Artykuł metodologiczny

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57509

⸱

3 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology and Oncology, Washington University School of Medicine, 2Center for Genome Sciences and Systems Biology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Streszczenie

Konwencjonalne techniki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) pozwoliły na ogromną charakterystykę genomu przez ponad dekadę. W szczególności NGS został wykorzystany do analizy spektrum mutacji klonalnych w nowotworach złośliwych. Chociaż są znacznie bardziej skuteczne niż tradycyjne metody Sangera, NGS ma problemy z identyfikacją rzadkich mutacji klonalnych i subklonalnych ze względu na wysoki poziom błędów wynoszący ~0,5–2,0%. W związku z tym standardowy NGS ma granicę wykrywalności dla mutacji, które są >0,02 frakcji allelu wariantu (VAF). Chociaż znaczenie kliniczne tak rzadkich mutacji u pacjentów bez znanej choroby pozostaje niejasne, pacjenci leczeni z powodu białaczki znacznie poprawiają wyniki, gdy choroba resztkowa wynosi <0,0001 za pomocą cytometrii przepływowej. Aby złagodzić to sztuczne tło NGS, opracowano liczne metody. W tym miejscu opisujemy metodę sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów (ECS), która polega na znakowaniu pojedynczych cząsteczek zarówno indeksem losowym 16 pz w celu korekcji błędów, jak i wskaźnikiem specyficznym dla pacjenta w pz 8 pz w celu multipleksowania. Nasza metoda może wykrywać i śledzić mutacje klonalne przy wariantowych frakcjach alleli (VAF) o dwa rzędy wielkości niższych niż granica wykrywalności NGS i tak rzadkich jak 0,0001 VAF.

Wprowadzenie

Wraz z wiekiem, narażenie na mutageny i błędy stochastyczne podczas podziału komórki powoduje akumulację aberracji somatycznych w genomie, co leży u podstaw fundamentalnej patogenezy przemian nowotworowych, chorób neurorozwojowych, zaburzeń pediatrycznych i normalnego starzenia się1,2. Mutacje somatyczne o potencjale wywołującym chorobę są ważnymi biomarkerami diagnostycznymi i prognostycznymi dla wczesnego wykrywania i zarządzania ryzykiem3,4,5. Aby lepiej zrozumieć klonogenezę fizjologiczną, która będzie informować o decyzjach klinicznych i badawczych, kluczowe znaczenie ma dokładna kwantyfikacja i charakterystyka tych mutacji. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie wykorzystywane do badania mutacji klonalnych w heterogenicznych próbkach DNA; jednak NGS ogranicza się do identyfikacji mutacji we frakcji allelu wariantu >0,02 (VAF) — ze względu na nieodłączny wskaźnik błędów 0,5–2,0% platform sekwencjonowania6,7,8. W związku z tym śledzenie istotnych diagnostycznie i prognostowo wariantów somatycznych przy niższym VAF nie może być osiągnięte przy użyciu standardowego NGS.

Ostatnio opracowano różne metody w celu obejścia wskaźnika błędów NGS8,9,10,11. Metody te wykorzystują znakowanie molekularne, które umożliwia korekcję błędów po sekwencjonowaniu. Każda cząsteczka lub fragment genomu w bibliotece sekwencjonowania jest oznaczony losowym unikalnym identyfikatorem molekularnym (UMI), który jest specyficzny dla tej cząsteczki. UMI są konstruowane przez permutacje ciągu losowych nukleotydów (8-16 N). Drugi kod kreskowy specyficzny dla próbki jest również zintegrowany z przepływem pracy, który umożliwia multipleksowanie wielu próbek w tym samym cyklu sekwencjonowania NGS. Amplifikacja PCR jest wykonywana na bibliotece znakowanej molekularnie, a następnie biblioteka jest wysyłana do sekwencjonowania. Podczas przygotowywania biblioteki oczekuje się, że błędy zostaną losowo wprowadzone do fragmentu genomu podczas amplifikacji i sekwencjonowania PCR8. Aby usunąć losowe błędy sekwencjonowania, odczyty nieprzetworzonego sekwencjonowania są grupowane zgodnie z UMI. Oczekuje się, że artefakty z sekwencjonowania nie będą obecne we wszystkich odczytach z tym samym UMI w tej samej pozycji genomowej ze względu na stochastyczny charakter wprowadzenia, podczas gdy prawdziwy wariant zostanie wiernie amplifikowany i sekwencjonowany we wszystkich odczytach, które mają ten sam UMI. Artefakty są bioinformatyczne usuwane. W tym miejscu opisujemy trzy metody sekwencjonowania z korekcją błędów (ECS) zoptymalizowane w laboratorium dla DNA w celu identyfikacji wariantów pojedynczych nukleotydów (SNV) i małych insercji-delecji (Indels) oraz dla RNA w celu ułatwienia kwantyfikacji ekspresji genów poniżej progu błędu NGS.

Pierwsza metoda opisuje sposób poszukiwania rzadkiego zdarzenia somatycznego za pomocą starterów specyficznych dla genów, zaprojektowanych przez badaczy. Przed przygotowaniem biblioteki badacze powinni zaprojektować elementarze ukierunkowane na interesujące ich fragmenty. Użyliśmy aplikacji internetowej Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplikony 200–250 pz są idealne do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ponieważ po włączeniu UMI będą generować nakładające się odczyty sparowanych końców z odczytami sparowanych końców 150 pz. Optymalne warunki projektowania podkładu, które należy zastosować, to: Minimalny rozmiar podkładu = 19; Optymalna wielkość podkładu = 25; Maksymalny rozmiar podkładu = 30; Minimum Tm = 64 °C; Optimum Tm = 70 °C; Maksymalne Tm = 74 °C; Maksymalna różnica Tm = 5 °C; Minimalna zawartość GC = 45; Maksymalna zawartość GC = 80; Liczba do zwrócenia = 20; Maksymalna stabilność końcowa 3' = 100.

