Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57497

⸱

27 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Streszczenie

Zachodnia kukurydziana stonka korzeniowa (WCR) jest ważnym szkodnikiem kukurydzy i jest dobrze znana ze swojej zdolności do szybkiego dostosowywania się do strategii zwalczania szkodników. Chociaż interferencja RNA (RNAi) okazała się potężnym narzędziem do badania biologii WCR, ma swoje ograniczenia. W szczególności RNAi samo w sobie jest przejściowe (tj. nie powoduje długoterminowego dziedziczenia mendlowskiego związanego fenotypu) i wymaga znajomości sekwencji DNA docelowego genu. To ostatnie może być ograniczające, jeśli fenotyp zainteresowania jest kontrolowany przez słabo zachowane lub nawet nowe geny, ponieważ identyfikacja użytecznych celów byłaby trudna, jeśli nie niemożliwa. W związku z tym liczba narzędzi w zestawie narzędzi genomicznych WCR powinna zostać rozszerzona poprzez opracowanie metod, które mogłyby być wykorzystane do tworzenia stabilnych zmutowanych szczepów i umożliwienia niezależnych od sekwencji badań genomu WCR. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metody stosowane do pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków WCR z kwasami nukleinowymi. Podczas gdy opisane w niniejszym dokumencie protokoły mają na celu stworzenie transgenicznego WCR, edycja genomu CRISPR/Cas9 może być również przeprowadzona przy użyciu tych samych protokołów, przy czym jedyną różnicą jest skład roztworu wstrzykiwanego do zarodków.

Wprowadzenie

Zachodnia kukurydziana stonka korzeniowa (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, jest ważnym szkodnikiem kukurydzy1. Co ciekawe, WCR wydaje się pokonywać środki zwalczania szybciej niż większość szkodników rolniczych, ponieważ nie tylko dostosowują się fizjologicznie, ale także behawioralnie2,3,4,5,6. W ciągu ostatniej dekady interferencja RNA (RNAi), potężne funkcjonalne narzędzie genomiczne, była badana jako potencjalna metoda kontroli WCR7,8, a także była używana jako środek do badania funkcji genów9. Jednakże, podczas gdy RNAi jest często wykonywane przez mikroiniekcję dwuniciowego RNA (dsRNA) u innych gatunków, RNAi oparte na iniekcji jest rzadkie w WCR. W rzeczywistości istnieje tylko kilka doniesień o RNAi poprzez mikrowstrzyknięcie dsRNA do WCR9. Powodem jest to, że WCR może osiągnąć wysoki poziom knockdownu genów poprzez spożycie dsRNA7,10, nawet pozwalając na badanie skutków embrionalnych poprzez podawanie dsRNA matce11. Chociaż metoda ta sprawia, że WCR jest doskonałym obiektem do funkcjonalnej analizy genomowej za pomocą RNAi, spowolniła ona postęp w rozwoju metodologii mikroiniekcji embrionalnej u tego gatunku.

Pomimo mocy RNAi, istnieje kilka wad. Na przykład nie wszystkie geny reagują jednakowo na RNAi. Ta zmienność może utrudnić interpretację wyników funkcjonalnego testu genomicznego. Ponadto RNAi jest przejściowe i nie generuje dziedzicznych mutacji. Z drugiej strony, transformacja linii zarodkowej, inne funkcjonalne narzędzie genomiczne, może generować dziedziczne mutacje poprzez wstawienie oznaczonego elementu transpozycyjnego do genomu12,13. To sprawia, że transformacja linii zarodkowej jest doskonałym narzędziem do tworzenia zmutowanych szczepów do wykorzystania w długoterminowych badaniach genetycznych. Transformacja może być również wykorzystana do uratowania mutacji poprzez dostarczenie funkcjonalnej kopii genu do zmutowanego genomu14. Co więcej, transformacja linii zarodkowej jest podstawą szerokiej gamy technik genetyki molekularnej. Oprócz wyciszania i/lub ratowania funkcji genów, transformacja linii zarodkowej może być wykorzystana do wychwytywania wzmacniaczy15, pułapkowania genów16, ekspresji ektopowej opartej na Gal417 oraz mutagenezy całego genomu18.

