Method Article

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

DOI:

10.3791/57509

⸱

August 3rd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology and Oncology, Washington University School of Medicine, 2Center for Genome Sciences and Systems Biology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne techniki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) pozwoliły na ogromną charakterystykę genomu przez ponad dekadę. W szczególności NGS został wykorzystany do analizy spektrum mutacji klonalnych w nowotworach złośliwych. Chociaż są znacznie bardziej skuteczne niż tradycyjne metody Sangera, NGS ma problemy z identyfikacją rzadkich mutacji klonalnych i subklonalnych ze względu na wysoki poziom błędów wynoszący ~0,5–2,0%. W związku z tym standardowy NGS ma granicę wykrywalności dla mutacji, które są >0,02 frakcji allelu wariantu (VAF). Chociaż znaczenie kliniczne tak rzadkich mutacji u pacjentów bez znanej choroby pozostaje niejasne, pacjenci leczeni z powodu białaczki znacznie poprawiają wyniki, gdy choroba resztkowa wynosi <0,0001 za pomocą cytometrii przepływowej. Aby złagodzić to sztuczne tło NGS, opracowano liczne metody. W tym miejscu opisujemy metodę sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów (ECS), która polega na znakowaniu pojedynczych cząsteczek zarówno indeksem losowym 16 pz w celu korekcji błędów, jak i wskaźnikiem specyficznym dla pacjenta w pz 8 pz w celu multipleksowania. Nasza metoda może wykrywać i śledzić mutacje klonalne przy wariantowych frakcjach alleli (VAF) o dwa rzędy wielkości niższych niż granica wykrywalności NGS i tak rzadkich jak 0,0001 VAF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z wiekiem, narażenie na mutageny i błędy stochastyczne podczas podziału komórki powoduje akumulację aberracji somatycznych w genomie, co leży u podstaw fundamentalnej patogenezy przemian nowotworowych, chorób neurorozwojowych, zaburzeń pediatrycznych i normalnego starzenia się1,2. Mutacje somatyczne o potencjale wywołującym chorobę są ważnymi biomarkerami diagnostycznymi i prognostycznymi dla wczesnego wykrywania i zarządzania ryzykiem3,4,5. Aby lepiej zrozumieć klonogenezę fizjologiczną, która będzie informować o decyzjach klinicznych i badawczych, kluczowe znaczenie ma dokładna kwantyfikacja i charakterystyka tych mutacji. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie wykorzystywane do badania mutacji klonalnych w heterogenicznych próbkach DNA; jednak NGS ogranicza się do identyfikacji mutacji we frakcji allelu wariantu >0,02 (VAF) — ze względu na nieodłączny wskaźnik błędów 0,5–2,0% platform sekwencjonowania6,7,8. W związku z tym śledzenie istotnych diagnostycznie i prognostowo wariantów somatycznych przy niższym VAF nie może być osiągnięte przy użyciu standardowego NGS.

Ostatnio opracowano różne metody w celu obejścia wskaźnika błędów NGS8,9,10,11. Metody te wykorzystują znakowanie molekularne, które umożliwia korekcję błędów po sekwencjonowaniu. Każda cząsteczka lub fragment genomu w bibliotece sekwencjonowania jest oznaczony losowym unikalnym identyfikatorem molekularnym (UMI), który jest specyficzny dla tej cząsteczki. UMI są konstruowane przez permutacje ciągu losowych nukleotydów (8-16 N). Drugi kod kreskowy specyficzny dla próbki jest również zintegrowany z przepływem pracy, który umożliwia multipleksowanie wielu próbek w tym samym cyklu sekwencjonowania NGS. Amplifikacja PCR jest wykonywana na bibliotece znakowanej molekularnie, a następnie biblioteka jest wysyłana do sekwencjonowania. Podczas przygotowywania biblioteki oczekuje się, że błędy zostaną losowo wprowadzone do fragmentu genomu podczas amplifikacji i sekwencjonowania PCR8. Aby usunąć losowe błędy sekwencjonowania, odczyty nieprzetworzonego sekwencjonowania są grupowane zgodnie z UMI. Oczekuje się, że artefakty z sekwencjonowania nie będą obecne we wszystkich odczytach z tym samym UMI w tej samej pozycji genomowej ze względu na stochastyczny charakter wprowadzenia, podczas gdy prawdziwy wariant zostanie wiernie amplifikowany i sekwencjonowany we wszystkich odczytach, które mają ten sam UMI. Artefakty są bioinformatyczne usuwane. W tym miejscu opisujemy trzy metody sekwencjonowania z korekcją błędów (ECS) zoptymalizowane w laboratorium dla DNA w celu identyfikacji wariantów pojedynczych nukleotydów (SNV) i małych insercji-delecji (Indels) oraz dla RNA w celu ułatwienia kwantyfikacji ekspresji genów poniżej progu błędu NGS.

