Artykuł metodologiczny

Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57506

⸱

27 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy solidny i zoptymalizowany protokół produkcji miligramowych ilości natywnych, bezznacznikowych monomerów i włókienek eksonu1 białka huntingtyny (Httex1) w oparciu o przejściową fuzję małego modyfikatora związanego z ubikwityną (SUMO).

Streszczenie

Choroba Huntingtona (HD) jest dziedziczną śmiertelną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną ekspansją CAG (≥36) w pierwszym eksonie genu HD, co skutkuje ekspresją białka huntingtyny (Htt) lub jego N-końcowych fragmentów z ekspandowanym odcinkiem poliglutaminy (polyQ).

Ekson1 białka huntingtyny (Httex1) jest najmniejszym fragmentem Htt, który podsumowuje wiele cech HD w modelach komórkowych i zwierzęcych i jest jednym z najczęściej badanych fragmentów Htt. Niewielki rozmiar Httex1 sprawia, że jest on eksperymentalnie bardziej podatny na charakterystykę biofizyczną przy użyciu technik standardowych i wysokorozdzielczych w porównaniu z dłuższymi fragmentami lub pełnowymiarowymi Htt. Jednak wysoka skłonność do agregacji zmutowanego Httex1 (mHttex1) ze zwiększoną zawartością polyQ (≥42) utrudniła opracowanie wydajnych systemów ekspresji i oczyszczania w celu wytworzenia tych białek w wystarczających ilościach i udostępnienia ich naukowcom z różnych dyscyplin bez użycia białek fuzyjnych lub innych strategii zmieniających natywną sekwencję białka. Przedstawiamy tutaj solidną i zoptymalizowaną metodę produkcji miligramowych ilości natywnego, bezznacznikowego Httex1 opartego na przejściowym połączeniu małego modyfikatora związanego z ubikwityną (SUMO). Prostota i skuteczność strategii wyeliminuje potrzebę stosowania nienatywnych sekwencji Httex1, dzięki czemu białko to stanie się bardziej dostępne dla badaczy i poprawi odtwarzalność eksperymentów w różnych laboratoriach. Wierzymy, że te postępy ułatwią również przyszłe badania mające na celu wyjaśnienie zależności struktura-funkcja Htt, a także opracowanie nowych narzędzi diagnostycznych i terapii do leczenia lub spowolnienia postępu HD.

Wprowadzenie

Htt jest białkiem o masie 348 kDa i bierze udział w kilku funkcjach fizjologicznych1. Gdy Htt zawiera rozszerzony region polyQ składający się z więcej niż 36 reszt na swoim N-końcu, powoduje HD2,3. Patologia HD charakteryzuje się inkluzjami komórkowymi w prążkowiu i korze, co prowadzi do śmierci neuronów i atrofii dotkniętych tkanek4,5. Kilka N-końcowych fragmentów Htt, które zawierają drogę powtórzeń polyQ, zostało wykrytych w pośmiertnych mózgach pacjentów z HD i uważa się, że są generowane przez proteolityczne przetwarzanie białka huntingtyny6. Ostatnie badania sugerują, że Httex1 może również powstawać w wyniku nieprawidłowego splicingu mRNA. Httex1 zawiera patologiczną mutację polyQ, a jej nadekspresja u zwierząt może podsumować wiele kluczowych cech HD7, podkreślając w ten sposób możliwą centralną rolę tego fragmentu w patologii HD i progresji choroby6,8,9.

Ze względu na wysoką skłonność do agregacji zmutowanego Httex1 (mHttex1) z ekspandowanym traktem polyQ, większość istniejących systemów ekspresji opiera się na przejściowej fuzji Httex1 z białkami (takimi jak S-transferaza glutationu (GST), tioredoksyna (TRX) lub białko wiążące maltozę (MBP) i/lub peptydy (polihistydyna), które w różny sposób poprawiają jego ekspresję, stabilność, oczyszczanie i/lub rozpuszczalność10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Partner fuzyjny jest połączony z Httex1 krótką sekwencją zawierającą miejsce rozszczepienia proteaz, takich jak trypsyna, proteaza wirusa wytrawiania tabakowego (TEV) lub PreScission, aby umożliwić rozszczepienie i uwolnienie Httex1 przed rozpoczęciem agregacji lub oczyszczania. Do wad tych metod należy możliwość pozostawienia dodatkowych pozostałości z powodu nieśladowego rozszczepienia oraz tworzenia ściętych fragmentów z powodu nieprawidłowego rozszczepienia w sekwencji Httex1, a także niejednorodność spowodowana niepełnym rozszczepieniem (zobacz Vieweg et al., aby uzyskać bardziej szczegółowe omówienie zalet i ograniczeń tego podejścia)10. Aby rozwiązać te problemy, niedawno opracowaliśmy strategię ekspresji, która po raz pierwszy umożliwia wygenerowanie natywnego Httex1 bez znaczników poprzez wykorzystanie przejściowej N-końcowej fuzji Synechocystis sp. (Jednoodparty) DnaB intein do Httex110. Podczas gdy rozszczepienie inteiny jest bezśladowe i specyficzne i daje mg ilości białek, nadal ma dwie wady, które mogą zmniejszyć wydajność: a mianowicie przedwczesne rozszczepienie inteiny, które może wystąpić podczas odciągania, oraz fakt, że rozszczepienie następuje w ciągu kilku godzin, co może prowadzić do utraty białka w wyniku agregacji, szczególnie w przypadku Httex1 z ekspandowanymi powtórzeniami poliQ.

