Artykuł metodologiczny

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

DOI:

10.3791/57494

⸱

7 maja 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, College of Bioscience and Biotechnology, Chungnam National University, 2Department of Pharmacology, College of Medicine, Chungnam National University, 3Department of Nursing, Gwangju Women's University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika pojedynczego genu pEUI(+) przez leczenie tebufenozydem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjna kontrola ekspresji transgenu jest pożądana w badaniach biologicznych i klinicznych. Jednak ze względu na to, że binarna cecha obecnie stosowanych przełączników genowych wymaga jednoczesnego przeniesienia dwóch terapeutycznych jednostek ekspresji do jednej komórki, praktyczne zastosowanie systemu w terapii genowej jest ograniczone. Aby uprościć system ekspresji transgenu, wygenerowaliśmy przełącznik genowy oznaczony jako pEUI(+) obejmujący kompletny zestaw modułów ekspresji transgenu w jednym wektorze. Składający się z domeny wiążącej DNA GAL4 i zmodyfikowanego EcR (GvEcR), minimalnej domeny aktywacyjnej VP16 połączonej z domeną wiążącą DNA GAL4, a także zmodyfikowanego receptora ekdyzonu Drosophila (EcR), nowo opracowany pojedynczy przełącznik genowy jest wysoce wrażliwy na podawanie induktora chemicznego w sposób zależny od czasu i dawki. Wektor pEUI(+) jest potencjalnie potężnym narzędziem do poprawy kontroli ekspresji transgenu zarówno w badaniach biologicznych, jak i badaniach przedklinicznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół modulacji przejściowej i stabilnej ekspresji transgenu za pomocą wektora pEUI(+) poprzez leczenie tebufenozydem (Teb). Ponadto dzielimy się ważnymi wskazówkami dotyczącymi stosowania Teb jako induktora chemicznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka różnych przełączników genów zostało zbadanych pod kątem ich zdolności do precyzyjnego regulowania ekspresji transgenów w hodowlach komórkowych i modelach zwierzęcych, z różnym skutkiem1,2,3. Potencjalne systemy przełączania genów powinny spełniać kilka rygorystycznych kryteriów, w tym: precyzyjną ekspresję kierunkową transgenu, reakcję na induktory zależną od dawki i czasu, znikomą nieszczelność promotora, odwracalność aktywacji transgenu poprzez usunięcie induktora oraz poziomy toksyczności induktora tolerowane przez linie komórkowe i zwierzęta laboratoryjne1,2,3. Wykorzystano kilka induktorów małocząsteczkowych, w tym tetracyklinę4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10 oraz ecdysone11,12,13,14. Ogólnie rzecz biorąc, systemy te wymagają co najmniej dwóch plazmidów zawierających dwie lub trzy odrębne jednostki ekspresji, z których jedna lub dwie tworzą element regulatorowy (plazmid induktora), który wiąże induktor małej cząsteczki w celu uzyskania aktywności transkrypcyjnej; oraz inny plazmid (plazmid efektorowy) zawierający transgen pod kontrolą regulatorowego regionu DNA, który umożliwia dostęp elementu regulatorowego związanego z induktorem. Główną wadą systemu binarnego jest to, że wymaga on jednoczesnego wprowadzenia dwóch wektorów (induktora i efektora) do komórki docelowej. W eksperymentach z przejściową ekspresją transgenu, jednoczesna transfekcja dwóch plazmidów nieuchronnie wytwarza populację komórek, która jest pojedynczo transfekowana za pomocą induktora lub efektora, lub współtransfekowana nierównomiernie. Ponadto system binarny wymaga co najmniej dwóch rund selekcji antybiotyków w celu ustalenia stabilnych linii komórkowych, co jest czasochłonne i pracochłonne. Tak więc połączenie wszystkich składników wymaganych do ekspresji i regulacji transgenu w jeden wektor byłoby idealne, aby zagwarantować jednoczesną ekspresję wszystkich wymaganych elementów w jednej komórce i umożliwić regulację ekspresji transgenu poprzez leczenie induktorami małocząsteczkowymi.

