Artykuł metodologiczny

System detekcji mutacji Lambda Select cII

DOI:

10.3791/57510

⸱

26 kwietnia 2018

 , 
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt potraktowanych chemicznie/fizycznym środkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano wiele transgenicznych modeli zwierzęcych i systemów wykrywania mutacji do testowania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków. Spośród nich myszy transgeniczne i system wykrywania mutacji Lambda (λ) Select cII zostały wykorzystane do eksperymentów mutagenności przez wiele grup badawczych na całym świecie. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII, który można zastosować do hodowanych komórek transgenicznych myszy / szczurów lub odpowiadających im zwierząt traktowanych środkiem chemicznym / fizycznym będącym przedmiotem zainteresowania. Protokół składa się z następujących etapów: 1) izolacja genomowego DNA z komórek lub narządów/tkanek zwierząt transgenicznych poddanych działaniu odpowiednio in vitro lub in vivo badanego związku; (2) odzyskanie wektora lambda przenoszącego mutację genu reporterowego (tj. transgenu cII) z genomowego DNA; (3) pakowanie uratowanych nosicieli w bakteriofagi zakaźne; (4) zakażenie bakterii gospodarza i hodowla w warunkach selektywnych, aby umożliwić namnażanie się indukowanych mutacji cII; oraz (5) ocena mutantów cII i analiza sekwencji DNA w celu określenia odpowiednio częstości mutacji cII i spektrum mutacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szeroka gama transgenicznych modeli zwierzęcych i systemów wykrywania mutacji została opracowana do testowania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków. Spośród nich, transgeniczne myszy Big Blue (zwane dalej BB) i system wykrywania mutacji λ Select cII zostały wykorzystane do eksperymentów mutagenności przez tę grupę i wiele innych grup badawczych na całym świecie1,2,3,4,5,6,7,8,9. Przez ostatnie 16 lat badaliśmy mutagenne skutki różnych czynników chemicznych i / lub fizycznych przy użyciu tych transgenicznych zwierząt lub odpowiadających im embrionalnych kultur komórek fibroblastów traktowanych związkiem testowym, a następnie analizowaliśmy fenotyp i genotyp transgenu cII za pomocą testu λ Select cII i sekwencjonowania DNA, odpowiednio10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Genom tych transgenicznych zwierząt zawiera bakteriofag λ wektor wahadłowy (λLIZ) zintegrowany z chromosomem 4 jako wielokopiczny konkategomer głowa do ogona1,2,25. Wektor wahadłowy λLIZ zawiera dwa mutacyjne geny reporterowe, a mianowicie transgeny lacI i cII1,2,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47. Test λ Select cII opiera się na odzyskiwaniu wektorów wahadłowych λLIZ z genomowego DNA komórek pochodzących z narządów/tkanek zwierząt transgenicznych1,2,25. Odzyskane wektory wahadłowe λLIZ są następnie pakowane w głowy fagów λ zdolne do infekowania gospodarza wskaźnikowego Escherichia coli. Następnie zakażone bakterie są hodowane w selektywnych warunkach, aby umożliwić ocenę i analizę mutacji w transgenach cII < klasie sup = "xref" >1,< klasie sup = "xref">3.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół testu λ Select cII, który składa się z izolacji genomowego DNA z komórek/organów zwierząt transgenicznych traktowanych in vitro/in vivo związkiem testowym, pobierania wektorów wahadłowych λLIZ z genomowego DNA, pakowania wektorów do zakaźnych fagów λ, zakażenia gospodarza E. coli bakteriofagami, identyfikacja mutantów cII w warunkach selektywnych w celu określenia częstości występowania mutacji cII oraz analiza sekwencji DNA w celu ustalenia spektrum mutacji cII. Protokół może być stosowany do transgenicznych hodowli komórek myszy/szczurów poddanych działaniu in vitro czynnika chemicznego/fizycznego będącego przedmiotem zainteresowania lub tkanek/narządów odpowiednich zwierząt poddanych działaniu in vivo badanej substancji chemicznej/środka1,2,4,48,49,50,51,52. Schematyczną prezentację testu λ Select cII przedstawiono na rysunku Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja genomowego DNA z fibroblastów embrionalnych myszy

UWAGA: Pierwotne mysie fibroblasty embrionalne są izolowane z embrionów pochodzących od transgenicznych myszy BB z genetycznym tłem C57BL/6, zgodnie z opublikowanym protokołem53. Materiał wyjściowy dla tego protokołu składa się z 1 x 106 do 1 x 107 embrionalnych komórek fibroblastów poddanych działaniu badanego związku w porównaniu z kontrolą. Zbieranie i zliczanie tych komórek przy użyciu standardowych metod jest opisane w references10,54,55.