W Metodzie 2 opisujemy metodę łączącą protokół ECS-DNA z chemią Illumina w celu zbadania klonalnych SNV i małych Indel, tak rzadkich jak 0,0001 VAF, przy użyciu dostępnych na rynku paneli genowych, które zawierają setki amplikonów. W naszym eksperymencie wykorzystaliśmy Panel Sekwencjonowania Szpiku TruSight (Illumina) i zaprojektowaliśmy rozszerzony panel, aby uwzględnić dodatkowe geny interesujące dla chorób szpiku u dzieci. Panele te nie oferowały unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI), które ułatwiałyby korekcję błędów, dlatego dodaliśmy do nich własną strategię adapterów. ECS powinien działać równie dobrze z każdym innym panelem zaprojektowanym do wzbogacania genów związanych z różnymi chorobami. Po wyizolowaniu DNA i późniejszym określeniu ilościowym z tkanki lub próbki będącej przedmiotem zainteresowania, zaleca się posiadanie co najmniej 500 ng podstawowego DNA na próbkę. Rutynowo tworzymy pojedynczą bibliotekę sekwencjonowania przy użyciu 250 ng DNA, aby uchwycić jak najwięcej unikalnych fragmentów genomu do dalszych odczytów, deduplikacji i obliczeń VAF. Opcjonalna biblioteka sekwencjonowania replik może być wykonana z pozostałych 250 ng DNA. Zawsze tworzymy dwie biblioteki replikacji na próbkę i bierzemy pod uwagę tylko te zdarzenia, które zostały wykryte niezależnie w obu replikacjach, jako prawdziwie dodatnie. Zaimplementowaliśmy również genomiczny model błędu dwumianowego specyficzny dla pozycji, aby zwiększyć dokładność wywoływania wariantów4,13.

Na koniec, opisujemy metodę łączącą sekwencjonowanie ECS z RNA w celu kwantyfikacji transkryptu przy użyciu gotowych paneli QIAseq Targeted RNA (Qiagen). Interfejsy UMI wymagane do deduplikacji i korekcji błędów zostały włączone do zestawów, a badacze mogą tworzyć biblioteki zgodnie z zaleceniami producenta. Z bioinformatycznego punktu widzenia naukowcy mogą postępować zgodnie z planem opracowanym dla ECS-DNA, który zostanie szczegółowo opisany w sekcji PROTOCOL.