Aby przezwyciężyć niedociągnięcia binarnych przełączników genów, niedawno opracowaliśmy pojedynczy przełącznik genów, używając systemu indukowania genów opartego na EcR opartego na Drosophila melanogaster15. Ekdyzon pośredniczy w ekspresji genów, gdy wiąże się z heterodimerem EcR/ultraspiracle (USP), co z kolei indukuje wiązanie EcR z elementami regulatorowymi DNA3,11. Receptor X retinoidu kręgowców (RXR), ortolog USP owadów, rekrutuje EcR do utworzenia aktywnego aktywatora transkrypcji16. Tak więc, w celu docelowej ekspresji transgenu w komórkach lub tkance kręgowców, EcR i RXR muszą być jednocześnie wyrażane przed stymulacją przez ekdyzon lub jego agonistów. Ponieważ na heterodimeryczną cechę przełącznika genu opartego na EcR może mieć wpływ endogenny poziom RXR, Padidam i wsp. zastąpił domeny wiążące i aktywujące DNA EcR heterologicznymi domenami aktywacyjnymi GAL4 wiążącymi DNA, domenami aktywacyjnymi białka wirusa opryszczki pospolitej vmw65 (VP16) połączonymi z domeną wiążącą ligand EcR, która następnie przestała reagować na endogenny RXR i utworzyła homodimer w celu uzyskania aktywności transkrypcyjnej17. Przełącznik genowy oparty na EcR został dodatkowo ulepszony poprzez skonstruowanie chimerycznego białka składającego się z minimalnej domeny aktywacyjnej VP16 w połączeniu z GvEcR, które tworzyło homodimer i lokalizowało się w cytozolu pod nieobecność agonisty ekdyzonu, Teb16,18. Wiążąc się z Teb, GvEcR zmienił swoją subkomórkową lokalizację z cytozolu na jądro, aby rozpoznać hybrydowy promotor składający się z minimalnego promotora E1b danio pręgowanego w połączeniu z dziesięcioma tandemowymi powtarzającymi się sekwencjami aktywacji (UAS) w celu zainicjowania transkrypcji docelowego genu 16.

Aby uprościć wcześniej zgłoszone przełączniki genów oparte na EcR16,18, połączyliśmy binarne cechy systemu w jeden wektor wyposażony we wszystkie wymagane elementy do stymulowania ekspresji transgenu, a następnie oznaczyliśmy nowo wygenerowany wektor, pEUI(+) (numer dostępu GenBank: KP123436, Rysunek 1A)15. Efektor reagujący na sterownik GvEcR (zwany dalej sterownikiem) składa się z dziesięciu powtórzeń tandemowego UAS obok minimalnego promotora E1b, po których następuje miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) z sekwencjami rozpoznawania EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI i AflII (rysunek 1B). Dodatkowo, aby ułatwić selekcję transfekowanych komórek, gen N-acetylotransferazy puromycyny (PAC) sterowany promotorem SV40 umieszczono między regionami sterownika i efektora w celu utrzymania stabilnych linii komórkowych (Figura 1).

Opisujemy szczegółowy protokół przejściowej i stabilnej modulacji ekspresji transgenu za pomocą pEUI(+). Ponadto udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące skutecznego stosowania Teb jako agonisty ekdyzonu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Subklonowanie transgenu

  1. Wybierz odpowiednie miejsce (lub miejsca) rozpoznawania enzymu restrykcyjnego w MCS pEUI(+) i sklonuj interesujący nas gen w pożądanym kierunku (Rysunek 1).
    UWAGA: Transgen powtórzeń ankryny 13A (ANKRD13A) znakowany epitopem EGFP lub FLAG został subklonowany w miejscu EcoRI wektora pEUI(+) przy użyciu polimerazy DNA T4 w metodzie klonowania niezależnej od sekwencji i ligacji19.
  2. Linearyzować pEUI(+) za pomocą EcoRI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Wymieszać 50 ng/μl zlinearyzowanego pEUI(+) z 40 ng/μl EGFP lub ANKRD13A amplifikowanego PCR i reagować z polimerazą DNA T4 (1 U) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT) przed inkubacją na lodzie przez 10 minut. Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej bezpośrednio do 100 μl komórek kompetentnych DH10B do następującego eksperymentu transformacji.
    UWAGA: Chociaż do MCS pEUI(+) (Rysunek 1B) dodano kilka miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych, zalecamy subklonowanie docelowego genu do miejsca EcoRI, przy użyciu technologii klonowania niezależnego od ligacji19,20.
  3. Zweryfikuj wstawkę przez sekwencjonowanie, a następnie oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA, który nadaje się do transfekcji.