  1. Przygotuj wcześniej bufor A (0,3 M sacharozy, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM spermidyny, 0,15 mM sperminy i 2 mM EDTA), bufor B (150 mM NaCl i 5 mM EDTA, pH 7,8) i bufor C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM NaCl, 20 mM EDTA i 1% SDS), i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do jednego roku54,55.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 2–4 ml buforu A w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, wielokrotnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze 1 000 μl.
  3. Dodać jedną objętość (2–4 ml) buforu A zawierającego 1% oktylofenoksypolietylenu (np. Nonidet P40) za pomocą szklanej pipety serologicznej.
  4. Inkubować probówkę na lodzie przez 5 minut.
  5. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić supernatant i przemyć osad 10–15 ml buforu A za pomocą szklanej pipety serologicznej.
  7. Zawiesić osad w 2–4 ml buforu B.
  8. Dodać jedną objętość (2–4 ml) buforu C zawierającego 600 μg/ml proteinazy K.
  9. Inkubować probówkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  10. Dodać RNazę A do końcowego stężenia 100 μg/ml.
  11. Inkubować probówkę przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  12. Dodać jedną objętość (2–4 ml) fenolu (nasyconego w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1 obj./obj.).
    UWAGA: Fenol może stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością. Fenol jest silnie dla skóry i łatwo się przez nią wchłania, a także wykazuje inne działanie. Podczas pracy z fenolem należy zawsze używać podwójnych rękawiczek, nosić okulary ochronne i pracować w osłonie przeciwchemicznej.
  13. Dobrze wymieszać, obracając probówkę do góry dnem przez 5 minut na rotatorze probówki w temperaturze 4 °C.
  14. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Usunąć fazę wodną (górną warstwę) do nowej probówki za pomocą szklanej pipety serologicznej.
  16. Powtórz ekstrakcję fenolem: chloroformem: alkoholem izoamylowym 1 do 3 razy, aż faza wodna będzie czysta, a granica faz nie będzie już mętna.
  17. Dodać 1/10 objętości (200–400 μl) 3M octanu sodu o pH 5,2.
  18. Dodaj 2,5 objętości (5–10 ml) 100% etanolu (schłodzonego) i delikatnie odwróć probówkę ręcznie przez 2–3 minuty.
  19. Zwiń DNA szklanym haczykiem i przenieś je do nowej probówki zawierającej 1-5 ml 70% etanolu i dokładnie umyj. Alternatywnie, odwirować probówkę z dużą prędkością (3 500 x g) w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA i dokładnie przepłukać ją 1–5 ml 70% etanolu.
  20. Odwirować probówkę z dużą prędkością (3 500 x g) w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i wysuszyć DNA na powietrzu przez 10-15 minut.
  21. Rozpuścić DNA w 10–100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) i przechowywać w temperaturze 4 °C (w przypadku krótkiego przechowywania do jednego miesiąca) lub w temperaturze -20 °C (w przypadku dłuższego okresu przechowywania). Optymalne stężenie DNA dla testu λ Select cII wynosi 0,5–1,0 μg/μL (w buforze TE)56.