Ostatnio opracowano narzędzia umożliwiające zaawansowaną edycję genomu. Narzędzia te obejmują nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) oraz system nukleazy CRISPR/Cas919,20. Zaletą tych nowych narzędzi jest to, że oferują one naukowcom możliwość wywołania pęknięcia dwuniciowego DNA w prawie każdym miejscu w prawie każdym genomie. Po wywołaniu, pęknięcia te mogą być naprawione przez niehomologiczne łączenie końców, co może wprowadzić delecje lub insercje w docelowym genie, lub przez naprawę kierowaną homologią, która w obecności zmodyfikowanego konstruktu może katalizować wymianę całych genów lub regionów genetycznych21,22. Metody te wymagają jednak mikroiniekcji DNA, RNA i/lub białka do bardzo młodych zarodków.

Ważne, w przeciwieństwie do dsRNA używanych dla RNAi, kwasy nukleinowe i białka używane do transformacji linii zarodkowej i edycji genomu nie mogą łatwo przenikać przez błony komórkowe. Dlatego mikroiniekcja plazmidowego DNA, mRNA i/lub białek musi odbywać się w fazie blastodermy syncytialnej (tj. przed celularyzacją zarodka owada). To sprawia, że czas wstrzyknięć jest czynnikiem krytycznym. Na przykład u Drosophila melanogaster zarodki muszą zostać wstrzyknięte w ciągu dwóch godzin po złożeniu jaja12. W związku z tym opracowanie skutecznego protokołu mikroiniekcji embrionalnej dla WCR musi uwzględniać najlepsze warunki do składania jaj przez samice, a także najlepszą metodę pobierania wystarczającej ilości zarodków przedkomórkowych.

Próba wykorzystania szerokiego zakresu narzędzi genetyki molekularnej do biologii WCR wymaga opracowania metod pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków WCR. Tutaj podajemy szczegółowe instrukcje wraz ze wskazówkami i poradami, aby pomóc innym w stosowaniu technik opartych na transformacji w badaniach WCR. Oprócz rozszerzenia technologii transgenicznych na WCR w celu wykorzystania ich w funkcjonalnych badaniach genomicznych, techniki te umożliwiają również przetestowanie nowych potężnych strategii zwalczania szkodników, takich jak gen drive23,24 do przetestowania na tym ważnym gospodarczo szkodniku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla dorosłych osobników WCR na poziomie kolonii

  1. Zaopatrz się w wystarczającą ilość dorosłych osobników WCR (500 - 1,000) od wiarygodnej firmy lub laboratorium badawczego (patrz przykład w Tabeli materiałów) i umieść w klatce o długości30 cm 3.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepu bez diapauzy.
  2. Przygotuj sztuczną dietę WCR zgodnie z protokołem producenta i wlej warstwę o grubości 1 cm do pojemnika o pojemności 38 uncji (patrz Tabela Materiałów). Po wymieszaniu niewykorzystaną dietę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
  3. Umieść szalkę Petriego (100 x 15 mm) z dietą dla dorosłych (10 - 15 g) w klatce o długości 30 cm3. Dodaj więcej diety, gdy jedzenie jest niskie lub suche.
  4. Umieść kolbę (300 ml) z wodą, pokrytą wacikiem, który służy do przytrzymywania na miejscu bawełnianej rolki (6 "x 3/8"), która ma służyć jako źródło wody. Zmień wodę, gdy się wyczerpie.
  5. Utrzymuj WCR na poziomie 26 °C przy wilgotności 60% i cyklu świetlnym 14:10 w inkubatorze do hodowli owadów.