2. Transfekcja przejściowa i leczenie Teb

  1. Przygotuj cztery szalki do hodowli komórkowych (średnica 60 mm) zawierające świeżo pasażowane komórki HEK293 w 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 5-10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny). Dalej "pożywka do hodowli komórkowych" lub po prostu "pożywka hodowlana" reprezentuje DMEM uzupełniony FBS i antybiotykami. Utrzymuj komórki HEK293 w temperaturze 37 °C.
  2. Transfekcja 1 μg oczyszczonego DNA do komórek HEK293 o gęstości 50 - 60% przy użyciu 3 μl odczynnika do transfekcji. Dodać odczynnik do transfekcji do 200 μl rozcieńczalnika (DMEM bez FBS i antybiotyków) zawierającego DNA. Po inkubacji mieszaniny reakcyjnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej należy dodać mieszaninę do komórek HEK-293 na szalce hodowlanej. Do transfekcji należy użyć dwóch szalek, a pozostałe dwie pozostawić nietraktowane jako kontrole.
  3. Po 12 - 24 godzinach transfekcji dodać Teb (stężenia końcowe, 0,2 - 10 μmol) do jednej z transfekowanych próbek i do jednej z nietransfekowanych próbek. Pozostałe dwie próbki należy pozostawić niepoddane działaniu kontroli doświadczalnej.
    UWAGA: Roztwór podstawowy Teb (50 mM rozpuszczony w dimetylosulfotlenku) można rozcieńczyć w pożywce do hodowli komórkowych, DMEM lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w odpowiednim stężeniu przed dodaniem do hodowanych komórek, w zależności od parametrów doświadczalnych. Jednak ze względu na niską rozpuszczalność Teb w roztworze wodnym należy unikać przygotowywania mieszanki wzorcowej o wysokim stężeniu Teb w podłożu; zamiast tego należy zastąpić kompletną pożywkę do hodowli komórkowych świeżą pożywką zawierającą Teb o pożądanym stężeniu.
  4. Hodować komórki poddane działaniu Teb i niepoddane działaniu Teb przez 12 - 48 godzin w temperaturze 37 °C.
  5. Jeśli używasz wkładki EGFP, przeanalizuj ekspresję EGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym ( Rysunek 2). W przeciwnym razie zbierz komórki do testu immunoblottingowego.
    1. W teście immunoblottingu należy dwukrotnie przepłukać komórki lodowatym PBS, a następnie zeskrobać je za pomocą skrobaka do komórek.
    2. W celu ułożenia komórek w stos należy odwirowywać zbiory w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o stężeniu 21 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 18-25 °C (RT).
    3. Po całkowitym odrzuceniu PBS dodać 0,5 ml lodowatego odczynnika do ekstrakcji białek ssaków (M-PER) wraz z inhibitorem proteazy (5 μl 100-krotnego koktajlu inhibitorów proteazy) do osadu, jeśli komórki są hodowane w naczyniu o średnicy 60 mm.
    4. Ponownie zawiesić komórki za pomocą kilku rund pipetowania, a następnie inkubować zawieszone komórki przez 15 minut w temperaturze 18-25 °C (RT).
    5. Wirować lizat komórkowy w temperaturze 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Przenieść wodny roztwór sklarowany nad osadem do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    7. Analizuj supernatant za pomocą immunoblottingu, postępując zgodnie ze standardowymi protokołami z odpowiednimi przeciwciałami.