Pierwsza metoda opisuje sposób poszukiwania rzadkiego zdarzenia somatycznego za pomocą starterów specyficznych dla genów, zaprojektowanych przez badaczy. Przed przygotowaniem biblioteki badacze powinni zaprojektować elementarze ukierunkowane na interesujące ich fragmenty. Użyliśmy aplikacji internetowej Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplikony 200–250 pz są idealne do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ponieważ po włączeniu UMI będą generować nakładające się odczyty sparowanych końców z odczytami sparowanych końców 150 pz. Optymalne warunki projektowania podkładu, które należy zastosować, to: Minimalny rozmiar podkładu = 19; Optymalna wielkość podkładu = 25; Maksymalny rozmiar podkładu = 30; Minimum Tm = 64 °C; Optimum Tm = 70 °C; Maksymalne Tm = 74 °C; Maksymalna różnica Tm = 5 °C; Minimalna zawartość GC = 45; Maksymalna zawartość GC = 80; Liczba do zwrócenia = 20; Maksymalna stabilność końcowa 3' = 100.

W Metodzie 2 opisujemy metodę łączącą protokół ECS-DNA z chemią Illumina w celu zbadania klonalnych SNV i małych Indel, tak rzadkich jak 0,0001 VAF, przy użyciu dostępnych na rynku paneli genowych, które zawierają setki amplikonów. W naszym eksperymencie wykorzystaliśmy Panel Sekwencjonowania Szpiku TruSight (Illumina) i zaprojektowaliśmy rozszerzony panel, aby uwzględnić dodatkowe geny interesujące dla chorób szpiku u dzieci. Panele te nie oferowały unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI), które ułatwiałyby korekcję błędów, dlatego dodaliśmy do nich własną strategię adapterów. ECS powinien działać równie dobrze z każdym innym panelem zaprojektowanym do wzbogacania genów związanych z różnymi chorobami. Po wyizolowaniu DNA i późniejszym określeniu ilościowym z tkanki lub próbki będącej przedmiotem zainteresowania, zaleca się posiadanie co najmniej 500 ng podstawowego DNA na próbkę. Rutynowo tworzymy pojedynczą bibliotekę sekwencjonowania przy użyciu 250 ng DNA, aby uchwycić jak najwięcej unikalnych fragmentów genomu do dalszych odczytów, deduplikacji i obliczeń VAF. Opcjonalna biblioteka sekwencjonowania replik może być wykonana z pozostałych 250 ng DNA. Zawsze tworzymy dwie biblioteki replikacji na próbkę i bierzemy pod uwagę tylko te zdarzenia, które zostały wykryte niezależnie w obu replikacjach, jako prawdziwie dodatnie. Zaimplementowaliśmy również genomiczny model błędu dwumianowego specyficzny dla pozycji, aby zwiększyć dokładność wywoływania wariantów4,13.

Na koniec, opisujemy metodę łączącą sekwencjonowanie ECS z RNA w celu kwantyfikacji transkryptu przy użyciu gotowych paneli QIAseq Targeted RNA (Qiagen). Interfejsy UMI wymagane do deduplikacji i korekcji błędów zostały włączone do zestawów, a badacze mogą tworzyć biblioteki zgodnie z zaleceniami producenta. Z bioinformatycznego punktu widzenia naukowcy mogą postępować zgodnie z planem opracowanym dla ECS-DNA, który zostanie szczegółowo opisany w sekcji PROTOCOL.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekwencjonowanie DNA z korekcją błędów

