Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Podsumowanie

Jony potasu przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, a zewnątrzkomórkowe stężenie K⁺ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Opisujemy, jak wykonać, skalibrować i stosować monopolarne mikroelektrody selektywne K⁺. Zastosowanie takich elektrod umożliwia pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki stężenia K⁺ w dorosłych wycinkach hipokampa.

Streszczenie

Jony potasu znacząco przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, dlatego też zewnątrzkomórkowe stężenie K⁺ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Zmienione stężenia zewnątrzkomórkowego K⁺ wpływają na spoczynkowy potencjał błonowy i pobudliwość komórkową poprzez przesunięcie równowagi między stanami zamkniętymi, otwartymi i nieaktywowanymi dla zależnych od napięcia kanałów jonowych, które leżą u podstaw inicjacji i przewodzenia potencjału czynnościowego. W związku z tym cenny jest bezpośredni pomiar zewnątrzkomórkowej dynamiki K⁺ w stanach zdrowotnych i chorobowych. Tutaj opisujemy, jak wykonać, skalibrować i używać monopolarnych mikroelektrod selektywnych K⁺. Umieściliśmy je w wycinkach mózgu dorosłego hipokampa, aby zmierzyć elektrycznie wywołaną dynamikę koncentracji K ⁺. Rozsądne stosowanie takich elektrod jest ważną częścią zestawu narzędzi potrzebnych do oceny mechanizmów komórkowych i biofizycznych, które kontrolują zewnątrzkomórkowe stężenia K⁺ w układzie nerwowym.

Wprowadzenie

Stężenia jonów potasu są ściśle regulowane w mózgu, a ich wahania wywierają potężny wpływ na spoczynkowy potencjał błonowy wszystkich komórek. W świetle tych krytycznych wkładów, ważnym celem biologii jest określenie mechanizmów komórkowych i biofizycznych, które są wykorzystywane do ścisłej regulacji stężenia K⁺ w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w różnych narządach ciała^1,2. Ważnym wymogiem w tych badaniach jest możliwość dokładnego pomiaru stężeń K⁺. Chociaż zidentyfikowano wiele składników, które przyczyniają się do homeostazy potasu w mózgu w stanach zdrowych i chorych^3,4,5, dalszy postęp został spowolniony ze względu na specjalistyczny charakter przygotowania jonoselektywnych mikroelektrod do pomiaru potasu. Czujniki mikroelektrodowe stanowią złoty standard w pomiarze stężeń K⁺ in vitro, w wycinkach tkanek i in vivo.

Nowsze podejścia do monitorowania K⁺ są w trakcie opracowywania przy użyciu czujników optycznych, jednak nie wykrywają one biologicznie istotnego zakresu stężeń K⁺ lub nie zostały w pełni sprawdzone w systemach biologicznych, chociaż wstępne wyniki wydają się obiecujące^6,7^,8. W porównaniu z czujnikami optycznymi, mikroelektrody są zasadniczo ograniczone do punktowego pomiaru źródeł jonów, chociaż układy elektrod mogą poprawić rozdzielczość przestrzenną⁹. W tym artykule skupiono się na jednolufowych czujnikach mikroelektrodowych do monitorowania dynamiki K⁺.

W tej pracy opisujemy szczegółowe procedury etapowe wytwarzania mikroelektrod selektywnych K⁺, przy użyciu jonoforu potasu na bazie walinomycyny, który pozwala na wysoce selektywny (10^4-krotna selektywność K⁺ do Na⁺) ruch K⁺ przez membrany¹⁰. Walinomycyna, naturalnie występujący polipeptyd, działa jak przepuszczalny por K⁺ i ułatwia przepływ K⁺ w dół gradientu elektrochemicznego. Opisujemy również, jak kalibrować elektrody, jak je przechowywać i używać, a na koniec, jak je wykorzystać do pomiaru dynamiki stężenia K ⁺ w ostrych wycinkach mózgu hipokampa u dorosłych myszy. Zastosowanie takich elektrod wraz z genetycznie zmodyfikowanymi myszami, które nie mają specyficznych kanałów jonowych, proponowanymi do regulacji zewnątrzkomórkowej dynamiki K⁺, powinno ujawnić mechanizmy komórkowe wykorzystywane przez układ nerwowy do kontrolowania stężenia K⁺ w otoczeniu w środowisku zewnątrzkomórkowym.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles. Wszystkie myszy trzymano w pomieszczeniach z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum w 12-godzinnym jasnym i ciemnym środowisku. Wszystkie zwierzęta były zdrowe, bez widocznych zmian w zachowaniu, nie brały udziału w wcześniejszych badaniach i zostały złożone w ofierze podczas cyklu świetlnego. Dane do eksperymentów zebrano od dorosłych myszy (w wieku 6-8 tygodni dla wszystkich eksperymentów).