Protokół

1. Celowane sekwencjonowanie DNA z korekcją błędów

  1. Amplifikacja PCR wybranych fragmentów genomowych.
    1. Do amplifikacji amplikonów należy użyć polimerazy DNA o wysokiej wierności (Tabela materiałów, pozycja 1). Reakcję PCR należy przeprowadzić w termocyklerze zgodnie z następującymi warunkami: 30 s w 98 °C; 18–40 cykli: 10 s w 98 °C, 30 s w 66 °C oraz 30 s w 72 °C; 2 min w 72 °C; podtrzymanie w 4 °C.
    2. Produkty PCR należy oczyścić za pomocą kulek paramagnetycznych (Tabela materiałów, pozycja 2). Reakcję PCR dodaje się do kulek w stosunku 1:1,8 (objętość reakcji PCR: objętość kulek) zgodnie z protokołem producenta. Elucję przeprowadza się w 20 µL ddH2O.
    3. Należy określić stężenie DNA (Tabela materiałów, pozycja 3), aby wyznaczyć końcowe stężenie DNA.
    4. Aplikację DNA należy nałożyć na 2% żel agarozowy (Tabela materiałów, pozycja 4), aby potwierdzić wielkość amplikonów.
      UWAGA: Alternatywnie badacze mogą zdecydować się na analizę produktów PCR za pomocą Bioanalizatora, aby określić wielkość amplifikowanych fragmentów genomowych oraz stężenie produktów.
  2. Przyłączanie adapterów sekwencyjnych
    1. Należy przygotować adaptery i7 (Tabela materiałów, pozycja 5). Należy ich używać w formie dostarczonej w kolejnych krokach.
    2. Adaptery 16N i5 należy nabyć komercyjnie z następującą sekwencją oligo (Tabela materiałów, pozycja 6): AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(N1:25252525)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
      UWAGA: Adaptery 16N i5 zastępują standardowe adaptery i5; są to adaptery z ciągiem 16 losowych nukleotydów w celu ułatwienia ECS.
    3. Przygotowanie roztworu roboczego adaptera 16N i5: 40 µL zapasu adaptera 16N i5 o stężeniu 100 µM, 10 µL buforu TE oraz 10 µL roztworu NaCl 500 µM.
    4. Należy odmierzyć 7.5 µL roztworu roboczego i5 przygotowanego w kroku 1.2.3 do osobnych studzienek PCR.
    5. Do odpowiednich studzienek należy dodać 5 µL specyficznego dla próbki adaptera i7.
    6. Inkubować w 95 °C przez 5 min, a następnie chłodzić w termocyklerze o 1 °C co 30 s aż do osiągnięcia 4 °C.
    7. Podtrzymać w 4 °C.
  3. Naprawa końców i dA-tailing bibliotek
    UWAGA: Równolegle z przyłączaniem adapterów można przeprowadzić naprawę końców i dA-tailing amplikonów PCR z kroku 1.1. Po zakończeniu tych etapów wykonuje się ligację przyłączonych adapterów z kroku 1.2 do amplikonów PCR po naprawie końców i dA-tailingu. Po ligacji adapterów konstrukcja biblioteki ECS jest zakończona.
    1. Rozpocząć od maksymalnie 1 µg DNA wyjściowego (minimum ~200 ng).
    2. Przeprowadzić naprawę końców i dA-tailing amplikonów (Tabela materiałów, pozycja 7).
      1. Dodać 3,0 µL mieszanki enzymów End Prep Enzyme Mix oraz 6,5 µL buforu End Repair Buffer.
      2. Inkubować mieszaninę przez 30 min w 20 °C, a następnie przez 30 min w 65 °C i podtrzymać w 4 °C.
    3. Przeprowadzić ligację przyłączonych adapterów (Tabela materiałów, pozycja 8).
      1. Dodać 2,5 µL przyłączonych adapterów z kroku 2, 15 µL Blunt/TA Ligase Mastermix oraz 1 µL wzmacniacza ligacji Ligation enhancer.
      2. Inkubować mieszaninę przez 15 min w 20 °C, a następnie przez 15 min w 37 °C.
    4. Oczyścić biblioteki za pomocą kulek magnetycznych (Tabela materiałów, pozycja 2): dodać reakcję PCR do kulek w zmodyfikowanym stosunku 1:0,75 (objętość reakcji PCR: objętość kulek magnetycznych):
      1. Pipetować 62,6 µL roztworu kulek magnetycznych do 83,5 µL produktów PCR z kroku 1.2.7.
      2. Przenieść mieszaninę do probówki 1,5 mL o niskim wiązaniu (low binding).
      3. Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut.
      5. Umieścić probówkę na uchwycie magnetycznym. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy nadfiltr stanie się klarowny.
      6. Usunąć nadfiltr.
      7. Przemyć kulki 200 µL 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórzyć etap płukania etanolem raz.
      10. Wysuszyć kulki na powietrzu.
      11. Eluować w 20 µL ddH2O.
        UWAGA: Ta modyfikacja stosunku reakcji PCR do kulek magnetycznych pozwoli na preferencyjne usunięcie fragmentów DNA mniejszych niż 200 bp.
  4. Kwantyfikacja za pomocą droplet digital PCR