  1. Amplifikacja PCR interesujących fragmentów genomu.
    1. Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności do amplifikacji amplikonów (Tabela materiałów, pozycja 1). Amplifikować reakcję PCR w następujących warunkach w termocyklerze: 30 s w temperaturze 98 °C; 18–40 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 66 °C i 30 s w temperaturze 72 °C; 2 min w temperaturze 72 °C; przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Oczyść produkty PCR za pomocą kulek paramagnetycznych (tabela materiałów, poz. 2). Dodaj reakcję PCR do kulek w stosunku 1: 1,8 (objętość reakcji PCR: objętość kulki) zgodnie z protokołem producenta. Eluować za pomocą 20 μl ddH2O.
    3. Określić ilościowo stężenie DNA (tabela materiałów, pozycja 3) w celu określenia końcowego stężenia DNA.
    4. Uruchom podwielokrotność DNA na 2% żelu agarozowym (Tabela materiałów, pozycja 4), aby potwierdzić rozmiar amplikonów.
      UWAGA: Alternatywnie, badacze mogą zdecydować się na przeprowadzenie analizy bioanalizatorem produktów PCR w celu określenia wielkości amplifikowanych fragmentów genomu, a także stężenia produktów.
  2. Wyżarzanie adaptera sekwencyjnego
    1. Zaopatrz się w adaptery i7 (Tabela materiałów, poz. 5). Korzystaj z nich tak, jak są one dostępne w kolejnych krokach.
    2. Adaptery 16N i5 należy zakupić komercyjnie z następującą sekwencją oligo (pozycja 6 tabeli materiałów): AATGATACGGCGACCGAGATCTACTACAC(N1:25252525)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
      UWAGA: Adaptery 16N i5 zastępują standardowe adaptery i5 i są to adaptery z ciągiem 16 losowych nukleotydów w celu ułatwienia ECS.
    3. Przygotuj roztwór roboczy adaptera 16N i5: 40 μL 100 μM 16N i5 zapasu adaptera, 10 μL buforu TE i 10 μL 500 μM roztworu NaCl.
    4. Podwielokrotność 7,5 μl roztworu roboczego i5 przygotowanego w kroku 1.2.3 do oddzielnych studzienek PCR.
    5. Dodaj 5 μl adaptera i7 specyficznego dla próbki do odpowiednich studzienek.
    6. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie schładzać w temperaturze 1 °C co 30 s do 4 °C w termocyklerze.
    7. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Naprawa końcowa i dA-tailing bibliotek
    UWAGA: Równolegle z wyżarzaniem adaptera można wykonać naprawę końcową i dA-tailing na amplikonach PCR z kroku 1.1. Po wykonaniu tych kroków przeprowadza się ligację wyżarzonych adapterów od kroku 1.2 do naprawionego końca i amplikonów PCR z ogonem dA. Po podwiązaniu adaptera budowa biblioteki ECS jest zakończona.
    1. Zacznij od co najwyżej 1 μg wyjściowego DNA (minimum ~200 ng)
    2. Wykonaj naprawę końcową i dA-tail na amplikonach (tabela materiałów, pozycja 7).
      1. Dodać 3,0 μl mieszanki enzymów do przygotowania końcówek i 6,5 μl buforu do naprawy końcówek.
      2. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 20 °C, następnie przez 30 minut w temperaturze 65 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    3. Wykonać podwiązanie na wyżarzonych adapterach (tabela materiałów, poz. 8).
      1. Dodaj 2,5 μl wyżarzonych adapterów z kroku 2, 15 μl Blunt/TA Ligase Mastermix i 1 μl wzmacniacza ligacji.
      2. Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 20 °C, a następnie przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Wyczyść biblioteki za pomocą kulek magnetycznych (pozycja 2 w tabeli materiałów): Dodaj reakcję PCR do kulek w zmodyfikowanym stosunku 1: 0,75 (objętość reakcji PCR: objętość kulek magnetycznych):
      1. Odpipetować 62,6 μl roztworu kulek magnetycznych do 83,5 μl produktów PCR z kroku 1.2.7.
      2. Przenieść mieszaninę do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml.
      3. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut.
      5. Umieść rurkę na uchwycie magnetycznym. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny.
      6. Usunąć supernatant.
      7. Umyj koraliki 200 μl 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórz krok mycia etanolem jeden raz.
      10. Wysuszyć koraliki na powietrzu.
      11. Eluować za pomocą 20 μl ddH2O.
        UWAGA: Ta modyfikacja w stosunku reakcji PCR do kulek magnetycznych preferencyjnie usunie fragmenty DNA mniejsze niż 200 pz.
  4. Oznaczanie ilościowe metodą kropelkową metodą PCR
    UWAGA: Precyzyjna kwantyfikacja mutacji wymaga ścisłego przestrzegania liczby cząsteczek z każdej biblioteki, które są ładowane do sekwencera. Aby to osiągnąć, ilościowe określenie liczby cząsteczek dla poszczególnych bibliotek na jednostkę objętości odbywa się przy użyciu platformy QX200 droplet digital PCR (ddPCR) — alternatywną opcją jest ilościowy PCR. Po analizie ddPCR odczyt określi liczbę cząsteczek na μl na bibliotekę.