Aby rozwiązać te ograniczenia i udoskonalić naszą strategię produkcji natywnego, wolnego od tagów Httex1, opracowaliśmy nowy system ekspresji oparty na przejściowym połączeniu SUMO, a dokładniej na homologu drożdży Smt3 do Httex1. Zastosowanie systemu SUMO do produkcji białek rekombinowanych zostało po raz pierwszy opublikowane w 2004 roku29, gdzie wykazano zwiększoną szybkość ekspresji i rozpuszczalności białka fuzyjnego SUMO. Znacznik SUMO może zostać rozszczepiony przez ubikwitynę, podobną do białka proteazy 1 (ULP1), która nie wymaga miejsca rozpoznania, ale rozpoznaje trzeciorzędową strukturę SUMO i praktycznie eliminuje możliwość błędnego rozszczepienia30. Co więcej, rozszczepienie, w którym pośredniczy ULP1, jest szybkie i bezśladowe oraz nie pozostawia dodatkowych pozostałości. Przedwczesne rozszczepienie znacznika fuzyjnego, obserwowane w przypadku autokatalitycznego intein10, jest całkowicie unikane dzięki wymogowi zewnętrznej proteazy. Podczas gdy strategia SUMO jest obecnie szeroko stosowana do produkcji białek rekombinowanych31,32,33, w tym artykule pokazujemy, że jest ona szczególnie przydatna do generowania wewnętrznie nieuporządkowanego, podatnego na agregację, amyloidogennego białka, takiego jak Httex1. Wierzymy, że prostota, wydajność i solidność naszej metody opartej na syntezie jądrowej SUMO sprawi, że natywny, wolny od znaczników Httex1 będzie bardziej dostępny dla badaczy z różnych dyscyplin i wyeliminuje potrzebę stosowania nienatywnych sekwencji Httex1 in vitro. Jest to ważny postęp, który ułatwi przyszłe badania w celu wyjaśnienia zależności struktura-funkcja Httex1.

Protokół opisuje oczyszczanie Httex1 z 12 L kultury bakteryjnej, ale protokół może być łatwo dostosowany do produkcji na mniejszą lub większą skalę. Protokół opisuje produkcję Httex1 typu dzikiego (wtHttex1) o długości powtórzeń polyQ poniżej (23Q) i zmutowanego Httex1 (mHttex1) o długości powtórzeń polyQ powyżej (43Q) progu patogennego (36Q).

Protokół

1. Ekspresja rekombinowanego Httex1 23Q i 43Q

  1. Przygotuj wymagane i roztwory. Przygotować 1000x roztwór podstawowy ampicyliny (AMP, 100 mg/ml), przefiltrować (0,2 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować pożywkę bulionu lizogenicznego (LB) (25 g LB Miller na 1 L H2O), autoklaw. Przygotować 1 M roztwór podstawowy izopropylo-ß-D-1tiogalaktopiranozydu (IPTG), przefiltrować (0,2 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przekształć chemicznie kompetentny E. coli B ER 2566 za pomocą wektora pTWIN1, zawierającego ludzki Httex1 połączony z N-końcowym znacznikiem His6-SUMO metodą szoku cieplnego34.
    UWAGA: Zastosowano również szczep E. coli BL21 DE3. Jednak w tym przypadku zaobserwowano zwiększoną liczbę obcięć.
  3. Zaszczepić 200 ml pożywki LB za pomocą 1x AMP w kolbie stożkowej o pojemności 1 l, dodając pojedynczą kolonię z płytki agarowej ze sterylną końcówką pipety. Inkubować kulturę w temperaturze 30 °C i 180 obr./min przez 20 godzin (przez noc) w inkubatorze bakteryjnym.
  4. Pobrać próbkę kultury o objętości 1 ml za pomocą sterylnej pipety. Zmierzyć gęstość optyczną próbki przy długości fali 600 nm (OD600) za pomocą jednorazowej plastikowej kuwety i fotometru (przestrzegać zakresu pomiarowego między 0,1 a 1, w razie potrzeby rozcieńczyć pożywką LB). Oblicz ilość kultury wstępnej, która spowoduje początkowy OD600 wynoszący 0,05 w kulturze 3 L (przy kulturze wstępnej600 = 3, co oznaczałoby 50 ml).
  5. Zaszczepić cztery kultury (każda po 3 litry pożywki LB z 1x AMP w kolbie o pojemności 5 l), dodając obliczoną ilość kultury wstępnej za pomocą sterylnej pipety. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C i prędkości 180 obr./min w inkubatorze bakteryjnym.
  6. Co 30 minut pobieraj 1 ml próbki kultury za pomocą sterylnej pipety. Zmierzyć średnicę zewnętrzną600 próbki za pomocą jednorazowej plastikowej kuwety i fotometru. Gdy OD600 osiągnie 0,1 (zwykle po 1-2 godzinach), ustaw temperaturę inkubatora bakteryjnego na 14 °C i kontynuuj inkubację podczas chłodzenia. Co 30 minut pobieraj 1 ml próbki kultury za pomocą sterylnej pipety. Zmierz średnicę zewnętrzną600 próbki za pomocą jednorazowej plastikowej kuwety i fotometru.
    UWAGA: Czas schładzania kultur może się różnić w zależności od używanego inkubatora, więc czas rozpoczęcia chłodzenia może wymagać dostosowania w zależności od typu używanego inkubatora. Jednak zmiana gradientu temperatury powinna mieć tylko niewielki wpływ na plon, ponieważ białko fuzyjne SUMO wydaje się być dość stabilne.
  7. Gdy OD600 osiągnie 0,3-0,4 (zwykle po 1-2 godzinach), należy pobrać próbkę kultury przed indukcją do analizy nadekspresji SDS-PAGE. Oblicz wielkość próbki, która daje porównywalną liczbę komórek i dobry sygnał na barwionej SDS-PAGE Coomassie: Dla żelu 10-dołkowego: objętość = 0,2 ml / OD600; Weź połowę na 15-dołkowy żel.
    1. W przypadku kultury bakteryjnej o średnicy zewnętrznej600 = 0,4 weź 500 μl. Weź obliczoną objętość kultury bakteryjnej za pomocą sterylnej pipety. Odwirować próbkę (18000 x g, 4 °C, 2 min) i odrzucić supernatant. Przechowywać osad w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie gotowy do analizy (krok 1.11).
  8. Indukować ekspresję białka przez pipetowanie 1,2 ml 1 M roztworu podstawowego IPTG do każdego 3 l roztworu hodowli (stężenie końcowe 0,4 mM). Kontynuować inkubację kultury w temperaturze 14 °C przez 16 godzin (przez noc).
    UWAGA: Temperatura zazwyczaj osiąga ~20 °C do czasu dodania IPTG, w zależności od wydajności inkubatora.
  9. Pobrać próbkę kultury po indukcji do analizy nadekspresji SDS-PAGE, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.7.
  10. Zebrać komórki przez odwirowanie w probówkach o pojemności 1 l (3993 x g, 4 °C, 10 min). Odrzucić supernatant, zawiesiny komórek trzymać na lodzie i przejść bezpośrednio do oczyszczania.
  11. Przeanalizuj nadwyrażenie za pomocą SDS-PAGE35,36. Zawiesić próbki przed i po indukcji w 20 μl bieżącego buforu i 20 μl 2x obciążającego barwnika. Podgrzewać próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym i załadować 20 μl na 15% żel, gdy są jeszcze gorące. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 180 V. Żel należy zabarwić barwnikiem Coomassie zgodnie z instrukcją producenta. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 1C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można zatrzymać, osad komórkowy można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni. Aby uzyskać optymalne rezultaty, zaleca się stosowanie świeżego granulatu bakteryjnego i unikanie zamrażania. Zamroźno-rozmrażanie może prowadzić do lizy komórek i degradacji Httex1. Może to obniżyć wydajność i jakość białka.