    UWAGA: Precyzyjna kwantyfikacja mutacji wymaga ścisłego przestrzegania liczby cząsteczek każdej biblioteki ładowanych do sekwencera. Aby to osiągnąć, kwantyfikację liczby cząsteczek dla poszczególnych bibliotek na jednostkę objętości przeprowadza się przy użyciu platformy droplet digital PCR (ddPCR) QX200 — alternatywną opcją jest ilościowy PCR (qPCR). Po analizie ddPCR wynik określi liczbę cząsteczek na µL dla każdej biblioteki.
    1. Rozcieńczyć biblioteki ECS 1:1000 poprzez stopniowe rozcieńczanie dziesięciokrotne w probówkach PCR w paskach.
    2. Przygotować następujący mastermix do ddPCR w probówce 1,5 mL: 10 µL PCR Mix (Tabela materiałów, pozycja 9), 0,2 µL startera P5, 0,2 µL startera P7, 5 µL oczyszczonego produktu ECS z kroku 1.4.1 oraz 4,5 µL ddH2O.
    3. Odmierzyć 20 µL mastermixu do każdej studzienki z próbką, dbając o wielokrotność 8.
      1. Odmierzyć 70 µL oleju do generowania kropel (Tabela materiałów, pozycja 10) do każdej studzienki na olej. Przykryć kasetę gumową uszczelką.
    4. Wygenerować krople za pomocą generatora kropel (Tabela materiałów, pozycja 11).
    5. Używając pipety wielokanałowej, przenieść krople wygenerowane w kroku 1.4.4 do płytki PCR, upewniając się, że pipetowanie próbki odbywa się powoli, w czasie 5 sekund, aby uniknąć ścinania DNA.
    6. Amplifikować sygnał w kroplach przez 40 cykli w termocyklerze, stosując następujące warunki: 5 min w 95 °C; 40 cykli: 30 s w 95 °C, 1 min w 63 °C; 5 min w 4 °C, 5 min w 90 °C; a następnie podtrzymać w 4 °C.
    7. Przygotować urządzenie do odczytu kropel matrycowych ddPCR (Tabela materiałów, pozycja 11). Ustawić parametry dla Absolute Quantification oraz użyć QX200 ddPCR Eva Green Supermix.
    8. Po zakończeniu analizy ddPCR należy upewnić się, że dla wszystkich próbek ustawiono ten sam próg podziału (divisive threshold).
    9. Na podstawie odczytu stężenia z Droplet Reader QX200 odmierzyć odpowiednią objętość, aby wprowadzić pożądaną liczbę cząsteczek do kolejnego kroku.
  5. Amplifikacja PCR bibliotek do sekwencjonowania
    1. Przygotować następujący mastermix dla pożądanej liczby cząsteczek z kroku 1.4.9: 25 µL Q5 Mastermix (Tabela materiałów, pozycja 1), 2,5 µL startera P5 (10 µM), 2,5 µL startera P7 (10 µM), X µL DNA, 20-X µL ddH2O.
    2. Amplifikować biblioteki z kroku 1.5.1 w termocyklerze, stosując następujące warunki: 30 s w 98 °C; 20 cykli: 10 s w 98 °C, 30 s w 63 °C, 30 s w 72 °C; 2 min w 72 °C; a następnie podtrzymać w 4 °C.
    3. Oczyścić biblioteki za pomocą kulek magnetycznych (Tabela materiałów, pozycja 2): dodać reakcję PCR do kulek magnetycznych w zmodyfikowanym stosunku 1:0,75 (objętość reakcji PCR: objętość kulek magnetycznych).
      1. Pipetować 37,5 µL roztworu kulek magnetycznych do 50 µL produktów PCR z kroku 1.5.2.
      2. Przenieść mieszaninę do probówki 1,5 mL o niskim wiązaniu (low binding).
      3. Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 min.
      5. Umieścić probówkę na uchwycie magnetycznym. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy nadfiltr stanie się klarowny.
      6. Usunąć nadfiltr.
      7. Przemyć kulki 200 µL 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórzyć etap płukania etanolem raz.
      10. Wysuszyć kulki na powietrzu.
      11. Eluować w 20 µL ddH2O.
    4. Nałożyć aplikację DNA na 2% żel agarozowy, aby potwierdzić wielkość amplikonów.
    5. Określić stężenie DNA (Tabela materiałów, pozycja 3), aby wyznaczyć stężenie poszczególnych bibliotek ECS.
    6. Połączyć biblioteki w ilościach ekvimolarnych.
      UWAGA: Na przykład badacze mogą połączyć osiem bibliotek w grupie ekvimolarnej4 z 4 milionami cząsteczek wyjściowych do sekwencjonowania przy użyciu platformy sekwencyjnej generującej do 400 milionów odczytów. Ostrożnie zaleca się stosowanie średnio dziesięciu surowych odczytów na cząsteczkę do korekcji błędów. Zużyje to 360 milionów odczytów (4 mln cząsteczek * 8 bibliotek * 10 odczytów do korekcji błędów). Przy 4 milionach unikalnych cząsteczek na bibliotekę badacze mogą spodziewać się teoretycznego średniego pokrycia konsensusowego na poziomie 7042x na amplikon (4 mln/568 amplikonów z panelu genowego).
    7. Określić stężenie DNA (Tabela materiałów, pozycja 3), aby wyznaczyć stężenie połączonej biblioteki ECS.
    8. Przekazać połączoną bibliotekę ECS o stężeniu około 4 nM.
    9. Przekazać następujące ustawienia sekwencjonowania dla platform Illumina (MiSeq, HiSeq lub NextSeq): odczyty paired-end 2x144, 8 cykli Index 1 i 16 cykli Index 2.