2. Reakcja na pakowanie in vitro

  1. Na jedną reakcję pakowania dodać ~5 μg genomowego DNA (końcowa objętość: 8–12 μL, genomowe DNA wyizolowano w sekcji 1 z mysich fibroblastów embrionalnych traktowanych in vitro związkiem testowym lub kontrolą) do probówki mikrowirówkowej zawierającej pierwszą mieszaninę reakcyjną (~10 μL).
    UWAGA: Przygotowane we własnym zakresie lub dostępne w handlu ekstrakty z opakowań λ są używane w różnych laboratoriach. W zestawie ekstraktów do pakowania używanego tutaj56 (patrz Tabela materiałów), czerwone probówki zawierały pierwszą mieszaninę reakcyjną (~10 μL), a niebieskie probówki zawierały drugą mieszaninę reakcyjną (~70 μL dla co najmniej 5 reakcji).
  2. Inkubować probówkę przez 90 minut w temperaturze 30 °C.
  3. Dodać wymaganą objętość (~12 μl) drugiej mieszaniny reakcyjnej do probówki.
  4. Inkubować probówkę przez dodatkowe 90 minut w temperaturze 30 °C.
  5. Dodać 1,1 ml buforu SM do probówki.
    UWAGA: 1 ml tego roztworu (tj. opakowania mieszaniny reakcyjnej) zostanie użyty do badań przesiewowych mutantów λ cII. Pozostała część zostanie wykorzystana do mianowania.
    1. Przygotować bufor SM, mieszając 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO, 4,7H2O, 50 ml1 M Tris-HCl (pH 7,5) i 5 ml 2% (w/v) żelatyny. Dodać dH2O do końcowej objętości 1 litra, w autoklawie przez 30 min. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 roku.
  6. Wirować probówkę zawierającą zapakowaną próbkę DNA przez 10 s w temperaturze pokojowej (energiczne wirowanie).
  7. Pulsacyjnie odwiruj probówkę w mikrowirówce i przechowuj na lodzie, aż będzie gotowa do użycia. Jeżeli próbka nie zostanie wykorzystana w tym samym dniu od zapakowania, dodać 50 μl chloroformu na ml zapakowanej próbki DNA, delikatnie przemieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.

3. Przygotowanie kultury bakterii E. coli G1250

  1. Co najmniej dwa dni przed posiewem należy wykonać kilka płytki z smugami bakteryjnymi z Escherichia coli (E. coli) G1250 na płytkach agarowych TB1-kanamycyny.
    1. Przygotuj płytki agarowe TB1-kanamycyny w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl, 10,0 g peptonu kazeinowego i 12,0 g agaru. Dodać 800 ml dH2O. Dodać 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Dodaj dH2O do końcowej objętości 1 litra.
    2. Dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 30 minut. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury 55 °C. Dodać 50,0 mg kanamycyny i wymieszać. Wlać do sterylnych szalek Petriego o średnicy 100 mm (20–25 ml na szalkę). Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
  2. Płytki ze smugami bakteryjnymi inkubować w stacjonarnym inkubatorze o temperaturze 30 °C przez co najmniej 24 godziny.
  3. Na dzień przed posiewem połączyć 10 ml płynnego podłoża TB1 ze 100 μl 20% (w/v) roztworu maltozy-1 M MgSO4 w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    1. Przygotować płynne podłoże TB1 w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl i 10,0 g peptonu kazeinowego, a następnie dodaj 800 ml dH2O, 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy i dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Następnie dodać dH2O do końcowej objętości 1 litra, dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 30 minut. Przechowuj pożywkę w temperaturze pokojowej przez okres do trzech miesięcy.
    2. Przygotować 20% (w/v) Maltozy-1 MMgSO4 w następujący sposób. Wymieszaj 20,0 g maltozy i 24,6 gMgSO4. 7H2O, następnie dodać dH2O do końcowej objętości 100 ml. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  4. Zaszczepić płynną pożywkę kilkoma koloniami z płytki smugowej bakterii za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej56.
  5. Inkubować płynną kulturę przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C z energicznym wytrząsaniem (250–300 obr./min).
  6. W dniu posiewu odwirować stożkową probówkę zawierającą płynną kulturę G1250 o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek bakteryjnych.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml 10 mMMgSO4
    8. .
  8. Zmierzyć absorbancję zawiesiny komórek w stosunku 1:10 przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis (np. 100 μl zawiesiny komórek + 900 μL 10 mM MgSO4)56.
  9. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do końcowego OD600 0,5 za pomocą 10 mM MgSO4. Przygotowana zawiesina G1250 E. coli o OD600 = 0,5 jest określana jako "kultura posiewu G1250".
  10. Przechowuj kulturę galwaniczną G1250 na lodzie i zużyj w ciągu 1-2 godzin.