2. Liza komórek i oczyszczanie białka fuzyjnego6-SUMO Httex1 metodą immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali (IMAC)

  1. Przygotować 2 l buforu A w szklanej butelce (50 mM Tris(hydroksymetylo)-aminometan (Tris), 500 mM NaCl, 15 mM imidazolu). Przygotować 1 l buforu B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol pH 7,4) w szklanej butelce. Po rozpuszczeniu soli dostosować pH za pomocą 10 N HCl i przefiltrować roztwory do świeżych butelek z filtrem butelkowym (0,65 μm). Przygotować 1000x roztwór podstawowy fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF, 0,3 M), podwielokrotność do 100 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Protokół został opracowany tak, aby umożliwić wykonanie wszystkich etapów od lizy osadów bakteryjnych do oczyszczania i liofilizacji metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) w ciągu 8-9 godzin. Aby ograniczyć agregację i proteolizę, zaleca się szybką pracę bez przerw i wykonywanie wszystkich kroków w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
  2. Dodać 100 μl roztworu podstawowego PMSF i pięć tabletek (1 na 30 ml końcowej objętości) inhibitora proteazy do 100 ml wstępnie schłodzonego buforu A. Dodać osad bakteryjny do buforu i homogenizować zawiesinę, mieszając mieszadłem magnetycznym i pipetując w górę iw dół sterylną pipetą o pojemności 10 ml (~30 min).
  3. Podzielić zawiesinę bakterii na porcje po 40 ml w jednorazowych plastikowych probówkach o pojemności 50 ml. Sonifikuj każdą podwielokrotność w partii woda/lód w celu lizy komórek (amplituda 70%, całkowity czas sonikacji 5 minut, interwały 30 s sonikacji, 30 s przerwy).
    UWAGA: Ważne jest, aby próbka nie nagrzewała się podczas etapu sonikacji. Zaleca się dodanie trochę wody do łaźni lodowej, aby poprawić odprowadzanie ciepła podczas sonikacji. Procedura sonikacji może wymagać dostosowania, jeśli używany jest inny instrument. Inne metody lizy, takie jak French Press lub mikrofluidyzator, powinny również działać i mogą być korzystne, aby uniknąć podgrzewania próbki i agregacji białek. Urządzenia te nie były dostępne w naszym laboratorium i uzyskaliśmy dobre wyniki dzięki naszemu protokołowi sonikacji.
  4. Pobrać próbkę 50 μl lizatu do analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Odwirować próbkę (18000 x g, 4 °C, 2 min) i odpipetować frakcję rozpuszczalną do nowej probówki. Zawiesić frakcję nierozpuszczalną w 50 μl buforu A za pomocą pipety. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu analizy SDS-PAGE (krok 2.6).
  5. Klarować lizat przez odwirowanie (39191 x g, 4 °C, 60 min).
  6. Na etapie wirowania przeanalizuj etap lizy komórek za pomocą SDS-PAGE. Dodaj 50 μl 2x barwnika ładującego odpowiednio do rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej frakcji lizatu. Podgrzewaj przez 5 minut w temperaturze 95 °C i nałóż 2 μl na 15% żel, gdy jest jeszcze gorący. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 180 V. Żel należy zabarwić barwnikiem Coomassie zgodnie z instrukcją producenta. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 1C.
  7. Przefiltrować supernatant (0,45 μm, filtry strzykawkowe). Pobrać próbkę 20 μl przefiltrowanego supernatantu do analizy SDS-PAGE (krok 2.11).
    UWAGA: Zazwyczaj uzyskuje się objętość od 90 do 100 ml sklarowanego i przefiltrowanego supernatantu. Zazwyczaj wystarczą 3 filtry strzykawkowe. Jeśli filtracja jest uciążliwa, spróbuj zwiększyć prędkość i/lub czas wirowania.
  8. Wyizolować białko fuzyjne His6-SUMO Httex1 z oczyszczonego lizatu bakteryjnego za pomocą chromatografii powinowactwa do immobilizowanego metalu (IMAC) w systemie szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC) w temperaturze 4 °C37.
    1. Napełnić oczyszczony lizat do superpętli i załadować do kolumny Ni-NTA (rozebranej, oczyszczonej i ponownie załadowanej zgodnie z instrukcją producenta, zalecana jest poprzednia ślepa próba) z prędkością 2 ml/min. Przepuścić 10 objętości kolumny (CV, 200 ml) buforu A przy 10 ml/min w celu wypłukania niezwiązanych białek.
    2. Eluować białko fuzyjne za pomocą 2,5 CV (50 ml) 100% buforu B w tempie 2 ml/min. Użyj frakcji o wielkości 50 ml do ładowania i mycia oraz 5 ml do elucji. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 1D.
  9. Pobrać próbkę każdej frakcji do analizy SDS-PAGE (20 μl) i połączyć frakcje zawierające białko fuzyjne zgodnie z pikiem chromatogramu IMAC. Dodać (2S,3S)-1,4-Bis(sulfanylo)butano-2,3-diol (DTT) i L-cysteinę (końcowe stężenie 100 mM każdy) w postaci proszku i rozpuścić, delikatnie odwracając probówkę.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że czystość białka fuzyjnego w różnych frakcjach jest porównywalna. Na wszelki wypadek frakcje oczyszczonego białka fuzyjnego powinny być szybko połączone po IMAC, aby zapobiec agregacji wysoce skoncentrowanych frakcji. Ponadto zaleca się przejście bezpośrednio do rozszczepienia znacznika SUMO i oczyszczania HPLC. W razie potrzeby protokół można zatrzymać w tym miejscu. Rozcieńczony roztwór białka fuzyjnego zamrożono w ciekłym azocie, przechowywano w temperaturze -80 °C i oczyszczono po rozmrożeniu bez znacznego zmniejszenia wydajności. Przechowywanie rozcieńczonego roztworu białka fuzyjnego w temperaturze 4 °C przez 24 godziny również daje podobne wyniki.
  10. Przeanalizuj IMAC za pomocą SDS-PAGE. Do każdej próbki dodać 20 μl barwnika ładującego. Załadować 2 μl surowego materiału (2.7), frakcję niezwiązaną, frakcję płuczącą i każdą frakcję piku elucji na 15% żelu. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 180 V. Żel należy zabarwić barwnikiem Coomassie zgodnie z instrukcją producenta. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 1D.