2. Panele genowe z sekwencjonowaniem DNA z korekcją błędów

  1. Hybrydyzacja oligosów z paneli genowych
    UWAGA: Na tym etapie zostaną przygotowane biblioteki do sekwencjonowania z wykorzystaniem zmodyfikowanego protokołu Illumina TruSight lub TruSeq w celu wprowadzenia UMI (Tabela materiałów, pozycja 17).
    1. Przeprowadzić hybrydyzację oligosów z fragmentem genomicznym zgodnie z protokołem producenta. Należy użyć 250 ng DNA (lub dowolnej pożądanej ilości materiału wyjściowego).
    2. Usunąć niezwiązane oligonukleotydy zgodnie z protokołem producenta.
    3. Przeprowadzić etap elongacji i ligacji zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Poniżej znajdują się modyfikacje protokołu producenta.
  2. Wprowadzanie adapterów i5 i i7 za pomocą PCR
    1. Przygotować mieszaninę PCR (mastermix), pipetując następujące odczynniki do probówki o odpowiedniej pojemności: 37.5 µL z Q5 Mastermix (Tabela materiałów, Pozycja 1), 6 µL z 10 µM adaptatory 16N i5 (opisane szczegółowo w Metodzie 1, Krok 1.2.2), 6 µL adapterów i7 (w przypadku multipleksowania należy użyć różnych adapterów i7 dla poszczególnych próbek) oraz 22 µL roztworu do elongacji i ligacji z kuleczkami z kroku 2.1.3.
      UWAGA: Q5 Mastermix zastępuje mastermix polimerazy dostarczony przez firmę Illumina. Polimeraza Q5 amplifikuje fragment genomowy z wyższą wiernością i mniejszą liczbą wprowadzonych błędów.
    2. Przeprowadź program PCR w termocyklerze, stosując następujące parametry: 30 s w temperaturze 98 °C, 4–6 cykli po 10 s w 98 °C, 30 s przy 66 °C, 30 s w temperaturze 72 °C; 2 min w temperaturze 72 °Ca następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Liczba cykli zależy od wielkości panelu. Z naszego doświadczenia wynika, że 4 cykle PCR są wystarczające, jeśli panel genowy zawiera około 1500 różnych par oligospecyficznych dla genów, natomiast panel z 500–600 parami oligos wymaga 6 cykli PCR.
    3. Oczyszczanie reakcji PCR za pomocą kulek magnetycznych (Tabela materiałów, pozycja 2): dodać mieszaninę reakcyjną PCR do kulek magnetycznych w zmodyfikowanym stosunku 1 reakcja PCR: 0,75 kulki magnetycznej:
      1. Pipeta 56.25 µL roztworu kulek magnetycznych do 75 µL produktów PCR z etapu 2.2.2.
      2. Przenieś mieszaninę do probówki o niskim wiązaniu (low binding) o pojemności 1,5 ml.
      3. Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 min.
      5. Umieść probówkę na statywie magnetycznym. Inkubuj przez 2 min w temperaturze pokojowej lub do czasu, aż nadfiltr stanie się przejrzysty.
      6. Usunąć supernatant.
      7. Przemyć kuleczki za pomocą 200 µL z 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórzyć etap przemywania etanolem raz.
      10. Osusz koraliki na powietrzu.
      11. Eluuj za pomocą 20 µL z ddH2O2O.
  3. Ilościowe oznaczenie bibliotek przy użyciu platformy QX200 ddPCR.
    1. Należy postępować zgodnie z krokiem 1.4 w Metodzie 1.
      UWAGA: W każdej bibliotece próbek znormalizowano 4 miliony cząsteczek4 na reprezentatywnym wyniku (Rycina 2) aby uzyskać teoretyczną średnią 7 042 unikalnie zaindeksowanych cząsteczek (4 miliony podzielone przez 568 oligospecyficznych dla genu).
  4. Amplifikacja i normalizacja bibliotek do sekwencjonowania.
    1. Należy namnożyć pożądaną liczbę cząsteczek, wykorzystując następującą mieszaninę mastermix w całkowitej objętości reakcji PCR: 50 µL: 25 µL mieszaniny Q5 Mastermix, 2 µL startera P5 (1 µM), 2 µL z starterem P7 (1 µM), oraz 21 µL cząsteczek DNA.
    2. Przeprowadź program PCR w termocyklerze, stosując następujące parametry: 30 s w temperaturze 98 °C; 16 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w 66 °C, 30 s w 72 °C; 2 min w temp. 72 °C; a następnie utrzymać w 4 °C.
    3. Oczyszczanie bibliotek sekwencyjnych przy użyciu kulek magnetycznychTabela materiałów, Pozycja 2): Dodaj mieszaninę reakcyjną PCR do kulek magnetycznych w zmodyfikowanym stosunku 1 reakcja PCR: 0,75 kulki magnetycznej:
      1. Pipeta 37.5 µL roztworu kulek magnetycznych do 50 µL Produkty PCR z kroku 2.4.2.
      2. Przenieś mieszaninę do probówki o niskim wiązaniu o pojemności 1,5 ml.
      3. Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      4. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 min.
      5. Umieść probówkę na statywie magnetycznym. Inkubuj przez 2 min w temperaturze pokojowej lub do momentu, aż supernatant stanie się klarowny.
      6. Odsączyć supernatant.
      7. Przemyć kuleczki za pomocą 200 µL z 70% etanolu.
      8. Inkubować przez 30 s. Usunąć etanol.
      9. Powtórzyć etap płukania etanolem raz.
      10. Osuszyć koraliki na powietrzu.
      11. Eluuj za pomocą 20 µL z ddH2O2O.
    4. Próbkę alikwotu eluowanego DNA (~3 µL) na 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić wielkość amplikonów.
    5. Oznaczenie stężenia DNA (Tabela materiałów, pozycja 3), aby określić stężenie poszczególnych bibliotek ECS.
    6. Połącz biblioteki w ilościach ekimolarnych. Szczegółowe informacje na temat łączenia znajdują się w metodzie 1, kroku 1.5.6. oraz w sekcji Dyskusja.
    7. Zarejestruj zبpoolowaną bibliotekę ECS w stężeniu około 4 nM.
    8. Wprowadź następujące ustawienia sekwencjonowania dla platform sekwencjonujących Illumina (MiSeq, HiSeq lub NextSeq): odczyty parzystokoncowe (paired-end) 2x144, 8 cykli dla Index 1 oraz 16 cykli dla Index 2.
  5. Bioinformatyczne przetwarzanie i analiza ECS
    1. Należy pozyskać odczyty z sekwenatora po demultipleksowaniu próbek lub przeprowadzić bioinformatyczne demultipleksowanie surowych odczytów sekwencyjnych na poszczególne próbki przy użyciu sekwencji adapterów i7 za pomocą niestandardowego skryptu.
    2. Usuń pierwsze 30 nukleotydów z każdego odczytu po demultipleksowaniu, aby usunąć sekwencje oligo z panelu genowego.
    3. Dopasuj do siebie odczyty posiadające te same UMI w celu utworzenia rodzin odczytów.
      UWAGA: Badacze mogą korzystać z oprogramowania uwzględniającego UMI, takiego jak MAGERI13 w celu wyodrębnienia rodzin odczytów. W tym doświadczeniu nie dopuszczono żadnej odległości Hamminga w obrębie sekwencji UMI, aby zwiększyć specyficzność metody.
    4. Przeprowadź deduplikację i korekcję błędów, korzystając z następujących zalecanych parametrów.
      1. Należy użyć ≥5 par odczytów z tej samej rodziny odczytów. Zaleca się użycie minimum trzech par odczytów.
      2. Porównaj nukleotydy na każdej pozycji we wszystkich odczytach w tej samej rodzinie odczytów i wyznacz nukleotyd konsensusowy, jeśli zgodność między odczytami dla danego nukleotydu wynosi co najmniej 90%. W przypadku zgodności poniżej 90% dla danej pozycji nukleotydu przypisz symbol N.
      3. Odrzuć odczyty konsensusowe, które posiadają >10% całkowitej liczby nukleotydów konsensusowych zostało zaklasyfikowanych jako N.
    5. Wszystkie zachowane odczyty konsensusowe należy dopasować lokalnie do ludzkiego genomu referencyjnego hg19 lub hg38, korzystając z preferowanych przez badacza narzędzi do dopasowania, takich jak Bowtie2 i BWA.
    6. Przetwórz dopasowane odczyty za pomocą programu Mpileup, stosując parametry –BQ0 –d 10 000 000 000 000, aby usunąć progi pokrycia i zapewnić prawidłowy wynik pileup niezależnie od VAF.
    7. Odsiewać pozycje z pokryciem odczytów konsensusowych poniżej 1000x.
      UWAGA: Badacz określa minimalne pokrycie dla każdej pozycji nukleotydowej w sposób dowolny; w celu przeprowadzenia dalszych analiz zaleca się uzyskanie pokrycia sekwencją konsensusową na poziomie co najmniej 500x.
    8. Użyj rozkładu dwumianowego do wywołania wariantów pojedynczego nukleotydu (SNP) w danych zachowanych z kroku 2.5.7, stosując następujące parametry. Statystyka dwumianowa będzie oparta na modelu błędów specyficznych dla danej pozycji genomowej. Każdą pozycję genomową modeluje się niezależnie po zsumowaniu wskaźników błędów dla wszystkich próbek dla tej konkretnej pozycji. Zgodnie z przykładem:
      Prawdopodobieństwo profilu nukleotydowego w danej pozycji genomowej, p
      ∑ Wariant RF2 ∑ Wszystkie RF
      = 26/255505
      = 0.000101759
      Prawdopodobieństwo dwumianowe dla 24 wariantowych RF spośród łącznie 35911 RF, P(X ≥ x) w próbce K
      = 1 - binomial(24, 35911, 0.000101759)
      = 2,26485E-13
      UWAGA: Dla każdej analizowanej pozycji genomicznej możliwe są trzy zmiany mutacyjne (tj.A>T, A>C, A>G), z których każde zostałoby przedstawione jako artefakt tła. Zachowano zdarzenia somatyczne, które po korekcie Bonferroniego istotnie różnią się od tła. Na przedstawionym przykładzie w Tabela 1liczba przeprowadzonych testów wynosiła 11, zatem zastosowano poprawkę Bonferroniego pAby uznać zdarzenie za istotne statystycznie, wymagana była wartość p ≤ 0,00454545 (0,05/11).
    9. Zdarzenia somatyczne muszą wystąpić w obu powtórzeniach z tego samego preparatu; w przeciwnym razie należy uznać je za wyniki fałszywie dodatnie.