4. Posiewanie zapakowanych próbek DNA

  1. Z jednej zapakowanej próbki DNA przygotuj szesnaście sterylnychprobówek okrągłodennych o wymiarach 14 x 100 mm 2 i szesnaście płytek agarowych TB1. Dziesięć z każdego zestawu zostanie wykorzystanych do badań przesiewowych, a sześć do mianowania (trzy dla miana 20 i trzy dla miana 100).
    1. Przygotuj płytki agarowe TB1 w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl, 10,0 g peptonu kazeinowego i 12,0 g agaru, a następnie dodaj 800 ml dH2O i 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl i dodać dH2O do końcowej objętości 1 l.
    2. Dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 30 minut. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury 55 °C, a następnie przelać ją do sterylnych szalek Petriego o średnicy 100 mm (20–25 ml na szalkę). Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni.
      UWAGA: Płytki agarowe TB1 należy przygotować co najmniej 24 godziny przed użyciem.
  2. Porcję 200 μl kultury galwacyjnej G1250 do każdej probówki okrągłodennej.
  3. W celu miareczkowania należy rozcieńczyć zapakowaną próbkę DNA w stosunku 1:100 i dobrze wymieszać przez wirowanie (tj. 10 μl upakowanej próbki DNA + 990 μl buforu SM).
  4. Dodać 20 μl rozcieńczenia 1:100 do każdej z trzech probówek o mianie 20.
  5. Dodać 100 μl rozcieńczenia w stosunku 1:100 do każdej z trzech probówek o mianie 100.
  6. Do badań przesiewowych dodać 100 μl "nierozcieńczonej" próbki DNA do każdej z dziesięciu probówek przesiewowych.
  7. Przetwarzać wszystkie probówki do miareczkowania i badań przesiewowych (2 x 3 + 10 = 16 probówek) w następujący sposób: dobrze wymieszać przez wirowanie przez około 10 s, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić gospodarzowi E. coli adsorbację fagów.
  8. Dodać 2,5 ml stopionego górnego agaru TB1 (schłodzonego do 55 °C) w kuchence mikrofalowej do każdego miana lub probówki przesiewającej, natychmiast wymieszać przez wirowanie (delikatnie) i wlać do odpowiedniego miana lub przesiewania płytek agarowych TB1.
    1. Przygotuj górny agar TB1 w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl, 10,0 g peptonu kazeinowego i 7,0 g agaru, a następnie dodaj 800 ml dH2O. Dodaj 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy, a następnie dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Na koniec dodaj dH2O do końcowej objętości 1 litra.
    2. Dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 20–25 minut. Przechowywać w temperaturze pokojowej do trzech miesięcy.
    3. Przed użyciem rozpuść przygotowany górny agar TB1 w kuchence mikrofalowej, dobrze wymieszaj i pozostaw do ostygnięcia do 55 °C w łaźni wodnej.
      UWAGA: Stopiony i schłodzony wierzchołek TB1 dodaje się do zawartości każdego miana lub probówki przesiewającej, a po wymieszaniu wlewa się do odpowiedniego miana lub przesiewania TB1 płytek agarowych.
  9. Pozostaw talerze na 15–30 minut w temperaturze pokojowej, z uchyloną pokrywką, aby zapobiec kondensacji.
  10. Odwrócić płytki i umieścić dziesięć płytek przesiewających w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 24 °C i inkubować przez 46–48 godzin (tj. w warunkach selektywnych), a sześć płytek mianowych w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubować przez 24 godziny/noc (tj. w warunkach nieselektywnych).
    UWAGA: W celu zapewnienia jakości i standaryzacji wyników, dostępne na rynku roztwory kontrolne fagów zawierające mieszaninę typu dzikiego i zmutowanego cII o znanej częstości występowania mutacji są siane wraz z zapakowanymi próbkami DNA i włączane do wszystkich serii testów56.