3. Rozszczepienie znacznika His6-SUMO i oczyszczanie metodą HPLC

Uwaga: Kwas trifluorooctowy (TFA) jest lotną cieczą i może powodować poważne oparzenia, więc należy obchodzić się z nim ostrożnie. Obchodzenie się z produktem należy wykonywać pod wyciągiem wyciągowym i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (tj. jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny).

  1. W butelce o pojemności 5 l dodaj 5 ml TFA za pomocą plastikowej strzykawki do 5 l wody (rozpuszczalnik A:H2O, 0,1% (TFA). Dodaj 2,5 ml TFA za pomocą plastikowej strzykawki do 2,5 litrowej butelki acetonitrylu (rozpuszczalnik B: acetonitryl, 0,1% TFA).
  2. Przygotować system HPLC zgodnie z sugestią producenta. Wykonaj pusty przebieg, aby upewnić się, że kolumna jest czysta.
  3. Pobrać próbkę 100 μl białka fuzyjnego przed dodaniem ULP1 w celu monitorowania reakcji rozszczepienia przez UPLC (krok 3.5).
  4. Przenieść 20 ml białka fuzyjnego do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 0,4 ml roztworu podstawowego ULP1, inkubować na lodzie. Pozostałe białko fuzyjne należy przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Znakowany przez Hisa fragment katalityczny 403-621 specyficznej dla ubikwityny proteazy 1 (tutaj określanej jako "ULP1") został użyty do rozszczepienia znacznika SUMO. Białko fuzyjne jest bardziej stabilne niż rozszczepione Httex1. Zaleca się, aby nie rozcinać metki SUMO z całej partii. Zamiast tego należy kontynuować pracę z podwielokrotnościami o rozmiarze, który można bezpośrednio i całkowicie zastosować do kolumny HPLC.
  5. Co 10 minut pobiera się próbkę 100 μl reakcji rozszczepienia w celu monitorowania postępu za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC). Odwirować próbki (18000 obr./min, 4 °C, 2 min) i przeanalizować 2 μl supernatantu za pomocą UPLC (gradient od 10% do 90% rozpuszczalnika B w A przez 0,25 do 3 min, 10% B przez 1 min, patrz instrukcja producenta dotycząca użytkowania przyrządu). Porównać chromatogramy uzyskane dla próbki przed dodaniem ULP1 i próbki pobrane później. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 2B.
  6. Po zakończeniu rozszczepienia SUMO (pik białka fuzyjnego zniknął w chromatogramie UPLC i jest w pełni przekształcony w nowo pojawiający się pik SUMO i Httex1), przefiltrować próbkę za pomocą filtra strzykawkowego (0,22 μm).
    UWAGA: Rozszczepienie SUMO jest zazwyczaj bardzo szybkie (10-20 min w 4 °C), dlatego analiza UPLC o czasie trwania 4 min jest cennym narzędziem do monitorowania reakcji. Filtrowanie próbki przed oczyszczeniem metodą HPLC jest głównie środkiem zapobiegawczym mającym na celu wydłużenie żywotności kolumny. Próbka nie powinna stać się mętna.
  7. Oczyścić przefiltrowaną próbkę za pomocą RP-HPLC (gradient 25-35% rozpuszczalnika B w rozpuszczalniku A, przez 40 minut przy 15 ml/min. (0-10 min: 5%; 10-12,5 min: 5 do 25%; 12,5-52,5 min: 25 do 35%; 52,5-57,5 min 35 do 95%; patrz instrukcje producenta dotyczące użytkowania przyrządu). Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 2C.
    UWAGA: Httex1 i jego6-SUMO dobrze oddzielają się od RP-HPLC. Jednak na początku i na końcu szczytu mogą znajdować się niewielkie ilości obciętego Httex1. Zbieraj małe frakcje, aby uzyskać maksymalną ilość czystego materiału.
    Ostrzeżenie: Podczas pracy z płynami kriogenicznymi należy używać odpowiedniego sprzętu ochronnego (tj. fartucha laboratoryjnego, izolowanych rękawic i osłony twarzy).
  8. Analizować frakcje HPLC za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylającą (ESI-MS, autosampler, wstrzyknąć 10 μL, przepływ 0,6 ml / min, rozpuszczalnik: 20% B w A, bez kolumny, patrz instrukcje producenta dotyczące użytkowania przyrządu) i UPLC (gradient od 10% do 90% rozpuszczalnika B w A przez 0,25 do 3 min, 10% B przez 1 min, Zapoznaj się z instrukcjami producenta dotyczącymi użytkowania przyrządu). Frakcje o podobnej czystości można umieścić w plastikowych probówkach o pojemności 50 ml, zamrozić w ciekłym azocie i poddać liofilizacji. Zważyć i przenieść liofilizowane białko do plastikowych probówek o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Scharakteryzuj oczyszczony materiał za pomocą UPLC, ESI-MS i SDS-PAGE. Rozpuścić 100 μg liofilizowanego Httex1 w 8 μl czystego TFA w probówce o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w zamkniętej probówce. Ostrożnie odparować TFA pod wyciągiem ze strumieniem azotu lub argonu. Stosować azot/argon pod niskim ciśnieniem, aby uniknąć utraty próbki.
    1. Rozpuścić białko w 100 μlH2O. Przeanalizować 2 μl za pomocą UPLC i 5 μl za pomocą ESI-MS, jak w kroku 3.8. Wymieszaj 20 μl roztworu białkowego z 20 μl 2x barwnika ładującego.
    2. Analizuj ilości od 1 μg do 10 μg za pomocą SDS-PAGE. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 180 V. Żel należy zabarwić barwnikiem Coomassie zgodnie z instrukcją producenta. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 2D.