    1. Rozcieńczyć biblioteki ECS w stosunku 1:1,000 przez stopniowe rozcieńczanie przez współczynnik 10 w probówkach paskowych PCR.
    2. Przygotuj następującą mieszankę wzorcową do ddPCR w probówce o pojemności 1,5 ml: 10 μl mieszanki PCR (tabela materiałów, pozycja 9), 0,2 μl podkładu P5, 0,2 μl podkładu P7, 5 μl oczyszczonego produktu ECS z kroku 1.4.1 i 4,5 μl ddH2O.
    3. Porcjować 20 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki próbki, upewniając się, że są wielokrotności liczby 8.
      1. Porcjować 70 μl oleju wytwarzającego kropelki (tabela materiałów, pozycja 10) do każdego szybu naftowego. Przykryj kasetę gumową uszczelką.
    4. Twórz kropelki za pomocą generatora kropel (Tabela materiałów, poz. 11).
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj kropelki wytworzone w kroku 1.4.4 do płytki PCR, upewniając się, że pipetowanie próbki odbywa się powoli przez 5 sekund, aby uniknąć ścinania DNA.
    6. Wzmacniać sygnał zawarty w kropelkach przez 40 cykli w termocyklerze, stosując następujące warunki: 5 minut w temperaturze 95 °C; 40 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 1 minutę w temperaturze 63 °C; 5 minut w temperaturze 4 °C, 5 minut w temperaturze 90 °C, a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotuj czytnik kropelek szablonu ddPCR (tabela materiałów, pozycja 11). Upewnij się, że parametry dla bezwzględnej kwantyfikacji i użycia QX200 ddPCR Eva Green Supermix.
    8. Po zakończeniu analizy ddPCR upewnij się, że ustawiłeś ten sam próg dzielenia dla wszystkich próbek.
    9. Korzystając z odczytu stężenia z czytnika kropel QX200, podwielokrotn odpowiednią objętość, aby wprowadzić żądaną liczbę cząsteczek do kolejnego etapu.
  5. Amplifikacja PCR bibliotek do sekwencjonowania
    1. Przygotuj następującą mieszankę wzorcową dla żądanej liczby cząsteczek z kroku 1.4.9: 25 μL Q5 Mastermix (tabela materiałów, pozycja 1), 2,5 μl P5 Primer (10 μM), 2,5 μL P7 Primer (10 μM), X μL DNA, 20-X μL ddH2O.
    2. Amplifikować biblioteki z kroku 1.5.1 w termocyklerze, stosując następujące warunki: 30 s w 98 °C; 20 cykli po 10 s w 98 °C, 30 s w 63 °C, 30 s w 72 °C; 2 min w 72 °C; a następnie przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
    3. Oczyść biblioteki za pomocą kulek magnetycznych (Tabela materiałów, poz. 2): Dodaj reakcję PCR do kulek magnetycznych w zmodyfikowanym stosunku 1: 0,75 (objętość reakcji PCR: objętość kulek magnetycznych).
      1. Odpipetować 37,5 μl roztworu kulek magnetycznych do 50 μl produktów PCR z kroku 1.5.2.
      2. Przenieść mieszaninę do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml.
      3. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut.
      5. Umieść rurkę na uchwycie magnetycznym. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny.
      6. Usunąć supernatant.
      7. Umyj koraliki 200 μl 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórz krok mycia etanolem jeden raz.
      10. Wysuszyć koraliki na powietrzu.
      11. Eluować za pomocą 20 μl ddH2O.
    4. Uruchom podwielokrotność DNA na 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić wielkość amplikonów.
    5. Określ ilościowo stężenie DNA (tabela materiałów, pozycja 3) w celu określenia stężenia oddzielnych bibliotek ECS.
    6. Pula bibliotek w ilościach równomolowych.
      UWAGA: Na przykład badacze mogą połączyć osiem bibliotek w grupie równomolowej4 z 4 milionami cząsteczek wyjściowych do sekwencjonowania za pomocą platformy sekwencjonowania, która generuje do 400 milionów odczytów. Ostrożnie zaleca się stosowanie średnio dziesięciu surowych odczytów do korekcji błędów dla każdej cząsteczki. Zajęłoby to 360 milionów odczytów (4 miliony cząsteczek * 8 bibliotek * 10 odczytów w celu korekcji błędów). Przy 4 milionach unikalnych cząsteczek na bibliotekę, naukowcy mogą spodziewać się teoretycznego średniego konsensusu odczytu na poziomie 7042x na amplikon (4 miliony/568 amplikonów z panelu genów).
    7. Określ ilościowo stężenie DNA (tabela materiałów, pozycja 3), aby określić stężenie połączonej biblioteki ECS.
    8. Prześlij pulę biblioteki ECS przy około 4 nM.
    9. Zapewnij następujące ustawienia sekwencjonowania platformom sekwencjonowania Illumina (MiSeq, HiSeq lub NextSeq): 2x144 odczyty sparowanych końców, 8 cykli Indeks 1 i 16 cykli Indeks 2.