1. Przygotowanie mikroelektrod selektywnych K⁺

1. Silanizacja szkła borokrzemianowego
   1. Wyjmij wystarczającą ilość szklanych kapilar z opakowania i umieść w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Napełnij stożkową rurkę do góry 1 M HCl. Umyj elektrody, delikatnie mieszając w HCl przez noc lub przez minimum 6 godzin.
   2. Krótko spłukać naczynka 70% etanolem, a następnie całkowicie wysuszyć w temperaturze 100-120 °C przez 6-8 godzin. Umyte naczynka należy przechowywać w pojemnikach z bezwodnym środkiem osuszającym siarczan wapnia do 4 tygodni przed dalszym użyciem.
   3. Przed silanizacją należy pociągnąć kapilary do cienkiej końcówki za pomocą ściągacza do mikroelektrod. Mikroelektrody, których używamy, mają średnicę około 2-5 mikronów. Z umytymi naczyniami włosowatymi należy zawsze obchodzić się w rękawiczkach, ponieważ oleje ze skóry mogą zakłócać silanizację.
   4. Umieść mikroelektrody w szklanym pojemniku tak, aby elektrody były podniesione od dołu, aby zapobiec złamaniu końcówki. Przymocuj mikroelektrody do pojemnika za pomocą taśmy autoklawowalnej lub podobnej taśmy klejącej.
   5. Usunąć około 0,5 ml 5% roztworu silanizacyjnego dichlorodimetylosilanu (DDS) z pojemnika, stosując metodę zastępowania azotu (patrz Rysunek 2). Napełnij balon azotem gazowym i przymocuj strzykawkę lub rurkę i igłę do balonu. Wprowadzić igłę do pojemnika DDS, jednocześnie pobierając DDS do oddzielnej strzykawki za pomocą dłuższej igły.
   6. Nanieś roztwór silanizacyjny kroplami na końcówki pipet i natychmiast przykryj. Umieścić pojemnik z mikroelektrodami z roztworem silanizacyjnym we wstępnie podgrzanym (170-180 °C) piecu laboratoryjnym na 10-12 godzin lub w temperaturze 200-220 °C na 30 minut
   7. Po inkubacji wyłącz piekarnik, a następnie wyjmij talerz z piekarnika. Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania płytki z inkubatora, ponieważ jest ona bardzo gorąca. Umieść talerz na ławce w temperaturze pokojowej na 10-15 minut, aby szklane naczynia ostygły.
   8. Usuń mikroelektrody z płytki (używając żyletki lub skalpela do przecięcia taśmy) i umieść je w hermetycznym pojemniku wypełnionym środkiem osuszającym. Mikroelektrody silanizowane utrzymywane w stanie wolnym od wilgoci mogą być używane do 1 tygodnia po silanizacji.
2. Gruntowanie elektrod
   1. Przygotuj roztwór podstawowy koktajlu jonoforowego K⁺: 5% w/v walinomycyny, 93% v/v 1,2-dimetylo-3-nitrobenzenu, 2% w/v tetrakis(4-chlorofenylo)boran potasu¹¹. Ten roztwór ma słaby żółty kolor. Przechowywać w hermetycznym, nieprzezroczystym pojemniku w temperaturze pokojowej. Przy prawidłowym przechowywaniu roztwór ten może przetrwać wiele miesięcy.
   2. Przygotować roztwór podstawowy 10 mM HEPES buforowany 300 mM NaCl o pH 7,4. Zamocuj elektrodę w zacisku i wypełnij buforowanym NaCl za pomocą końcówki mikrofilu 28G podłączonej do strzykawki. Zwróć uwagę, że roztwór soli dotarł do końca końcówki mikroelektrody. Upewnij się, że mikroelektroda jest wolna od dużych pęcherzyków, które mogłyby zakłócać przepływ prądu.
   3. Złamij końcówkę elektrody na szerokość około 10-20 μm, używając strony skalpela lub żyletki.
   4. Za pomocą mikropipety nanieść małą kropelkę (~0,1 μl) jonoforu K⁺ w pobliżu końcówki mikroelektrody. Jeśli elektroda została odpowiednio silanizowana, kropla zostanie wchłonięta przez złamaną końcówkę. Napełnij elektrodę jonoforem K⁺ do 1-2 mm, a nadmiar usuń za pomocą bibuły.