2. Pobieranie i wyrównywanie zarodków

  1. Przygotuj komorę na jaja, używając 1% agaru w wodzie na sterylnej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm2. Przechowywać w temperaturze 4 °C po zestaleniu się agaru.
  2. Aby zebrać nowo złożone jaja, umieść pojedynczą warstwę bibuły filtracyjnej, a następnie 4 warstwy gazy (każda przycięta na wymiar) na powierzchni agaru (Rysunek 1A).
    UWAGA: Gaza może być ponownie użyta, po umyciu w wybielaczu i autoklawowaniu, ale nie jest to konieczne przy pierwszym użyciu. Bibuła filtracyjna nie powinna być ponownie używana i nie musi być sterylizowana.
  3. Umieść talerz do zbierania jaj w klatce WCR tak późno, jak to możliwe (koniec dnia pracy) i przykryj namiotem z folii aluminiowej. Pozostaw na noc.
    UWAGA: Włączenie świateł od 10 rano do 12 rano (14 godzin) opóźnia składanie jaj, ułatwiając w ten sposób zbieranie młodszych jaj do mikroiniekcji bez konieczności umieszczania przez personel laboratoryjny komory zbiorczej w klatce późno w nocy.
  4. Wyjmij komorę na jajka około 8 lub 9 rano.
  5. Za pomocą kleszczy zbieraj po 1 warstwie gazy na raz i umieszczaj w zlewce (500 ml) wody. Zmyj jajka z gazy, delikatnie mieszając (Rysunek 1B i 1C).
  6. Za pomocą pipety gruszkowej przenieś jaja do innej zlewki (500 ml) z wodą. Powtórz 2-3 razy, aby oczyścić jajka.
  7. Użyj pipety z bańką, aby przenieść jaja na bibułę filtracyjną (Rysunek 1D), minimalizując przy tym ilość przenoszonej wody.
  8. Pokrój czarną bibułę filtracyjną na paski o szerokości szkiełka i mocno przyklej do szkiełka, aby upewnić się, że papier leży płasko (Rysunek 2A).
    UWAGA: bibuła filtracyjna pomaga poprawić widoczność pod mikroskopem, zmniejszając ilość odbitego światła.
  9. Nałóż nietoksyczny klej (patrz Tabela materiałów dla przykładu) na bibułę filtracyjną cienkimi liniami (Rysunek 2B). Utrzymuj linie kleju cieńsze niż średnica jajka, aby uniknąć pokrycia jajek klejem.
  10. Za pomocą cienkiej szczotki delikatnie przesuwaj jajka WCR jedno po drugim z bibuły filtracyjnej do linii kleju. Staraj się ułożyć jajka na kleju, zanim wyschnie i zachowaj co najmniej jedną odległość jajka między każdym jajkiem.
  11. Zmaksymalizuj wydajność iniekcji, umieszczając wiele linii jaj na jednym szkiełku z bibuły filtracyjnej (Rysunek 3).
  12. Po ułożeniu wszystkich jaj na bibule filtracyjnej poczekaj, aż cały klej wyschnie przed mikroiniekcją.
    UWAGA: W celu transformacji linii zarodkowej i edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, wstrzyknij wszystkie zarodki do południa (12 po południu), tak aby najstarszy zarodek nie miał więcej niż 19 godzin. Jednak w przypadku RNAi nie ma ograniczeń czasowych, ponieważ w WCR dsRNA może przemieszczać się między komórkami. W rzeczywistości, w przypadku RNAi, starzenie się zarodków może skutkować lepszymi wskaźnikami przeżycia.