2. Panele genetyczne z sekwencjonowaniem DNA z korekcją błędów

  1. Hybrydyzacja oligonukleotydów z paneli genowych
    UWAGA: W tym kroku skonstruuje się biblioteki sekwencjonowania przy użyciu zmodyfikowanego protokołu Illumina TruSight lub TruSeq w celu włączenia UMI (Tabela materiałów, pozycja 17).
    1. Hybrydyzuj oligonukleotydy na fragment genomu zgodnie z protokołem producenta. Użyj 250 ng DNA (lub dowolnej pożądanej ilości materiału wyjściowego).
    2. Usunąć niezwiązane oligonukleotydy zgodnie z protokołem producenta.
    3. Wykonać podwiązanie przedłużające zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Modyfikacje protokołu producenta rozpoczynają się poniżej.
  2. Integracja adapterów i5 i i7 przez PCR
    1. Przygotować mastermix do PCR, pipetując następujące odczynniki do probówki o odpowiedniej objętości: 37,5 μl Q5 Mastermix (tabela materiałów, pozycja 1), 6 μl 10 μM 16N i5 adapterów (szczegółowo w Metodzie 1, Krok 1.2.2), 6 μL adapterów i7 (Użyj różnych adapterów i7 do oddzielnych próbek do multipleksowania), i 22 μl roztworu przedłużającego podwiązanie z kulkami z etapu 2.1.3.
      UWAGA: Q5 Mastermix zastępuje mastermix polimerazy dostarczony przez firmę Illumina. Polimeraza Q5 amplifikuje fragment genomu z większą wiernością i mniejszą liczbą wprowadzonych błędów.
    2. Uruchom program PCR na termocyklerze, stosując następujące parametry: 30 s w 98 °C, 4–6 cykli po 10 s w 98 °C, 30 s w 66 °C, 30 s w 72 °C; 2 min w 72 °C, a następnie przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Liczba cykli zależy od rozmiaru panelu. Z naszego doświadczenia wynika, że 4-cyklowy PCR jest wystarczający, jeśli panel genów ma około 1500 różnych par oligonukleotydów specyficznych dla genu, podczas gdy panel z 500-600 parami oligonukleotydów wymaga 6 cykli PCR.
    3. Oczyść reakcje PCR za pomocą kulek magnetycznych (tabela materiałów, poz. 2): Dodaj reakcję PCR do kulek magnetycznych w zmodyfikowanej reakcji 1 PCR: stosunek kulek magnetycznych 0,75:
      1. Odpipetować 56,25 μl roztworu kulek magnetycznych do 75 μl produktów PCR z kroku 2.2.2.
      2. Przenieść mieszaninę do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml.
      3. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut.
      5. Umieść rurkę na uchwycie magnetycznym. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny.
      6. Usunąć supernatant.
      7. Umyj koraliki 200 μl 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórz krok mycia etanolem jeden raz.
      10. Wysuszyć koraliki na powietrzu.
      11. Eluować za pomocą 20 μl ddH2O.
  3. Kwantyfikuj biblioteki za pomocą platformy QX200 ddPCR.
    1. Postępuj zgodnie z krokiem 1.4 w metodzie 1.
      UWAGA: 4 miliony cząsteczek zostały znormalizowane na bibliotekę próbek4 w reprezentatywnym wyniku (Rysunek 2) w celu uzyskania teoretycznej średniej 7 042 unikalnie indeksowanych cząsteczek (4 miliony podzielone przez 568 oligonukleotydów specyficznych dla genu).
  4. Wzmacnianie i normalizowanie bibliotek na potrzeby sekwencjonowania.
    1. Amplifikuj żądaną liczbę cząsteczek za pomocą następującej mieszanki głównej do końcowego PCR o łącznej objętości 50 μL: 25 μl Q5 Mastermix, 2 μl P5 Primer (1 μM), 2 μL P7 Primer (1 μM) i 21 μL cząsteczek DNA.
    2. Uruchomić program PCR na termocyklerze, używając następującego parametru: 30 s w 98 °C; 16 cykli po 10 s w 98 °C, 30 s w 66 °C, 30 s w 72 °C; 2 min w 72 °C; a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
    3. Oczyść biblioteki sekwencjonowania za pomocą kulek magnetycznych (tabela materiałów, pozycja 2): Dodaj reakcję PCR do kulek magnetycznych w zmodyfikowanej reakcji 1 PCR: Stosunek kulek magnetycznych 0,75:
      1. Odpipetować 37,5 μl roztworu kulek magnetycznych do 50 μl produktów PCR z kroku 2.4.2.
      2. Przenieść mieszaninę do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml.
      3. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut.
      5. Umieść rurkę na uchwycie magnetycznym. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny.
      6. Usunąć supernatant.
      7. Umyj koraliki 200 μl 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórz krok mycia etanolem jeden raz.
      10. Wysuszyć koraliki na powietrzu.
      11. Eluować za pomocą 20 μl ddH2O.
    4. Uruchom porcję eluowanego DNA (~ 3 μl) na 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić wielkość amplikonów.
    5. Określ ilościowo stężenie DNA (tabela materiałów, pozycja 3) w celu określenia stężenia oddzielnych bibliotek ECS.
    6. Połącz biblioteki w ilościach równomolowych. Patrz Metoda 1 Krok 1.5.6. a także Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat poolingu.
    7. Prześlij pulę biblioteki ECS przy około 4 nM.
    8. Zapewnij następujące ustawienia sekwencjonowania platformom sekwencjonowania Illumina (MiSeq, HiSeq lub NextSeq): 2x144 odczyty sparowanych końców, 8 cykli Indeks 1 i 16 cykli Indeks 2.
  5. Przetwarzanie i analiza bioinformatyczna ECS
    1. Uzyskaj odczyty demultipleksowane próbki z sekwencera lub wykonaj demultipleksację odczytów surowych sekwencji na różne próbki za pomocą sekwencji adaptera i7 bioinformatyczny za pomocą niestandardowego skryptu.
    2. Odetnij pierwsze 30 nukleotydów z każdego odczytu zdemultipleksowanego, aby usunąć sekwencje oligonukleotydów z panelu genów.
    3. Wyrównaj odczyty, które mają te same interfejsy UMI, aby utworzyć rodziny odczytu.
      UWAGA: Badacze mogą używać oprogramowania obsługującego UMI, takiego jak MAGERI13, do wyodrębniania rodzin odczytu. W tym eksperymencie nie dozwolono na żadną odległość hamminga w sekwencji UMI, aby zwiększyć specyficzność metody.
    4. Wykonaj deduplikację i korekcję błędów, korzystając z następujących zalecanych parametrów.
      1. Użyj ≥5 par odczytu w tej samej rodzinie odczytu. Zalecane są co najmniej trzy pary odczytu.
      2. Porównaj nukleotyd na każdej pozycji we wszystkich odczytach w tej samej rodzinie odczytów i wygeneruj nukleotyd konsensusu, jeśli istnieje co najmniej 90% zgodności między odczytami dla danego nukleotydu. Wywołaj N, jeśli istnieje mniej niż 90% zgodności co do pozycji nukleotydu.
      3. Odrzuć odczyty konsensusu, które mają >10% całkowitej liczby nukleotydów konsensusu nazywanych jako N.
    5. Dopasuj wszystkie zachowane odczyty konsensusu lokalnie do ludzkiego genomu referencyjnego hg19 lub hg38 przy użyciu preferowanych przez badacza nakładek, takich jak Bowtie2 i BWA.
    6. Przetwarzaj odczyty wyrównane za pomocą Mpileup przy użyciu parametrów –BQ0 –d 10 000 000 000 000 w celu usunięcia progów pokrycia w celu zapewnienia prawidłowego wydruku stosu niezależnie od VAF.
    7. Odfiltruj pozycje z mniej niż 1000-krotnym pokryciem odczytu konsensusu.
      UWAGA: Badacz arbitralnie określa minimalne pokrycie dla każdej pozycji nukleotydu, zaleca się co najmniej 500-krotne pokrycie konsensusu odczytu do dalszej analizy.
    8. Użyj rozkładu dwumianowego, aby wywołać warianty pojedynczego nukleotydu (SNP) w zatrzymanych danych z kroku 2.5.7 z następującymi parametrami. Statystyka dwumianowa będzie oparta na genomowym modelu błędu specyficznego dla pozycji. Każda pozycja genomowa jest modelowana niezależnie po zsumowaniu poziomów błędów wszystkich próbek dla tej konkretnej pozycji. Podążając za przykładem:
      Prawdopodobieństwo profilu nukleotydowego w danej pozycji genomowej, p
      ∑ Wariant RF2 ∑ Łączna liczba RFs
      = 26/255505
      = 0,000101759
      Dwumianowe prawdopodobieństwo 24 wariantów RF z 35911 całkowitych RF, P(X ≥ x) w próbie K
      = 1 - dwumianowy(24, 35911, 0.000101759)
      = 2.26485E-13
      UWAGA: Dla każdej pytanej pozycji genomowej istniałyby trzy możliwe zmiany mutacyjne (tj. A>T, A>C, A>G), z których każda byłaby reprezentowana jako artefakt tła. Zdarzenia somatyczne, które znacznie różnią się od tła po korekcji Bonferroniego, są zachowane. W przykładzie przedstawionym w tabeli 1 liczba przeprowadzonych testów wynosiła 11, stąd wartość p skorygowana przez Bonferroniego ≤0,00454545 (0,05/11) była wymagana, aby nazwać zdarzenie statystycznie istotnym.
    9. Zdarzenia somatyczne muszą być obecne w obu powtórzeniach tego samego próbki; w przeciwnym razie należy je traktować jako fałszywie dodatnie.