5. Badanie miana i płytek przesiewowych w celu określenia częstości występowania mutacji cII

  1. Po 24 godzinach/noc inkubacji w temperaturze 37 °C należy policzyć liczbę blaszek utworzonych w każdej z trzech płytek miana 20 i płytki miana 100. Aby łatwiej zidentyfikować tabliczki, trzymaj tabliczkę obok białego pudełka z lampą i na ciemnym tle ze zdjętą pokrywką (patrz Rysunek 2).
  2. Proszę uśrednić (średnią) liczbę tabliczek zliczonych w każdym zestawie tabliczek miana 20 i miana 100 tabliczek (potrójnych, każda).
  3. Wybierz średnią liczbę z zestawu płytek mianowych, która jest najbliższa zakresowi 50–200 płytek na zestaw płytek.
  4. Obliczyć całkowitą liczbę blaszek przesiewanych na dziesięciu płytkach przesiewowych w następujący sposób:
    Całkowita liczba przesiewanych blaszek = (Średnia liczba blaszek w wybranym zestawie płytek miareczkowych ÷ Liczba μl rozcieńczenia użytego na wybraną płytkę mianejącą) x Współczynnik rozcieńczenia x Liczba μL zapakowanej próbki DNA na płytkę przesiewową [100 μL/płytkę] x Liczba płytek przesiewowych [10].
    UWAGA: Na przykład, jeśli średnia liczba tabliczek na tabliczkę w zestawie tabliczek miana 20 wynosi 128, a odpowiadająca jej liczba w zestawie tabliczek miana 100 wynosi 478, liczba 128 zostanie użyta do obliczenia całkowitej liczby tabliczek przesiewanych w następujący sposób:
    (128 ÷ 20) x 100 [współczynnik rozcieńczenia] x 100 [μL/płytkę] x 10 [płytki] = 640 000
    Jest to równoznaczne z pomnożeniem średniej liczby tabliczek przez 5 000 lub 1 000, jeśli średnia liczba opiera się na zliczeniach odpowiednio z płytek Titer 20 lub Titer 100.
  5. Po 46–48 godzinach inkubacji w temperaturze 24 °C należy policzyć całkowitą liczbę blaszek utworzonych na dziesięciu płytkach przesiewowych (postępować zgodnie z instrukcjami podanymi w sekcji 5.1).
    UWAGA: Częstość występowania mutacji cII oblicza się, dzieląc całkowitą liczbę blaszek utworzonych na płytkach przesiewowych przez całkowitą liczbę blaszek przesiewanych. Korzystając z powyższego przykładu, jeśli całkowita liczba blaszek zliczonych na dziesięciu płytkach przesiewowych wynosi 112, częstość mutacji cII dla tej próbki DNA wynosiłaby 112 ÷ 640 000 = 17,5 x 10-5.

6. Weryfikacja domniemanych mutantów λ cII, amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA

  1. Wydrążyć daną płytkę nazębną sterylną końcówką pipety o szerokim otworze i wyrzucić ją (pipetując w górę i w dół) do sterylnej probówki do mikrowirówki zawierającej 500 μl sterylnego buforu SM.
  2. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić wymycie cząstek faga z czopa agarowego.
  3. W sterylnej probówce okrągłodennej o wymiarach 14 x 100 mm2 wymieszać 200 μl kultury galwacyjnej G1250 z 1 μl rdzeniowego roztworu fagowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umieścić próbkę na płytce przy użyciu 2,5 ml stopionego górnego agaru TB1 o temperaturze 55 °C i inkubować płytkę w temperaturze 24 °C przez 46–48 godzin (warunki selektywne), jak opisano w sekcjach 4.8–4.10.
  5. Gdy uformują się blaszki wtórne, użyj końcówki pipety, aby ostrożnie wybrać pojedynczą, dobrze odizolowaną, zweryfikowaną płytkę z mutacją λ cII (unikaj dotykania dolnego agaru).
    UWAGA: Ponowne umieszczenie przypuszczalnych płytek z mutacją cII służy dwóm celom: (i) artefakty poszycia mogą być czasami mylone z blaszkami o małych rozmiarach; oraz (ii) rdzeń agarozy pobrany z płytki przesiewowej może zawierać niezmutowany (fagi) wraz ze zmutowanym fagiem. Wtórne blaszki z powtórnego posiewu o niskiej gęstości zapewnią nieskażoną zmutowaną matrycę do PCR i późniejszej analizy sekwencji DNA.
  6. Przenieść płytkę nazębną do probówki mikrowirówkowej zawierającej 25 μl podwójnie destylowanej wody, pipetując w górę iw dół.
  7. Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut.
  8. Wirować z maksymalną prędkością (18 000 x g) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Natychmiast przenieść 10 μl supernatantu do nowej probówki mikrowirówki zawierającej 40 μl mastermixu PCR, w którym końcowe stężenia odczynników wynoszą 1 x bufor Taq PCR, 10 pmol każdy ze starterów do przodu i do tyłu, 12,5 nmol do każdego dNTP i 2,5 U polimerazy DNA Taq.
    UWAGA: Startery do przodu i do tyłu są następujące: odpowiednio 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (pozycje od -68 do -50 względem kodonu start cII) i 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (pozycje od +345 do +365 względem kodonu start cII).
  10. Wzmocnić matrycę, stosując następujące parametry cykliczne: 3-minutowa denaturacja w temperaturze 95 °C, następnie 30 cykli trwających 30 s w temperaturze 95 °C, 1 minuta w temperaturze 60 °C i 1 minuta w temperaturze 72 °C, z końcowym przedłużeniem o 10 minut w temperaturze 72 °C.
  11. Produkt PCR 432 pz zawierający gen cII i regiony flankujące należy oczyścić za pomocą dostępnych w handlu zestawów do oczyszczania PCR, zgodnie z instrukcjami producenta.
  12. Wykonaj sekwencjonowanie DNA przy użyciu odpowiedniej platformy sekwencjonowania i przeanalizuj wynikowe sekwencje DNA w celu wykrycia mutacji w transgenie cII (patrz uwaga poniżej).
    UWAGA: Najlepiej osiągnąć to poprzez wyrównanie z referencyjną sekwencją cII za pomocą oprogramowania, takiego jak internetowy serwer wyrównywania sekwencji T-Coffee. Aby dowiedzieć się, jak korzystać z programu, odwiedź: http://tcoffee.crg.cat/