4. Dezagregacja i recyulizacja białek Httex1

Uwaga: TFA jest lotną cieczą i może powodować poważne oparzenia, więc należy obchodzić się z nią ostrożnie. Obchodzenie się z materiałem należy wykonywać pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (tj. jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny).

  1. Przygotować 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) z wstępnie zmieszanego proszku w probówce o pojemności 50 ml. Przefiltruj roztwór DPBS przez filtr 0,2 μm przed każdym użyciem.
  2. Rozpuścić 150 μg liofilizowanego Httex1 w 12 μl czystego TFA w probówce o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w zamkniętej probówce. Ostrożnie odparować TFA pod wyciągiem ze strumieniem azotu lub argonu. Użyj niskiego ciśnienia azotu/argonu, aby uniknąć utraty próbki38.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, użyj 4 μl TFA do rozpuszczenia i dezagregacji 50 μg białka. Ta procedura stworzy warstwę białka na wewnętrznych ściankach probówki. Aby zapobiec natychmiastowej agregacji Httex1 w kolejnych krokach, pracuj ze wstępnie schłodzonymi, utrzymuj białko zawsze na lodzie i unikaj wysokich stężeń.
  3. Rozpuścić zdezagregowane białko w 1 ml wstępnie schłodzonego DPBS i dostosować pH do 7,2-7,4 za pomocą 1 M NaOH. Przefiltrować roztwór białka przez filtr odśrodkowy o sile 100 kDa do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml (20000 x g, 4 °C, 20 minut).
    UWAGA: Obliczone teoretyczne stężenie Httex1 jest wyższe niż pożądane stężenie końcowe, aby uwzględnić ewentualne straty. Etap filtracji jest niezbędny do usunięcia wszelkich agregatów, które mogły powstać podczas rozpuszczania białka.
  4. Określ stężenie Httex1 za pomocą krzywej kalibracyjnej UPLC opartej na analizie aminokwasów (detekcja przy λ214) i wyślij 2 μg białka do analizy aminokwasów w celu walidacji stężenia10. Obliczyć ilość DPBS, którą należy dodać, aby uzyskać stężenie 3 μM Httex1.
  5. Rozcieńczyć białko do 3 μM, dodając obliczoną ilość DPBS do probówki. Utrzymuj probówkę na lodzie do momentu zainicjowania protokołu agregacji.
    UWAGA: Httex1 43Q nie powinien być przechowywany w roztworze. Zawsze przygotowuj świeży roztwór białkowy w oparciu o powyższy protokół. Białka Httex1 najlepiej przechowywać w postaci liofilizowanego proszku w temperaturze -20°C.

5. Monitorowanie kinetyki agregacji Httex1 43Q za pomocą UPLC i dichroizmu kołowego (CD) Spektroskopia i charakterystyka agregatów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