figure-protocol-1
Tabela 1: Przykład przedstawiający sposób konstruowania modelu błędu dwumianowego specyficznego dla pozycji.

3. Sekwencjonowanie RNA z korekcją błędów

  1. Oprócz oceny mutacji na poziomie DNA, zintegruj ECS z różnymi ukierunkowanymi panelami sekwencjonowania RNA, aby wykryć rzadki lub mało obfity transkrypt na poziomie RNA. Łącząc ECS z gotowymi panelami sekwencjonowania RNA Qiagen, zademonstrowaliśmy cyfrową kwantyfikację ekspresji genów dla transkryptów z zaledwie dziesięcioma kopiami bez konieczności normalizacji względem genu porządkującego. Interfejsy UMI wymagane do korekcji błędów zostały zintegrowane z panelem.
    1. Przeprowadzić ekstrakcję całkowitego RNA (tabela materiałów, poz. 20).
    2. Przeprowadzić przygotowanie biblioteki ECS-RNA zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów, poz. 19).
    3. Wykonaj potok bioinformatyczny zgodnie z krokami 2.5.1–2.5.6. metody 2 opisanej w poprzedniej sekcji. Po kroku 2.5.6 liczba dopasowanych odczytów konsensusu na gen reprezentuje poziom ekspresji genu bez potrzeby normalizacji długości genu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z Ukierunkowanym Sekwencjonowaniem Skorygowanym o Błędy dla DNA, przeprowadziliśmy eksperyment potwierdzający zasadność rozcieńczania zmutowanego DNA pacjenta w komercyjnym genomowym DNA. Pacjent miał mutację w GATA1 (chrX:48650264, C>G) z pierwotnym VAF 0,19. Pokazujemy w Rysunek 1, że ECS jest ilościowy do poziomu 1:10 000 dla wariantu pojedynczego nukleotydu.

figure-results-1
Rysunek 1: Serie rozcieńczeń GATA1 SNV pokazujące, że ECS jest ilościowy na poziomie 1:10 000. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pokazujemy również, że ECS-DNA niezawodnie wykrywa rzadkie mutacje klonalne w genach powtarzających się w dorosłej ostrej białaczce szpikowej (AML) u zdrowych osób starszych4. Uzyskaliśmy próbki sierści buffy od 20 zdrowych osób w Nurse's Health Study w odstępie około ~10 lat. Na tych próbkach zastosowaliśmy protokół panelu ECS-DNA. Do tego eksperymentu dostosowaliśmy panel sekwencjonowania szpiku Illumina TruSight, który składa się z 568 amplikonów (więcej informacji na temat listy genów na https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) i zsekwencjonowaliśmy 80 bibliotek od 20 osób (2 kolekcje w różnych punktach czasowych, 2 powtórzenia na osobę na punkt czasowy) przy użyciu platformy Illumina NextSeq, która wygenerowała średnio 47,7 miliona odczytów sparowanych końców i średnio 3,4 miliona Poprawiono błędy sekwencje konsensusu na bibliotekę4. Średnie pokrycie nukleotydami na bibliotekę wynosiło około 6000x (3,4 miliona podzielone przez 568). Dla każdej próbki skonstruowaliśmy profil błędu specyficzny dla pozycji, używając sekwencjonowanych bibliotek, które nie pochodzą z tej samej próbki. Znaleźliśmy 109 klonalnych mutacji somatycznych, które były obecne w obu powtórzeniach co najmniej jednego punktu czasowego. Mutacje te mają VAF w zakresie od 0,0003 do 0,1451. Wybraliśmy 21 mutacji ze znanymi reprezentacjami COSMIC i zwalidowaliśmy wszystkie 21 mutacji w jednym lub dwóch punktach czasowych zbierania za pomocą ddPCR (n = 34, Rysunek 2, zaadaptowany z Young et al. 20164).