Tabela analizy genomowej przedstawiająca zmianę nukleotydową G>A, warianty RFs i wartości p w różnych próbkach.
Tabela 1: Przykład demonstrujący sposób konstruowania specyficznego dla pozycji dwumianowego modelu błędów.

3. Sekwencjonowanie RNA z korekcją błędów

  1. Oprócz oceny mutacji na poziomie DNA, zintegrowano ECS z różnymi panelami ukierunkowanego sekwencjonowania RNA w celu wykrycia rzadkich lub występujących w niskiej liczbie transkryptów na poziomie RNA. Łącząc ECS z gotowymi panelami sekwencjonowania RNA firmy Qiagen, zademonstrowaliśmy cyfrową kwantyfikację ekspresji genów dla transkryptów posiadających zaledwie dziesięć kopii, bez konieczności normalizacji względem genu referencyjnego. UMIs wymagane do korekcji błędów zostały zintegrowane z panelem.
    1. Przeprowadzić ekstrakcję całkowitego RNA (Tabela materiałów, pozycja 20).
    2. Wykonać przygotowanie biblioteki ECS-RNA zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów, pozycja 19).
    3. Przeprowadzić analizę bioinformatyczną zgodnie z krokami 2.5.1–2.5.6 Metody 2 opisanej w poprzedniej sekcji. Po kroku 2.5.6 liczba wyrównanych odczytów konsensusowych na gen reprezentuje poziom ekspresji genu bez konieczności normalizacji ze względu na długość genu.

Wyniki

Wykorzystując sekwencjonowanie celowane z korekcją błędów (Targeted Error-Corrected Sequencing) dla DNA, przeprowadziliśmy eksperyment dowodzący zasady działania, polegający na rozcieńczeniu zmutowanego DNA pacjenta w komercyjnym DNA genomicznym. Pacjent posiadał mutację w genie GATA1 (chrX:48650264, C>G) z pierwotną wartością VAF wynoszącą 0,19. Wykazujemy na Rysunku 1, że ECS jest ilościowy do poziomu 1:10 000 dla pojedynczych wariantów nukleotydowych.

Wykres serii rozcieńczeń GATA1; VAF w ECS vs. DNA guza; dopasowanie liniowe y=0,1864x, R²=0,99885.
Rysunek 1: Seria rozcieńczeń SNV GATA1 wykazująca, że ECS jest ilościowa do poziomu 1:10 000. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykazaliśmy również, że metoda ECS-DNA niezawodnie wykrywa rzadkie mutacje klonalne w genach często występujących w ostrej białaczce szpikowej (AML) u dorosłych w próbkach pobranych od zdrowych osób starszych4. Uzyskano próbki warstwy leukocytarnej (buffy coat) od 20 zdrowych osób biorących udział w Nurse's Health Study, zarchiwizowane w odstępie około 10 lat. W badaniu tych próbek zastosowano protokół panelu ECS-DNA. Na potrzeby tego eksperymentu zaadaptowano panel sekwencyjny Illumina TruSight Myeloid składający się z 568 amplikonów (więcej informacji na temat listy genów dostępnych pod adresem https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html). Wysekwencjonowano 80 bibliotek od 20 osób (2 serie pobrań w różnych punktach czasowych, 2 powtórzenia na osobę w każdym punkcie czasowym) przy użyciu platformy Illumina NextSeq, co pozwoliło na uzyskanie średnio 47,7 miliona odczytów par końców (paired-end reads) oraz średnio 3,4 miliona skorygowanych błędów sekwencji konsensusowych na bibliotekę4. Średnie pokrycie nukleotydowe na bibliotekę wynosiło około 6 000x (3,4 miliona podzielone przez 568). Dla każdej próbki opracowano specyficzny dla pozycji profil błędów, wykorzystując zsekwencjonowane biblioteki pochodzące z innych próbek. Zidentyfikowano 109 klonalnych mutacji somatycznych, które występowały w obu powtórzeniach co najmniej jednego punktu czasowego pobrania. Mutacje te charakteryzowały się VAF w zakresie 0,0003–0,1451. Wybrano 21 mutacji z potwierdzoną reprezentacją w bazie COSMIC, a następnie wszystkie 21 mutacji zwalidowano w jednym lub dwóch punktach czasowych pobrania przy użyciu ddPCR (n = 34, Rysunek 2, zaadaptowano z Young et al. 20164).