2. Kalibracja mikroelektrod selektywnych K⁺

1. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych
   1. Przygotować roztwory o różnych stężeniach KCl w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym o równej osmolarności (ACSF), zastępując NaCl KCl. Do kalibracji elektrod użyliśmy 0,1, 1, 4,5, 10 i 100 mM K⁺ ACSF. Przepisy dotyczące tych roztworów kalibracyjnych są wymienione w tabeli 1.

pkt. pkt. pkt. pkt.

Chemiczny	Mw	końcowy mM	0.1 mM [K+]	1 mM [K+]	4.5 mM [K+]	10 mM [K+]	100 mM [K+]
	(g / mol)
Zawartość NaCl	Klasa 58,44	Różni się	1,51 gr	1,50 gr	1,44 grama	1,4 grama	0,345 gr
Kcl	1 mln zapasów	Różni się	20 μl	200 μl	900 μl	Pojemność 2 ml	Pojemność 20 ml
CaCl2	1 mln zapasów	cyfra arabska	400 μl
MgCl2	1 mln zapasów	1	200 μl
NaH2PO4	119,98	Rozdział 1.2	0.29 g
NaHCO3	84,01	26	0.437 g
D-glukoza	180,16	10	0,360 g
Woda	q.s. 200 ml

Tabela 1. Roztwory kalibracyjne potasu

2. Kalibracja mikroelektrod
   1. Pęcherzyk wszystkich roztworów z 95% O₂/5% CO₂ przez co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozpocznij perfuzję kąpieli za pomocą 4,5 mM [K⁺] ACSF z szybkością 3 ml na minutę. Umieść elektrodę selektywną K⁺ w uchwycie elektrody przymocowanym do głowicy elektrody na manipulatorze. Stopień ten jest podłączony do odpowiedniego wzmacniacza. Włóż końcówkę elektrody do perfuzatu kąpieli.
   2. Upewnij się, że elektroda uziemiająca Ag/AgCl jest zanurzona w tym samym roztworze i że przepływ jest stały. Nakładaj roztwory kalibracyjne w sposób krokowy i zapisuj potencjalne zmiany mV na końcówce elektrody. Poczekaj, aż potencjał na końcówce elektrody osiągnie stabilną wartość, zanim przejdziesz do następnego rozwiązania
   3. Zmierz zmianę napięcia w stanie ustalonym w odpowiedzi na zastosowanie roztworów kalibracyjnych na końcówkę elektrody. Upewnij się, że nachylenie odpowiedzi elektrody wynosi co najmniej 52 i nie więcej niż 58 mV na zmianę logarytmu w [K⁺].

3. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu w hipokampie

1. Przygotowanie roztworów do krojenia
   1. Przygotować 500 ml roztworu do cięcia sacharozy składającego się z: 194 mM sacharozy, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glukozy, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄ i 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, nasyconych 95%_O2 i 5% CO_{2 .}
   2. Przygotować 1-2 litry roztworu rejestrującego (ACSF) składającego się z: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glukozy, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄ i 26 mM NaHCO₃; pH 7,3 - 7,4 (po bulgotaniu), 290 - 300 mOsm, nasyconych 95% O₂ i 5% CO₂ . Napełnić zlewkę zawierającą komorę na plasterki mózgu roztworem do nagrywania i utrzymywać ją w temperaturze 32-34 °C. Napełnić komorę wibratomu lodowatą wodą
   błotną.
2. Przygotowanie ostrych plastrów
   1. Głęboko znieczul mysz, umieszczając ją w słoiku z dzwonem napełnionym 2-3 ml izofluranu. Sprawdź, czy palce u nóg nie mają odruchu szczypania, a jeśli nie reagują, szybko odetnij mu głowę za pomocą ostrych nożyc lub gilotyny, zgodnie z protokołem dla zwierząt.
   2. Wykonaj 2-3 cm nacięcie za pomocą nożyc z ogonowej części czaszki, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej. Ręcznie chowając skórę głowy, wykonaj dwa poziome nacięcia o długości 1 cm od otworu wielkiego wzdłuż boków czaszki. Następnie za pomocą cienkich nożyc wytnij nacięcie wzdłuż długości czaszki, wzdłuż linii środkowej od tyłu czaszki do nosa.
   3. Za pomocą cienkich kleszczy umieszczonych w pobliżu linii środkowej cofnij naciętą czaszkę na dwie części. Wyjmij mózg myszy z czaszki i użyj ostrza, aby usunąć móżdżek i opuszki węchowe, które znajdują się odpowiednio w ogonowej i rostralnej części mózgu. Można je zidentyfikować po dużych szczelinach, które oddzielają je od kory.
   4. Zamontuj blok mózgu na tacy z wibratomem za pomocą super kleju. Napełnij tacę wibratomu roztworem do cięcia na zimno.
   5. Wytnij skrawki tkanki na płaszczyźnie koronalnej o grubości 300 μm. Zwykle można zebrać 6 koronalnych wycinków hipokampa.
   6. Po odcięciu każdej sekcji należy natychmiast przenieść je do zlewki z ramką podgrzaną do temperatury 32–34°C. Przechowywać skrawki w tej temperaturze przez 20 minut przed wyjęciem zlewki zawierającej kawałki i umieścić ją w temperaturze pokojowej na co najmniej 20–30 minut przed zapisem.

4. Pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki K⁺

1. Ustawianie przygotowania plastrów
   1. Delikatnie umieść plasterek mózgu w kąpieli za pomocą pipety Pasteura i delikatnie przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami.
   2. Upewnij się, że końcówki bipolarnej elektrody stymulującej są równoległe do siebie i znajdują się na poziomie płaszczyzny plasterka. Powoli, w ciągu 6-7 sekund, włóż elektrody do warstwy promieniowania CA3 o głębokości około 40-50 μm, aby stymulować zabezpieczenia Schaffera. W przekrojach koronalnych CA3 można w przybliżeniu zidentyfikować jako część hipokampa właściwą bocznie do warstwy komórek ziarnistych w obrębie hipokampa, z warstwą promieniową opadającą przyśrodkowo i brzusznie do warstwy komórek piramidowych.
   3. Ostrożnie włóż elektrodę selektywną K⁺ do warstwy promieniowania CA1 o głębokości około 50 μm, powoli opuszczając elektrodę przez około 3-4 sekundy. Poczekaj, aż potencjał ustabilizuje się na elektrodzie przed zastosowaniem stymulacji do plasterka: zwykle zajmuje to od 5 do 10 minut. Jeśli plasterek wykazuje spontaniczne zmiany w zewnątrzkomórkowym K⁺, wyrzuć i powtórz ten proces z nowym plasterkiem.
2. Zmierz wywołane uwolnienie K⁺
   1. Zastosuj ciągi stymulacji elektrycznej (8 impulsów), ręcznie naciskając spust na stymulatorze, jednocześnie cyfrowo rejestrując odpowiedzi. Zastosuj stymulację przy 10 Hz i szerokości impulsu 1 ms, zaczynając od amplitudy bodźca 10 μA.
   2. Stosuj zwiększające amplitudy stymulacji o współczynnik 2, aż do wykrycia maksymalnej amplitudy odpowiedzi K⁺. Jeśli nie widzisz żadnej odpowiedzi, przesuwaj położenie elektrody K⁺ bliżej miejsca stymulacji w krokach co 100 μm
   3. Określ amplitudę bodźca, która wytwarza połowę maksymalnej odpowiedzi. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to od 40 do 160 μA, w zależności od jakości preparatu, wieku zwierzęcia i odległości między elektrodami stymulacyjnymi a elektrodą selektywną K⁺.
   4. W tym samym wycinku, stosując amplitudę bodźca o jeden krok niższą niż amplituda, która wytwarza odpowiedź połówkową maksymalną (np. jeśli 80 μA daje odpowiedź połówkową maksymalną, użyj 40 μA), zastosuj ciągi bodźców o rosnącej liczbie impulsów. Początkowo używaliśmy ciągów o 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 i 128 impulsach.
   5. Aby potwierdzić, że sygnały K⁺ są pośredniczone przez wyzwalanie potencjału czynnościowego elektrycznie stymulowanej kąpieli pobocznej Schaffera, należy zastosować 0,5 μM TTX w ACSF przez 10 minut i powtórzyć protokół stymulacji. Nie należy zaobserwować żadnych wywołanych reakcji.
   6. Po zakończeniu eksperymentu z plastrem upewnij się, że elektroda zachowała swoją responsywność, ponownie kalibrując elektrodę w roztworach kalibracyjnych i upewniając się, że odpowiedź nie odbiega o więcej niż 10% od początkowej kalibracji