figure-results-2
Rycina 2: Mutacje zidentyfikowane przez ECS zweryfikowano za pomocą ddPCR z wysoce zgodnymi VAF. (n=34, zmodyfikowane z Young et al. 20164). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jeśli chodzi o poziom ekspresji skorygowany o błędy za pomocą protokołu ECS-RNA, dostosowaliśmy panel genów za pomocą chemii QIAseq, który składa się z 416 genów, o których wiadomo, że są związane z różnymi nowotworami (zaadaptowane z panelu transkryptomu ludzkiego raka QIAseq) i amplifikowaliśmy najczęściej wyrażany ekson danego genu (Lista genów w materiale uzupełniającym 1). Zsekwencjonowaliśmy biblioteki za pomocą platformy Illumina MiSeq w formacie sparowanego końca, który dał średnio 8,3 miliona odczytów na bibliotekę i udało nam się przechwycić średnio 0,417 miliona sekwencji konsensusu z korekcją błędów. Wykazaliśmy, że poziom ekspresji transkryptu o niskiej liczebności (<1,000 liczby transkryptów w 50 ng całkowitego RNA) jest wysoce odtwarzalny między powtórzeniami (punkt danych n = 300, Rysunek 3). Walidacja za pomocą ddPCR (sześć wybranych genów o różnym stopniu ekspresji) wykazała, że poziom ekspresji genów został prawidłowo uchwycony przez protokół ECS bez konieczności normalizacji.

figure-results-3
Rysunek 3: U góry, korelacja liczby transkryptów przez ECS-RNA między powtórzeniami tej samej próbki (n = 300). Dolna, liczba transkryptów zidentyfikowana przez ECS została zweryfikowana za pomocą ddPCR (n = 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu demonstrujemy zestaw protokołów sekwencjonowania z korekcją błędów, które można łatwo wdrożyć do badania mutacji z niskimi VAF w różnych chorobach. Najważniejszym czynnikiem jest włączenie UMI do każdej cząsteczki przed sekwencjonowaniem, ponieważ umożliwiają one korekcję błędów surowych odczytów. Opisane tutaj metody pozwalają naukowcom na włączenie niestandardowych UMI zarówno do dostępnych na rynku paneli genowych, jak i samodzielnie zaprojektowanych oligonukleotydów specyficznych dla genów.

Standardowy protokół NGS wyklucza wykrycie mutacji z VAF poniżej 2% ze względu na wskaźnik błędów sekwencjonowania, a to ogranicza zastosowanie NGS w badaniach, w których kluczowe jest wykrycie rzadkich wariantów. Omijając standardowy poziom błędów NGS, ECS umożliwia czułe wykrywanie tych surowych wariantów. Na przykład wykrycie mutacji patogennych, gdy te mutacje pojawiają się po raz pierwszy (a więc przy niskim VAF) jest niezbędne do wczesnej interwencji w chorobie14,15. W badaniach nad białaczką wykrycie minimalnej choroby resztkowej (resztkowe komórki białaczkowe po leczeniu) informuje o stratyfikacji ryzyka i może być wykorzystane do informowania o opcjach leczenia w sposób, w jaki nie mogą tego zrobić oceny cytometrii binarnej przepływu. Ponadto ECS ma zastosowanie do wykrywania krążącego kwasu nukleinowego guza i oceny potencjału przerzutowego u pacjentów z guzami litymi poprzez ocenę obecności/braku, a także obciążenia wariantami niektórych mutacji, które są charakterystyczne dla guza pierwotnego16.

Jak pokazano w tabeli 1, moc wykorzystania modelu błędów opartego na rozkładzie dwumianowym i specyficznym dla pozycji do wywoływania wariantów zależy w dużej mierze od liczby sekwencjonowanych bibliotek, a także od głębokości sekwencjonowania użytego do zbudowania modelu błędów. Solidność modelu błędu wzrasta wraz ze wzrostem liczby próbek i większą głębokością sekwencjonowania. Zaleca się użycie co najmniej 10 sekwencjonowanych próbek ze średnim pokryciem odczytu z korekcją błędów wynoszącym 3000x na próbkę w celu zbudowania profilu błędów dla każdej próbki. Podejście oparte na konkretnej pozycji jest podobne do podejścia MAGERI, ale zamiast stosowania zagregowanego poziomu błędu dla wszystkich sześciu różnych typów podstawień (A>C/T>G, A>G/T>C, A>T/T>A, C>A/G>T, C>G/G>C, C>T/G>A)13, Każdą substytucję modelujemy niezależnie na każdej pozycji. Na przykład poziom błędu C>T w danej pozycji genomowej różni się od innego położenia. Nasze podejście uwzględnia również efekt partii sekwencjonowania, ponieważ podstawowy współczynnik substytucji obserwowany w jednym przebiegu sekwencjonowania może różnić się od innego przebiegu. Dlatego ważne jest, aby modelować każdą pozycję dla wszystkich typów podstawień, zwłaszcza gdy próbki z różnych serii sekwencjonowania są łączone w celu zbudowania modelu.