3. Przygotowanie plazmidowego DNA i igieł iniekcyjnych

  1. Przygotuj wysokiej jakości superskręcone plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu wolnego od endotoksyn (patrz Tabela materiałów dla przykładu).
  2. Aby przygotować roztwór do wstrzykiwań, należy sprawdzić stężenie każdego plazmidu, a następnie połączyć plazmid pomocniczy (stężenie końcowe 250 ng/μl), plazmid dawcy (stężenie końcowe 750 ng/μl) i bufor czerwieni fenolowej (stężenie końcowe 20%). Krótko zmieszać roztwór i wirować przez 3 minuty z maksymalną prędkością, aby wytrącić cząstki, które mogłyby zatkać igłę.
  3. Pociągnij igły ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 10 cm) za pomocą ściągacza do mikropipet typu Flaming/Brown. Do przechowywania zabezpiecz wyciągnięte igły dwustronną taśmą klejącą na szalce Petriego lub innym przezroczystym pojemniku.
    UWAGA: W przypadku systemu ściągacza do mikropipet stosowane są następujące ustawienia: Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.
  4. Napełnij igłę iniekcyjną za pomocą końcówki do mikroładowarki (patrz Tabela materiałów), aby odpipetować 0,5 - 1,0 μl do wnętrza igły, w pobliżu stożkowego końca. Usunąć pęcherzyki z końcówki igły, jeśli takie wystąpią.
  5. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań do uchwytu igły.
  6. Otwórz końcówkę igły, delikatnie łamiąc cienką parą kleszczyków lub delikatnie dotykając/przeciągając końcówkę na szkiełku nakrywkowym lub szkiełku podstawowym.
    UWAGA: Celem jest uzyskanie najmniejszego otworu, który nadal umożliwia wydostanie się mieszanki wtryskowej (mniejsze otwory zazwyczaj wymagają wyższego ciśnienia wtrysku). Igły skośne nie wymagają tego kroku, ponieważ są już otwarte.

4. Mikroiniekcja i pielęgnacja po iniekcji

  1. Za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie zwilż powierzchnię 1-3 jajek sterylną wodą, włóż igłę i wstrzyknij roztwór. Wstrzyknąć każde jajko, zanim powierzchnia wyschnie. Zwróć uwagę na pojawienie się niewielkiej ilości czerwonego koloru wewnątrz jaj podczas wstrzykiwania, aby wskazać na udane mikrowstrzyknięcie. Zmiażdż lub usuń jaja, które wyglądają na uszkodzone, puste lub w inny sposób nie mogą zostać wstrzyknięte.
    UWAGA: Chociaż ciśnienie wtrysku różni się w zależności od rozmiaru otworu igły, 10 - 13 psi jest dobrym punktem wyjścia.
  2. Po wstrzyknięciu wszystkich jaj usuń bibułę filtracyjną ze szkiełka podstawowego.
  3. Umieść bibułę filtracyjną na powierzchni 1% naczynia agarowego (opisanego powyżej).
  4. Użyj plastikowej folii parafinowej do uszczelnienia naczynia i umieść w inkubatorze do hodowli owadów w temperaturze 26 °C na 12 dni.
    UWAGA: Folia parafinowa pomoże zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu pleśni między naczyniami. Jednak każde inne leczenie zapobiegające rozwojowi pleśni i bakterii może zmniejszyć przeżywalność wstrzykniętych zarodków.

