Method Article

System detekcji mutacji Lambda Select cII

DOI:

10.3791/57510

⸱

April 26th, 2018

 , 
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt potraktowanych chemicznie/fizycznym środkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano wiele transgenicznych modeli zwierzęcych i systemów wykrywania mutacji do testowania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków. Spośród nich myszy transgeniczne i system wykrywania mutacji Lambda (λ) Select cII zostały wykorzystane do eksperymentów mutagenności przez wiele grup badawczych na całym świecie. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII, który można zastosować do hodowanych komórek transgenicznych myszy / szczurów lub odpowiadających im zwierząt traktowanych środkiem chemicznym / fizycznym będącym przedmiotem zainteresowania. Protokół składa się z następujących etapów: 1) izolacja genomowego DNA z komórek lub narządów/tkanek zwierząt transgenicznych poddanych działaniu odpowiednio in vitro lub in vivo badanego związku; (2) odzyskanie wektora lambda przenoszącego mutację genu reporterowego (tj. transgenu cII) z genomowego DNA; (3) pakowanie uratowanych nosicieli w bakteriofagi zakaźne; (4) zakażenie bakterii gospodarza i hodowla w warunkach selektywnych, aby umożliwić namnażanie się indukowanych mutacji cII; oraz (5) ocena mutantów cII i analiza sekwencji DNA w celu określenia odpowiednio częstości mutacji cII i spektrum mutacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szeroka gama transgenicznych modeli zwierzęcych i systemów wykrywania mutacji została opracowana do testowania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków. Spośród nich, transgeniczne myszy Big Blue (zwane dalej BB) i system wykrywania mutacji λ Select cII zostały wykorzystane do eksperymentów mutagenności przez tę grupę i wiele innych grup badawczych na całym świecie1,2,3,4,5,6,7,8<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja genomowego DNA z fibroblastów embrionalnych myszy

UWAGA: Pierwotne mysie fibroblasty embrionalne są izolowane z embrionów pochodzących od transgenicznych myszy BB z genetycznym tłem C57BL/6, zgodnie z opublikowanym protokołem53. Materiał wyjściowy dla tego protokołu składa się z 1 x 106 do 1 x 107 embrionalnych komórek fibroblastów poddanych działaniu badanego związku w porównaniu z kontrolą. Zbieranie i zliczanie tych komórek przy użyciu standardowych metod jest opisane w references10,54,5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W zależności od rozkładu danych, testy parametryczne lub nieparametryczne są używane do określenia istotności różnicy w częstości występowania mutacji cII między grupą leczoną a kontrolną (tj. częstość występowania mutacji indukowanej i spontanicznej). Porównanie częstości występowania indukowanych mutacji cII w różnych grupach badanych odbywa się za pomocą różnych (parami) testów statystycznych, w zależności od przypadku. Test hipergeometryczny Adamsa i Skopka .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test λ Select cII służy do wykrywania mutacji w transgenie cII odzyskanym z genomowego DNA komórek pochodzących z narządów/tkanek gryzoni BB3. Genom tych transgenicznych zwierząt zawiera wiele tandemowych kopii chromosomalnie zintegrowanego wektora wahadłowego λLIZ, który przenosi transgeny cII (294 pz) i lacI (1080 pz) jako geny reporterowe mutacji 1,2,25. Test λ Selec.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za wkład wszystkich kolegów i współpracowników w nasze oryginalne badania, których wyniki zostały przywołane w tym manuskrypcie (w celach ilustracyjnych). Prace autorów są wspierane przez granty z National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health (1R01DE026043) dla AB oraz z University of California Tobacco-Related Disease Research Program dla AB (TRDRP-26IR-0015) i ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorzy badania nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, interpretacji danych, pisaniu raportu ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu go do publikacji.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarMO Bio Laboratories, Inc.12112-05Klasa bakteriologiczna
BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cykluThermo Fisher Scientific4337455Brak
Kazeina PeptonAlfa AesarH26557Brak
ŻelatynaJ. T. Baker2124-01
Glicerol wFisher ScientificBP 229-1 / M-13750Brak
LB AgarFisher ScientificBP 9724-500Brak
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen810450 Reakcje oczyszczania PCR
Octan sodu trójwodny FisherScientificM-15756Brak
Taq5000 Polimeraza DNA Qiagen201207Brak
Chlorowodorek tiaminyMacron Fine Chemicals2722-57Brak
Ekstrakt z opakowań TranspackStratagene Corp., przejęty przez BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.20022350 reakcje pakowania
Tris BaseFisher ScientificBP 152-1 / EC 201-064-4Brak
TryptonBiosciencesRC-110Brak
proszku

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lambda Select cII Mutation AssayGenomic DNA IsolationLambda Shuttle Vector RecoveryBacteriophage PackagingHost Bacteria InfectionSelective CulturingcII Mutant ScoringDNA Sequence AnalysisMutagenicity TestingTransgenic Rodent Cells

Related Articles