3. Generacja stabilnych linii komórkowych HEK293 z genomiczną integracją przełącznika genu pEUI(+)

  1. Transfekcja 5 - 10 μg oczyszczonego pEUI(+) z transgenem do komórek HEK293, które są 50 - 60% zlewające się w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 90 mm, przy użyciu 15 - 30 μl odczynnika do transfekcji. Dodać odczynnik do transfekcji do 500 μl rozcieńczalnika (DMEM bez FBS i antybiotyków) zawierającego DNA. Po inkubacji mieszaniny reakcyjnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej należy dodać mieszaninę do komórek HEK-293 na szalce hodowlanej.
  2. Po transfekcji pozwolić transfektantom na wzrost i ekspresję produktów genu oporności na puromycynę w nieselektywnej pożywce hodowlanej (bez puromycyny) przez 24-48 godzin w temperaturze 37 °C.
  3. Oddziel komórki od szalek hodowlanych przez trypsynizację. Po odrzuceniu pożywki hodowlanej przepłukać transfektanty wstępnie podgrzanym PBS (37 °C), dodać 1 ml 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C. Po wygaszeniu trypsyny/EDTA przez dodanie wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (10 ml, 37 °C), zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie odwirować w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przy 21 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 18-25°C.
  4. Zawiesić transfektanty w 50 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (37 °C) i przenieść 10 ml komórek do 90 mm świeżych naczyń do hodowli komórkowych. Hodować komórki w temperaturze 37 °C do 50 - 60% zbiegu przed leczeniem puromycyną (zazwyczaj trwa to około 24 - 48 godzin).
  5. Hodować transfektanty w temperaturze 37 °C w pożywce do hodowli komórkowych uzupełnionej 3 μg/ml puromycyny przez 3-4 tygodnie. W okresie selekcji należy zmieniać pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą puromycynę (3 μg/ml) co 2 - 3 dni, aby utrzymać ciśnienie selekcyjne. Gdy komórki staną się w pełni zlewne, podziel je zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 3.3 - 3.4, za pomocą pożywki hodowlanej zawierającej puromycynę. Wyrzuć pozostałe komórki z pożywki hodowlanej, jeśli nie są potrzebne.
    UWAGA: Warunki selekcji puromycyny muszą być ustalone eksperymentalnie dla określonych typów komórek. Użyliśmy 3 μg/ml puromycyny w pożywce do hodowli komórkowych; To wystarczyło, aby wywołać śmierć komórki w nietransfekowanym HEK293.
  6. Zbierz komórki z poszczególnych kolonii za pomocą cylindra do klonowania i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych. Przepłukać płytkę dwukrotnie wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS w celu usunięcia pływających komórek.
    2. Za pomocą sterylnych kleszczy ustaw cylinder klonujący nad poszczególnymi koloniami.
    3. Dodaj 0,2 ml 0,35% trypsyny/EDTA do każdego cylindra.
    4. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 1 minutę, aż komórki się oderwą, a następnie dodać kilka kropli wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej do cylindrów.
    5. Przenieś komórki z każdego cylindra do indywidualnych studzienek 6-dołkowej płytki, z 2 ml pożywki hodowlanej i 1 μg/ml puromycyny w każdym dołku.
      UWAGA: Gdy komórki zaczną się zlewać, zwiększ skalę hodowli. Teraz klon(y) mogą zostać ustanowione.
  7. Utrzymuj pojedyncze klony w pożywce do hodowli komórkowych uzupełnionej 1 μg/ml puromycyny.
  8. Walidacja poszczególnych kolonii poprzez testowanie ich wrażliwości na traktowanie Teb (stężenie końcowe, 10 μM) przez 24 godziny. Przetestuj reakcję klonów na Teb, analizując poziom ekspresji transgenu za pomocą immunoblottingu. Wybierz żądany klon (lub klony). Próbkę poddaną działaniu Teb i próbkę niepoddaną działaniu teb hodować w pożywce przez 12–48 godzin w temperaturze 37 °C przed analizą poziomu indukcji transgenu. Poziom ekspresji transgenu można zmierzyć za pomocą immunoblottingu, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 2.5.1 - 2.5.7.