Wykres korelacji VAF pomiędzy ECS a ddPCR, regresja liniowa, R²=0,9965, dane eksperymentalne.
Rysunek 2: Mutacje zidentyfikowane za pomocą ECS zostały zweryfikowane metodą ddPCR, wykazując wysoce zgodne wartości VAF. (n=34, zmodyfikowano na podstawie Young et al. 20164). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

W odniesieniu do poziomu ekspresji skorygowanego o błędy przy użyciu protokołu ECS-RNA, opracowaliśmy niestandardowy panel genów w oparciu o technologię QIAseq, składający się z 416 genów znanych z powiązania z różnymi nowotworami (adaptowany z panelu QIAseq Human Cancer Transcriptome) i przeprowadziliśmy amplifikację najczęściej ekspresjonowanego eksonu danego genu (lista genów w Supplementary Material 1). Biblioteki sekwenowano na platformie Illumina MiSeq w formacie paired-end, co dało średnio 8,3 miliona odczytów na bibliotekę, a nam udało się uzyskać średnio 0,417 miliona skorygowanych o błędy sekwencji konsensusowych. Wykazaliśmy, że poziom ekspresji transkryptów o niskiej liczebności (<1 000 kopii transkryptu w 50 ng całkowitego RNA) jest wysoce powtarzalny między powtórzeniami (liczba punktów danych n = 300, Rysunek 3). Walidacja za pomocą ddPCR (sześć wybranych genów o różnym stopniu ekspresji) wykazała, że poziom ekspresji genów został prawidłowo uchwycony przez protokół ECS bez konieczności normalizacji.

Wykresy rozrzutu liczby transkryptów ECS-RNA, korelacja logarytmiczna z ddPCR, pokazująca regresję liniową.
Rysunek 3: Góra, korelacja liczby transkryptów metodą ECS-RNA pomiędzy powtórzeniami tej samej próbki (n = 300). Dół, liczba transkryptów zidentyfikowanych metodą ECS została zweryfikowana za pomocą ddPCR (n = 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu demonstrujemy zestaw protokołów sekwencjonowania z korekcją błędów, które można łatwo wdrożyć do badania mutacji z niskimi VAF w różnych chorobach. Najważniejszym czynnikiem jest włączenie UMI do każdej cząsteczki przed sekwencjonowaniem, ponieważ umożliwiają one korekcję błędów surowych odczytów. Opisane tutaj metody pozwalają naukowcom na włączenie niestandardowych UMI zarówno do dostępnych na rynku paneli genowych, jak i samodzielnie zaprojektowanych oligonukleotydów specyficznych dla genów.

Standardowy protokół NGS wyklucza wykrycie mutacji z VAF poniżej 2% ze względu na wskaźnik błędów sekwencjonowania, a to ogranicza zastosowanie NGS w badaniach, w których kluczowe jest wykrycie rzadkich wariantów. Omijając standardowy poziom błędów NGS, ECS umożliwia czułe wykrywanie tych surowych wariantów. Na przykład wykrycie mutacji patogennych, gdy te mutacje pojawiają się po raz pierwszy (a więc przy niskim VAF) jest niezbędne do wczesnej interwencji w chorobie14,15. W badaniach nad białaczką wykrycie minimalnej choroby resztkowej (resztkowe komórki białaczkowe po leczeniu) informuje o stratyfikacji ryzyka i może być wykorzystane do informowania o opcjach leczenia w sposób, w jaki nie mogą tego zrobić oceny cytometrii binarnej przepływu. Ponadto ECS ma zastosowanie do wykrywania krążącego kwasu nukleinowego guza i oceny potencjału przerzutowego u pacjentów z guzami litymi poprzez ocenę obecności/braku, a także obciążenia wariantami niektórych mutacji, które są charakterystyczne dla guza pierwotnego16.

Jak pokazano w tabeli 1, moc wykorzystania modelu błędów opartego na rozkładzie dwumianowym i specyficznym dla pozycji do wywoływania wariantów zależy w dużej mierze od liczby sekwencjonowanych bibliotek, a także od głębokości sekwencjonowania użytego do zbudowania modelu błędów. Solidność modelu błędu wzrasta wraz ze wzrostem liczby próbek i większą głębokością sekwencjonowania. Zaleca się użycie co najmniej 10 sekwencjonowanych próbek ze średnim pokryciem odczytu z korekcją błędów wynoszącym 3000x na próbkę w celu zbudowania profilu błędów dla każdej próbki. Podejście oparte na konkretnej pozycji jest podobne do podejścia MAGERI, ale zamiast stosowania zagregowanego poziomu błędu dla wszystkich sześciu różnych typów podstawień (A>C/T>G, A>G/T>C, A>T/T>A, C>A/G>T, C>G/G>C, C>T/G>A)13, Każdą substytucję modelujemy niezależnie na każdej pozycji. Na przykład poziom błędu C>T w danej pozycji genomowej różni się od innego położenia. Nasze podejście uwzględnia również efekt partii sekwencjonowania, ponieważ podstawowy współczynnik substytucji obserwowany w jednym przebiegu sekwencjonowania może różnić się od innego przebiegu. Dlatego ważne jest, aby modelować każdą pozycję dla wszystkich typów podstawień, zwłaszcza gdy próbki z różnych serii sekwencjonowania są łączone w celu zbudowania modelu.