Ważną kwestią przy projektowaniu eksperymentu ECS jest pożądany próg wykrywalności. Piękno badań NGS polega na tym, że można je łatwo skalować pod względem genów/celów będących przedmiotem zainteresowania, progu wykrywania (podyktowanego głębokością sekwencjonowania) i liczby badanych osób. Na przykład, jeśli naukowcy są zainteresowani znalezieniem rzadkich mutacji w dwóch amplikonach o progu wykrywania 0,0001, mogą zebrać maksymalnie 75 próbek w jednym cyklu sekwencjonowania przy użyciu chemii MiSeq V2, która generuje do 15 milionów odczytów (2 amplikony * 10 000 cząsteczek * 10 odczytów w celu korekcji błędów * 75 próbek = 15 milionów odczytów sekwencjonowania). Naukowcy mogą zmieniać liczbę cząsteczek poddawanych sekwencjonowaniu lub liczbę zbiorczych próbek w jednym cyklu sekwencjonowania, aby dostosować próg wykrywania. W naszych badaniach naszym celem było znalezienie mutacji o progu detekcji 0,0001 VAF (1:10 000) przy użyciu panelu genów Illumina. Rutynowo używamy 250 ng wyjściowego DNA, aby zapewnić wychwycenie wystarczającej ilości cząsteczek w celu osiągnięcia wyżej wymienionego progu wykrywalności. Naukowcy mogą zdecydować się na rozpoczęcie od mniejszej ilości DNA (zalecane jest 50 ng), jeśli pożądana granica wykrywalności wynosi >0,001 VAF.

Ponieważ UMI są dołączane do indeksów i5, ustawienia sekwencjonowania muszą zostać odpowiednio zmienione. Na przykład użyliśmy 16 N UMI, a ustawienia sekwencjonowania to 2x144 sparowane odczyty końcowe, 8 cykli indeksu 1 i 16 cykli indeksu 2, w przeciwieństwie do zwykłych 8 cykli indeksu 2. Wzrost cyklu Indeksu 2 jest kompensowany spadkiem całkowitej liczby cykli przypisanych do odczytów. Jeśli badacze zdecydują się na użycie 12N UMI 10,17, ustawienia powinny zostać zmienione na 12 cykli indeksu 2.

Ta metoda sekwencjonowania oparta na UMI jest zoptymalizowana pod kątem korygowania błędów sekwencjonowania. Pozostaje nieoptymalna w radzeniu sobie z jackpottingiem PCR, który jest problemem dla wszystkich metod opartych na amplifikacji. Przeprowadziliśmy rundy walidacji post-sekwencjonowania i post-bioinformatycznej przy użyciu ddPCR i prawie nie wykrywamy żadnych fałszywych alarmów z powodu jackpotowania PCR. Niemniej jednak zaleca się, aby naukowcy przeprowadzili eksperymenty przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności, aby zapewnić niskie błędy amplifikacji.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy uczestnikom badania Children's Oncology Group AAML1531 oraz Nurses' Health Study za ich wkład w postaci próbek pacjentów. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health (UM1 CA186107, RO1 CA49449 i RO1 CA149445), Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital (MC-II-2015-461) oraz Eli Seth Matthews Leukemia Foundation.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Q5 High Fidelity Hot Start Master MixNew England BioLabsM0492S
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAThermo FisherScientific S33102
Truseq Niestandardowy zestaw indeksu amplikonuIlluminaFC-130-1003
Sekwencje adaptera UMI i5Zintegrowane technologieDNA-NEBNext
Ultra End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BioLabsE7442S
NEBNext Ultra II Ligation ModuleNew England BioLabsE7595S
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad1864034
QX200 Olej do wytwarzania kropelek do EvaGreenBio-Rad1864005
QX200 Kroplowy cyfrowy system PCRBio-Rad1864001
ddPCR 96-dołkowe płytkiBio-Rad12001925
DG8 Wkłady do generatora kropel QX200/QX100Uszczelki Bio-Rad1864008
DG8 do generatora kropel QX200/QX100 BioanalizatorBio-Rad1863009
Agilent GenomicsG2939BA
TapeStationAgilent GenomicsG2991AA
Panel sekwencjonowania szpiku TruSightIlluminaFC-130-1010
Muszka 2Uniwersytet
panel ukierunkowanego RNA QIAseqQiagen-Rneasy
Plus Mini Kit (50)Qiagen74134
Dostosowany przez Johnsa Hopkinsa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, M. L., et al. Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).
  2. O'Roak, B. J., et al. Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations. Nature. 485, 246-250 (2012).
  3. Young, A. L., et al. Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing. Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).
  4. Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. NatureCommunications. 7, 12484(2016).
  5. Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).
  6. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  7. Kohlmann, A., et al. Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease. Leukemia. 28, 129-137 (2014).
  8. Luthra, R., et al. Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring. Haematologica. 99, 465-473 (2014).
  9. Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).
  10. Schmitt, M., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).
  11. Vander Heiden, J. A., et al. pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires. Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).
  12. Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).
  13. Shugay, M., et al. MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing. PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).
  14. Wong, T. N., et al. Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia. Nature. 518, 552-555 (2014).
  15. Krimmel, J. D., et al. Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).
  16. Phallen, J., et al. Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA. ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).
  17. Egorov, E. S., et al. Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers. The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Error corrected SequencingVariant Allele FractionDigital Droplet PCRUnique Molecular IdentifiersIllumina SequencingClonal Mutation DetectionMinimal Residual DiseaseGene Panel AnalysisLow abundanceHematological Malignancies

Related Articles