4. Wyczerpanie Teb

  1. Ugasić bodźce Teb, zastępując pożywkę zawierającą Teb pożywką do hodowli komórkowych pożywką wolną od Teb.
    UWAGA: Zaleca się wymianę pożywki wzrostowej bez uprzedniego ponownego wysiewu komórek na nową szalkę hodowlaną. Wydaje się, że resztki Teb przylegają do plastikowego naczynia i wywołują silną ekspresję transgenu w tle. Przed ponownym wysianiem komórek na nowej płytce hodowlanej, zebrane komórki należy kilkakrotnie przepłukać pożywką hodowlaną lub PBS.
    1. Oddziel komórki od szalek hodowlanych przez trypsynizację. Po odrzuceniu pożywki zawierającej Teb, przepłukać komórki stymulowane Teb dwukrotnie wstępnie podgrzanym PBS (37 °C), dodać 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C. Po schłodzeniu trypsyny/EDTA przez dodanie wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej wolnej od Teb (10 ml, 37 °C), zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie odwirować w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przy 21 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 18-25 °C.
    2. Ponownie zawiesić komórki w 50 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej bez tełku (37 °C) i przenieść 5 ml komórek do trzech 60-milimetrowych świeżych szalek do hodowli komórkowych. Hodować komórki w temperaturze 37 °C odpowiednio przez 24, 48 i 72 godziny.
    3. Zbierz komórki w różnych punktach czasowych i zmierz poziom ekspresji transgenu za pomocą immunoblottingu.
      UWAGA: W tych warunkach eksperymentalnych ekspresja transgenu stała się niewykrywalna około 3 dni po hodowli komórek w pożywce hodowlanej wolnej od Teb (Ryc. 3). Poziom ekspresji transgenu można zmierzyć za pomocą immunoblottingu, zgodnie z krokami 2.5.1 - 2.5.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przełącznik pojedynczego genu oparty na GvEcR jest przedstawiony w Rysunek 1A. Wektor pEUI(+) zoptymalizowano pod kątem regulowanej ekspresji transgenu poprzez leczenie Teb. Region efektorowy pEUI(+) składa się z 10xUAS i minimalnego promotora E1b, po którym następuje MCS zawierający miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI i AflII. Sygnał SV40 poly(A) został dodany za MCS (Rysunek 1B). Gen PAC zo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główną wadą stosowania binarnego przełącznika ekspresji genów jest konieczność jednoczesnego dostarczania dwóch oddzielnych plazmidów (sterownika i efektora) do komórki docelowej. Może to prowadzić do nierównomiernego rozmieszczenia plazmidów i skutkować niespójną odpowiedzią przełącznika na induktory 1,2,3. Kolejną wadą systemu dwuwektorowego jest to, że do zidentyfikowania obiecujących linii komórkowych wymagane są co najmniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy żadnych konfliktów interesów w związku z tym raportem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują S-Y Choi (Chonnam National University) za cenne uwagi i dokładne zapoznanie się z naszym manuskryptem. Prace te były wspierane przez fundusz badawczy Uniwersytetu Narodowego Chungnam.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pEUI(+)TransLabLicencja patentowa została przeniesiona na TransLab Inc. 
Odczynnik do transfekcji Gene-FectTransLabTLC-001
HEK293ATCCCRL-1573
TebufenozydFluka31652
Cylinder klonującySigmaCLS31668
PuromycinCorning58-58-2
AntybiotykiGibco15240-062
Trypsyna-EDTAWelgeneLS015-01
DMEMWelgeneLM001-05
Surowica bydlęcapłodu WelgeneS001-01
Naczynie do hodowli komórkowychSPL life science11090
mysz FLAGA M2SigmaF3165
przeciwciało anty-alfa tubulinyCalbiochemCP06
Cylinder klonującySigmaCLS31668
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410.1
M-PER Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków
Thermo Fisher78505
100X Inhibitor proteazy Cock. IIIT& IBPI-9200

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
  2. Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
  3. Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  5. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  6. Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
  7. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
  8. Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29(2012).
  9. Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
  10. Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
  11. Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
  12. Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
  13. Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
  14. Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
  15. Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367(2016).
  16. Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
  17. Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
  18. Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  19. Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
  20. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  21. No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
  22. Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
  23. Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
  24. Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
  25. McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
  26. Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149(2014).
  27. Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
  28. Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
  29. Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja transgenuinduktor tebufenozydkom rki HEK 293mikroskopia fluorescencyjnaanaliza immunoblottingowaodwracalny system ekspresjitraktowanie induktorem chemicznymprzej ciowa stabilna transfekcja

Powiązane artykuły