  1. Przygotuj roztwór mrówczanu uranylu dla TEM, jak wcześniej raportowano39.
  2. Rozpocząć agregację Httex1 43Q przez inkubację roztworu 3 μM w DPBS w temperaturze 37 °C (użyć 1 ml roztworu przygotowanego w sposób opisany powyżej w protokole dezagregacji).
    UWAGA: Agregacja Httex1 może być przeprowadzana w wyższych stężeniach w zależności od potrzeb i celów eksperymentu.
  3. Oznaczyć ilościowo ilość rozpuszczalnego białka za pomocą UPLC we wskazanych punktach czasowych (po 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 i 120 godzinach). W tym celu należy pobrać podwielokrotność 35 μl i usunąć nierozpuszczalne agregaty przez odwirowanie (20000 x g, 4 °C, 20 min). Wstrzyknąć 4 μl supernatantu do UPLC. Oblicz proporcję rozpuszczalnego monomeru na podstawie zmiany powierzchni piku za pomocą oprogramowania przyrządu 40. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 3A.
  4. Scharakteryzować zmiany w strukturze drugorzędowej za pomocą spektroskopii CD w temperaturze 0 i 48 godzin. Pobrać podwielokrotność 100 μl i zmierzyć eliptyczność (kuweta kwarcowa 1 mm, 195 nm do 250 nm, 20 °C, punkty danych co 0,2 nm, prędkość 10 nm/min, czas integracji cyfrowej 2 s, szerokość pasma 1,0 nm). Uzyskaj 6 widm próbki i uśrednij i wygładź za pomocą filtra dwumianowego o szerokości splotu 99. Wykreślić widma jako średnią eliptyczność molową reszty (θMRE)41. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 3B.
  5. Scharakteryzować właściwości strukturalne i morfologiczne kruszyw za pomocą TEM. Umieść 3 μl roztworu białkowego na siatce miedzianej o oczkach 200 oczek i pokrytej węglem Formvar/węglowej na 1 minutę. Umyj siatkę dwukrotnie 15 μl wody, raz 15 μl 0,7% (w/v) mrówczanu uranylu i zaplamić przez 30 s 15 μl 0,7% m/v mrówczanu uranylu. Wykonaj analizę TEM siatek. Porównaj wyniki z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 3C.

Wyniki

Httex1 jest wyrażany w E. coli z N-końcowym znacznikiem His6-SUMO. Reprezentatywne wyniki ekspresji i oczyszczania białka fuzyjnego przedstawiono na Rysunku 1. Sekwencja Httex1 składa się z reszt 2-90 białka Htt i zaczyna się od Ala2, ponieważ Met1 jest całkowicie odcinany in vivo42. Numeracja aminokwasów odnosi się do wariantu 23Q; pełna sekwencja wyrażonego białka fuzyjnego pokazana jest na Rysunku 1A. Plazmidy zostaną w najbliższym czasie zdeponowane w Addgene, aby udostępnić je społeczności naukowej. Schemat plazmidu oraz wyrażonego białka fuzyjnego przedstawiono na Rysunku 1B. His6-SUMO Httex1 wykazuje średni poziom ekspresji (Rysunek 1C), a większość białka fuzyjnego znajduje się w frakcji rozpuszczalnej po lizie, zarówno dla wariantu 23Q, jak i 43Q. Białko fuzyjne migruje wyżej niż oczekiwano na podstawie masy cząsteczkowej. Wynika to częściowo z silnego zwinięcia białka SUMO, ale głównie z nietypowego składu sekwencji Httex1, zawierającej przede wszystkim reszty glutaminy i proliny. Zarówno białko fuzyjne typu dzikiego (23Q), jak i zmutowane (43Q) można wzbogacić do czystości ok. 80% za pomocą IMAC (Rysunek 1D). Obecność współoczyszczonych białek gospodarza można wyjaśnić stosunkowo niskim poziomem ekspresji Httex1 oraz dużą objętością próbki nałożonej na kolumnę.

Odszczepienie znacznika His6-SUMO oraz oczyszczanie Httex1 przedstawiono na Rysunku 2A. UPLC jest wydajnym narzędziem do monitorowania odszczepiania znacznika His6-SUMO (Rysunek 2B). Pierwotny pik białka fuzyjnego znika, a pojawiają się dwa nowe, dobrze oddzielone piki odpowiadające znacznikowi His6-SUMO oraz białku Httex1. Reakcja odszczepiania kończy się w ciągu 10-20 min. Metoda Western Blot (WB) jest zbyt powolna, aby efektywnie monitorować reakcję odszczepiania, ale została uwzględniona na rysunku dla odniesienia i w celu wykazania kompletności odszczepienia SUMO. Zarówno Httex1 23Q, jak i 43Q można skutecznie oddzielić od znacznika His6-SUMO za pomocą RP-HPLC (Rysunek 2C), a uzyskane białka charakteryzowały się wysoką czystością, co potwierdzono w analizach UPLC, MS i SDS-PAGE (Rysunek 2D).

Aby wykazać, że białka Httex1 przygotowane tą metodą zachowują oczekiwane właściwości agregacyjne Httex1, oceniliśmy kinetykę fibrylizacji mutantu Httex1 w temperaturze 37 °C za pomocą testu sedymentacyjnego, monitorowaliśmy zmiany w strukturze drugorzędowej metodą spektroskopii CD oraz scharakteryzowaliśmy morfologię agregatów za pomocą TEM. Reprezentatywny zestaw danych dotyczących kinetyki agregacji w procesie tworzenia włókien mHttex1, wyznaczony za pomocą testu sedymentacyjnego, przedstawiono na Rysunku 3A. Ubytek rozpuszczalnego Httex1 43Q w czasie, wynikający z tworzenia się włókien, określono ilościowo za pomocą UPLC. Obserwujemy całkowite wyczerpanie rozpuszczalnego białka po 48 godzinach inkubacji. Dodatkowo, za pomocą spektroskopii CD określiliśmy strukturę drugorzędową białka (Rysunek 3B). Httex1 43Q zmienia swoją strukturę z nieuporządkowanej (λmin 205 nm) na konformację zdominowaną przez harmonijkowe struktury β (λmin 215 nm) po 48 godzinach inkubacji. Zmiana strukturalna ta wiąże się z tworzeniem długich agregatów włóknistych, co jest widoczne w TEM po 48 godzinach (Rysunek 3C).