Ważną kwestią przy projektowaniu eksperymentu ECS jest pożądany próg wykrywalności. Piękno badań NGS polega na tym, że można je łatwo skalować pod względem genów/celów będących przedmiotem zainteresowania, progu wykrywania (podyktowanego głębokością sekwencjonowania) i liczby badanych osób. Na przykład, jeśli naukowcy są zainteresowani znalezieniem rzadkich mutacji w dwóch amplikonach o progu wykrywania 0,0001, mogą zebrać maksymalnie 75 próbek w jednym cyklu sekwencjonowania przy użyciu chemii MiSeq V2, która generuje do 15 milionów odczytów (2 amplikony * 10 000 cząsteczek * 10 odczytów w celu korekcji błędów * 75 próbek = 15 milionów odczytów sekwencjonowania). Naukowcy mogą zmieniać liczbę cząsteczek poddawanych sekwencjonowaniu lub liczbę zbiorczych próbek w jednym cyklu sekwencjonowania, aby dostosować próg wykrywania. W naszych badaniach naszym celem było znalezienie mutacji o progu detekcji 0,0001 VAF (1:10 000) przy użyciu panelu genów Illumina. Rutynowo używamy 250 ng wyjściowego DNA, aby zapewnić wychwycenie wystarczającej ilości cząsteczek w celu osiągnięcia wyżej wymienionego progu wykrywalności. Naukowcy mogą zdecydować się na rozpoczęcie od mniejszej ilości DNA (zalecane jest 50 ng), jeśli pożądana granica wykrywalności wynosi >0,001 VAF.

Ponieważ UMI są dołączane do indeksów i5, ustawienia sekwencjonowania muszą zostać odpowiednio zmienione. Na przykład użyliśmy 16 N UMI, a ustawienia sekwencjonowania to 2x144 sparowane odczyty końcowe, 8 cykli indeksu 1 i 16 cykli indeksu 2, w przeciwieństwie do zwykłych 8 cykli indeksu 2. Wzrost cyklu Indeksu 2 jest kompensowany spadkiem całkowitej liczby cykli przypisanych do odczytów. Jeśli badacze zdecydują się na użycie 12N UMI 10,17, ustawienia powinny zostać zmienione na 12 cykli indeksu 2.

Ta metoda sekwencjonowania oparta na UMI jest zoptymalizowana pod kątem korygowania błędów sekwencjonowania. Pozostaje nieoptymalna w radzeniu sobie z jackpottingiem PCR, który jest problemem dla wszystkich metod opartych na amplifikacji. Przeprowadziliśmy rundy walidacji post-sekwencjonowania i post-bioinformatycznej przy użyciu ddPCR i prawie nie wykrywamy żadnych fałszywych alarmów z powodu jackpotowania PCR. Niemniej jednak zaleca się, aby naukowcy przeprowadzili eksperymenty przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności, aby zapewnić niskie błędy amplifikacji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy uczestnikom badania Children's Oncology Group AAML1531 oraz Nurses' Health Study za ich wkład w postaci próbek pacjentów. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health (UM1 CA186107, RO1 CA49449 i RO1 CA149445), Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital (MC-II-2015-461) oraz Eli Seth Matthews Leukemia Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Q5 High Fidelity Hot Start Master MixNew England BioLabsM0492S
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAThermo FisherScientific S33102
Truseq Niestandardowy zestaw indeksu amplikonuIlluminaFC-130-1003
Sekwencje adaptera UMI i5Zintegrowane technologieDNA-NEBNext
Ultra End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BioLabsE7442S
NEBNext Ultra II Ligation ModuleNew England BioLabsE7595S
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad1864034
QX200 Olej do wytwarzania kropelek do EvaGreenBio-Rad1864005
QX200 Kroplowy cyfrowy system PCRBio-Rad1864001
ddPCR 96-dołkowe płytkiBio-Rad12001925
DG8 Wkłady do generatora kropel QX200/QX100Uszczelki Bio-Rad1864008
DG8 do generatora kropel QX200/QX100 BioanalizatorBio-Rad1863009
Agilent GenomicsG2939BA
TapeStationAgilent GenomicsG2991AA
Panel sekwencjonowania szpiku TruSightIlluminaFC-130-1010
Muszka 2Uniwersytet
panel ukierunkowanego RNA QIAseqQiagen-Rneasy
Plus Mini Kit (50)Qiagen74134
Dostosowany przez Johnsa Hopkinsa

Bibliografia

  1. Hoang, M. L., et al. Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).
  2. O'Roak, B. J., et al. Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations. Nature. 485, 246-250 (2012).
  3. Young, A. L., et al. Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing. Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).
  4. Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. NatureCommunications. 7, 12484(2016).
  5. Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).
  6. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  7. Kohlmann, A., et al. Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease. Leukemia. 28, 129-137 (2014).
  8. Luthra, R., et al. Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring. Haematologica. 99, 465-473 (2014).
  9. Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).
  10. Schmitt, M., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).
  11. Vander Heiden, J. A., et al. pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires. Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).
  12. Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).
  13. Shugay, M., et al. MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing. PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).
  14. Wong, T. N., et al. Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia. Nature. 518, 552-555 (2014).
  15. Krimmel, J. D., et al. Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).
  16. Phallen, J., et al. Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA. ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).
  17. Egorov, E. S., et al. Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers. The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie z korekcj b d wfrakcja wariantowego allelucyfrowy PCR kropelkowyunikalne identyfikatory molekularnesekwencjonowanie Illuminadetekcja mutacji klonalnychminimalna choroba resztkowaanaliza panelu gen wtranskrypty o niskiej liczno cinowotwory hematologiczne
Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.