Method Article

Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

DOI:

10.3791/57511

⸱

May 7th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jony potasu przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, a zewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Opisujemy, jak wykonać, skalibrować i stosować monopolarne mikroelektrody selektywne K+. Zastosowanie takich elektrod umożliwia pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki stężenia K+ w dorosłych wycinkach hipokampa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jony potasu znacząco przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, dlatego też zewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Zmienione stężenia zewnątrzkomórkowego K+ wpływają na spoczynkowy potencjał błonowy i pobudliwość komórkową poprzez przesunięcie równowagi między stanami zamkniętymi, otwartymi i nieaktywowanymi dla zależnych od napięcia kanałów jonowych, które leżą u podstaw inicjacji i przewodzenia potencjału czynnościowego. W związku z tym cenny jest bezpośredni pomiar zewnątrzkomórkowej dynamiki K+ w stanach zdrowotnych i chorobowych. Tutaj opisujemy, jak wykonać, skalibrować i używać monopolarnych mikroelektrod selektywnych K+. Umieściliśmy je w wycinkach mózgu dorosłego hipokampa, aby zmierzyć elektrycznie wywołaną dynamikę koncentracji K +. Rozsądne stosowanie takich elektrod jest ważną częścią zestawu narzędzi potrzebnych do oceny mechanizmów komórkowych i biofizycznych, które kontrolują zewnątrzkomórkowe stężenia K+ w układzie nerwowym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stężenia jonów potasu są ściśle regulowane w mózgu, a ich wahania wywierają potężny wpływ na spoczynkowy potencjał błonowy wszystkich komórek. W świetle tych krytycznych wkładów, ważnym celem biologii jest określenie mechanizmów komórkowych i biofizycznych, które są wykorzystywane do ścisłej regulacji stężenia K+ w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w różnych narządach ciała1,2. Ważnym wymogiem w tych badaniach jest możliwość dokładnego pomiaru stężeń K+. Chociaż zidentyfikowano wiele składników, które przyczyniają się do homeostazy potasu w mózgu w stanach zdrowych i chorych

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles. Wszystkie myszy trzymano w pomieszczeniach z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum w 12-godzinnym jasnym i ciemnym środowisku. Wszystkie zwierzęta były zdrowe, bez widocznych zmian w zachowaniu, nie brały udziału w wcześniejszych badaniach i zostały złożone w ofierze podczas cyklu świetlnego. Dane do eksperymentów zebrano od dorosłych myszy (w wieku 6-8 tygodni dla wszystkich eksp....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do selektywnego pomiaru zewnątrzkomórkowego K+ przygotowaliśmy jonoselektywne mikroelektrody pokryte warstwą hydrofobową poprzez silanizację czystych pipet ze szkła borokrzemianowego (Rysunek 1A). Powłoka ta umożliwia jonoforowi K+ zawierającemu walinomycynę spoczywanie na końcówce elektrody i przepuszczanie tylko strumienia K+ przez wąski otwór na końcówce elektrody (Rysunek 1B). Po zalaniu elektrod wypełn.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwoliła nam ocenić dynamikę K+ w odpowiedzi na elektryczną stymulację zabezpieczeń Schaffera w ostrych wycinkach hipokampa od dorosłych myszy. Nasza metoda przygotowania mikroelektrod jonoselektywnych K+ jest podobna do wcześniej opisanych procedur 12,13,14,15. Jednak ta metoda ma przewagę nad alternatywnymi konfiguracjami elektrod, poniewa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Khakh było wspierane przez NIH MH104069. Laboratorium Mody było wspierane przez NIH NS030549. J.C.O. dziękuje NIH T32 Neural Microcircuits Training Grant (NS058280).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VibratomeDSKMicroslicer Zero 1
Mysz: myszy wsobne C57BL/6NTacTaconicStock#B6
Ściągacz elektrodOlympusBX51
Ag / AgCl mielony granulatWPIEP2
Niestandardowa końcówka microfil 28GŚwiatowe instrumenty precyzyjneCMF28G
Pręt wolframowyAM Systems716000
Bipolarne elektrody stymulująceFHCMX21XEW(T01)
Izolator bodźcówŚwiatowe instrumenty precyzyjneA365
Trawa S88 Stymulatortrawy FirmaS88
Pipety ze szkła borokrzemianowegoŚwiatowe instrumenty precyzyjne1B150-4
Płyta od A do DDigidata 1322AWzmacniacz sygnału Axon Instruments
Multiclamp 700A lub 700BAxon Instruments
HeadstageCV-7B Cat 1Axon Instruments
Patch komputerDelln/a
Chlorek soduSigmaS5886
Chlorek potasuSigmaP3911
HEPESSigmaH3375
Wodorowęglan soduSigmaS5761
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS0751
D-glukozaSigmaG7528
Chlorek wapniaSigma21108
Chlorek magnezuSigmaM8266
walinomycynaSigmaV0627-10mg
1,2-dimetylo-3-nitrobenzenSigma40870-25ml
Tetrakis potasu (4-chlorofenylo)boranSigma60591-100mg
5% dimetylodichlorosilan w heptanieSigma85126-5ml
TTXCayman Firma chemiczna14964
Kwas solnySigmaH1758-500mL
SacharozaSigmaS9378-5kg
Pipeta MikromanipulatorSutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200
Soczewka obiektywowaOlympusPlanAPO 10xW
Mikroskop Sutter P-97 pCLAMP10.3 Urządzenia molekularne nie dotyczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
  2. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).
  3. Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Le....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Potassium Ion Selective MicroelectrodesBrain Slice PreparationElectrophysiological RecordingExtracellular Potassium MeasurementMicroelectrode FabricationIonophore CalibrationHippocampal Slice StimulationSchaffer Collateral ActivationNernst Equation AnalysisTTX Application

Related Articles