Ekspresja białek, rozpuszczalność, oczyszczanie; analiza elektroforetyczna, chromatografia; mapa plazmidu, indukcja IPTG.
Rycina 1Ekspresja i oczyszczanie białka His6-białko fuzyjne SUMO Httex1. 
(A) sekwencja aminokwasowa His6-SUMO-Httex1-QN konstrukty fuzyjne (His6-SUMO w kolorze zielonym i Httex1-QN w kolorze pomarańczowym); (B) Schematyczny przegląd ekspresji i oczyszczania białka fuzyjnego; (C) analiza SDS-PAGE ekspresji i rozpuszczalności białka fuzyjnego po lizie; (D) Chromatogram z oczyszczania białka fuzyjnego metodą IMAC oraz analiza frakcji za pomocą SDS-PAGE (czerwony pasek: frakcja nieprzypisana, nieprzypływająca; niebieski pasek: frakcja płucząca, czarny pasek: frakcje zawierające pik elucyjny); Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Oczyszczanie białek; chromatogramy HPLC, wyniki SDS-PAGE, wykazujące odszczepienie SUMO, etapy oczyszczania.
Rycina 2Odcięcie znacznika His6 Znacznik SUMO i oczyszczanie białka Httex1-Q pozbawionego znacznikaN białka
(A) schematyczny przegląd; (B) analiza odszczepienia znacznika SUMO przez ULP1 metodą UPLC (kolor niebieski: przed dodaniem ULP1; kolor czarny: odpowiednio 20 min (23Q) lub 10 min (43Q) po dodaniu ULP1) oraz WB (MAB5492 1:200, wtórne przeciwciało kozie przeciwko mysich 1:50); (C) Chromatogram preparatywnego oczyszczania Httex1 metodą RP-HPLC; D: analiza oczyszczonego Httex1 za pomocą UPLC, SDS-PAGE i ESI-MS; oczekiwana masa cząsteczkowa wynosi odpowiednio 9943 Da (23Q) i 12506 Da (43Q). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza agregacji białek; wykres, widma CD, obraz z mikroskopii elektronowej; rozpuszczalność, analiza strukturalna.
Rycina 3Agregacja Httex1-43Q: (A) Analiza sedymentacyjna oparta na UPLC. (B) widma CD struktury drugorzędowej w 0 h i 48 h. (C) Mikrografie TEM agregatów po 48 h (paski skali wynoszą 20 nm). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym protokole przedstawiliśmy skuteczną procedurę uzyskiwania miligramowych ilości natywnego, nieoznakowanego Httex1 zawierającego 23 lub 43 reszty glutaminy. Osiągnięto to poprzez ekspresję Httex1 jako C-końcowej fuzji do znacznika His 6-SUMO, który jest używany do izolowania białka fuzyjnego z lizatu komórkowego przez IMAC i jest rozszczepiany przed oczyszczaniem Httex1 metodą HPLC. Podczas gdy strategia SUMO została wykorzystana do produkcji kilku innych białek, nasza metoda pokazuje, że unikalne właściwości SUMO mogą być również wykorzystane do generowania wewnętrznie nieuporządkowanego, podatnego na agregację, amyloidogennego białka, które wcześniej okazało się niezwykle trudne w obsłudze i produkcji43,44. Przedstawiamy protokół, który jest prosty, łatwy w użyciu i porównywalny z protokołem wytwarzania "dobrze zachowującego się" białka. Fuzja SUMO rozpuszcza i stabilizuje Httex1 podczas etapu odciągania i oczyszczania IMAC. Przedwczesne rozszczepienie znacznika, zaobserwowane w przypadku strategii intein10 i agregacji, nie stanowiło już problemu.

Białka wewnętrznie nieuporządkowane są szczególnie podatne na degradację. Chociaż degradacja N-terminala w regionie N17 nie stanowi problemu przy użyciu tego protokołu, mogą wystąpić obcięcia w PRD Httex1. Ponieważ obcięte białka są bardzo podobne do Httex1 pod względem hydrofobowości, ładunku i wielkości, usunięcie ich za pomocą środków chromatograficznych jest trudne, dlatego najlepiej jest w pierwszej kolejności zapobiec ich powstawaniu. Ścisłe trzymanie się protokołu, zawsze praca na lodzie i stosowanie wystarczającej ilości inhibitora proteazy powinno pomóc w utrzymaniu obserwowanego obcięcia na bardzo niskim poziomie. Zastosowanie znacznika fuzyjnego na C-końcu Httex1 może łatwo usunąć obcięcia w PRD, ponieważ obcięte białko również straciłoby znacznik powinowactwa. Jeśli jednak sekwencja natywna musi zostać zachowana, opcja ta nie może być zastosowana, ponieważ Httex1 kończy się proliną i zgodnie z naszą najlepszą wiedzą nie ma C-końcowych znaczników fuzji, o których wiadomo, że indukują bezśladowe i skuteczne rozszczepienie po prolinie.

Najbardziej krytyczną częścią protokołu jest obsługa Httex1 uwolnionego po rozszczepieniu znacznika SUMO przez ULP1. Białko należy natychmiast oczyścić za pomocą RP-HPLC. Na szczęście jest to wydajna i szybka reakcja, która zwykle kończy się w ciągu 10-20 minut w temperaturze 4 °C. W przeciwieństwie do tego, strategia inteiny wymagała kilku godzin na całkowite rozszczepienie inteiny, co wymagało kompromisu między niepełnym rozszczepieniem a początkową agregacją w celu maksymalizacji wydajności. W przypadku zmutowanego Httex1 wymagana jest szybka obróbka, ponieważ zacznie on agregować przy stosunkowo wysokim stężeniu obecnym w reakcji rozszczepienia, podczas gdy wariant 23Q jest stabilny przez dłuższy czas. Podczas oczyszczania RP-HPLC uwidacznia się kolejna zaleta SUMO: podczas gdy inteina Ssp DnaB jest hydrofobowa i silnie przylega do kolumny, SUMO jest bardziej hydrofilowa i całkowicie wymywa się z kolumny C4 o odwróconej fazie. Chociaż komercyjny ULP1 jest dość kosztowny, białko można łatwo wyprodukować z wysoką wydajnością zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami29.