5. Hodowla i wylęg zarodków

  1. Badanie zarodków należy rozpocząć 12 dni po wstrzyknięciu pod kątem nowo wyklutych larw i kontynuować codziennie przez następne 2 tygodnie.
  2. Przenieś larwy za pomocą cienkiej szczotki do pudełka hodowlanego z kiełkującą kukurydzą i ziemią.
    UWAGA: W naczyniu agarowym może rozwijać się pleśń, ale w większości przypadków larwy nadal się wykluwają. Uważnie szukaj larw w pleśni, aby złapać je wszystkie. Niektóre larwy mogą przesunąć się na pokrywę naczynia i utknąć w kondensacji.
  3. Larwy z tyłu w temperaturze 26 °C zgodnie ze standardowymi metodami hodowli WCR25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ważnym aspektem podczas opracowywania tego protokołu był etap rozwoju embrionalnego w momencie mikroiniekcji. W szczególności transformacja linii zarodkowej wymaga mikroiniekcji DNA przed procesem celularyzacji embrionalnej, ponieważ cząsteczki DNA nie mogą łatwo przenikać przez błony komórkowe. Próby wizualizacji etapów rozwoju embrionalnego WCR przy użyciu barwienia jąder komórkowych zakończyły się niepowodzeniem, ponieważ dechorionacja embrionów WCR w zasadzie rozpuszcza wszystkie błon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż mikroiniekcja WCR z dsRNA w celu RNAi została zgłoszona9, jest to pierwszy protokół, który ustanawia najlepsze praktyki w zakresie mikroiniekcji przedkomórkowych zarodków WCR, krytycznego procesu przeprowadzania transformacji linii zarodkowej i/lub edycji genomu CRISPR/Cas9 u tego gatunku. Udana mikroiniekcja zarodków WCR zależy od wielu czynników, podobnie jak od wydajności transformacji. Poniżej omówiono niektóre z głównych problemów wpływających na wynik stosowania tego protokołu do tra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z Monsanto Corn Rootworm Knowledge Research Program, grant numer AG/1005 (dla MDL i YC) oraz fundusze na start dla MDL z NCSU. FC był wspierany przez granty z Monsanto's Corn Rootworm Knowledge Research Program (AG/1005) oraz National Science Foundation, grant numer MCB-1244772 (dla MDL). Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. FC i MDL wymyśliły i zaprojektowały eksperymenty; Eksperymenty przeprowadzili FC, PW i SP; FC i MDL przeanalizowały wyniki; a FC, NG i MDL napisali manuskrypt. Dziękujemy Teresie O'Leary, Williamowi Klobasie i Stephanie Gorski za ich ekspercką pomoc w badaniach przesiewowych WCR. Dziękujemy również dr Wade'owi Frenchowi (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) za transport jaj w celu założenia kolonii laboratoryjnych i dostarczenie protokołów hodowlanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jakościowa bibuła filtracyjna ()Ahlstrom8613-0900Do mikroiniekcji jaj
1 uncja Pojemniki Plastikowa zastawa stołowa Anny'sASET101Pojemnik na jajka
Drosophila Agar Typ IIApex66-103Podłoże do naczynia do składania jaj WCR
Kleszcze do piórek Bioquip4748Obchodzenie się z larwami i poczwarkami 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Mycie kukurydzy i potraw
Ulubiona żółtafarma Coor Trucker502Kukurydza do karmienia
WCR System mikroiniekcji (domowej roboty)NACzęści i instrukcje dostępne na żądanieKontroluje ciśnienie wtrysku (0-20 psi)
Nietoksyczny klej Elmer's Products, Inc.E304Klej jaj na bibule filtracyjnej
epTIPS Końcówki do mikroładowarekEppendorfC2554691Końcówki do zasypywania igłami
Falcon Naczynia do kultur tkankowych Falcon25383-103Kiełkowanie kukurydzy /150 x 25 mm
Fisherbrand  Ilościowe koła z bibuły filtracyjnejFisher ScientificS47576CRobienie naczynia agarowego do składania jaj / 9cm
SparkleenFisher Scientific04-320-4Zmywanie naczyń
Zwykłe szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-549-3Przechowywanie bibuły filtracyjnej i jaj do mikroiniekcji
Western Corn Rootworm bez substytutu pyłkuFrontier Agricultural Sciences F9766BWCR Sztuczna dieta dla dorosłych
Waciki, dużeGenesee Scientific51-101Zamknij kolbę
Globe Scientific 3,0 mL Pipety transferowe do małych baniekGlobe Scientific 137035Zbieraj i przenoś jaja
Stereomikroskop fluorescencyjny Leica M165 FC LeicaM165 FC Badania przesiewowe WCR
Zestaw filtrów DsRed do stereomikroskopu fluorescencyjnegoLeicaDSR: 510-560 nm, filtr emisyjny: 590-650 nm
Filtr EGFPLeicaGFP2Filtr wzbudzenia: 440– 520 nm, filtr emisyjny: 510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PKlatka dla dorosłej kolonii