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W zależności od rozkładu danych, testy parametryczne lub nieparametryczne są używane do określenia istotności różnicy w częstości występowania mutacji cII między grupą leczoną a kontrolną (tj. częstość występowania mutacji indukowanej i spontanicznej). Porównanie częstości występowania indukowanych mutacji cII w różnych grupach badanych odbywa się za pomocą różnych (parami) testów statystycznych, w zależności od przypadku. Test hipergeometryczny Adamsa i Skopka ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test λ Select cII służy do wykrywania mutacji w transgenie cII odzyskanym z genomowego DNA komórek pochodzących z narządów/tkanek gryzoni BB3. Genom tych transgenicznych zwierząt zawiera wiele tandemowych kopii chromosomalnie zintegrowanego wektora wahadłowego λLIZ, który przenosi transgeny cII (294 pz) i lacI (1080 pz) jako geny reporterowe mutacji 1,2,25. Test λ Selec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za wkład wszystkich kolegów i współpracowników w nasze oryginalne badania, których wyniki zostały przywołane w tym manuskrypcie (w celach ilustracyjnych). Prace autorów są wspierane przez granty z National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health (1R01DE026043) dla AB oraz z University of California Tobacco-Related Disease Research Program dla AB (TRDRP-26IR-0015) i ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorzy badania nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, interpretacji danych, pisaniu raportu ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu go do publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarMO Bio Laboratories, Inc.12112-05Klasa bakteriologiczna
BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cykluThermo Fisher Scientific4337455Brak
Kazeina PeptonAlfa AesarH26557Brak
ŻelatynaJ. T. Baker2124-01
Glicerol wFisher ScientificBP 229-1 / M-13750Brak
LB AgarFisher ScientificBP 9724-500Brak
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen810450 Reakcje oczyszczania PCR
Octan sodu trójwodny FisherScientificM-15756Brak
Taq5000 Polimeraza DNA Qiagen201207Brak
Chlorowodorek tiaminyMacron Fine Chemicals2722-57Brak
Ekstrakt z opakowań TranspackStratagene Corp., przejęty przez BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.20022350 reakcje pakowania
Tris BaseFisher ScientificBP 152-1 / EC 201-064-4Brak
TryptonBiosciencesRC-110Brak
proszku

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828(2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116(2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test mutacyjny Lambda Select cIIizolacja genomowego DNAodzysk wektora wahad owego Lambdapakowanie bakteriofag winfekcja bakterii gospodarzahodowla selektywnaocena mutant w cIIanaliza sekwencji DNAbadanie mutagenno citransgeniczne kom rki gryzoni

Powiązane artykuły