Nie można wystarczająco podkreślić krytycznego znaczenia zastosowania protokołu dezagregacji przed użyciem Httex1. Liofilizowane białka polyQ, takie jak Httex1, są stabilne i mogą być przechowywane przez długi czas, ale nie są całkowicie rozpuszczalne w wodzie i. Obecność wstępnie uformowanych oligomerów lub włókienek może mieć znaczący wpływ na kinetykę agregacji i właściwości biofizyczne białka45. Opisany tutaj protokół dezagregacji pozwala na dezagregację białka, usunięcie wstępnie uformowanych agregatów i wytworzenie roztworu monomerycznego Httex1 z liofilizowanej próbki. Zaobserwowaliśmy podobną kinetykę agregacji i morfologię włókienek dla Httex1 uzyskanych za pomocą SUMO i strategii inteiny.

W porównaniu z poprzednimi metodami wytwarzania Httex1, opisana tutaj strategia SUMO oferuje kilka zalet i rozszerza zakres możliwych badań w celu zbadania struktury i właściwości funkcjonalnych tego białka w zdrowiu i chorobie. Białko fuzyjne SUMO-Httex1 jest łatwe w obsłudze, można je zamrozić i przechowywać lub przechowywać w roztworze przez 24 godziny w temperaturze otoczenia, podczas gdy wolny mHttex1 szybko się agreguje. Stabilność i wysoka rozpuszczalność białek fuzyjnych SUMO-Httex1 zapewnia większą elastyczność w manipulowaniu białkiem i/lub wprowadzaniu modyfikacji enzymatycznych i chemicznych do mHttex1, które w innym przypadku nie byłyby możliwe po rozszczepieniu. Obejmuje to wprowadzenie modyfikacji potranslacyjnych, fluoroforów, znaczników spinowych, znaczników biotyny itp. Zaprezentowane tutaj postępy powinny 1) ułatwić przyszłe badania w celu wyjaśnienia zależności struktura-funkcja Httex1; 2) opracowanie nowych narzędzi do badania agregacji Htt i rozprzestrzeniania się patologii; 3) umożliwienie opracowania nowych testów w celu identyfikacji cząsteczek stabilizujących zmutowany Httex1 i zapobiegających jego agregacji; oraz 4) zachęcić naukowców z innych dziedzin do podjęcia prac nad tym białkiem i przyłączenia się do naszego dążenia do znalezienia lekarstwa na chorobę Huntingtona.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana głównie z grantów fundacji CHDI i Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki. Dziękujemy dr Sophie Vieweg za przydatne dyskusje podczas opracowywania tego nowego systemu odciągania pokarmu oraz pozostałym członkom grupy Lashuel za podzielenie się swoimi doświadczeniami z tym systemem odciągania pokarmu oraz za ich wkład i cenne informacje zwrotne. Dziękujemy również prof. Oliverowi Hantschelowi za dostarczenie plazmidu ULP1. Autorzy dziękują dr. Johnowi B. Warnerowi i dr. Senthilowi K. Thangarajowi za krytyczną recenzję manuskryptu

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mrówczan uranylu (UO2(CHO2)2)EMS22450
Formvar/carbon 200 mesh, siatki Cu 50EMSFCF200-Cu-50
High Precision Cell wykonany z kwarcu SUPRASIL 1 mm ścieżka światła od Hellma AnalyticsHellmaAnalytics110-1-40
Substancja buforowa Dulbecco's (PBS w/o Ca i Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVAWitechSVA4730203
AmpicillinAxonLabA0839.0100
Rosół Luria (bulion Miller's LB)  Chemie Brunschwig1551.05
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)AxonLabA1008.0025
E. coli B ER2566NEBNEB# E4130
ImidazolSigma56750-500G
cKompletny  Koktajl inhibitorów proteazyRoche4693116001
Przeciwciało przeciw huntingtynie, a.a. 1-82Merck Millipore CorporationMAB5492
IRDye 680RD Goat anty-mysie IgG (H + L)Licor925-68070
PMSFAxonLabA0999.0005
HisPrep 16/10 kolumna GE Healthcare28936551
Kolumna HPLC C4Phenomenex00G-4168. P0      10 &mikro; m C4 300 & Aring;, Kolumna LC 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm kolumna ochronna, bez płaszcza temperaturowego
Acetonitryl HPLCMachereyNagelC2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterileSarstedt AG83.1826
Spektrofotometr pół-mikro kuwetaReactolab S.A.2534
Superloop, Złączki 1/16" (Ä KTAdesign), 50 mlGE Healthcare18111382
Kwas trifluorooctowySigma302031
GREINER Probówki do FPLC 16 x 100 mm, kapsel 12,0 mlGreiner Bio-One7.160 102
  100 kD Microcon  filtry szybkiego przepływuMerck Millipore CorporationMRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultradźwiękowy procesor cieczySonics
Ä KTA 900 wyposażony w kolektor frakcji GE Healthcare
Jasco J-815 System UPLC do dichroizmu cyrkularnegoJasco
Waters WodyC8 BEH uniewinnienie 2,1x100 mm kolumna 1,7 mikrona  , kolumna podgrzewana (40 ° C), natężenie przepływu 0,6 ml/min, objętość wtrysku 4 μ System
HPLC L watersDetektor UV Waters2489 i moduł gradientu czwartorzędowego 2535, pętla 20 mL w obudowie FlexInject
ESI-MS: Finnigan LTQThermo Fisher Naukowy
przyrząd do liofilizacjiFreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN FEIwyposażony w pistolet LaB6 i kamerę CCD 4K x 4K FEI Eagle (FEI) i pracujący przy napięciu 80 kV
37 & stopni; C drżenie  inkubatorInfors HT multitron Biofotometr standardowy
plusEppendorf
Mikroskop elektronowy

Bibliografia

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19(2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie bia ekchromatografia powinowactwa do zimmobilizowanych metaliHPLC w fazie odwr conejanaliza UPLCanaliza SDS PAGEtworzenie w kienkinetyka agregacjibia ko bez znacznika
Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.