Sigma-AldrichC8052-.5MGZobacz tabelę 1
CYB-1Medical Packaging CorporationCYB-1Pędzel do cytologii
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes Technologie życiowe 11330-057Podłoże podstawowe; Zobacz tabele 1 i 2
Naskórkowy czynnik wzrostu (rekombinowane białko ludzkie, wolne od pochodzenia zwierzęcego)Thermo Fisher ScientificPHG6045Patrz Tabela 1
EpinefrynaSigma-AldrichE4250-1GPatrz Tabela 2
EtanolFisher Scientific 2701
EtanoloaminaSigma-AldrichE0135-500ML16,6 mM roztwór; Patrz Tabela 2
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)TCI America E0084
Płodowa surowica bydlęca (wysokowydajny FBS)Invitrogen 10082147Patrz Tabela 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50Przygotuj 10 mM roztwór podstawowy 4,1 mg w 1 ml
DMSO Growth Factor-Reduced MatrigelCorning, Inc.356231Matryca błony podstawnej Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), bez czerwieni fenolu, bez LDEV, 10 ml.
HemacytometrHausser Scientific1483
Roztwór kolagenu ludzkiego, typ I (VitroCol; 3 mg/mL)Zaawansowany BioMatrix5007-ARoztwór kolagenu
HyClone (aka FetalClone II) GE Healthcare SH30066.03HIZobacz Tabelę 2
HydrokortyzonTechnologie StemCell07904Zobacz Tabele 1 i 2
Insulina, ludzka rekombinant, roztwórLife Technologies 12585014roztwór o stężeniu 4 mg/ml; patrz Tabela 2
4-dołkowe naczynie IVF, NUNC bez obróbki(za pośrednictwem Fisher Scientific)125663504-dołkowa płytka do sferoid; wielkość studzienki zbliżona do płytki 24-dołkowej
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GNapromieniowane mysie fibroblasty embrionalne
Urządzeniamolekularne Metamorph 7.7Oprogramowanie analityczne; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software na wycenę
Mikroskop odwrócony Olympus IX51Firma Olympus Corporationzaprzestałaprodukcji mikroskopu do obrazowania. Zamiennik: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  za wycenę
Pen StrepLife Technologies 15140122Patrz Tabela 2
FsophoryletheanolamineSigma-AldrichP0503-5GPatrz Tabela 2
Kwas retinowySigma-AldrichR2625-50MGPatrz Tabela 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905Łyżeczka do nosa
Slidebook 5.53i, Intelligent Imaging InnovationsWycofaneoprogramowanie do obrazowania. Wymiana: Zeszyt slajdów 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook do wyceny
Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
Sterylna wodaSigma-AldrichW3500-6X500ML
Naczynie do hodowli tkankowych 100Techno Plastic Products93100Naczynie do hodowli tkankowych do
ekspansji TobramycynaSigma-AldrichT4014-100MGZobacz tabelę 1
Transferyna (transferyna ludzka 0,5 ml)Lonza CC-4205Zobacz tabelę 2
SólT6397-1G [T3]; Zobacz tabelę 2
Trypsyna z trzustki świniSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (przez Fisher Scientific)NC039302420 ml lipofilizowanego proszku; Patrz Tabela 2
Chlorowodorek wankomycyny ze Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5GPatrz Tabela 1
VX770Selleck ChemicalsS1144Przygotować 1 mM roztwór podstawowy 0,4 mg w 1 ml
DMSO VX809Selleck ChemicalsS1565Kupić lub przygotować 10 mM roztwór podstawowy 4,5 mg w 1 ml
dichlorowodorku DMSO Y-27632  Inhibitor ROCK Enzo Nauki Przyrodnicze ALX-270-333-M025 Patrz tabela 1
TP91015TP91050TP99010 sodowa 3,3′,5-trijodo-L-tyroniny trójjodo-Aldricha

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375(2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802(2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842(2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie kom rki nab onka nosabadanie funkcji CFTRgenerowanie kultur sferoid wwarunki warunkowego przeprogramowaniaagoni ci generuj cy cAMPtest obrz ku sferoid winkubacja w medium r nicuj cymmacierz b ony podstawnejocena pod mikroskopem odwr conymtestowanie modulator w CFTR

Powiązane artykuły