Miniaturowy pędzelMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Joystick MikromanipulatorNarishigeMN-151Mikromanipulator i uchwyt igły
Mikroskop XY StageOlympus265515Stolik mikroskopowy (przystosowany do użytku ze stereoskopem)
Klasa 90 GazaInternetowy sklep z tkaninamiCHEE90Do składania jaj
Plastikowa folia parafinowa Opakowanie z tworzywa sztucznego PechineyPM-996Uszczelnij miskę agarową po mikroiniekcji / Rozmiar rolki 4 cale x 125 stóp
Inkubator Percival Percival I41VLH3C8Komora uprawowa WCR (inkubator do hodowli owadów)
Kolby Erlenmeyera z wąskimi ustamiVWR4980-300-PKPojemnik na wodę dla dorosłej kolonii 
Zlewki Griffin Low FormVWR1000-600-PKDo mycia jaj
Plecione rolki bawełnianeRichmond Dental Cotton Co.605-3599Zastosowanie w zaopatrzeniu w wodę dla dorosłej kolonii 
Szalki Petriego (35x10mm)SIGMACLS430588-500EANa talerze dietetyczne
Phenol RedSigma143-78-8Bufor do mikroiniekcji
Laserowy ściągacz MicropipietteInstrument SutterP-2000/GŚciągacz igieł/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Premium Wierzchnia warstwa glebyThe Scotts Company71130758Gleba do uprawy
cronWorki na zamek błyskawiczny Reloc Zippit 2 milStany Zjednoczone Plastic Corporation48342Naczynie agarowe w worku po mikroiniekcji/5x7
Szalki Petriego (100x15m)VWR89038-968Robienie naczynia agarowego do składania jaj / 100 x 15 mm
6 uncji PojemnikiWebstaurantstore128E506WCR komora łączeniowa jednoparowa 
38 uncji PojemnikiWebstaurantstore128NC888Pudełko do hodowli larw/38 uncji
ChoiceHD 16 uncji Półprzezroczysty plastikowy pojemnik delikatesowy do kuchenki mikrofalowejWebstaurantstore128HRD16Pudełko do hodowli larw/16 uncji
Zakres mikroiniekcji Wild HeerbruggWILD-M8Luneta do mikroiniekcji wyposażona w stolik XY
Standardowe szklane kapilaryWorld Precision Instruments1B100F-4Igły do mikroiniekcji
Dorosła zachodnia kukurydziana dżdżownica korzeniowa NorthCenteral Aqricultural Reasearch LaboratorySzczep bez diapazyProśba od laboratorium dr Bryana Wade'a Frencha
Zestaw Midi Plasmid DNAQiagen12143Oczyszczanie plazmidowych DNA gotowych do wstrzyknięcia
Filtr wzbudzenia

Bibliografia

  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629(2011).
  3. Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
  4. Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
  5. Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
  6. Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
  7. Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  8. Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
  9. Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162(2010).
  10. Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
  11. Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
  12. Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
  13. Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
  14. Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
  15. O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
  16. Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
  17. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  18. Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
  19. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  20. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  21. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  22. Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
  23. Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
  24. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  25. Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
  26. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
  27. Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
  28. Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
  29. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  30. Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
  31. Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
  32. Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
  33. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
  34. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
  35. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11(2007).
  36. Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroiniekcja zarodk winiekcja plazmid wig y borokrzemianowetechnika mikromanipulacyjnaprotok zbierania jajprzygotowanie zarodk whodowla larw
Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.