Wyniki

Do selektywnego pomiaru pozakomórkowego K⁺ przygotowaliśmy mikrolektrody jonoselektywne pokryte warstwą hydrofobową poprzez silanizację czystych pipet z borokrzemianowego szkła (Rycina 1A). Powłoka ta umożliwia zatrzymanie jonoforu K⁺ zawierającego walinomycynę na końcówce elektrody i pozwala na przepływ jedynie jonów K⁺ przez wąski otwór na czubku elektrody (Rycina 1B). Po wstępnym przygotowaniu ...

Dyskusja

Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwoliła nam ocenić dynamikę K⁺ w odpowiedzi na elektryczną stymulację zabezpieczeń Schaffera w ostrych wycinkach hipokampa od dorosłych myszy. Nasza metoda przygotowania mikroelektrod jonoselektywnych K⁺ jest podobna do wcześniej opisanych procedur 12,13,14,15. Jednak ta metoda ma przewagę nad alternatywnymi konfiguracjami elektrod, poniewa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mysz: myszy wsobne C57BL/6NTac	Taconic	Stock#B6
Ściągacz elektrod	Olympus	BX51
Ag / AgCl mielony granulat	WPI	EP2
Niestandardowa końcówka microfil 28G	Światowe instrumenty precyzyjne	CMF28G
Pręt wolframowy	AM Systems	716000
Bipolarne elektrody stymulujące	FHC	MX21XEW(T01)
Izolator bodźców	Światowe instrumenty precyzyjne	A365
Trawa S88 Stymulator	trawy Firma	S88
Pipety ze szkła borokrzemianowego	Światowe instrumenty precyzyjne	1B150-4
Płyta od A do D	Digidata 1322A	Wzmacniacz sygnału Axon Instruments
	Multiclamp 700A lub 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch komputer	Dell	n/a
Chlorek sodu	Sigma	S5886
Chlorek potasu	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma	S0751
D-glukoza	Sigma	G7528
Chlorek wapnia	Sigma	21108
Chlorek magnezu	Sigma	M8266
walinomycyna	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimetylo-3-nitrobenzen	Sigma	40870-25ml
Tetrakis potasu (4-chlorofenylo)boran	Sigma	60591-100mg
5% dimetylodichlorosilan w heptanie	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Firma chemiczna	14964
Kwas solny	Sigma	H1758-500mL
Sacharoza	Sigma	S9378-5kg
Pipeta Mikromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Soczewka obiektywowa	Olympus	PlanAPO 10xW

Mikroskop Sutter P-97 pCLAMP10.3 Urządzenia molekularne nie dotyczy